DE2943116C2 - Einrichtung zur durchflußcytometrischen Reaktions- und/oder Diffusionsmessung - Google Patents

Description

23 43 116'

3 4

kann sowohl kleiner als auch größer als der Zelldurch- bildung des Flüssigkeitsstrahles 1 und 7. In einer einseimessersein. tig offenen Metallkammer 25 ist sowohl das Zufüh-

Das System gestattet es aber, erstmals Diffusionen rungsrohr 3 als auch das Rohr 6 befestigt Die Verschie- und Reaktionen an einzelnen Zellen und Partikeln in bemöglichkeit der beiden Rohre 3 und 6 zueinander Suspensionen mit einstellbaren Reaktionszeiten und/ 5 bzw. gegenüber dem äußeren Rohr 4 (siehe Fig. 1) ist oder Diffusionsgradienten bei hoher Meßrate durchzu- nicht näher dargestellt Sie läßt sich jedoch durch beführen. Neben den Reaktionsdaten lassen sich weitere kannte Verschiebetechniken verifizieren. Die Zufüh-Parameter der Zellen und Partikel erfassen und zur ge- rung der Reaktionsflüssigkeit 7 erfolgt über einen seitnaueren Charakterisierung heranziehen. Weiterhin sind lieh angeordneten Stutzen 26.

hochauflösende Untersuchungen an Systemen im Diffu- io In den Fig. 3a—c sind jeweils 2 Teilchen 2 dargesionsgleich&cwicht als auch vor Erreichen des Gleichge- stellt, die entlang des Suspensionsfadens 1 hintereinanwichtszustandes möglich. Die Messung einzelner Parti- der aufgereiht sind. Die Suspensionsflüssigkeit 1 umgibt kel in großer Anzahl erlaubt Aussagen mit hoher stati- die Teilchen 2 im gezeigten Beispiel als dünner Film. Die scher Sicherheit Teilchen 2 mit Suspension 1 bewegen sich gemeinsam

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausfüh- 15 mit der Reaktionsflüssigkeit 5 in horizontaler Pfeilrichrungsbeispielen mittels der Fig. 1, 2 und 3a—c näher tung,
erläutert. Seitlich der F i g. 3a—c sind sowohl zwei kleine Pfeile

Die Fig. 1 stellt eine Einrichtung mit Beleuchtungs- P\ und P₂, die zwei der möglichen Polarisationsrichtun- und Aufnahmeeinrichtung schematisch dar. Die Proben- gen der beiden parallelen Anregungsstrahlen widergesuspension 1 (Teilchen 2 mit Flüssigkeit) strömt über ein 20 ben, als auch die Querschnitte zweier paralleler Be-Zuführungsrohr 3 in das sich verjüngende Rohr 4 zur leuchtungs- bzw. Beobachtungsstrahlen 12, 17, oder 18 hydrodynamischen Fokussierung. Über dieses Rohr 4 dargestellt Mit kreisförmigen Strahlungsquerschnitten wird eine erste Mantelflüssigkeit 5 zur Ausbildung des (F i g. 3a) kann entweder die Zellänge (wobei der zweite Suspensionsfadens zugeführt (ähnlich wie in der DE-OS Strahl 18 der Korrektur der Absolutwerte dient) oder, 25 43 310). 25 wenn mit zwei Polarisationsrichtungen angeregt wird,

Um das Zuführungsrohr 3 herum ist konzentrisch z. B. die Mobilität von Fluorchromen bestimmt werden, zum Rohr 4 (und Rohr 3) ein weiteres Rohr 6 angeord- Mit einem schlitz- und einem kreisförmigen Strahlnet über welches die Reaktionsflüssigkeit 7 zugeführt querschnitt (siehe F i g. 3b) läßt sich die Länge und Breiwird. Die Teilchen 2, die Suspensionsflüssigkeit 1 und te (Extinktion) der Teilchen 2 bestimmen, die Reaktionsflüssigkeit 7 werden sodann mittels des 30 Zwei schlitzförmige Strahlquerschnitte (siehe äußeren, sich verjüngenden Rohres 4 derart hydrodyna- F i g. 3c) erlauben die Bestimmung von Zellängen, wobei misch fokussiert, wie es z. B. in den Fig.3a—c darge- die Teilchen nicht unbedingt gut ausgerichtet sind oder stellt ist Mittels Doppelpfeilen ist angedeutet, daß so- Klumpen gebildet haben. Dabei wird mit einem Strahl wohl das Zuführungsrohr 3 relativ zu dem weiteren die Länge entsprechend der o. g. DE-OS relativ zu der Rohr 6 als auch beide Rohre 3 und 6 relativ zum äußeren 35 Strömungsgeschwindigkeit und mit Hilfe der Passage-(ersten) Rohr 4 in Strömungsrichtung bewegbar sein zeit vom ersten bis zum zweiten Strahl die Strömungssollen. Mit diesen Verschiebemöglichkeiten sind sowohl geschwindigkeit selbst bestimmt. Damit ist eine Eichung der Durchmesser des Suspensionsfadens 1 als auch der der Auswerteelektronik zur Darstellung der absoluten der Reaktionsflüssigkeit 7 veränderbar. Größenwerte möglich.

Der gemeinsam gebildete Flüssigkeitsstrahl 8 tritt 40

dann aus dem Düsenende 9 des äußeren Rohres 4 ent- Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

weder frei aus oder es wird von einer weiteren Mantel-

flüssigkeit 10 bis zum Auslaß 27 umgeben, welche im
Mantelrohr 11 zugeführt wird. Diese weitere Flüssigkeit
kann beispielsweise zur Stabilisierung des Flüssigkeits- 45
Strahls 8 oder zur optischen Anpassung dienen. Er kann
jedoch auch entfallen, wenn nur von den Teilchen 2
ausgehendes Streu- oder Fluoreszenzlicht betrachtet
werden soll.

Die Beleuchtung, Beobachtung und Auswertung er- 50
folgt mittels eines Laserstrahls 12, der über einen Polarisationsrotator 13 (kann entfallen), einem dichroitischen
Spiegel 14 (Epi Illumination) und ein Objektiv 15 auf die
Teilchen 2 bzw. den gemeinsamen Flüssigkeitsstrahl 8
gerichtet ist Beobachtet (gemessen) wird im Durchlicht 55
17 mit Linse 16 oder im Auflicht (Streu- oder Fluoreszenzlicht) 18 über das Interferenzfilter 19, den Calcite
Crystial 20 und die zwei Photomultiplier 23,24, auf die
die polarisierten Teilstrahlen 21,22 gerichtet sind. Diese
beiden Strahlen 21 und 22 dienen z. B. der Messung der 60
Emissionsanisotropie. Die Impulsauswerteschaltung ist
nicht dargestellt, da sie im wesentlichen der in der genannten DE-OS gleicht. An Stelle einer Trennung nach
unterschiedlichen Polarisations-Richtungen kann auch
eine Aufspaltung des Beobachtungsstrahls in mehrere 65
unterschiedliche Wellenlängenbereiche mit Hilfe von
Prismen oder halbdurchlässigen Spiegeln erfolgen.

Die Fig. 2 zeigt ein Detail der Einrichtung zur Aus-

Claims (4)

23 43 116 ι 2 denn einerseits erzeugte die Reaktionsflüssigkeit AbPatentansprüche: sorption und/oder Streuung des Beleuchtungs- und/ oder Beobachtungsstrahles und andererseits müßte ein

1. Einrichtung zur durchflußcytometrischen Reak- Minimaldurchmesser der ersten Mantelflüssigkeit auftions- und/oder Diffusionsmessung von in einer 5 grund der Stabilisierung der hydrodynamischen Fokus-Flüssigkeit suspendierten Teilchen mit einem von sierung eingehalten werden, so daß bei dieser bekanoder Suspension und einer ersten Mantelflüssigkeit ten Einrichtung nicht einfach diese Mantelflüssigkeit als durchflossenen, sich verjüngenden Rohr zum hydro- Reaktionsflüssigkeit verwendet werden könnte,
dynamischen Fokussieren der Suspension zu einem Solche Messungen gelangen bisher nur an Einzelteil-Suspensionsfaden, der nach Verlassen des Rohres to chen mit direkter mikroskopischer Beobachtung (EHi zusammen mit der ersten Mantelflüssigkeit zu einem Konen et al, »Quantitative aspects of rapid microfluor-Auslaß geführt wird, mit einem den Suspensionsfa- emetry for the study of enzyme reactions and transport den kreuzenden Beleuchtungs- und/oder 3eobach- mechanismus in single living cells«, Fluorescence techtungsstrahl und mit mindestens einem an eine Im- nignes in cell biology, Springer Verlag 1973, Heidelbergpulsauswerteschaltung angeschlossenen Detektor is New-York.52 707-218).

für die von den vereinzelten Teilchen ausgehende Hierbei finden Farbstoffreaktionen, radioaktive oder

Strahlung, dadurch gekennzeichnet, daß immunologische Techniken Anwendung,
zwischen dein Suspensionsfaden (1,2) und der ersten Diese Techniken bzw. Messungen sind nur an einzel-

Mantelflüssigkeit (5) eine weitere Mantelflüssigkeit nen Teilchen möglich, welche nicht repräsentativ für die

(7) konzentrisch zu beiden ausgebildet ist, die mit 20 Gesamtmenge der Teilchen zu sein brauchen, oder es den Teilchen (2) in Wechselwirkung tritt, und daß können, bei Messungen an Teilchen in Suspension, über diese weitere Mantelflüssigkeit (7) innerhalb des die einzelnen Teilchen keine weiteren Informationen Rohres (4) zum hydrodynamischen Fokussieren mit- erhalten werden.

tels einem weiteren Rohr (6), welches ein Zufüh- Die der Erfindung gestellte Aufgabe besteht nunmehr

rungsrohr (3) der Flüssigkeit (1) mit den Teilchen (2) 25 darin, die eingangs genannte Einrichtung derart zu verumgibt, der ersten Mantelflüssigkeit (5) zuführbar ändern bzw. zu verbessern, daß solche Messungen ist. durchgeführt werden können, wobei auch die Möglich-

2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekenn- keit gegeben sein soll, daß zuerst zwischen den beiden zeichnet, daß der Suspensionsfaden (1, 2) nach dem Mantelflüssigkeiten ein Reaktionsprodukt erhalten Verlassen des sich verjüngenden Rohres (4) zusam- 30 wird, welches dann erst mit den Teilchen wechselwirkt, men mit der ersten und zweiten Mantelflüssigkeit (5, Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mittels der 7) in einem Mantelrohr (11) zu dem Auslaß (27) führ- Merkmale des Anspruches 1 gelöst. Die Merkmale des bar ist. Anspruches 2 geben eine Weiterbildung der Erfindung

3. Einrichtung nach Anspruch 1 oder 1 und 2, da- an, die besonders zu Messungen geeignet ist, bei denen durch gekennzeichnet, daß das weitere Rohr (6) rela- 35 keine Fluoreszenz bzw. Streustrahlung nachzuweisen tiv zum Zuführungsrohr (3) und beide relativ zum bzw. benötigt wird. Die übrigen Ansprüche geben weifokussierenden Rohr (4) in axialer Richtung beweg- tere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung wieder, bar sind, wodurch der Durchmesser der weiteren Bei der Erfindung wird demnach das Verfahren der Mantelflüssigkeit (7) und des Suspensionsfadens (1) hochauflösenden Durchflußcytrometrie durch einen zuveränderbar ist. 40 sätzlichen Mantelstrom erweitert, der die Reaktionslö-

4. Einrichtung nach Anspruch 1 oder einem der sung enthält. Damit wird eine schnell aufeinanderfolfolgenden, dadurch gekennzeichnet, daß die von den gende Messung einzelner Zellen und Partikel möglich, Teilchen (2) ausgehende Strahlung (17,18) der Mes- wobei gleichzeitig weitere Parameter der jeweiligen sung der Extinktion, der Fluoreszenz, des Streulichts Zelle erfaßbar sind. Das mikroskopische Auflösungsveroder des Beugungslichtes dient. 45 mögen bleibt dabei auch bei hohen Meßraten erhalten.

Nach dem Austritt aus dem Probenzuführungsrohr wird

die Suspension von einem konzentrischen Fiüssigkeits-

bzw. Reaktionsstrahl, der die Reaktions- oder Farbstofflösung enthält, ummantelt. Beide werden in der an sich

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zur durchfluß- 50 bekannten Weise hydrodynamisch fokussiert und ein cytrometrischen Reaktions- und/oder Diffusionsmes- weiterer Mantelstrom gestattet in speziellen Anwensung von in einer Flüssigkeit suspendierten Teilchen mit dungsfällen die optische Anpassung an ebene Beobacheinem von der Suspension und einer ersten Mantelflüs- tungsfenster. Das Durchmesserverhältnis des Suspensigkeit durchflossenen, sich verjüngenden Rohr zum hy- sions- zum Reaktionsflüssigkeitskanal kann an Hand der drodynamischen Fokussieren der Suspension zu einem 55 Versuchsbindungen gewählt werden. Bei hoher Eigen-Suspensionsfaden, der nach Verlassen des Rohres zu- absorption der Reaktionslösung z. B. wird der Endsammen mit der ersten Mantelflüssigkeit zu einem Aus- durchmesser des Flüssigkeitszylinders der Reaktionslölaß geführt wird, mit einem den Suspensionsfaden kreu- sung nur wenig größer als die Zelle gewählt. Ohne wezenden Beleuchtungs- und/oder Beobachtungsstrahl sentliche Einbußen an Genauigkeit der räumlichen Posi- und mit mindestens einem an eine Impulsauswerteschal- 60 tionierung bei der hydrodynamischen Fokussierung lastung angeschlossenen Detektor für die von den verein- sen sich durch Verlegung der Mündung des Suspenzelten Teilchen ausgehende Strahlung. sionszuführungsrohres entlang der Strömungsachse un-Eine ähnliche Einrichtung ist in der DE-OS 25 43 310 terschiedliche Reaktionszeiten bis zum Meßpunkt einbeschrieben. Mit ihr können jedoch u.a. nur Teilchen stellen. Durch Wahl der Stoffkonzentration im Reakeinzeln gezählt und klassifiziert werden. Die Messung 65 tionsmantel können unterschiedliche Diffusionsgradiendes Transportes von Stoffen in und aus den Teilchen ten eingestellt werden. Bei fluorochromierten Stoffen ist (Zellen oder Partikeln) sowie chemische Reaktionen an dabei die Größe des abtastenden Strahles nur durch die den Teilchen können mit ihr nicht durchgeführt werden, räumliche Trennung der Einzelzellen begrenzt, d. h. er