DE2920890C2

DE2920890C2 - Esterastin-Derivate und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE2920890C2
Application number: DE2920890A
Authority: DE
Inventors: Takaaki Fujisawa Kanagawa Aoyagi; Tomio Tokyo Takeuchi; Hamao Tokyo Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1978-05-25
Filing date: 1979-05-23
Publication date: 1982-07-15
Also published as: GB2023604A; GB2023604B; DE2920890A1; US4202824A; FR2426679B1; CA1133921A; FR2426679A1

Description

CHNHCOCH₃

CH₂CONH₂

reduziert oder

b) mittels einer 0,01 η wäßrigen Natriumhydroxid- oder Kaliumhydroxidlösung in einer Lösungsmittel-Mischung aus Wasser-Dioxan oder Wasser-Aceton bei Zimmertemperatur hydrolysiert und gegebenenfalls das erhaltene 1,3-Lacton der 3,5-Dihydroxy-2-hexylhexadeca-7,10-diencarbonsäure der Formel

CHJ-(CHJ)₄-CH = CH-CH₂-CH=CH-CH₂-CH-CH₂-CH-CH-(CHj)₅-CH₃ (IV)

OH O —C = O

wie unter a) angegeben zum 1,3-Lacton der 3,5-Dihydroxy-2-hexyl-hexadecancarbonsäure der Formel CH₃—(CH₂),o—CH-CH₂-CH-CH-(CH₂)S-CH₃ (V)

OH O C =

reduziert oder gegetenenfa.'.s das nach a) erhaltene Tetrahydroesterastin gemäß b) zur Verbindung V hydrolysiert.

Die Erfindung betrifft neue, physiologisch aktive Derivate des Esterastins. Die erfindungsgemäßen Verbindungen inhibieren die enzymatische Wirkung der Esterase; sie sind als Tetrahydroesterastin, 3,5-Dihydroxy^-hexylhexadeca-T.lO-dienoyl-l^-lacton (13-Lacton der S.S-Dihydroxy^-hexylhexadeca^.lO-diencarbonsäure) bzw. S.S-Dihydroxy^-hexylhexadecanoyl-l.S-lacton (1,3-Lacton der 3^-Dihydroxy-2-hexylhexadecancarbonsäure) zu bezeichnen. Die beiden letztgenannten Verbindungen können auch als 0-Lactone der d-Hydroxymycolinsäure angesehen werden. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung dieser Substanzen, gemäß welchen Esterastin als Ausgangsmaterial chemisch umgesetzt wird.

Die erfindungsgemäßen Substanzen lassen sich für immunosuppressiv wirkende Präparate verwenden, mit welchem die Immunreaktion bei lebenden Tieren verringert werden kann. Die erfindungsgemäßen neuen Substanzen haben die Fähigkeit, die enzymatische Wirkung einer weitaus größeren Zahl von Enzymen zu inhibieren als das Esterastin selbst

Das Esterastin selbst ebenso wie seine Esterase inhibierende Wirkung sind seit langem bekannt. Esterastin läßt sich aus der Kulturbrühe gewinnen, die man beim Züchten des Mikroorganismus Streptomyces lavendulae MD4-C1 (Hinterlegungsnummer FERM-P 3 723 bzw. ATCC. 31 336) erhält. Die Herstellung und die Natur des Eseterastins sind beispielsweise in »Journal of Antibiotics«, Band 31, Nr. 6 Seiten 639 bis 641 sowie in der US-Patentanmeldung Serial Nr. 873 bis 350 und in der französischen Patentanmeldung Nr.

78-041 174 beschrieben. Das Esterascin bewirkt die Verminderung der Anzahl der Zellen, die humorale Antikörper erzeugen, und unterdrückt außerdem die zellvermittelte Immunität Esterastin besitzt eine sehr geringe Toxizität und kann als sicheres Präparat zur chemotherapeutischen Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die durch Immunreaktionen hervorgerufen werden, wie beispielsweise allergische Kontaktdermatitis, systemischer Lupus erythematosus, autoimmune hämolytische Anämie, Periarteriitis nodosa,

so Myasthenie, Arthritis, Rheumatismus und multiple Sklerose. Darüber hinaus kann das Esterastin als Immunreaktionen unterdrückendes Präparat bei chirurgischen Eingriffen wie Transplantationen von inneren Organen wie Herz, Niere und Muskel verwendet werden. Durch Carrageenin hervorgerufene Entzündungen werden durch Esterastin inhibiert.

Neben den vorstehend aufgeführten günstigen Eigenschaften hat das Esterastin aber den Nachteil, eine recht instabile Substanz zu sein. Es ist daher notwendig, das Esterastin in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Chloroform zu lösen und die Lösung bei einer niedrigen Temperatur aufzubewahren, um das Esterastin bei der Lagerung vor Zersetzung zu schützen. Im Gegensatz dazu sind die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen verhältnismäßig beständig, so daß sie in Pulverform Ober lange Zeit hinweg, die bis zu einem Jahr ausmachen kann, gelagert werden können, ohne daß eine Verringerung ihrer Wirkung eintritt.

5 6

Esterastin besitzt die folgende chemische Struktur:

CH₃-(CH₁J₄-CH = CH-CH₂-CH = CH-CH₂-CH-CH₁-CH-CH-(CH₁Js-CH₃

I "Il

ο ο — c=o

C = O (II)

CHNHCOCH₃

CH₂CONH₂

Untersuchungen am Esterastin haben jetzt gezeigt, Palladium hydrieren läßt, wobei dessen Tetrahydroderidaß es sich mit Wasserstoff in Gegenwart eines 15 vat entsteht, welches der Formel III entspricht: bekannten Hydrierungskatalysators wie Platinoxid oder

CH₃-(CHJ₁₀-CH-CH₂-CH-CH-(Ch₂)J-CH₃ O O C = O

C = O ~ (ΠΙ)

CHNHCOCH₃

CH₂CONH₂

Dieses Tetrahydroderivat, jetzt als Tetrahydroesterastin bezeichnet, inhibiert die Wirkung der Esterase in gleicher Weise wie das Esterastin selbst, jedoch ist der Wirkungsbereich sehr viel größer, da die Zahl der Enzyme, deren Wirkung inhibiert wird, weit größer ist als die Zahl der Enzyme, die durch Esterastin selbst inhibiert werden.

Weiterhin ist jetzt gefunden worden, daß das Esterastin unter schwach alkalrchen Bedingungen hydrolysiert werden kann, beispielsweise bei Verwendung einer 0,01 η wäßrigen Natriumhydroxidlösung. Bei einer solchen Hydrolyse erhält man eine Esterase inhibierende Substanz, die, wie festgestellt wurde, eine neue Verbindung darstellt, die der Formel

CH₃ -(CH₂),,-CH = CH-CH₂-CH= CH-CH₂-CH-CH₂-CH-CH-(CH₂)₅-CH₃

(IV)

OH Q-C =

entspricnt und welche als 3^-Dihydroxy-2-hexyl-hexadeca-7,10-dienoyl-13-lacton zu bezeichnen ist Auch das Tetrahydroesterastin läßt sich unter schwach alkalischen Bedingungen , beispielsweise mit 0,01 η wäßriger Natriumhydroxidlösung, hydrolysieren; dabei erhält .nan dann eine weitere Esterase inhibierende Substanz, die auch eine neue Verbindung darstellt, welche der Formel entspricht

CHj—(CH₂),o—CH-CH₂-CH — CH—(CH₂J₅-CH₃ (V)

OH

O C = O

und die als S.S-Dihydroxy^-hexylhexadecanoyl-l.S-lacton zu bezeichnen ist Diese letztgenannte Verbindung kann auch durch katalytische Hydrierung des bereits erwähnten SfS-Dihydroxy^-hexylhexadeca-y.iO-dienoyl-l,3-lactons in Gegenwart eines bekannten Hydrierungskatalvsators wie Platinoxid oder Palladium hergestellt werden. Diese beiden neuen Verbindungen zeigen ebenfalls eine gute Esterase hinhibierende Wirkung, die die das Esterastins selbst sogar übertrifft, weil die Zahl der inhibierten Enzyme größer ist als bei diesem.

Gegenstand der Erfindung sind infolgedessen die im Anspruch 1 beanspruchten und gekennzeichneten Verbindungen.

Das Esterastin, welches als Ausgangsmateria! für die Herstellung der Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung verwendet wird, kann in bekannter Weise durch aerobe Züchtung der Sporen oder des Mycels von tsterastin erzeugenden Stämmen der Art Streptomyces

50 wie Streptomyces lavendulae MD4-C1 (hinterlegt als FERM-P 3 723 oder ATCC 31 336) in einem Kulturmedium, welches bekannte Kohlenstoff- und Stickstoffqueilen als Nährstoffe enthalten, gewonnen werden.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin das Verfahren zur Herstellung der 1,3-Lactone der Formel I gemäß Anspruch 1, welches in Anspruch 2 beansprucht und gekennzeichnet ist

Zur Herstellung des Tetrahydroesterastins, d. h. der Verbindung der Formel III wird Esterastin der Formel II mit Wasserstoff in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators reduziert. Das als Ausgangsmaterial eingesetzte Esterastin wird zunächst in einem organischen Lösungsmittel wie einem niederen Alkami, beispielsweise Methanol oder Äthanol, die sich unter den Reaktionsbedingungen inert verhalten, gelöst. Zu der Lösung wird eine ausreichend Menge eines bekannten Hydrierungskatalysators wie Platinoxid oder Palladiummetall gegeben. Die Menge des Katalysators kann etwa 2 bis

55

60

20 Gew.-% der Menge des als Ausgangsmaterial eingesetzten Esteraslins betragen. Die Reduktion wird in einem Strom aus Wasserstoffgas oder in einer Parr-Apparatur bei Umgebungstemperatur durchgeführt und erfordert eine Zeitspanne von etwa 2 bis 12 Stunden. Im allgemeinen genügt es, die katalytische Reduktion über Nacht ablaufen zu lassen. Nach Beendigung der Reaktion wird das Reaktionsgemisch nitriert, um den Katalysator zu entfernen. Das Filtrat wird zur Trockne eingeengt so daß man das Tetrahydroesterastin als pulverförmiges Rohprodukt erhält.

Falls erforderlich, kann das gewonnene Produkt durch Chromagographieren an Silikagel gereinigt werden, wobei man ein Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und Chloroform als Laufmittel verwendet. Das Verhältnis der beiden Lösungsmittel Äthylacetat und Chloroform soll vorzugsweise bei I : 1 liegen.

7nr !-!«»rctplliino Hpc 1 1-1 jartnnc Hf»r 1 S-Dihvrlrrniv-?-

hexylhexadeca^.lO-diencarbonsäure mit der Formel IV wird Esterastin unter alkalischen Bedingungen hydrolysiert.

Das 13-Lacton der S^-Dihydroxy^-hexylhexadecancarbonsäure mit der Formel V läßt sich gewinnen, indem man Tetrahydroesterastin unter alkalischen Bedingungen hydrolysiert

Das als Ausgangsmaterial eingesetzte Esterastin oder das Tetrahydroesterastin kann dabei in einem Lösungsmittelgemisch wie Wasser-Dioxan oder Wasser-Aceton gelöst werden. Die beiden Gemische, d. h. Wasser-Dioxan (1:1) und Wasser-Aceton (1:1) eignen sich ganz besonders als Reaktionsmedium. Die so hergestellte Lösung des Esterastins wird mit der äquimolekularen oder nahezu äquimolekularen Menge eines schwachen Alkalis vermischt, um die Hydrolyse durchzuführen. Bei dem Alkali kann es sich um ein Alkalimetallhydroxid oder -carbonat handeln; eine 0,01 η wäßrige Lösung von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid ist besonders geeignet. Das Reaktionsgemisch wird bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt Gegebenenfalls kann das Reaktionsgemisch erwärmt werden. Nach Beendigung der Hydrolysereaktion wird die Reaktionslösung mit η-Hexan extrahiert, so daß das Hydrolyseprodukt (d. h_ das 33-Dihydroxy-2-hexylhexadeca-7,10-dienoyl-1 J-Iacton oder 3^-Dihydroxy-2-hexylhexadecanoyl-13-lacton) in die n-Hexan-Phase überführt wird.

Die Lösung des Hydrolyseproduktes in η-Hexan (der Extrakt) kann durch Chromatographieren über Silikagel gereinigt werden. Als Laufmittel eignet sich für diesen Zweck insbesondere n-Hexan-Chloroform (3:1). Man erhält auf diese Weiie die Verbindung (IV) oder die Verbindung (V) in reiner Form.

Die Verbindung der Formel (V), d. h. das 3,5-Dihydroxy-2-hexylhexadecanoyI-i3-Iacton, kann auch so hergestellt werden, daß man die Verbindung der Fo-mel (IV), nämlich das 3J>-Dihydroxy-2-hexyIhexadeca-7,10-dienoyl-13-lacton, in Gegenwart eines Hydrierungskataiysators reduziert

Die Reduktion des S^-Dihydroxy^-hexylhexydeca-7,1Q-dienoyi-l,3-lacton mit Wasserstoff wird in Gegenwart eines bekannten Hydrierungskatalysators wie Platinoxid oder PaJladiummetall durchgeführt, und zwar in derselben Weise wie sie vorstehend bereits beschrieben worden ist Die Ausgangsverbindung der Forme! (IV) wird in einem organischen Lösungsmittel wie einem niederen Aikanoi gelöst und die entstandene Lösung wird mit einer ausreichenden Menge eines Hydrierungskatalysators versetzt Die Mischung wird

dann in einem Wasserstoffstrom oder in einer Parr-Apparatur reduziert; die Zeitspanne für die Reduktion beträgt 2 bis 12 Stunden. Man erhält auf diese Weise das 3^-Dihydroxy-2-hexylhexadecanoyl-13-lacton als Hydrierungsprodukt. Lag das als Ausgangsmaterial eingesetzte 33-Dihydroxy-2-hexylhexadeca-7,I0-dienoyl-1,3lacton in reinem Zustand vor, so ist eine Reinigung des anfallenden Hydrierungsproduktes nicht erforderlich.

ίο Die Esterase inhibierende Wirkung der erfindungsgemäßen neuen Verbindungen kann mit Hilfe der modifizierten Methode nach Yasunori Kobayashi bestimmt werden; diese Methode ist beschrieben in der japanischen Veröffentlichung »Seikagaku«. Band 36,

r> Seite 335(1964). Bei dieser Methode wird ein im Handel erhältliches, rohres Lipasepräparat, welches aus Schweinepankreas gewonnen worden ist, in einer Konzentration von 0,5 Gew.-% in einer auf pH 7,0 (7(»niifferten 0.05 m Phnsnhallösiinl· Hip aiirh pinpn

Polyäthylenglykolalkylphenyläther als Emulgator (beispielsweise das Handelsprodukt Triton X-100®) enthält, gelöst. 0,03 ml dieser Lipaselösung, 2,92 ml auf pH 7,0 gepufferte 0,05 m Phosphatlösung und 0,025 ml einer Lösung, die eine Probe der zu prüfenden neuen Verbindung enthält wurden vermischt und die entstandene Mischung (2,975 ml) wurde 3 Minuten auf 20^cC erwärmt und dann mit 0,025 ml einer Lösung vermischt, die 10 mf p-Nitrophenylacetat pro ml Methanol enthielt so daß eine Umsetzung des p-Nitrophenylacetats mit der Lipase eintreten konnte. Nachdem die enzymatische Reaktion bei 20⁰C in etwa 30 Minuten abgelaufen war, wurde die Absorbanz (a)der entstandenen Reaktionslösung bei 400 nm gemessen. Weiterhin wurde die Absorbanz feiner Kontrollreaktionslösung ebenfalls bei 400 nm festgestellt; die Kontrollreaktionslösung war in einem Blindtest gewonnen worden, bei welchem gepufferte 0,05 m Phosphatlösung verwendet worden war. die die zu prüfende neue Verbindung nicht enthielt. Der prozentuale Grad der Inhibierung der Esterase wurde nach folgender Gleichung bereichnet:

Inhibierung (%) =

{b- a)

x 100

Nach dieser Prüfmethode wies das Tetrahydroesterastin in reiner Form eine Potenz von ID» auf, d. h. eine Dosis, die eine 50%ige Inhibierung der Esterase vi bewirkte, lag bei 0,0033 μg/ml.

S.S-Dihydroxy^-hexylhexadeca^.iO-dienoyl-LV cton und 33-Dihydroxy-2-hexylhexadecanoyI-13-lacton zeichneten sich durch eine Potenz aus, daß ihr ID» d. h. ihre 50%ige Hemmung der Esterase, bei 0,007 u£/ml bzw. 0,009 μg/ml lag. Zum Vergleich konnte festgestellt werden, daß das farblose Pulver des Stammesterastins eine Potenz aufwies, daß der ID₅O-Wert bei 0,0002 μ^/ΐηΙ lag.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen zeichen nen sich alle durch eine erheblich höhere Wirkung bei der Inhibierung der Cholesterinesterase aus als das Esterastin selbst Bei der Bestimmung der Inhibierung der Cholesterinesterase durch die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen unter Verwendung von Cholestee5 rinacetat als Substrat und Cholesterinesterase als

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ILagltlkllUVItE L~U£.J1I1 UIIVI VJLI I LOLStUtIUtIg UU IVICIIgC des bei der Umsetzung des Substrates mit dem Enzym bei 37⁼C in drei Minuten freigesetzten Cholesterins

konnte festgestellt werden, daß Tetrahydroesterastin eine etwa dreifach höhere Cholesterinesterase inhibierende Wirkung aufweist als Esterastin; bei 3,5-Dihydroxy-2-hei(ylhexadeca-7,10-dienoyl-13-lacton ist die Cholesterinesterase inhibierende Wirkung etwa 20mal höher als beim Esterastin und etwa 7mal höher als beim Tetrahydroesterastin.

'■i%e erfindungsgemäßen neuen Verbindungen zeichnen sich alle durch eine sehr niedrige Toxizität aus, was aus der Tatsache hervorgeht, daß bei einer Dosis von 250 mg pro Kilogramm (bei intraperito-fealer Injektion) bei Mäusen überhaupt keine Toxizität beobachtet wurde. Es ist bekannt, daß Paradoxon und Diisopropylfluorphosphat die Esterase von Schweinepankreas inhibieren; diese bekannten Verbindungen sind jedoch stark toxisch. Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen sind dagegen nicht toxisch und besitzen dennoch ein? stark inhibierende Wirkung gegen Schweinepanl>p«ir>» Ι·*»αρο»η. Λ\η tnUiUinfnnrJn U/it-lumn 1*4- ~n ***-.» Π r\i vujv uijtwi ui>bj wiw iiiniLitvt viiuv π ii nuiig ui jv ει v/u.

daß die Verbindung (III) gemäß vorliegender Erfindung selbst in einer Menge von 6,4xlO-^qm und die Verbindungen (IV) und (V) gemäß vorliegender Erfindung noch in Mengen von 2xlO~⁸m noch inhibierend wirken, d. h. eine 50%ige Inhibierung der Esterase bewirken, wenn die Prüfung mit p-Nitrophenylacetat als Substrat durchgeführt wird.

Wegen ihrer Esterase inhibierenden Wirkung können die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen sowie das Esterastin selbst zur chemotherapeutischen Behandlung vieler Krankheiten wie allergische Kontaktdermaiitis, sy .lematischer Lupus erythematosus, autoimmune hämolytische Anämie, Periarteriitis nodosa, Myasthenie, Arthritis, Rheumatismus und multiple Sklerose verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich weiterhin als Mittel zur Unterdrückung des Abstoßungssyndrom bei chirurgischen Eingriffen wie Transplantationen von inneren Organen wie Herz und Niere. Wegen der Cholesterinesterase inhibierenden Wirkung können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch als Mittel zur chemotherapeutischen Behandlung von Thrombosen und Arteriosklerose verwendet werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1
Herstellung von Tetrahydroesterastin

95 mg Esterastin wurden in 10 ml Methanol aufgenommen. Diese methanolische Lösung wurde mit 20 mg Platinoxid als Hydrierungskatalysator versetzt Die Mischung wurde dann bei Umgebungstemperatur mit Wasserstoff gas bei einem Druck von 1,4 kg/cm² 2 Stunden lang hydriert Nach Beendigung der Reduktion wurde das Reaktionsgemisch filtriert, um das Platinoxid zu entfernen. Das Filtrat (die Reaktionslösung) wurde zur Trockne eingeengt, wobei man 96 mg Tetrahydroesterastin als farbloses Pulver erhielt Dieses gab bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel einen Einzel-Heck.

Die Tatsache, daß das hergestellte Tetrahydroesterastin bei der Dünnschichtchromatographie einen EinzelHeck ergab, wurde hier — wie auch bei den folgenden Beispielen — als Beweis dafür genommen, daß das Produkt eine 100%ige Reinheit aufwies.

Das gewonnene Tetrahydroesterastin lag in Form eines farblosen Pulvers mit F 1024 - ~ 104,0° C vor.

Gewichtsanalyse für C
Berechnet:

C 65,88; H 9,81: N 5,49; O 18,82%;
Gefunden:
-. C 65,84; H 9,71; N 4,93; O 18,12%;

Molekulargewicht

(bestimmt durch Massenspektrometrie): 510
Charakteristische Absorptionsbanden im Infrarotin Absorptionsspektrum (in KBr-Tablette) bei 3320, 2920, 1830, 1720, 1650, 1610, 1545, 1185, 1120, 885 und 720 cm-'.

Absorption im kernmagnetischen Resonanzspektrum (in Deutero-chloroform, oppm) bei 3,2 (2-CH), 4,34 r. (3-CH), -2,1 (4-CHj), 5,02 (5-CH), 1,26 (6-15-CH₂, 2'-5'-CH₂), 0,88 (16-CHj, 6'-CH₃), - 1,76 (1'-CH₂), 4,72 (2"-CH), 2,76 und 2,98 (3"-CH₂), 6,78 (2"-NH), 2,03 (2"-CDCH,), 5,44 und 5,80(3"-CONH₂).

\.„.„ wηj-i

;ü!ze für die Strukturformel III fürTetraliydroesterastin.

Beispiel 2
Herstellung von Tetrahydroesterastin

2) Eine Lösung von 10 mg Esterastin in 0,5 ml 99%igem wäßrigen Methanol wurde in Gegenwart von 2 mg Platinoxid als Katalysator bei Umgebungstemperatur und bei einem Wasserstoffdruck von 1,4 kg/cm² 2 Stunden hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert,

i" um das Platinoxid zu entfernen, und das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 9,7 mg eines farblosen Pulvers. Dieses Pulver wurde über eine Säule mit Silikagel Chromatographien, wobei ein Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und Chloro-

!5 form (1:1) zum Eluieren verwendet wurde. Das Eluat wurde in 1,7-ml-Fraktionen aufgefangen und die Fraktionen Nr. 15 bis 24 wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt. 5,9 mg Tetrahydroesterastin wurde in Form eines farblosen Pulvers gewonnen, welches hinsichtlich Reinheit und Gewichtsanalyse mit dem Produkt von Beispiel 1 identisch war.

Auch die übrigen Analysenwerte waren in Übereinstimmung mit dem Produkt von Beispiel 1.

Das für die Umsetzung gemäß Beispielen 1 und 2

1i benötigte Esterastin wurde wie folgt hergestellt:

(A) Ein Kulturmedium (300 1), welches 14% Glyzerin, 1,5% Baumwollsamenmehl, 03% Natriumchlorid, 0,2% L-Asparagin und 0,005% eines Antischaummittels, z. B. eine Polyoxyalkylenverbindung, enthielt, wurde in

Vi einem Behälter aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 5701 eingefüllt und dann durch Erhitzen auf 120° C 20 Minuten sterilisiert Das sterilisierte Kulturmedium wurde mit 301 einer Impfkultur geimpft Die Kultur war durch Züchten des Stammes Streptomyces MD4-C1 (FERM-P 3 723 oder ATCC Nr. 31 336) bei 27⁰C unter Belüftung und Rühren in 2 Tagen erhalten worden. Das geimpfte Kulturmedium wurde 48 Stunden bei 27° C bebrütet, wobei die Belüftung 300 l/Minute betrug und die Rührgeschwin-

digkeit auf 200 Umdrehungen pro Minute eingestellt war. Die Gärbrühe, die auf diese Weise erhalten wurde, wurde filtriert, so daß man 34,2 kg eines Filterkuchens gewann, der das Mycel enthielt Dieser Filterkuchen wurde zweimal mit je 1001 Äthanol extrahiert Die vereinigten äthanolischen Extrakte wurden unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 61 eingeengt Die konzentrierte Lösung wurde zweimal mit je 61 Butylacetat extrahiert Die ButylacetatextraJcte wurden

vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 128,2 g Esterastin als pulverförmiges Rohprodukt. Die Potenz dieses Präparates entsprach einem IDso-Wert von 0,08 mcg/ml.

(B) Das rohe pulverförmige Esterastin (128,2 g) wurde zur Reinigung in 300 ml Chloroform gelöst. Die entstandene Lösung wurde über eine Kolonne mit 13 kg Silikagel geleitet. Die Silikagelkolonne wurde mit 101 Chloroform und danach mit 101 Chloroform-Methanol (Volumenverhältnis 100:1) gewaschen und danach mit Chloroform-Methanol (Volumenverhältnis 80 : 1) eluiert. Die aktiven Fraktionen (2500 ml) des Eluates wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 4,83 g eines braungefärbten pulverförmigen Rohproduktes, welches eine Potenz zeigte, die einem IDw-Wert von 0,002 mcg/ml entsprach. Dieses pulverförmige Rohprodukt wurde in 20 ml Methanol aufgenommen und die

über eine 2-!-Ko!onns

die

dem Produkt Sephadex LH-20®, welches mit Methanol gequollen worden war, gefüllt war. Die Kolonne wurde dann mit 4 I Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise ein hellgelb gefärbtes Pulver in einer Ausbeute von 656 mg(ID5o = 0,0O04 mcg/ml). Das Pulver wurde in 5 ml Äthylacetat aufgenommen und die gewonnene Lösung wurde über eine Kolonne mit 250 g Silikagel geleitet, um das Esterastin zu adsorbieren. Die Silikagelkolonne wurde mit Äthylacetat entwickelt und die aktiven Fraktionen des Eluates wurden vereinigt (1000 ml) und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 351 mg Esterastin in Form eines farblosen Pulvers, dessen Potenz einem IDw-Wert (gegen Esterase) von 0,0002 mcg/ml entsprach. F: 90 bis 95° C. (α) +11° (c = 1; Chloroform).

Beispiel 3

Herstellung von 3,5-Di!?7droxy-2-hexylhexadeca-7,10-dienoyl-13-lacton

275 mg Esterastin wurden in 55 ml einer Lösung aus 0,01 η Natriumhydroxid in einer Mischung aus Wasser-Dioxan (Volumenverhältnis 1 :1) gelöst Die entstandene Lösung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur geruht, damit die Hydrolyse des Esterstins ablaufen konnte. Das Reaktionsgemisch wurde dann dreimal mit je 55 ml η-Hexan extrahiert Die n-Hexanextrakte wurden vereinigt und eingeengt Der verbleibende ölige Rückstand (150 ml), der aus dem n-Hexan-löslichen Material bestand, wurde über eine Kolonne mit Silikagel (1,0 χ 15 cm) chromatographiert, wobei ein Gemisch aus η-Hexan und Chloroform (3 :1) als Laufmitte! verwendet wurde. Das Eluat wurde in 5 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 56—65 wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft Man erhielt auf diese Weise 140 mg eines farblosen Öles, welches im wesentlichen aus 3^-Dihydroxy-2-hexylhexadeca-7,10-dienyl-13-lacton bestand Das Produkt wies eine spezifische optische Drehung von («)? —10° (c=l; Chloroform) auf.

Gewichtsanalyse für C22H38O3:

Berechnet: C 75,42; H 1035; O 13,71%;
Gefunden: C 75,76; H 10,86; O 14,40%;

Molekulargewicht

(bestimmt durch Massenspektrometrie): 350

Charakteristische Absorptionsbanden im Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr-Tablette) bei 3500, 3000, -> 2930,1820,1465,1380,1122,1070 und 880 cm - ·.

Absorption im kernmagnetischen Resonanzspektrum (in Deutero-chloroform, <5ppm) bei 3,32 (2-CH), 4,47 (3-CH), -2,0 (4-CH₂, 12-CH₂), 3,79 (5-CH), 2,32 (6-CH₂), 2,80 (9-CH₂), 5,15-5,72 (7,8,10,11-CH)₁ -1,3 (13-15-in CH₂, 2'-5'-CH₂), 0,89 (16-CH₃, 6'-CH₃), 1,81 (I¹CH₂) und -2 (OH)(vergleiche vorstehende Formel I).

Diese Werte sind eine Stütze für die Strukturformel IV.

Dieses Produkt ergab einen Einzelflech bei Rf 0,73, υ wenn man es der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unterwarf und zum Entwickeln ein Lösungsmittelgemisch aus η-Hexan, Chloroform und Äthylacetat im Verhältnis 5:5:1 benutzte.

>o B e i s ρ i e I 4

Herstellung von
3,5-Dihydroxy-2-hexylhexadecanoyl-l. 3-lacton

212 mg Tetrahydroesterastin wurden im 46 ml einer

r> Lösung aus 0,01 π Natriumhydroxid in einer Mischung aus Wasser und Dioxan (1 : 1) suspendiert. Die entstandene Mischung wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt, damit die Hydrolyse des Tetrahydroesterastins erfolgen konnte. Danach wurde

)■) das Reaktionsgemisch dreimal mit je 50 ml n-Hexan extrahiert Die gewonnenen n-Hexanextrakte wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Der verbleibende feste Rückstand, der aus dem n-Hexan-löslichen Material (156 mg) bestand, wurde über eine Silikagelko-

)i tonne (l,0x 15 cm) chromatographiert, wobei als Laufmittel ein Lösungsmittelgemisch aus η-Hexan und Chloroform (3:1) benutzt wurde. Das Eluat wurde in 2-ml-Fraktionen aufgefangen und die Fraktionen 24 — 41 wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt.

Man erhielt so 106 mg eines farblosen Pulvers, welches aus 3^-Dihydroxy-2-hexylhexadecanoyl-l,3-'icton bestand. Dieses Produkt ergab einen Einzelfleck bei Rr 0,74 bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel, wenn mit einem Lösungsmittelgemisch aus η-Hexan, Chloroform und Äthylacetat (5 :5 :1) entwickelt wurde.

Der Schmelzpunkt der Substanz lag bei etwa 64,5 —65^° C. Die optische Drehung wurde mit (λ)? - 15° (C= 1 !Chloroform)gemessen.

. Gewichtsanalyse für C₂₂H^Oj:

Berechnet: C 74,57; H 11,86; 0 13,55%;
Gefunden: C 74.22; H 1134; O 13,76%;

Charakteristische Absorptionsbanden im Infrarotabsorptionsspektrum (KBr-Tablette) bei 3550, 2900, 1815, 1470,1390,1135,1085,835 und 720 cm-'.

Absorption im kernmagnetischen Resonanzspektrum (in Deutero-chloroform. oppm) bei 331 (2-CH), 4,46 (3-CH), 1,7-2,6 (4-CH₂, 6-CH₂, 1'-CH₂), 3,76 (5-CH), 13 (7 ~ 15-CH₂,2' - 5'-CH₂), 0,89 (I6-CH3,6'-CH₃).
bo Diese Werte sind eine Stütze für die Strukturformel V.

Beispiel 5

Herstellung von
33-Dihydroxy-2-hsxyihe5adecai5oy!-!3-!actor.

140 mg d.es gemäß Beispiel 4 gewonnenen 3,5-Dihydroxy-2-hexylhexadeca-7,liD-dienoyl-13-lactons wurden

ir 10 ml Methanol gelöst und die entstandene methanolische Lösung wurde mit 40 mg Platinoxid als Hydrierungskatalysator vermischt Die gewonnene Mischung wurde der Hydrierung in einer Parr-Apparatur unterworfen, wobei mit Wasserstoff von 1,4 kg/cm² bei Umgebungstemperatur gearbeitet wurde. Die Umsetzung erforderte 2 Stunden. Das Reaktionsgemisch wurde danach filtriert um das Platinoxid zu entfernen. Das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt wobei 141 mg 3,5-Dihydroxy-2-hexylhexadecanoyl-13-lacton als farbloses Pulver zurückblieben.

Das Produkt ergab einen Einzelfleck bei Rt 0,74 bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel, wenn mit einem Lösungsmittelgemisch aus η-Hexan, Chloroform und Äthylacetat (5:5:1) entwickelt wurde. Das kernmagnetische Resonanzspektnim des Produktes zeigte das vollständige Verschwinden der Doppelbindungen der Ausgangsverbindung an.

Das gewonnene Produkt war mit dem Produkt von

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Gewichtsanalyse und der spezifischen optischen Drehung angezeigt wurde.

Beispiel 6

Eine Lösung von 10 mg Esterastin in 1 ml Methanol wurde mit 2 mg Palladium-Schwarz vermischt und die Mischung wurde mit Wasserstoffgas bei 1,41 kg/cm² 2 Stunden bei Umgebungstemperatur in einer Parr-Apparatur hydriert. Nach Abschluß der Reduktion wurde das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt; man erhielt so 9,8 mg eines pulverförmigen Produktes. Dieses Pulver wurde über eine Kolonne (1x12 cm) mit Silikagel gereinigt wobei zum Entwickeln ein Gemisch aus Athylacetat-Chloroform (1:1) verwendet wurde; das Eluat wurde in 1,7-ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 16 bis 25 wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt Man erhielt so 5,9 mg Tetrahydroesterastin in Form eines farblosen Pulvers. Dieses Produkt war identisch mit dem Produkt von Beispiel 2.

Beispiel 7

Eine Lösung von 10 g 34-Dihydroxy-2-hexylhexadeca-7,10-diencarbonsäure-13-lacton in 1 ml Methanol wurde mit 2 mg Palladium-Schwarz vermischt und die Mischung wurde in der in Beispiel 6 beschriebenen Weise hydriert Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt wobei man 9,5 mg eines pulverförmigen Produktes erhielt Dieses Produkt wurde über eine Kolonne mit Silikagel (1x12 cm) gereinigt wobei zum Entwickeln Chloroform-Methanol (100 :1) verwendet wurde. Das Eluat wurde in 1,4-ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 35 bis 47 wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt Man erhielt so 7,2 mg 3,5-Dihydroxy-2-hexyI-hexadecancarbonsäure-13-Iacton als farbloses Pulver; das Produkt wer mit dem Produkt von Beispiel 6 identisch.

Beispiel 8

Eine Lösung von 107 mg Esterastin in 25 ml einer '» Lösung, welche 0,01 η Kaliumhydroxid in Wasser-Dioxan (1:1) enthielt, wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt Die Reaktionslösung wurde anschließend 3mal mit je 25 ml η-Hexan extrahiert; die Extrakte wurden vereinigt und eingeengt wobei man

in 47,8 mg eines öligen Rückstandes erhielt Dieser Rückstand wurde über eine Kolonne mit Silikagel (I χ 12 cm) gereinigt, wobei zum Entwickeln ein Gemisch aus n-Hexan-Chloroform (3:1) verwendet wurde. Das Eluat wurde in 1,9-ml-Fraktionen aufgefan- > gen. Die Fraktionen Nr. 31 bis 51 wurden vereinigt und eingeengt. Man erhielt so 42,2 mg eines farblosen Öles, welches sich als 3,5-Dihydroxy-2-hexylhexadeci.n-7,10-diencarbonsäure-13-lacton erwies und mit dem Produkt von Beispiel 4 identisch war.

Beispiel 9

Eine Lösung von 76,5 mg Tetrahydroesterastin in 18 ml einer Lösung, welche 0,01 η Kaliumhydroxid in

2i 18 ml Dioxan-Wasser (1 :1) enthielt wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde 3mal mit η-Hexan extrahiert; die Extrakte wurden vereinigt und eingeengt. Man erhielt so 51,6 mg eines pulverförmigen Produktes. Dieser pulverförmige

so Rückstand wurde chromatographisch gereinigt und zwar in der in Beispiel 9 angegebenen Weise. Die Fraktionen 27 bis 43 des Eluates wurden vereinigt und eingeengt Man erhielt so 39,2 mg 3,5-Dihydroxy-2-hexylhexadecancarbonsäure-l^-lacton in Form eines farblosen Pulvers, welches mit dem Produkt von Beispiel 5 identisch war.

Zusammenfassung

Die Erfindung betrifft neue, physiologisch wirksame Derivate des Esterastins, welche die Aktivität von Esterase, ähnlich wie das Stammesterastin selbst inhibieren und die sich darüber hinaus durch eine höhere inhibierende Wirkung gegen Cholesterinrsterase aus-3 zeichnen als sie das Stammesterastin aufweist Bei den neuen Derivaten handelt es sich

1. um das Tetrahydroesterastin, welches durch katalytische Hydrierung von Esterastin hergestellt wird;

so 2. um das 1,3-Lacton der 3^-Dihydroxy-2-hexylhexadeca-7,10-diencarbonsäure, welches durch alkal,-sehe Hydrolyse von Esterastin gewonnen wird;

3. um das 13-Lacton der 3,5-Dihydroxy-2-hexylhexadecancarbonsäure, welches entweder durch alkalisehe Hydrolyse von Tetrahydroesterastin oder durch katalytische Hydrierung des bei der alkalischen Hydrolyse von Esterastins anfallenden Produktes gewonnen wird.

Claims

Patentansprüche:

1. 1,3-Lactone der allgemeinen Formel

CH₁-(CH₂J₄-CH = CH-CH₂-CH = CH-CH₂-CH-CH₂-CH-CH-(

O O C =

C = O (H)

CHNHCOCH,

CH₂CONH₂

R-CH-CK₁-CH-CH-(CH₂)S-Ch₃ (I)

I "Il

OR' O C =

in welcher R die Gruppe j|

CH₃-(CH₂),-CH = CH-CH₂-CH = CH-CH₂- oder die Gruppe

CH₃-(CH₂),-,-bedeutet und R' ein Wasserstoffatom oder die Gruppe -C-CH-CH₂-CONH₂

Il !

O NHCOCH₃ darstellt, mit der Maßgabe, daß R die Gruppe

CH₃- (CH₂),,,-bedeutet, wenn R' die Gruppe -C-CH-CH₂CONH₂

Il I

O ■ NHCOCH₃

darstellt, und daß R die Gruppe

CH₃-(CHj)₄-CH = CH-CH₂-CH = CH-CH₂-

CH₃ — (CH₂),„—

bedeutet, wenn R' ein Wasserstoffatom ist.

2. Verfahren zur Herstellung der 1,3-Lactone gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Esterastin der Formel

entweder

a) in einem niederen Alkanol in Gegenwart von Platinoxid oder Palladium als Katalysator mit Wasserstoff bei Zimmertemperatur zu Tetrahydroesterastin der Formel

CH₃-(CHJ₁₀-CH-CH₂-CH-CH-(CH₂)S-CHj

O O C =

C = O (III)