DE2834568B2 - Verfahren zur Messung der elektrophoretischen Beweglichkeit von Teilchen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der elektrophoretischen Beweglichkeit von Teilchen, bei dem an eine in einer Elektrophoresekammer befindliche Flüssigkeitsprobe eine Spannung angelegt, die Probe mikroskopisch betrachtet, videotechnisch aufgenommen, auf einem Monitor abgebildet und die Zeit gemessen wird, in welcher die jeweils ausgewählten Teilchen der Probe eine vorbestimmte Distanz zwischen zwei gewählten Markierungen durchwandern.

Es ist bereits ein Verfahren und eine Vorrichtung bekannt (Hannig, K.; Wirth, U.; Meyer, B.-M.; Zeiller, K.; »Theoretical and Experimental Investigations of the Influence of Mechanical and EIektrokinetic Variables on the Efficiency of the Method«, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem., Bd. 356), mittels der eine große Zahl von Zellen oder Partikeln, die als Strahl kontinuierlich in einen laminaren Puffersfrom gegeben und nach Ablenkung in einem senkrechten elektrischen Feld in einer endlichen Zahl von Gefäßen aufgefangen, mengenmäßig erfaßt und für weitere Untersuchungen verwendet werden können. I5ie Bestimmung der elektrophoretischen Beweglichkeit der Partikel erfolgt über die Auslenkung der zu untersuchenden Partikel in einem konstanten Laminarstrom.

Die Nachteile des Verfahrens bzw, der Anordnung liegen in der erforderlichen hohen Konstanz des Pufferund Probenstroms, in dem geringen Probendurchsatz

sowie in der Verwendung eines niederionischen Puffers, der die mehrmalige Untersuchung einschränkt

Weiter ist ein Verfahren zur Bestimmung der elektrophoretischen Beweglichkeit von einzelnen Partikeln aus der Dopplerverschiebung der Frequenz des an

ίο den Partikeln gestreuten Laserlichtes bekannt (Uzgiris, E. E.[1972], Optics Commun 6).

Der bei diesem Verfahren aufzubringende Aufwand zur Analyse des gestreuten Laserlichtes (Vielkanalanalysator etc.) ist sehr hoch.

Außerdem ist ein Verfahren bekannt (Vr&nsky, V. K.; »Die Zellelektrophorese«, Fortschritte der experimentellen und theoretischen Biophysik, Band 18), bei dem die elektrophoretische Beweglichkeit von einzelnen mikroskopisch kleinen Partikeln durch Zeitmessung ermittelt wird. An die Flüssigkeitsprobe in einer Elektrophoresekammer wird eine Spannung angelegt Mittels mikroskopischer Betrachtung der Probe wird manuell (z. B. mit Stoppuhr) die Zeit gemessen, die ein betrachtetes ausgewähltes Teilchen zum Durchwandern einer bestimmten vorgewählten Wegstrecke benötigt

Nachteilig ist, die subjektive Fehlerbehaftung des Meßergebnisses durch den Zeitnehmer. Diese subjektive Beeinflussung erfolgt einerseits durch die visuelle Betrachtung und manuelle Zeitnahme, andererseits durch die dem Beobachter überlassene Entscheidung über die Auswahl der zu untersuchenden Teilchen zur Zeitmessung. Zur Reduzierung des auftretenden subjektiven Meßfehlers sind Meßreihen notwendig, aus denen der Mittelwert gewonnen werden muß, wodurch der Zeitaufwand der Messungen ansteigt Gleichermaßen ist der hohe bedienungstechnische Aufwand von Nachteil.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mit möglichst einfachen Mitteln ein Verfahren zur zeitlichen Messung der elektrophoretisch^,··· Beweglichkeit einzelner ohne subjektive Beeinflussung auf ausgewählte elektrophoretisch auswertbarer Teilchen zu schaffen, das eine genaue Zeitmessung der Bewegung der Teilchen ohne subjektive Meßfehler beinhaltet Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren zur Messung der elektrophoretischen Beweglichkeit von Teilchen der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das bei der videotechnischen Aufnahme der Probe erzeugte BAS-Signal nach Durchlaufen einer Filterkette und nach anschließender Digitalisierung durch Vergleich mit einer einstellbaren Referenzspannung mit Impulsen logisch verknüpft wird, die gleichzeitig zum Monitor gelangen und von denen einer durch Zeitverzögerung aus dem Bildsynchronimpuls des BAS-Signals und die anderen zwei Impulse durch unterschiedliche Zeitverzögerung aus dem Zeilensynchronimpuls des BAS-Signals gewonnen werden, und daß durch das erste der durch die logische Verknüpfung entstandenen Signale, die jeweils bei gleichzeitigem Erscheinen eines der beiden zeitverzögerten Zeilensynchronimpulse, des zeitverzögerten Bildsynchronimpulses und eines Impulses des digitalisierten BAS-Signals auftreten, ein Zählvorgang ausgelöst wird, durch ein weiteres durch die logische Verknüpfung erzeugtes Signal gestoppt wird.

Es ist vorteilhaft, wenn ab Beginn des Zählvorgangs der durch einen zeitverzögerten Zeilensynchronimpuls verursacht wurde, jeder zeitverzögerte Zeilensynchron-

impuls dieser Zeitverzögerung und bei Beendigung des Zählvorgangs jeder zeitverzögerte Zeilensynchronimpuls unterdrückt wird. Es ist weiterhin vorteilhaft, wenn die zwei Zeitverzögerungen des jeweils zeitverzögerten Zeilensynchronimpulses sowohl gemeinsam als auch einzeln eingestellt werden.

Außerdem ist es noch vorteilhaft, wenn die Zeitverzögerung und die Impulsdauer des zeitverzögerten Bildsynchronimpulses eingestellt werden.

Von Vorteil ist auch, wenn die aus den Bild- und Zeilensynchronimpulsen erzeugten Signale den Monitor hell-dunkel steuern und als vertikale sowie horizontale Markierungslinien erscheinen.

Vorteilhaft ist weiterhin, wenn die Zählimpulse digital erfaßt und ausgewertet werden. Aus den Video-Synchronimpulsen werden durch Zeitverzögerung periodische Signale erzeugt, die auf dem Monitorbild einen einstellbaren rechteckfönnigen Bildausschnitt darstellen, welcher der Zeitmessung zugrunde gelegt wird, d. h, es wird, sofern sich ein elektrophoretisch auswertbares Teilchen der zu analysierenden Probe innerhalb dieses Bildausschnittes bewegt, die Zeit gemessen, die das Teilchen zum Durchwandern von einer vertikalen Begrenzung des Bildausschnittes zur anderen benötigt Die Zeitmessung erfolgt durch Start und Stop eines Zählvorgangs, dessen Zähümpulse digital erfaßt und rechentechnisch bearbeitet werden können. Start und Stop des Zählvorgangs werden durch die logische Verknüpfung der zeitverzögerten Video-Synchronimpulse mit dem digitalisierten BAS-Signal der videotechnischeu Aufnahme der Probe ausgelöst Um zu gewährleisten, daß Start und Stop des Zählvorgangs an unterschiedlichen vertikalen Begrenzungen des Bildausschnittes auf dem Monitor verursacht werden, werden diejenigen zeitverzögerten Zeilensynchronimpulse, die den Zählvorgang ausgelöst haben, vom Beginn der Zählung ab unterdrückt Durch einen Abgleich der Referenzspannung beim Vergleich mit dem BAS-Signal zur Digitalisierung wird eine Auswahl derjenigen Teilchen der Probe bewirkt, die zur elektrophoretischen Auswertung herangezogen werden.

Die Erfindung soll nachstehend anhand einer in der Zeichnung dargestellten Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens näher erläutert werden. Eine Videokamera 1 ist über einen Trennverstärker 2 und über einen Modulator 3 mit einem Monitor 4 verbunden. Gleichermaßen steht die Videokamera 1 über dem Trennverstärker 2, eine Filterkette 5 und einen mit einer Referenzspannung U_nI versehenen Komparator 6 mit einem ersten Eingang eines UND-Gliedes 7 in Verbindung, dessen zweiter Eingang mit dem Ausgang eines ODER-Gliedes 8 gekoppelt ist. Ein Eingang des ODER-Gliedes 8 ist mit dem Ausgang eines UND-Gliedes 9, der andere Eingang des ODER-Gliedes 8 mit dem Ausgang eines UND-Gliedes 10 verbunden. Ein weiterer Ausgang des Trennverstärkers 2 ist über ein Amplitudensieb 11 auf einen Impulsverteiler 12 geführt, dessen erster Ausgang mit einem Multivibrator 13 gekoppelt ist, dessen Ausgang mit zwei weiteren Multivibratoren 14,15 in Verbindung steht. Der zweite Ausgang des Impulsverteilers 12 ist über zwei in Reihe geschaltete Multivibratoren 16, 17 mit je einem Eingang der UND-Glieder 9, 10 verbunden. Der Ausgang des Multivibrators 14 ist auf einen zweiten Eingang des UND-Gliedes 9, auf einen Eingang des Modulators 3, auf einen ersten Eingang eines ODER-Gliedes 18 sowie auf einen ersten Eingang eines UND-Gliedes 19 geführt. In gleicher Weise besteht eine Kopplung des Ausgangs des Multivibrators 15 mit einem zweiten Eingang des UND-Gliedes 10, mit einem weiteren Eingang des Modulators 3, mit einem zweiten Eingang des ODER-Gliedes 18 sowie mit einem

■; ersten Eingang eines UND-Gliedes 20. Der Ausgang des Multivibrators 17 ist gleichfalls mit dem Modulator 3 und der Ausgang des UND-Gliedes 7 mit je einem Eingang der UND-Glieder 19, 20 verbundea Das UND-Glied 19 ist ausgangsseitig mit dem Rücksetzeingang eines Flip-Flops 21, das UND-Glied 20 hingegen mit dem Rücksetzeingang eines Flip-Flops 22 gekoppelt

Der Ausgang des Flip-Flops 21 ist auf einen dritten Eingang des UND-Gliedes 9 geführt, der Ausgang des Flip-Flops 22 auf einen dritten Eingang des UND-Gliedes 10. Das ODER-Glied 18 sowie das UND-Glied 7 sind ausgangsseitig mit je einem Eingang eines UND-Gliedes 23 verbunden, dessea Ausgang auf einen Rücksetzeingang eines Flip-Flops 24 geführt ist Die Setzeingänge der Flip-Flops 21,22 und 24 sind an einen Steuereingang E_a gelegt Der Ausfiuig des UND-Gliedes 7 ist mit je einem Eingang zweier UND-Glieder 25, 26 verbunden. Ein zweiter Eingang des UND-Gliedes 25 ist mit einem ersten Ausgang und ein zweiter Eingang des UND-Gliedes 26 ist mit einem zweiten Ausgang des Flip-Flops 24 gekoppelt Die Ausgänge der UND-Glieder 25, 26 sind auf zwei Eingänge eines Flip-Flops 27 geführt, dessen Ausgang mit einem Eingang eines UND-Gliedes 28 in Verbindung steht Der Ausgang des UND-Gliedes 28, an dessen zweiten Eingang ein Taktgenerator 29 angeschlossen ist ist mit einem Zähler 30 verbunden.

Die Videokamera 1, die das Videobild einer zu analysierenden flüssigen teilchenenthaltenden Probe,

die aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht in der Zeichnung dargestellt ist, für die Abbildung auf dem Bildschirm des Monitors 4 aufnimmt liefert ein BAS-Signal, dessen Signal-Rausch-Verhältnis in der Filterkette 5 verbessert wird. Dieses BAS-Signal wird im Komparator 6 digitalisiert indem es mit der Referenzspannung U_ltf verglichen wird, so daß die digitalen BAS-Impulse am UND-Glied 7 erscheinen. Im Amplitudensieb 11 werden aus dem in der Trennstufe 2 abgetrennten Videosignal die Synchronimpulse gewonnen und in dem nachfolgenden Impulsverteiler 12 in Bildsynchronimpuls (BSI) und Zeile.isynchronimpuls (ZSI) getrennt Der ZSI wird im Multivibrator 13 zeitverzögert. An den Multivibrator 13 schließen sich die beiden Multivibratoren 14,15 mit unterschiedlichen Verzögerungszeiten an, so daß an den Ausgängen der Multivibratoren 14, 15 jeweils zeitlich nacheinander zwei zeitverzöge.'te periodische Zeilensynchronimpulse anliegen, die über den Modulator 3 den Monitc; 4 hell-dunkel tasten uno auf dem Bildschirm des Monitors als zwei vertikale Markierungen sichtbar sind. Die Lage dieser Markierungen ist durch Variation der Zeitverzögerung des Multivibrators 13 gemeinsam und durch . Variation der Zeitverzögerungen der Multivibratoren 14,15 einzeln veränderbar. Diese vertikalen Markierungen begrenzen d^;e Distanz, die der Zeitmessung für die Teilchen in der zu analysierenden Probe zugrunde gelegt wird.

Der Bildsynchromipuls (BSI) am Ausgang des Impulsverteiler¹; 12 wird durch die Multivibratoren 16,

b¹) 17 zweimal zeitverzögert, so daß am Ausgang des Multivibrators 1Γ ein zeitverzögerter periodischer Bildsynchronimpuls (BSI) entsteht, dessen vordere Impulsflanke zeitlich durch den Multivibrator 16 und

dessen hintere Impulsflanke zeitlich durch den Multivibrator 17 bestimmt wird. Der zeitverzögerte BSI bewirkt ebenfalls über den Modulator 3 und die Hell-Dunkel-Steuerung des Monitors 4 auf dessen Bildschirm eine horizontale Markierung, deren Breite von der Zeitverzögerung des Multivibrators 17 abhängig ist. Durch Variation der Zeitverzögerung durch den Multivibrator 16 kann der Abstand der oberen Begrenzungslinie der horizontalen Markierung vom oberen Bildrand des Monitors 4 eingestellt werden. Die drei Markierungen auf dem Bildschirm des Monitors 4 stellen somit einen rechteckigen, beliebig einstellbaren Bildausschnitt dar, der zur erfindungsgemäßen Zeitmessung eines Teilchens der Probe verwendet wird, d. h., es wird die Zeit gemessen, die ein ausgewähltes Partikel für das Durchwandern des genannten Bildausschnittes zwischen den zwei vertikalen Markierungen benötigt. Die Zeitmessung erfolgt 'edoch nur, wenn sich das Teilchen !nn?rh?lb d?*· aurh horizontal begrenzten Bildausschnittes bewegt. Die Auswahl, welche Teilchen z. B. durch ihre GröBe und Helligkeit elektrophoretisch auswertbar sind, erfolgt durch den Abgleich der Referenzspannung Unt bei der Digitalisierung des BAS-Signals im Komparator 6.

Die in der Zeichnung dargestellte Anordnung wird durch einen Impuls am Steuereingang E„ mit dem Setzen der Flip-Flops 21, 22, 24 in Bereitschaft zur Messung gesetzt, was bedienungstechnisch nach Vorbereitung der zu analysierenden Probe erfolgen kann. In dieser Bereitschaftsstellung der Anordnung entsteht durch die Verknüpfung der UND-Glieder 7,9,10 sowie des ODER-Gliedes 8 am Ausgang des UND-Gliedes 7 ein Impuls, wenn gleichzeitig der zeitverzögerte BSI, einer der beiden zeitverzögerten Zeilensynchronimpulse sowie ein Impuls des digitalisierten BAS-Signals auftreten. In diesem Fall wird über das durch den gesetzten Flip-Flop 24 entriegelte UND-Glied 25 vom Ausgangsimpuls des UND-Gliedes 7 das Flip-Flop 27 gesetzt, welches die aus dem UND-Glied 28 bestehende Torschaltung entriegelt, so daß die Zählfrequenz des Taktgenerators 29 in den Zähler 30 eingezählt wird. Der nächste unter der obengenannten Bedingung am Ausgang des UND-Gliedes 7 erscheinende Impuls setzt über das ODER-Glied 18 sowie das UND-Glied 23 das Flip-Flop 24 zurück, welches über das UND-Glied 26 das Flip-Flop 27 rücksetzt. Durch diese Rücksetzung des Flip-Flops 27 wird das UND-Glied 28 gesperrt, der Zählvorgang des Zählers 30 wird abgebrochen. Der Zählerstand des Zählers 30 wird digital erfaßt und rechentechnisch, auf die gewünschte Zeitmessung bezogen, ausgewertet. Durch einen erneuten Impuls am - Steuerp'ngang Eu wird die Anordnung für die nächste Messung wiederum in Bereitschaft versetzt.

Der Zählvorgang des Zählers 30 wird bei Überschreiten einer der beiden vertikalen Markierungen durch ein ausgewähltes Teilchen der zu analysierenden Probe

ίο gestartet. Um zu verhindern, daß der Zählvorgang des Zählers 30 abgebrochen wird, indem ein Teilchen der Probe diejenige vertikale Markierung überschreitet, die ein Starten des Zählers 30 bewirkt hat, wird ab Beginn des Zählvorgangs jeder weitere zeitverzögerte ZSI der entsprechenden Zeitverzögerung unterdrückt. Zu diesem Zweck dient die Verknüpfung des Ausgangs des UND-Gliedes 7 mit den Ausgängen der Multivibratoren 14, 15 in den UND-Gliedern 19, 20 und den narhgeschalteten Flip-Flops 21. 22. die mit den UND-Gliedern 9,10 in Verbindung stehen. Der für den Beginn des Zählvorgangs am Ausgang des UND-Gliedes 7 entstehende Impuls setzt entweder über das UND-Glied 19 das Flip-Flop 21 zurück oder über das UND-Glied 20 wird das Flip-Flop 22 rückgesetzt.

Welches der beiden Flip-Flops 21, 22 rückgeselzt wird, ist davon abhängig, ob ein zeitverzögerter ZSI am Ausgang des Multivibrators 14 oder des Multivibrators 15 den Zählvorgang ausgelöst hat, d. h, welche vertikale Markierung auf dem Bildschirm des Monitors 4 von

jn einem Teilchen der Probe überschritten worden ist. Je nach Rücksetzen des Flip-Flops 21 oder 22 wird das UND-Glied 9 oder das UND-Glied 10 gesperrt, d.h. derjenige periodische zeitverzögerte ZSI des Multivibrators 14 oder 15, der den Zählvorgang ausgelöst und

!5 ein Setzen der Flip-Flops 21 oder 22 sowie 27 bewirk! hat, kann am Ausgang des UND-Gliedes 7 keiner Impuls zum Abbrechen des Zählvorgangs des Zählers 30 erzeugen. Ein Stoppen des Zählers 30 ist somit nur durch den anderen zeitverzögerten ZSI am Eingang eines der nicht durch einen der beiden Flip-Flops 21,22 gesperrten UND-Glieder 9, 10 bei gleichzeitigem

Vorhandensein des zeitverzögerten BSI sowie eines Impulses des digitalisierten BAS-Signals möglich. Den Multivibratoren 14, 15 sind zur Impulsformung

der zeitverzögerten Zeilensynchronimpulse in der Zeichnung nicht dargestellte Impulsformerstufen nachgeschaltet

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Messung der elektrophoreiischen Beweglichkeit von Teilchen, bei dem an eine in einer Elekirophoresekammer befindliche Probe eine Spannung angelegt, die Probe mikroskopisch betrachtet, videotechnisch aufgenommen, auf einem Monitor abgebildet und die Zeit gemessen wird, in welcher die jeweils ausgewählten Teilchen der Probe eine vorbestimmte Distanz zwischen zwei gewählten Markierungen durchwandern, dadurch gekennzeichnet, daß das bei der videotechnischen Aufnahme der Probe erzeugte BAS-Signal nach Durchlaufen einer Filterkette und nach anschließender Digitalisierung durch Vergleich mit einer einstellbaren Referenzspannung mit drei Impulsen logisch verknüpft wird, die gleichzeitig zum Monitor gelangen und von denen einer durch Zeitverzögerung aus dem Bildsynchronimpuls des BAS-Signals und die anderen zwei Impulse durch unterschiedene Zeitverzögerung aus dem Zeilensynehronnnpuls des BAS-Signals gewonnen werden, und daß durch das erste der durch die logische Verknüpfung entstandenen Signale, die jeweils bei gleichzeitigem Erscheinen eines der beiden zeitverzögerten Zeilensynchrcnimpulse, des zeitverzögerten Bildsynchronimpulses und eines Impulses des digitalisierten BAS-Signals auftreten, ein Zählvorgang ausgelöst wird, der durch ein weiteres durch die logische Verknüpfung erzeugtes Signal gestoppt wird.

2. Verfr.hren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ab Beginn des Zählvorgangs jeder zeitverzögerte Zesiensync.ironimpuls dieser Zeitverzögerung und bei Beendigung des Zählvorgangs jeder zeitverzögerte Zeileiit/nchronimpuls unterdrückt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei Zeitverzögerungen des jeweils zeitverzögerten Zeilensynchronimpulses sowohl gemeinsam als auch einzeln eingestellt werden.