DE2733561A1 - Immunitaetstest fuer thymopoietin - Google Patents
Immunitaetstest fuer thymopoietinInfo
- Publication number
- DE2733561A1 DE2733561A1 DE19772733561 DE2733561A DE2733561A1 DE 2733561 A1 DE2733561 A1 DE 2733561A1 DE 19772733561 DE19772733561 DE 19772733561 DE 2733561 A DE2733561 A DE 2733561A DE 2733561 A1 DE2733561 A1 DE 2733561A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- thymopoietin
- antigen
- antibody
- labeled
- complex
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
VON KREISLER SCHONWALD MEYER EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SE
PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler + 1973
Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln
Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. AIeIc von Kreisler, Köln
Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selting, Köln
5 KÖLN 1
DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF
25. Juli 1977 AvK/Ax
Sloan-Kettering Institute for Cancer Research York Avenue, New York N.Y., USA
, (02 21) 23 45 4i7 ß 9.8 Ä 5o/dW 7t.2U
des Thymus
Thymopoietin ist ein Polypeptidhormon/, das die Differenzierung von Prothymozyten zu Thymozyten auslöst und
ferner Nebenwirkungen auf die neuromuskuläre Transmission hat. Zwei Formen von Rinderthymopoietin, als
5 Thymopoietin I und II bezeichnet, wurden isoliert und wurden als immunologisch kreuzreaktiv nachgewiesen.
(Thymopoietin ist die neue Bezeichnung, die dem ursprünglichen Namen Thymin vorgezogen wird.) Siehe G. Goldstein,
Nature 247 (1974) 11.
; 10 Zwar kann Thymopoietin im biologischen Versuch unter
Ausnutzung entweder seiner Wirkungen auf die T-ZeIlendifferenzierung oder die neuromuskuläre Transmission
: nachgewiesen werden, jedoch sind diese Versuche kompli-
, ziert, zeitraubend und schwierig zu standardisieren.
: 15 Ferner lassen sich biologische Versuche im Gegensatz zum
! Immuntest, insbesondere zum Radioimmuntest, nicht leicht
j automatisieren, so daß sie durch klinische Laboratorien
1 oder andere Untersuchungsstellen nicht routinemäßig
' angewandt werden könnten, um große Zahlen von Proben ! 20 in wirtschaftlicher Weise zu untersuchen.
j Gegenstand der Erfindung ist ein Immunitätstest für
; Thymopoietin. Mit einem bevorzugten Immunitätstest
können Empfindlichkeiten bis hinab zu etwa 0,1 ng/ml
; des Hormons in Proben von biologischen Flüssigkeiten,
: 25 z.B. Plasma oder Serum, nachgewiesen werden. Der Test
j gemäß der Erfindung kann somit als diagnostischer
'■
Test für Krankheitszustände angewendet werden, bei
ι denen entweder erhöhte (Myasthenia gravis) oder ver-
709885/0872
minderte (Alterung, mangelnde Immunität oder immunologisch ausgelöste Krankheiten, Krebs, Unterernährung,
Infektionen u.dgl.) Konzentrationen von Thymopoietin vorliegen. Die beiden Formen von Thymopoietin sind bei
Immuntestmethoden nicht unterscheidbar.
Das zur Erzeugung des Antikörpers für den Test gemäß der Erfindung verwendete Antigen wird leicht erhalten, indem Thymopoietin in an sich bekannter Weise
an ein immunogenes Trägermaterial gebunden wird. Diese Bindung wird vorzugsweise durch Verwendung einer geeigneten bifunktionellen verbindenden Gruppe erreicht.
Bevorzugt als bifunktionelle verbindende Gruppe für diesen Zweck wird ein Cp-C^-Dialkanal, z.B. Glutaraldehyd.
Der hier gebrauchte Ausdruck "immunogenes Trägermaterial" bezeichnet Stoffe, die die Fähigkeit haben, unabhängig eine imrrunogene Antwort in einem Wirtstier
hervorzurufen, und die an Thymopoietin gekuppelt werden
können. Als Trägermaterialien eignen sich beispiels
weise Proteine, natürliche oder synthetische polymere
Verbindungen, beispielsweise Polypeptide, z.B. PoIylysin oder Copolymerisate von Aminosäuren und Polysaccharide. Besonders bevorzugt als Trägermaterialien
werden Proteine und Polypeptide, insbesondere Proteine.
Die Art des für die Herstellung eines Antigens gemäß der Erfindung verwendeten Proteinmaterials ist nicht
entscheidend wichtig. Als Beispiele von Proteinen, die sich für die Zwecke der Erfindung eignen, sind Serum- |
proteine von Säugetieren, z.B. menschliches γ-Globulin, I
menschliches Serumalbumin, Rinderserumalbumin, methyliertes Rinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin,
Rinder-Y-globulin und Pferde-y-globulin zu nennen. !
Weitere geeignete Proteine sind für den Fachmann nahe- > liegend. Im allgemeinen werden vorzugsweise, jedoch
709885/0872
nicht unbedingt Proteine verwendet, die für die Wirtstiere, in denen das erhaltene Antigen verwendet wird,
fremd sind·
Die Kupplung von Thymopoietin an das immunogene Träger-S material kann in bekannter Weise durchgeführt werden.
Bevorzugt werden Verfahren, bei denen die kovalente Bindung oder die physikalische Bindung, z.B. die elektrostatische Bindung, angewendet wird. Wenn beispielsweise die Kupplung durchgeführt wird, um eine kovalente
Bindung zu erreichen, kann eine bifunktionelle Bindungsgruppe, z.B. Glutaraldehyd, unter den von
S.Avrameas in Immunochemistry 6 (1969) 43 beschriebenen
Bedingungen verwendet werden.
ist die bevorzugte Art, die kovalente Bindung von
Thymopoietin an das immunogene Trägermaterial zu erreichen, jedoch können auch andere Bindungsverfahren
angewendet werden. Bei einer dieser Methoden kann die Carbodiimidtechnik, die beispielsweise in "Science",
wird, angewendet werden. In dieser Veröffentlichung wird
festgestellt, daß Carbodiimide verwendet werden können, um Materialien, die viele Arten von funktioneilen Gruppen enthalten, einschließlich Carbonsäuren und Amine zu
kuppeln. Eei dieser alternativen Methode verläuft die Kupplung unter Bildung von kovalenten Bindungen durch
Kupplung von Thymopoietin an das Protein über eine Amidbindung in der in dieser Veröffentlichung in j
"Science" beschriebenen Weise. Eine weitere geeignete ■
Methode der kovalenten Bindung, bei der Cyanate verwendet werden, wird in der US-PS 3 788 948 beschrieben.
Die Bindung von Thymopoietin an den Träger kann auch auf physikalischem Wege, z.B. durch elektrostatische ;
Bindung, nach bekannten Methoden erreicht werden. Bei j diesem Verfahren wird ein Komplex zwischen dem Träger :
709885/0872
und Thymopoietin gebildet. Es kann durchgeführt werden,
wie in "Methods in Immunology and Immunochemistry11,
herausgegeben von Curtis A.Williams, Band I, Academic Press 1967, beschrieben. Weitere Verfahren werden in
der US-PS 3 853 987 beschrieben.
Natürlich können auch andere bekannte Verfahren angewandt werden, um das Thymopoietin an den Träger zu
binden. ι
Die Antigene gemäß der Erfindung können verwendet werden, um nach bekannten Methoden die Bildung von Antikörpern,
die für Thymopoietin spezifisch sind, in Wirtstieren durch Injektion des Antigens bei diesen
Wirtstieren vorzugsweise unter Verwendung eines Adjuvans, z.B. Freundschem Adjuvans, auszulösen. Verbesserte
Titer können durch wiederholte Injektionen über einen gewissen Zeitraum erzielt werden. Als Wirtstiere eignen
sich für diesen Zweck beispielsweise Säugetiere wie Kaninchen, Pferde, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten,
Kühe und Schafe. Die erhaltenen Antiseren enthalten Antikörper, die, wie vorstehend beschrieben, selektiv
Komplexe mit Thymopoietin oder einem daraus hergestellten Antigen bilden. · ι
Die gemäß der Erfindung hergestellten spezifischen :
Antikörper für Thymopoietin sind wertvoll als Reagentien im Irrmuntest für Thymopoietin. Bei einer bevorzugten
Ausführungsform wird mit einem geeigneten Puffer verdünntes Antiserum, z.B. 5%iges Rinder-y-globulin \
in normaler Kochsalzlösung, die mit 0,1-molarem Phosphat;
bei pH 7,4 gepuffert wird (BGG-Puffer), mit einer Standardprobe
oder Testprobe und auch einer bekannten Menge von radioaktiv markiertem Thymopoietin, die beide im
BGG-Puffer gelöst sind, gemischt.
Verschiedene Methoden können dann angewandt werden, um die in der Testprobe vorhandene Thymopoietinmenge zu
709885/0872
bestimmen. Bei einer ersten Methode wird nach dem Mischen der vorstehend genannten Komponenten und nach Stehenlassen des Gemisches für einige Stunden bei Raumtemperatur der Antikörper-Antigen-Komplex unter Verwendung von
kaltem 30%igem Polyathylenglykol ausgefällt. Nach dem
Zentrifugieren wird der Überstand abgesaugt und die Radioaktivität im Sediment gemessen. Der Thymopoietingehalt der Probe kann dann durch Vergleich der beobachteten Stärke der Radioaktivität mit einer Standardkurve
in an sich bekannter Weise bestimmt werden. Eine geeignete Standardkurve kann erhalten werden, indem bekannte
Mengen Thymopoietin mit bestimmten Mengen von markiertem Thymopoietin und dem für Thymopoietin spezifischen
Antikörper gemischt werden und der Grad der Bindung für
jede bekannte Menge bestimmt wird.
Die Abtrennung des Antigen-Antikörper-Komplexes kann
auch mit Hilfe anderer Trennsysteme erfolgen. Diese alternativen Symsteme werden sogar dem vorstehend beschriebenen Polyäthylengiykolsystem vorgezogen, da mit
ihnen eine höhere Empfindlichkeit für den Test erzielt wird.
Bei einem dieser Systeme wird eine doppelte Antikörpermethode angewandt. Nach dem Bebrüten des aus drei Komponenten bestehenden Testreaktionsgemisches in der oben
beschriebenen Weise wird ein Antikörper, der in einer anderen Säugetierspezies gegen den Antikörper des primären Tests erzeugt worden ist, zugesetzt. Die Komponenten werden gemischt, und nach Stehenlassen für 5 bis
120 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gemisch zentri
fugiert. Nach dem Absaugen des Überstandes wird die
Radioaktivität der Fällung gemessen und die Thymopoietinkonzentration in der Probe aus einer Standardkurve in
der oben beschriebenen Weise bestimmt.
Bei dem anderen alternativen System wird mit Dextran umhüllte Holzkohle verwendet, um die Abtrennung des Anti-
709885/0872
körper-Antigen-Komplexes zu beschleunigen. Bei dieser ;
Methode wird mit Dextran umhüllte Holzkohle dem Testreaktionssystem nach dem Bebrüten zugesetzt. Eine verminderte Temperatur von etwa 4°C wird angewandt. Nachdem das Gemisch etwa 30 Minuten bei etwa 4°C stehen
gelassen worden ist, wird es zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Das Sediment wird auf Radioaktivität
untersucht, die bei dieser Methode "ungebundenes" Thymopoietin" darstellt.
Bei den bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Testsystems wird die normale Kochsalzlösung,
die im BGG-Puffersystem verwendet wird, durch 4-molares
KCl ersetzt. Dieser Ersatz verringert die nicht-spezifische Bindung beim Test ohne gleichzeitigen Verlust an
Als radioaktiv markierte Thymopoietine eignen sich für den Immuntest gemäß der Erfindung beispielsweise mit
Radioisotopen markierte Thymopoietine, insbesondere die mit Tritium (3H), Kohlenstoff-14 (14C), Jod-125 (125J)
oder mit Jod-131 (1J) markierten Thymopoietine. Für
andere Ausführungsformen des Immuntests gemäß der Erfindung können Thymopoietine verwendet werden, die mit
anderen einmaligen und nachweisbaren Markierungen, z.B. Chromophoren, Fluorophoren, Enzymen, roten Blutkörper
chen, Latexteilchen oder Elektronenspinnresonanzgruppen,|
versehen sind. i
125
poietin wird das J-Thymopoietin. Die Einführung der
125
kannten Methoden erfolgen, z.B. nach der Chloramin-T-
125
Hunter-Reagens (mit J jodierte p-Hydroxyphenylpropionsäure, N-Hydroxysuccinimidester), wie in Biochem.J.
133 (1973) 529 beschrieben. Diese Bevorzugung beruht
709885/0872
darauf, daß durch direkte Jodierung der Tyrosylkomponenten von Thymopoietin ein gewisser Verlust an Immunoreaktivität eintritt. Da Jedoch das Bolton-Hunter-Reagens mit freien Aminogruppen kondensiert, beeinträchtigt es nicht die immunodeterminanten Tyrosylbereiche.
Die übrigen vorstehend genannten markierten Thymopoietine werden nach bekannten Methoden hergestellt. Beispielsweise können mit Enzymen markierte Thymopoietine
in der in der US-PS 3 654 090 beschriebenen Welse her
gestellt werden. Ferner beschreibt die US-PS 3 853 987
Verfahren zur Verwendung von Tracermaterialien, z.B. fluoreszierenden Verbindungen und Latexsystemen, für
die Markierung. Diese Markierungsmethoden sind somit in der Literatur ausführlich beschrieben. Die erfindungs
gemäß verwendeten markierten Thymopoietine umfassen
demgemäß die mit Radioisotopen markierten sowie die mit den anderen genannten Materialien markierten Thymopoietine.
Durch Testen mit verschiedenen Kontrollpolypeptiden und Beobachtung, daß keine Verschiebung des Komplexes
aus Antikörper und markiertem Antigen stattfand, wurde nachgewiesen, daß der Immun te :jt gemäß der Erfindung
spezifisch für Thymopoietin i.ft. Insbesondere wurde keine Kreuzreaktion mit Ubich.^tin, einem in Geweben
weit verbreiteten Material, und mit Histonen, die aus
Rinderthymus extrahiert werden, festgestellt. Ein syn- j
thetisches Tridecapeptid auf fcasis von Resten 29-41 j von Thymopoietin, das die biologischen Aktivitäten von
Thymopoietin hat, zeigte keine Kreuzreaktion. Offensichtlich fehlt es in diesem Bereich entweder an den !
Resten und/oder der tertiären Struktur, die zur Rekonstitution der antigenen Stellen, die von den Antithymopoietin-Antikörpern im Antiserum erkannt werden, :
erforderlich sind.
709885/0872
1733561
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter
erläutert.
Antigen- und Antlkörperherstellung I
■ ι rf Γ I
Thymopoietin wurde auf die von Goldstein in Nature 247
(1974) 11 beschriebene Weise isoliert. Zur Immunisierung wurde es an eine gleiche Gewichtsmenge Pferde-γ-Globulin mit Glutaraldehyd als Kupplungsreagens nach
der Methode von Avrameas (Immunochemistry 6 (1969) 43) ; gekuppelt. Das erhaltene Antigen wurde dann für die
Bildung von Thymopoietin-Antikörper verwendet.
(1974) 11 beschriebene Weise isoliert. Zur Immunisierung wurde es an eine gleiche Gewichtsmenge Pferde-γ-Globulin mit Glutaraldehyd als Kupplungsreagens nach
der Methode von Avrameas (Immunochemistry 6 (1969) 43) ; gekuppelt. Das erhaltene Antigen wurde dann für die
Bildung von Thymopoietin-Antikörper verwendet.
Drei weibliche San-Juan-Kaninchen wurden mit Je 400 ug
Thymopoietln-Antigen immunisiert, das in Freundschcm
vollständigem Adjuvans emulgiert war und intradermal
an mehreren Stellen injiziert wurde. Die Immunisierung
wurde viermal in Abständen von 2 Wochen wiederholt·
Eine Woche nach den letzten Injektionen wurden die Tiere ausgeblutet.
Thymopoietln-Antigen immunisiert, das in Freundschcm
vollständigem Adjuvans emulgiert war und intradermal
an mehreren Stellen injiziert wurde. Die Immunisierung
wurde viermal in Abständen von 2 Wochen wiederholt·
Eine Woche nach den letzten Injektionen wurden die Tiere ausgeblutet.
Radioaktive Markierung von Thymopoietin
a) Chloramin-T-Methode ' '
Thymopoietin wurde an Carboxymethyl-Sephadex (CM-Sephadex)
(Säule von 0,6 χ 30 cm), das in 0,2-molarem '
Ammoniumacetat ins Gleichgewicht gebracht worden war I und einen pH-Wert von 4,5 hatte, weiter gereinigt, wo- I
bei mit einem linearen Gradienten bis 0,5-molar, pH 4,5,1
entwickelt wurde. Das Thymopoietin erschien dicht hinter dem Zwischenraumvolumen. Diese Fraktionen wurden gefriergetrocknet und an "Sephadex G-25" entsalzt. Die
Reinheit wurde durch Elektrophorese an Polyacrylamidgel
bei pH 4,3 und pH 8,9 ermittelt.
709885/0872
1733561
10 ug des hochreinen Thymopoietin wurden nach der Chloraminmethode von Hunter und Greenwood (Nature 194
(1962) 495 mit 2 mCi trägerfreiem 125J radioaktiv
125
markiert. Das J-Thymopoietin wurde von den nicht
umgesetzten Radionucliden an Sephadex G-25 (Säule von
0,6 χ 30 cm) in 0,05-molarem Phosphat, pH 7,5, abgetrennt. Die Säule wurde mit 0,25%iger Gelatine in
Phosphatpuffer vorgewaschen· Die Radioaktivität einer Probe von 1 ul aus jeder Fraktion wurde in einem automatischen γ-Spektrometer bestimmt. Die Fraktion, die '
dem Zwischenraumvolumen entsprach, wurde in aliquote Teile von 0,1 ml geteilt und für den Gebrauch innerhalb
von 3 Wochen bei -20°C aufbewahrt.
b) BoIton-Hunter-Methode
125
2 mCi von mit J jodiertem p-Hydroxyphenylpropion
säure-N-hydroxysuccinimidester (Bolton-Hunter-Reagens «
1500 Ci/mMol), der in Benzol gelöst war, wurden zur Jodierung von Thymopoietin bei 4°C nach der von BoIton
und Hunter in Eiochem. J. 133 (1973) 529 beschriebenen
unter einem Abzug getrocknet, indem ein Stickstoffstrom
über die Mündung des Kolbens geleitet wurde. 10 All :
Thymopoietin (0,5 mg/ml in 0,1-molarem Matriumborat,
pH 6,5) wurden zugesetzt, worauf 45 Minuten bei 4°C :
gehalten wurde. Dann wurden 0,5 ml 0,2-molares Glycin
in 0,1-molarem Natriumborat, pH 8,5, zur Reaktion mit
nicht umgesetztem Reagenz zugesetzt. Nach 15 Minuten
125
wurde J-Thymopoietin von den anderen markierten Pro— .
dukten der Konjugation nach der vorstehend in Abschnitt (a) beschriebenen Methode abgetrennt.
Nur 5% des nach der Chloramin-T-Methode radiojodierten !
ι Thymopoietins wurden in Gegenwart von überschüssigem
Antikörper gebunden. Diese Bindung wurde bei Verdünnun- !
gen von mehr als 10*" schwächer. Im Gegensatz hierzu wurden nach der Bolton-Hunter-Methode 45% des mit radioak-
709885/0872
1733561
tivem Jod markierten Thymopoietin in Gegenwart von überschüssigem Antikörper gebunden. Diese Bindung wurde:
ebenfalls 1
schwächer.
ebenfalls bei AntikörperverdUnnungen von mehr als 10
a) Radioimmuntest — Abtrennung mit Poly3thylenglykol
Bebrütungen wurden dreifach in Kunststoffröhrchen von
12 χ 75 mm durchgeführt. Zu O15 ml Antiserum, das mit ί
5%igem Rinder-y-globulin in mit 0,01-molarem Phosphat
gepufferter 0,15-molarer NaCl-Lösung (BGG-Puffer) ver-
125 dünnt war, wurden 0,2 ml Probe und 0,3 ml J-Thymo poietin (* 50.000 cpm in BGG-Puffer) gegeben. Wenn ι
Serumproben getestet werden sollen, werden sie durch Molekularsieb-Chromatographie an G-50-Sephadex in I
0,1-molarem Ammoniumdicarbonat, pH 8,0, hergestellt.
Die Fraktionen hinter dem ausgeschlossenen Volumen (Vo) und vor dem eingeschlossenen Volumen (Vi) wurden
vereinigt und gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wurde im Puffer für Thymopoietin aufgenommen. Diese
Herstellung dient dazu, Moleküle mit Molekulargewichten, die höher oder niedriger als das Molekulargewicht von
Thymopoietin sind, von der Bestimmung auszuschließen.
Die Teströhrchen werden auf einem Wirbelmischer bewegt :
und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann i
werden 0,5 ml kaltes 30%iges Polyäthylenglykol Jedem i
Röhrchen zugesetzt, das auf einem Wirbelmischer bewegt > und bei 2000 UpM 30 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert wird. Der Überstand wird abgesaugt
und die Radioaktivität im Sediment in einem automa
tischen γ-Spektrometer bestimmt. Ausgefälltes 125J-
Thymopoietin (%) wird nach der Formel a-c (b-c) χ 100
berechnet, worin a - mit dem Antikörper sedimentiertes cpm, b * insgesamt zugesetztes cpm und c ■ nicht spezifisch mit normalem Kaninchenserum oder mit Antikörper
und überschüssigem nicht markiertem Thymopoietin sedi-
709885/0872
IS
1733561
mentiertes cpm (dies machte gewöhnlich etwa 10% des :
gesamten cpm aus^C Fur die Standardkurve der Bindungshemmung wurde das gebundene Thymopoietin als Prozentsatz der maximalen Thymopoietinbindung mit Antikörper
bei 10 berechnet. Eine Antikörperverdünnung von 1:3000 wurde für die Standardkurve der Bindungshemmung
benutzt.
b) Radioimmuntest - doppelte Antikörpertrennunq
Der vorstehend unter (a) beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch 4-molarer KCl-BGG-Puffer verwendet wurde und nach der 2-stündigen Inkubationszeit
insgesamt 0,1 ml Ziegen-Antikaninchen-Antikörper und 0,02 ml normales Kaninchenserum zugesetzt, die Komponenten auf dem Wirbelmischer gemischt wurden und das
erhaltene Gemisch 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann zentrifugiert wurde. Der Überstand
wurde abgesaugt und die Radioaktivität des Sediments wie beim Versuch (a) gemessen.
c) Radioimmuntest - Trennung mit Hilfe von mit Dextran umhüllter Holzkohle
gleicher Volumina
Mischen/von (a) 5 g Holzkohle "Norit A" pro 100 ml
Phosphatpuffer, der 2 Mol KCl und Rinder-y-globulin
enthält, und (b) 0,5 g Dextran 110 pro 100 ml Phosphatpuffer, der 1 Mol KCl und Rinder-y-globulin enthält.
Insgesamt 0,5 ml der mit Dextran umhüllten Holzkohle werden bei 4°C nach der 2-stündigen Inkubation wie beim
Versuch (b) in das Reagenzröhrchen gegeben, worauf das Gemisch 30 Minuten bei 4°C stehen gelassen wird. Die
der Pellets
abgesaugt wird. Die Radioaktivität^ die bei dieser Bestimmung "ungebundenes" Thymopoietin darstellt, wird
gemessen.
709885/0872
Die BindungE-Herr.mungs-Standardkurve für nicht markiertes
Thymopoietin bei der bestimmung unter Anwendung der Abtrennung des Antigen-Antikörpcr-Komplexcs mit
Folyäthylenglykcl zeigte eine Empfindlichkeit für
Thymopoietinkonzentrationen von mehr als 5 ng/ml.
Keine starke Verschiebung wird durch Kontrollpolypeptide,
nämlich Insulin, a-Bungarotoxin, Ubichitin, Histon und ein synthetisches Tridecapeptidfragment von
Thymopoietin (Reste 29-41) bei Konzentrationen von IC 1G-1COO ng/rnl hervorgerufen.
Die Bindungs-Hemmungs-Kurven für nicht markiertes Thymopoietin bei den Bestimmungen unter Anwendung der
doppelten Antikörpertrennung und der Abtrennung dos Antigen-Antikörper-Komplexes mit Hilfe von mit Dextran
umhüllter Holzkohle zeigten beide Empfindlichkeiten für Thymopoeitinkonzentrationen bis hinab zu 0,1 ng
Thymopoietin/ml. Die beiden letztgenannten Methoden
sind somit für die Kessung von Thymopoietinkonzentrationen in Serumproben besonders gut geeignet.
7 0 9 H H S / Π 8 7 2
Claims (21)
1) Antigen, bestehend im wesentlichen aus Thymopoietin, das an ein immunogenes Trägermaterial gebunden ist.
2) Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Thymopoietin durch kovalente Bindung an das Trägermaterial
gebunden ist.
3) Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen über eine bifunktionelle Bindungsgruppe
kovalent gebunden ist.
4) Antigen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die bifunktionelle Bindungsgruppe ein C^-C^-Dialkanal
ist.
5) Antigen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das C2-C7-Dialkanal Glutaraldehyd ist.
6) Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als immunogenes Trägermaterial ein Protein enthält.
7) Antigen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein γ-Globulin von Säugetieren ist.
8) Antigen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Rinderserumalbumin ist.
9) Antikörper, der für Thymopoietin und ein Antigen, das im wesentlichen aus an ein immunogenes Trägermaterial
gebundenem Thymopoietin besteht, spezifisch ist und durch Impfen eines Wirtstieres mit dem genannten Antigen
und Gewinnung des Serums vom Wirtstier erzeugt worden ist.
10) Antikörper nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen aus Thymopoietin, das kovalent an ein
7 0 ° - P V/ 0 8 7 2
ORIGINAL INSPECTED
Protein gebunden ist, besteht.
11) Antikörper nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Thymopoietin über eine bifunktionelle Bindungsgruppe kovalent gebunden ist.
12) Antikörper nach Anspruch 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein aus der aus Pferde-y-globulin
und Rinderserumalbumin bestehenden Gruppe ausgewählt und die bifunktionelle Bindungsgruppe Glutaraldehyd ist,
13) Markiertes Thymopoietin, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Tritium, Kohlenstoff-14, Jod-131, Jod-125,
Chromophoren, Fluorophoren, Enzymen, roten Blutkörperchen, Latexteilchen und/oder Elektronenspinnresonanzgruppen
markiert ist.
14) Markiertes Thymopoietin nach Anspruch 13, dadurch ge-
125
kennzeichnet, daß es mit J markiert ist.
kennzeichnet, daß es mit J markiert ist.
15) Methode zur Bestimmung von Thymopoietin in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit einer
bekannten Menge markiertem Thymopoietin und einem Antikörper, der selektiv einen Komplex mit dem Thymopoietin
bildet, mischt, den hierbei gebildeten Antlkörper-Antigen-Komplex
vom Überstand abtrennt, den Grad der Bindung des markierten Thymopoietin im Komplex
mißt und die in der Probe vorhandene Thymopoietinmenge bestimmt, indem man den Grad der Bindung mit
einer Standardkurve vergleicht, die durch Mischen bekannter Mengen Thymopoietin mit bestimmten Mengen des
markierten Thymopoietin und des Antikörpers und Be- : Stimmung des Grades der Bindung für jede bekannte Thymo—
poietinmenge erhalten worden ist. j
16) Methode nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß ;
man einen Radioimmuntest anwendet und radioaktiv mar- ! kiertes Thymopoietin verwendet.
709885/0872
17) Verfahren nach Anspruch 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß man den Antikörper-Antigen-Komplex mit
Hilfe von 30%igem Polyathylenglykol von der Lösung abtrennt·
18) Methode nach Anspruch 15 und 16, dadurch gekennzeichnet,
daß man den Antikörper-Antigen-Komplex von der Lösung mit Hilfe einer doppelten Antikörpermethode unter
Verwendung eines Antikörpers gegen das Serum des Wirtstieres, in dem der Thymopoietin-Antikörper erzeugt wurde, abtrennt.
19) Methode nach Anspruch 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß man den Antikörper-Antigen-Komplex aus der
Lösung mit Hilfe einer Methode, bei der mit Dextran umhüllte Holzkohle verwendet wird und bei der die
Radioaktivität des Sediments ungebundenes Thymopoietin darstellt, abtrennt.
20) Methode nach Anspruch 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als radioaktiv markiertes Thymopoietin
J-Thymopoietin verwendet.
21) Methode nach Anspruch 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Plasma- oder Serumprobe der Bestimmung unterwirft.
Kr ■' η ς 7 2
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/709,565 US4055633A (en) | 1976-07-28 | 1976-07-28 | Immunoassay for thymopoietin |
| US05/810,269 US4124700A (en) | 1976-07-28 | 1977-06-27 | Immunoassay for thymopoietin |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2733561A1 true DE2733561A1 (de) | 1978-02-02 |
| DE2733561B2 DE2733561B2 (de) | 1979-07-26 |
| DE2733561C3 DE2733561C3 (de) | 1980-04-03 |
Family
ID=27108277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19772733561 Expired DE2733561C3 (de) | 1976-07-28 | 1977-07-26 | Spezifisches Reagens für den Immuntest für Thymopoietin |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6012576B2 (de) |
| AU (1) | AU497627B1 (de) |
| CA (1) | CA1075600A (de) |
| DE (1) | DE2733561C3 (de) |
| FR (1) | FR2359851A1 (de) |
| GB (1) | GB1545332A (de) |
| IT (1) | IT1126757B (de) |
| NZ (1) | NZ184667A (de) |
| SE (1) | SE447165B (de) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2557458B1 (fr) * | 1983-12-30 | 1987-09-04 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux anticorps capables de reconnaitre specifiquement des groupements hapteniques, leur preparation et leur application, et nouveaux antigenes permettant de les preparer |
| GB2160312B (en) * | 1984-04-13 | 1987-09-16 | South African Inventions | Adjuvant for immunisation |
| FR2581313A1 (fr) * | 1985-05-02 | 1986-11-07 | Pasteur Institut | Composes suscitant la formation d'anticorps, compositions immunogeniques et compositions immunoprotectrices les contenant et procede d'obtention d'anticorps les mettant en oeuvre |
| US5593842A (en) * | 1994-09-20 | 1997-01-14 | Gideon Goldstein | Method of measuring thymopoietin proteins in plasma and serum including acidification of the plasma and serum |
-
1977
- 1977-07-15 CA CA282,819A patent/CA1075600A/en not_active Expired
- 1977-07-18 NZ NZ18466777A patent/NZ184667A/xx unknown
- 1977-07-19 GB GB3017777A patent/GB1545332A/en not_active Expired
- 1977-07-26 IT IT5044677A patent/IT1126757B/it active
- 1977-07-26 DE DE19772733561 patent/DE2733561C3/de not_active Expired
- 1977-07-27 SE SE7708625A patent/SE447165B/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-07-27 AU AU27382/77A patent/AU497627B1/en not_active Expired
- 1977-07-27 FR FR7723092A patent/FR2359851A1/fr active Granted
- 1977-07-27 JP JP9021277A patent/JPS6012576B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1126757B (it) | 1986-05-21 |
| FR2359851A1 (fr) | 1978-02-24 |
| JPS5459318A (en) | 1979-05-12 |
| SE447165B (sv) | 1986-10-27 |
| DE2733561B2 (de) | 1979-07-26 |
| SE7708625L (sv) | 1978-01-29 |
| JPS6012576B2 (ja) | 1985-04-02 |
| DE2733561C3 (de) | 1980-04-03 |
| FR2359851B1 (de) | 1983-04-01 |
| NZ184667A (en) | 1980-02-21 |
| GB1545332A (en) | 1979-05-10 |
| CA1075600A (en) | 1980-04-15 |
| AU497627B1 (en) | 1978-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0013930B1 (de) | Immunogen, Antikörper für ein Thymus-Hormon, markiertes Thymus-Hormon und Verfahren zur Bestimmung dieses Thymushormons | |
| DE69119656T2 (de) | Satz zur spezifischen Bestimmung von Angiotensin-II | |
| EP0291086B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung eines Antikörpers in menschlichen Körperflüssigkeiten | |
| Haber et al. | Radio immunoassay employing gel filtration | |
| EP0460190B1 (de) | Verfahren zum nachweis von malignen erkrankungen | |
| DE2811257A1 (de) | Immunologische bestimmung | |
| US4124700A (en) | Immunoassay for thymopoietin | |
| DE69132122T2 (de) | Reinigung von cytokeratinfragmenten | |
| JPH0244030B2 (de) | ||
| Goldstein | Radioimmunoassay for thymopoietin | |
| DE69204718T2 (de) | CA-195 ähnliches immunreaktives Antigen von menschlicher Amnionflüssigkeit. | |
| US4299814A (en) | Radioimmunoassay of MIF | |
| Van Vunakis | [10] Radioimmunoassays: An overview | |
| DE69733957T2 (de) | Verfahren zur bestimmung der gegenwart des gehirnspezifischen proteins s-100 beta | |
| EP0124779A2 (de) | Radioimmunverfahren für Thymosin beta 4 | |
| DE2733561C3 (de) | Spezifisches Reagens für den Immuntest für Thymopoietin | |
| EP0379216A1 (de) | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von immunologisch nachweisbaren Substanzen | |
| Schmidt et al. | Structural and metabolic relationships between goldfish brain glycoproteins participating in functional plasticity of the central nervous system | |
| Abrass | Evaluation of sequential glomerular eluates from rats with Heymann nephritis. | |
| US4096237A (en) | Immunoassay for β-endorphin | |
| EP0345732A2 (de) | Verfahren zur Bestimmung eines Antikörpertiters | |
| EP0420043B2 (de) | Antikörper gegen hochkonservierte Aminosäuresequenzen von immunogenen Substanzen, Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper, sowie deren Verwendung in Immunoassays | |
| Kennedy et al. | Development of a specific radioimmunoassay for vitamin B12 and its application in the diagnosis of cobalt deficiency in sheep | |
| EP0121912A1 (de) | Radioimmunverfahren zur Bestimmung von Thymosin-beta-4 | |
| DE69610283T2 (de) | Verfahren zur immunologischen Identifizierung oder Bestimmung von Polypeptid-Antigenen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OAP | Request for examination filed | ||
| OD | Request for examination | ||
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |