DE2717328A1

DE2717328A1 - Verfahren zur abtrennung des hepatitis-begleitenden antigens

Info

Publication number: DE2717328A1
Application number: DE19772717328
Authority: DE
Inventors: Rodger L Bick
Original assignee: BICK RODGER L; FEKETE LAJOS F
Current assignee: Wilson William L 90291 Venice Calif Us Bick
Priority date: 1976-04-19
Filing date: 1977-04-19
Publication date: 1977-11-10
Also published as: FR2348702A1; JPS52130907A; FR2348702B1; US4057628A

Description

Verfahren zur Abtrennung des Hepatitiε-begleitenden Antigens

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung des Hepatitis-begleitenden Antigens von bestimmten gewünschten Blutplasraafraktionen.

Viele Patienten benötigen aus dem einen oder anderen Grund Bluttransfusionen. Hepatitis ist eine relativ verbreitete Krankheit, die durch die Bluttransfusion vom Spender auf den Empfänger übertragen wird. In der Vergangenheit gab es beträchtliche Schwierigkeit, die Hepatitis-Übertragung vom Spender auf den Empfänger zu vermeiden. Erfindungsgemäß wird dieses Problem dadurch gelöst, daß man das unerwünschte Hepatitis-begleitende Antigen aus den Blutplasmafraktionen entfernt, bevor sie dem Empfänger verabreicht werden.

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Vollständiges Blut v.tird dem Spender abgenommen und zentrifugiert, um die roten Blutzellcn abzutrennen. Das verbleibende Plasma wird nach üblichen Verfahren gesammelt und behandelt» um es zu konzentrieren und in verschiedene Plasmafraktionen auszutrennen. Ia üblichen werden bei allgemeinen kommerziellen Konzentrationsverfahren etwa 6000 1 Plasma auf etwa 10 1 Konzentrat konzentriert. Die verschiedenen Fraktionen, die bei der Konzentrierung und Abtrennung erhalten v/erden, werden zur Erzeugung von trockenen Produkten gefriergetrocknet» Die trockenen Produkte werden versandt und am Ort ihrer Verwendung gelagert. Wenn sie in Gebrauch genommen werden müssen, werden die gefriergetrockneten Produkte in Lösung gebracht, indem man sie in sterilem V/asser oder in Salzlösung löst.

Plasma von vielen verschiedenen Spendern wird vereinigt und gesammelt, um für die Konzentrierung einen großen Plasmaansatz zu erzeugen. Wenn ein Spender Hepatitis hat, wird der gesagte Ansatz an gesammeltem Plasma angesteckt. Da ungefähr 50 % dor Bevölkerung beim Test auf Hepatitis eine positive Reaktion ergeben, enthält das meiste konzentx-ierte Plasma Hepatitis-begleitendes Antigen. Bestimmte Blutplasmafraktionen, wie z.B. Albumin, können mit Hitze behandelt werden, um das unerwünschte Hepatitis-begleitende Antigen zu töten. Jedoch zerstört Hitze einige Blutfraktionen, so daß Verfahren unter Anwendung von Wärme für diese Fraktionen nicht geeignet sind. Bei kleinen Blutplasmamengen können chroiaatograpnische Techniken angewandt werden, um das ungewünschte Hepatitis-begleitende Antigen abzutrennen. Jedoch ist diese Technik für große Blutplasmavolumina nicht durchführbar. Die meisten Koagulationsprotein-Fraktionen können nicht mit Wärme behandelt werden, um das Hepatis-begleitende Antigen zu entfernen. Diese Fraktionen werden in großen Mengen bei der Behandlung von Blutern verwendet. Hämophile Patienten ziehen sich sehr oft wegen der großen Mengen an Koagu-

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lationsprotein-Fraktionen, die sie während der Behandlung empfangen, Hepatitis zu.

Erfindungsgemäß erfolgt die Abtrennung des Hepatitis-begleitenden Antigens mittels einer selektiven Fällungstechnik« Es ist bekannt, daß Polyäthylenglykol bei der Fraktionierung komplexer Proteingeraische verwendet werden kann, vergl. A« Poison et al., Biochim. Biophys. Acta 82 (1964) 463-475. Polyäthylenglykol wurde verwendet, um Hepatitis begleitendes Antigen durch selektive Fällungstechniken zu konzentrieren , vergl. z.B. Allan J. Johnson, Annais New York Academy of Sciences, 240 (1975) 162-164. Ferner wurden Äthylenoxid-Propylenglykol-Kondensationsprodukte zur selektiven Fällung verschiedener Blutplasmafraktionen ohne Bezugnahme auf Vorliegen oder Abwesenheit von Hepatitisbeg.leitendem Antigen verwendet ,vergl. Fekete et al., US-PS 3 770 631.

Gemäß der Erfindung führt die Verwendung von Äthylenglykol-Propylenglykol-Kondensationsprodukten in bestimmten Konzentrationen und bei bestimmten Temperaturwerten zur Bildung von flüssigen und festen Phasen in einem wässrigen Plasmagemisch, wobei das Hepatitis-begleitende Antigen völlig in einer der Phasen isoliert ist.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Abtrennung des Hepatitis-begleitenden Antigens von bestimmten gewünschten Blutplasmafraktionen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß raan zu einem wässrigen Blutpiasmageinisch, das Hepatitis-begleitendes Antigen und die gewünschten Blutplasmafraktionen enthält, ein Blocknischpolymerisat von Äthylenoxid in einer Henge und bei einer Temperatur zugibt, die ausreicht, um die Mischung in eine feste Phase und eine flüssige Phase zu trennen, wobei

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das geso.inte Hepatitis-begleitendo Antigen in oiner der beiden Phasen ist, und die Phasen trennt.

Εε wurde im einzelnen festgestellt, daß in einem solchen Gemisch, wenn die Konzentration des Blockmischpolymerisats wenigstens etv;a 9 %·> bez-ogen auf Gewicht pro Volumen, beträgt, und die Temperatur bei einem Wert von etwa 0 bis 39 0 liegt, wobei die Konzentration des Blockmischpolymerisats mit steigender Temperatur bis auf einen Wert von etwa 28 % bei 39°C ansteigt, das gesamte Hepatitis-begloitende Antigen in der festen Phase isoliert ist und eine von Hepatitis-begleitendem Antigen freie flüssige Phase (überstehende Flüssigkeit) zurückläßt, die als solche verwendet werden kann oder weiterverarbeitet werden kann, um brauchbare Proteine daraus abzutrennen. Venn die Konzentration des Blockroiachpolymerisats nicht mit steigender Temperatur erhöht wii-d, kennen zwei Phasen gebildet werden, wobei jedoch jede von ihnen etwas Hepatitis-begleitendes Antigen enthält. Alternativ erscheint bei Blockraischpolymerisafc-Konzentrationen von weniger als etwa 7 bzw- 15 % bei 0 bis 39°C das gesamte Hepatitis-begleitende Antigen in der flüssigen Phase und läßt ein oder mehrere Proteine in der festen Phase zurück, die dann zu ihrer Gewinnung fraktioniert werden kann. Wenn die gesamte Ausfällung des Hepatitis-begleitenden Antigens gewünscht ii_,t, ist die obere Konzentrationsgrenze des Blockmischpolymerisats seine Löslichkeitsgrenze bei den in Frage stehenden Temperaturen.

Die besonderen Blockmischpolymerisate, die bei den erfindungsgemäßen selektiven Ausfällungsverfahren verwendet werden, werden bequem durch Kondensation von Äthylenoxid mit Polyoxypropylen „ hergestellt. Die erhaltenen Kondensationsprodukte sind bekannte Materialien, die durch die folgende Strukturformel wiedergegeben v/erden können:

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H0(CH₂CH₂0)_a(CHCH₂0)_b(CH₂C}!₂0)_cH ,

in der a und c dia Anzahl dor Oxy α ό.hy 1 eneinhciten und b die Anzahl d&r Oxypropylenein'udten bedeuten. Pur die Zwecke der Ei-findunp, beeigneto Blockmischpolymerisate sind vcn der Vyandotte Chemicals Coi'poratico unter den Bezeichnungen "Pluroric Γ-3Β" und "Γ1 uronic i'-G.T' hi-jvJ J tlich. Pluronic F^38 enthält etwa 80 % Polyoiiryathylenoinheiten und der Polyoxypropylen-Anteil des Moleküls besitz!; ein Molekulargewicht von etwa 950. Das Kondencationsprodukt hat ein Ge ns rutin ο lekul ar gewicht von etwa 4-750. Piui'onic F-Go cntliält C¹JeDXaIIs etwa 80 % Polyoxyäthyl en einheit en und der Po]yoxyp:eopylen-Anteil des Moleküls hat ein Molekulargewicht von etwa 1750, wobei das Gesamtmolekulargewicht des ICondencationsprodukts etwa 8750 beträgt. Im allgemeinen enthalten die Blockmischpolymerisate, die für die selektiven Fällung.:■,verfahren gemäß der Erfindung geeignet sind, wenigstετ;;-. etwa ;.O % Äthylenoxid-Einheiten im Molekül und der Auteil m Polyorypropylen im Molekül hat ein Molekulargewicht von wenigstens etwa 900. Dos Material muß bis zu Konzentrationen vcn wenigrtens etwa 20 %, bezogen auf Gewicht pro Volumen, bei Temperaturen von etwa O bis 1O⁰C wasserlöslich sein. Das Material muß untoxisch sein. Bas Blockmischpolymerisat sollte so ausgewählt werden, daß das gefriergetrocknete, von Hepatitis-begleitendem Antigen freie Produkt, das erfindungsgemäß erhalten wird, sehr leicht löslich ist. Bei bestimmten Plasmafraktionen ist die Geschwindigkeit der Wiederauflösung sehr bedeutsam. Z.B. beginnt Faktor IX, wenn er aus der gefriergetrockneten Form wieder in Lösung gebracht wird, sehr schnell Thromben zu bilden. Wegen der ständigen Gefahr der

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Thrombusbildung bei diesem koagulierenäen Protein ist os nötig, daß das Material, das zur Durchführung der selektiven Ausfällung vorwendet wird, die Geschwindigkeit der Wiederauflösung nicht verringert und, wenn möglich, den Schritt des Wiederiulösungsbringens sogar beschleunigt. Me oben beschriebenen Blockmischpolymerisate beschleunigen die Vieäsrauflösung des gefriergetrockneten Produkts.

Die folgenden spezifischen Beispiele werden zur Verdeutlichung, nicht zur Beschränkung der Erfindung gegeben. Alle Prozentsätze sind auf Gewicht pro Volumen bezogen, wenn nicht anders angegeben.

BeispielI

Ein konzentriertes vereinigtes Blutplasma, von dem bekannt war, das es Hepstitis-begleitendes Antigen enthält, wurde mit 3 »8 Gew.-% Natriumeitrat antikoagulierend gewacht und der pH mit 1n Salzsäure auf 6,5» den isoelektrischen Punkt von Fibrinegon, eingestellt. Die Salzkonzentration des Plasmas war etwa 0,15 ^molar an Natriumchlorid. Die Temperatur des Plasmas wurde bei etwa 14-⁰C gehalten. Etwa 6 %, bezogen auf Gewicht pro Volumen, eines Blockmischpolymerisate wurde zum Plasma gegeben und darin gelöst. Das Blockmischpolymerisat war ein Äthylenoxid-Propylenglykol-Kondensationsprodukt, bei dem etwa 80 % des Blockmischpolymerisate aus Polyoxyäthyleneinheiten bestanden. Der Polyoxypropylen-Anteil des Polymerisats besaß ein Molekulargewicht von etwa 1750. Das Gesaintmolekulargewicht des Blockmischpolymeriaats war etwa 8?5O. Dieses Material ist handelsüblich von der Wyandott Chemicals Corporation unter der Bezeichnung "Pluronic P-68" erhältlich. Das Plasma wurde etwa 25 min gerührt; während dieses Zeitraumes bildete sich ein Niederschlag. Das erhaltene Gemisch wurde bei etwa 5000 g während 15 min zentrifugiert. Die erhaltene, Hepatitis-begleitendes Antigen enthaltende überstehende Lösung wurde für v/eitere Verwendung de-

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kant.iert; dor pH wurde überprüft, um sicherzustellen, daß er bei 6,5 geblieben war. Der aur» Fibrinogen bestehende Niederschlag enthielt kein Hepatiti.s-begleitendes Antigen. Wenn es gewünscht ist, jetzt den Fakte:· VIII (Antihämophilic-Faktor) aus der überstehenden Flüssigkeit zu isolieren, maß der pH auf etwa 6,9 erhöht werden, v/es der isoelektrische Punkt für den Faktor VIII ist und die !iecipsratur muß auf nicht mehr als etwa '10⁰C erniedrigt werden, da der Faktor VIII wärmeempfindlich ist und Temperaturen von über etwa 10°C nicht übersteht. Nach Zugabe von weiteren 4- Gew.-% Blookinischpolyn-erigat oder einer Gesamtmenge von 10 % fällt der Faktor VIII frei von Hepatitisbegleitendem Antigen aus. Dann wurden zusätzlich 11 % (oder 15 %» wenn die Isolierung des Faktors VIII unterbleibt), bezogen auf Gev/icht pro Volumen, desselben Blockmischpolymerisate au der überstehenden Flüssigkeit gegeben und darin zu einer Gesamtkonzentration von 21 % gelöst. Die Temperatur der überstehenden Flüssigkeit wurde auf etwa 20⁰C eingestellt und das Gemisch etwa 30 min lang gerührt. Während dieses 30 minütigen Zeitraums bildete sich ein Niederschlag in der überstehenden Flüssigkeit. Das Gemisch wurde dann etwa 15 niin lang bei etwa 5GOO g zentrifugiert und die erhaltene, von Hepatitis-begleitendem Intigon freie überstehende Lösung dekantiert. Der Niederschlag aus diesem zweiten Zentrifugierschritt wurde in gepufferter 0,15 molarer Salzlösung (einer Salzlösung von 0,03 % Imidazol und 0,0135 ⁿolar an Fatriuiaciti^at vom pH 7»4) gelöst. Die am Ende erhaltene gepufferte Salzlösung besaß einen hohen Gehalt an Hepatitis begleitendem Antigen.

Der wiederaufgelöste Niederschlag mit seinem hohen Titer an Hepatitis-begleitendem Antigen wurde bei den nachfolgenden Beispielen als positiver Vergleich verwendet.

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V/enn man da« in diesem Beispiel I verwendete Blockniiachpoly:iierisat durch ein zweites Blockraischpol^merisat ersetzt, erhält man eine gleich wirksame Isolierung des Jiepatitis-begleit enden Antigens in dem zweiten gewonnenen Niederschlag. Bas zweite Blockmischpolymerisat ist ein Äthyl enoxid-Propylenglykol-Kondonsr,-tionsprodukt, das etwa 80 % Polyoxyäthyleneinheiten enthält, wobei das im Mischpolymerisat enthaltene Polyo:rypropylen ein Molekulargewicht von etwa 950 aufweist. Das Gesarctmolekulargewicht des Blockfuischpolyneiisats beträgt etwa 4-750· Dieses Material ist handelsüblich von der Wyandotte Chemicals Corporation unter der Handelsbezeichnung "Pluronic F-^S" erhältlich.

Bei der Wiederholung dieses Beispiels mit konzentriertem gesammeltem Blutplasma wurde gefunden, daß die Konzentration des Blutplaruias so sein sollte, daß die darin enthaltene Gesamtkon- ?, ent rat ion an Protein nicht über etvra 4 %, bezogen auf Gewicht pro Volumen, beträgt.

Beispiel II

Eine citratfreie Probe Blutplasma, die verdünntes Prothrombin enthielt, welches Hepatitis-begleitondes Antigen enthielt, vrurde mit 1n Salzsäure auf pH 7,0 eingestellt. Das Plasma wurde pro Volumenteil mit einem Volumenteil Calslösucg verdünnt. Die Proteinkonzentration in dem ^.L dienen Plasma betrug etwa 5?3 %? bezogen auf Gewicht pro Volumen (g/pxO 100 cm^) und die Salzkonzentration war 0,15 wolar an Natriumchlorid. 15 %, bezogen auf Gewicht pro Volumen, des in Beispiel I beschriebenen Blockmischpolymerisats, das unter der Handelsbezeichnung "Pluronic F-68" vertrieben wird, wurden in dem konzentrierten Plasma gelöst und das Gemisch kontinuierlich 15 min bei einer Temperatur von etwa 20⁰C gerührt. Es bildete sich ein Niederschlag in dem Plasma. Das erhaltene Gemisch wurde bei 5000 g 15 min lang zentri fugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde zur Abtrennung von

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dem Niederschlag abdokantiert. Die dekantierte überstehende Flüssigkeit war frei von Hepatitis-begleitendem Antigen. Dei· Niederschlag enthielt Hepatitis-begleitendes Antigen. Die überstehende Flüssigkeit war so wie sie ist, gebrauchsfertig oder zur weiteren Verarbeitung zur Gewinnung von Prothrombin-Koraploxfaktoren, Antithrombin III oder beliebigen anderen Fraktionen geeignet, wie im folgenden beschrieben wird.

Z.B. fällt durch Einstellung des pH's der überstehenden ?^?lüssigkeit auf etwa i?»2 (den isoelektrischen Punkt des Prothr. in-Komplexes) und durch Zugabe von weiteren 3 % Blockmischpol; 'isat (insgesamt 18 %) der Prothrombinkomplex aus. Bei derselbe; Konzentration an Biockmischpolymerisat, jedoch bei einem pH von etwa 6,3 (dem isoelektrischen Punkt von Antithrombin III) fällt Antithrombin III aus und läßt von Hepatitis-begleitendem Antigen. freies Plasma als überstehende Lösung zurück, das natürlich selbst brauchbar ist. Es ist zu betonen, daß die Temperatur, bei der diese Fraktionierung durchgeführt wird, unbeachtlich ist, da sowohl Prothrombin-Komplex als auch Antithrombin III wärmebeständig sind. Die Temperatur ist lediglich kritisch, wenn, wie in Beispiel I, ein wärmeempfindliches Protein, wie z.B. der Faktor VIII, abgetrennt wird.

Die Wiederholung dieses Beispiels II unter Verwendung von 20 %, bezogen auf Gewicht pro Volumen, des in Beispiel 1 beschriebenen Blockmischpolymerisats mit geringerem Molekulargewicht der Bezeichnung "Pluronic F-38" führt zur Gewinnung einer überstehenden Lösung, die frei von Hepatitis-begleitendem Antigen ist, und eines Niederschlags, der Hepatitis-begleitendes Antigen enthält. Im allgemeinen sind die zur Durchführung der vollständigen Abtrennung mit dem Pluronic F-38 von niedrigerem Molekularrgewicht benötigten Konzentrationen um ein geringes höher als

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bei Verwendung von Pluronic F-GB, jedoch nahezu die (rleichen. Dieses Beispiel Π wurde als eine Stufe in einem Verfahren zur Abtrennung von Prothrorabinkoinplex-i'aktoren aus Plasma durchgeführt, das ursprünglich Hepatitis-beg!aitendes Antigen enthält. Die Pro throffibinkoiupl ex-Faktoren, die beim Verfcdiren in Form eines Prothroinbinkoiaplox-Konaeiitrats erhalten werden, si.no frei vor. Hepati ti s-begl ei t endein Antigen.

Die wie in diesem Beispiel II gewonnene überstehende Flüssigkeit wird vjeiterverarbeitet, indem man den pH mit 1n Salzsäure auf 5,2 einstellt und man läßt sich währand 30 min einen Niederschlag ausbilden, während das Gemisch kontinuierlich gerührt wird. Der erhaltene Niedex'schlag wird in mit Citrat versehener Salzlösung gelöst und durch Milliporenfiltration sterilisiert.

Die Durchführung des Verfahrens geiräß dieses Beispiels II als eine Stufe bei der Herstellung von Faktor IX-Konzentraten ergibt die Herstellung eines von Heptatitis-begleitendem Antigen freien Materials. Die überstehende Lösung, die das Produkt bei der Durchführung des Verfahrens gemäß Beispiel II ist, v.'ird bei pH 5,2 ausgefällt, gewonnen und zur Verwendung sterilisiert.

Die V/iederholung dieses Beispiels II unter Verwendung von Fraktion III oder IV als Ausgangsmaterial ergibt ebenfalls die Herstellung eines von Hepatitis-begleitendem Antigen freien Produkts.

Beispiel III

Mit Citrat versetztes, durch Gefrieren ausgefälltes Blutplasma, das Jlepatitis-begleitendes Antigen enthielt, wurde bei 2 bis 5°C aufgetaut und das erhaltene flüssige Plasma bei 5000 g 15 min

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lang zentrifugiert. Me überstehende Piasinaflüssigkeit wurde von dem durch Gefrieren ausgefällten Niederschlag (Kryopräcipitat) dekantiert. Dan erhaltene Kryopräsipitat wurde in 0,15 molarer Natriumchloridlösunp;, die als Puffer 0,02 molares Dreimavoluiaens aufwies, extrahiert und der pH wurde mit 1 η Salzsäure auf 6,5, den isoelektrischen Punkt von Fibrinogen, eingestellt.In einer ersten Abtrennungsstufe wurden 2 %, bezogen auf Gewicht pro ersten Abtrennuugsstufe wurden 2 %, bezogen auf Gewicht pro Volumen, eines Blockmischpolymerisats dem Gemisch zugesetzt. Das Gemisch enthielt etwa 3 % Gesamtprotsin, bezogen auf Gewicht pro Volumen. Das verwendete Blockmischpolymerisat ist das in Beispiel I beschriebene der Handelsbezeichnung "Pluronic F-68". Das Gemisch wurde etwa 30 min lang bei etwa 22°C gerührt und der erhaltene Niederschlag durch Zentrifugieren während 30 min bei 5000 g abgetrennt. Der von Hepatitis-begloitendem Antigen freie Fibrinogen-Niedercchlag wurde von der überstehenden Kryoflüssigkeit (Cryosupernate), die das Hepatitis-· begleitende Antigen enthielt, abgetrennt. In einer zweiten Trennstufe wurde die überstehende Kryoflüssigkeit (Cryosupernate) auf etwa 3°C abgekühlt, der pH auf 6,8, den isoelektrischen Punkt des Faktors VIII, eingestellt und eine zusätzliche Menge an "Pluronic F-68" in dem Gemisch gelöst, um die Gesamtkonzentration an diesem Blockmischpolymerisat auf 5 %·> bezogen auf Gewicht pro Volumen, zu bringen. Die Temperatur wurde auf 3°C eingestellt, sie kann jedoch bis 10°C betragen, ohne den Faktor VIII zu schädigen. Das erhaltene Gemisch wurde 30 min lang gerührt und der erhaltene Niederschlag bei 5000 g 30 min lang zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag enthielt von Hepatitis-begleitendem Antigen freien Faktor VIII. Die überstehende Flüssigkeit, die das Hepatitis-begleitende Antigen enthielt, wurde verworfen.

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Die Wiederholung dieses Beispiels III unter Verwendungvon Pluronic F-68-Konz; ent rat ionen von 4,5 % in der ersten Stufe und 3*5 % in. aufeinanderfolgenden Beispielen in der zweiten Stufe ergibt ebenfalls die Herateilung von Fibrinogen- und Paktor VlII-Niederschlagen, die von Hepatitis-begleitea.dem Antigen frei sind. Verschiedene Niedersehlagszoiten in der ersten und zweiten Stufe von 15 bis 30 rain sind zur Durchführung der benötigten Ausfällung wirksam. Der Ersatz des in Beispiel I oben beschriebenen Blockmischpolymerisats, das mit der Handelsbezeichnung "Pluronic i'-i>8" bezeichnet wurde, in diesem Beispiel ergibt ebenfalls die Herstellung von Fibrinogen- und Faktor VIII-Niederschlagen, die von Hepatitis-begleitendem Antigen frei sind.

Die Ionenkonzentration der verschiedenen wässrigen Plasmagemische, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 0,5 bis 0,05 -molar an Natriumchlorid und vorzugsweise von etwa 0,20 bis 0,10 molar an Natriumchlorid. Bei Konzentrationen, die unter 0,05 molar an Natriumchlorid liegen, ist es sehr schwierig, das Hepatitis-begleitende Antigen entweder in der flüssigen oder in der festen Phase zu isolieren. Bei Ionenstärken über etwa 0,5">*olar an Natriumchlorid beginnt die Stärke der Koagulationsfaktoren verschlechtert zu werden. Aus Bequemlichkeitsgründen und aus Gründen der Sicherheit wird die Ionenkonzentration im allgemeinen bei etwa dem physiologischen Wert von 0,15 molarem Natriumchlorid gehalten.

Die Temperaturen, bei denen die verschiedenen Verfahren gemäß der Erfindung durchgeführt werden können, liegen zwischen etwa 0 und etwa 39⁰C. Oberhalb 39°C wird die Stärke gewisser Koagulationsfaktoren sehr schnell zerstört und unter O⁰C tritt das

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Probleii auf, daß die verwendeten vräsf-rigon Lösungen gefrieren. In allgemeinen υ erden die seil ektiven FälluBHjpvorgänge, die angewandt werden, bei etua 22 G durchgeführt, so daß keine- besonderen Kühl- (.»der Wärroevorfahren benötigt v/erden- Eatürlich muß die Ji'rsktionierurig, wenn ein besonderes wärineempfindliehes Protein, z.B. Faktor VIII, abgetrennt wird, bei Temperaturen erfolgen, die das Protein sicher überstehen kann.

Im allgemeinen sollte der pH bei Weiten zwischenetwa 6,5 und 7,5 gehalten v/erden, um die Abtrennung durchzuführen und eine Verschlechterung der Stärke gewisser Koagulationsfaktoren zu vermeiden. Die Abtrennung des Hepatitis-begleitenden Antigens erfolgt im allgemeinen innerhalb dieses pH-Bereichs leichter.

Die Verfahren zur Entfernung des Hepatitis-begleitenden Antigens gemäß der vorliegenden Erfindung können bequem als ein Schritt in einem sonst üblichen Konzentrations- oder Fraktionierungsverfahren durchgeführt werden.

Zusammenfassend wix^d das Hepatitis-begleitende Antigen aus Plasma und Plasmafraktionen entfernt, indem das PlaoDa rait Äthylenoxid-Propylenglykol-Kondensaticnsprodukt bei einer Temperatur von etwa 0 bis 39 C vermischt wird. Unter diesen Bedingungen wird ein Niederschlag gebildet. Die Konzentration des Kondensationsprodukts wird so eingestellt, daß das gesamte Hepatitis-begleitende Antigen entweder im Niederschlag oder in der flüssigen Phase bleibt. Die Abtrennung der· erhaltenen flüssigen und festen Phasen ergibt eine flüssige Phase, die vollständig von dem unerwünschten Antigen frei ist. Die Konzentration an Kondensationsprodukt, die benötigt wird, um vollständige Ausfallung des Hepatitis-begleitenden Antigens zu erreichen, steigt mit wachsender Temperatur von einen V/ei't von etvia 9 %·, bezogen auf Gewicht pro Volumen, bei et\:a 0⁰C bir

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auf einen Voi't ν οι: etwa 28 % bei etwa 39 C. Lac gesagte Hepatitin-beglcitcnde Antigen bleibt in der flüssiger] Phase bei Kond£-iir-atiojQsprodukt-!£ouüeir!,.vationeii von v.^reriiger als etwa 7 % bei etwa 0⁰G und über 15 % bei etwa 39°C. Bei dazwischenliegenden Konzentrationen erscheint das Hepatitisbsgleitende Antigeu in beide]"» Phasen.

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Claims

Pat entansprüch

1, Verfahren zur Abtrennung des Hopatitis-bogleitemien Antigens von bestimmten gev/ünschten Blutpiasma-Fralctionen, dadurch g e k e u r. ζ ei chnet, daß Kinn zu einer väfssrigpri Blutpl'jiGiaa-Mischuns, die Hepatitis-begle.itcndes Antigon und die gevj uns eilten Blutplasma-Fraktionen cotMlt, ein BlockniiBcr-xioiy-· uic.riijat von Äthylenoxid und Polyo^cypropylen in einer solchen Menge und bei einer solchen Temperatur zusetzt, die ausreichend ist, um das Gemisch eine feste und eine flüssige Phase bilden zu lassen, wobei das gesamte Hepatitls-begleitende Antigen in einer der Phasen vorliegt, und die Phasen trennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Men^e des Blockniischpolymerisats von wenigstens etwa 9 %'. bezogen out." Gewicht pro Voluuen, bei etwa O⁰C bis etwa 28 %, bezogen auf Gewicht pro Volumen, bei etwa 29°C reicht,

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wobei das gesamte Hepatiti . κ-bcglei teride Antigen in der lesocxi Phase vorliegt.
3· Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Kcr[■;;.: des BJxcki'iiF.chpolymerisats von weniger als etwa 7 %■> bezogen auf Gewicht pro Veüurjen, bei etv/a 0 C bis weniger al π elva 15 %, bezogen auf Gev.'icht pro Volumen, bei etv/a 39 C beträgt, v/obe.i. diis {.-,etarnte Hepatitisbegleitende Antigen in der flüssigen Phase vorliegt.
4. Verfahren nach einen] der Ansprüche 1 bi;j y, dadurch gekennzeichnet , daß die v/äsiiX'ige Elutplasmaraicichuiig konzentriertes Blutplasma ist.
5- Verfahren nach Anspruch 2 oder 4, dadurch g e k e η u zeichnet , daß die Il&nge des Blockmischpolymerisate etwa 15 % und die Temperatur etv/a 20⁰C betragen und in tfesj Verfahren weiterhin die flüssige Phase zur Verwendung als selche gewonnen v/ird oder davon gewünschte Blutplasma-Fraktionen abgetrennt werden, indem man ihx'en pH auf el\;u den inoelektri iichen Punkt dieser Fraktionen einstellt, die LTom'.ontratiar.. an Blockmischpolymeri^at genügend erhöht;, u;n die .Vr.-■.]:!■ ionen auszufällen und die ausgefällten Fraktionen von dor ül>erstt;hendcn Flüssigkeit abtremit.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch g e k e η η ζ eic hn e t , da.Q die Konzentration an Blockmischpolynierisat auf etwa wenigstens 18 % erhöht und der pH zuerst auf etwa 5,2, um Prothroiübinkomplex auszufällen, und dann auf etwa 6,y eingestellt wird, um Antithrombiη III auszufällen.

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7* V erfahr an räch Anspruch 3 oder 4, dadurch g e k e η r< -zeichnet , daß die Menge des Blocktiäschpol^tnerisats etwa 6 % und die Tempei'atur etwa 14⁰C betragen und beim Verfahren ferner die feste Phase, die aus fibrinogen besteht, gewonnen wird und die Blockmiscbpolymerisat-Konzentration dor flüssigen Phase auf etwa 21 % und die Temperatur auf etwa 20⁰C erhöht v/erden, wodurch ein Niederschlag von Hepatitis-begleitandern Antigen gebildet wird und eine gev/ienbare und brauchbare flüssige Phase als überstehende Flüssigkeit zurückgelassen wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4 und/oder 7i dadurch gekennzeichne t , daß die Menge des Blockmischpolymerisats etwa 2 % und die Temperatur etwa 22⁰C betragen und beim Verfahren ferner die feste Phase, die aus Fibrinogen besteht, gewonnen wird und danach die Blockmischpolymerisat-Konzentration auf 6 % erhöht, die Temperatur der flüssigen Phase auf 3°C und den pH auf 6,9 erniedrigt werden, um den Faktor VIII auszufällen und eine flüssige Phase, die Hepatirisbegleitendes Antigen enthält, zurückzulassen.

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