DE2705366A1 - Empfindlicher ph-indikator - Google Patents

Description

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Dr. RUSCHKE & PARTNER PATENTANWÄLTE

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Quadratur Berlin TELEX: 1S37W

TELEX: 522717

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IicDonnell Douglas Corporation., Long Beach, California, V.St.A.

iiVrofindlicher oll-Indikator

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einen pH-Indikators aus reduziertem Anilinblau zur Verwendung bein liachv/eis von Ialcroorganismen in Kulturnedien.

Die Technik hat Mechanismen und Vorrichtungen entwickelt, die zur Untersuchung von Proben auf spezielle KikroOrganismen hin geeignet sind, wobei eine Kunststoffplatte oder -karte verwendet wird, welche eine Reihe von Trockenkulturrnedien enthält, die sich in gesonderten, aber miteinander verbundenen Zellen befinden. Dabei ist jedes dieser Medien eines einzigen Organismus gegenüber

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spezifisch. Wenn die Probe in die Karte eingeführt, mit den Medien in den Zellen vermischt und in einer Vorrichtung bebrütet wird, reagiert der in der Probe vorhandene Organismus (oder reagie ren die Organismen) mit dem gegenüber dem betreffenden Organismus spezifischen Kulturmedium und führt zu einer Änderung in dem Medium, welche von der Vorrichtung abgelesen wird und das Vorhandensein des betreffenden Organismus anzeigt. Die Änderung in dem Medium ist mit einer Änderung der Lichtdurchlässigkeit des Mediums, d.h. einer Farbänderung oder einer Änderung der Trübung, verbunden. Die Änderung kann durch metabolische Aktivität des Organismus verursacht werden, die z.B. die Bildung von Säure und eine Änderung des pH-Werts bewirken kann, was zu einer Farbänderung eines pH-empfindlichen Indikators in dem Medium führt. Die Änderung der Lichtdurchlässigkeit des Mediums kann auch durch ein sich in dem Medium bildendes Präzipitat, und zwar aufgrund der metabolischen Aktivität des Organismus, oder durch Wachstum des Organismus hervorgerufen v/erden.

Die für eine Verwendung in den oben beschriebenen Karten vorgesehenen spezifischen Mittel sollen das Wachstum eines Mikroorganismus fördern und das Wachstum von anderen Mikroorganismen hemmen, gefriergetrocknet werden können und unter den Bedingungen niedriger 0₂-Konzentration, die in den Hohlräumen der Karte herrschen, betriebsfähig sein.

Bei Medien zur Feststellung von E.coli, Hefe und Pilzen und zur

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Spezifizierung wird das Vorhandensein von jedem dieser Mikroorganismen durch metabolische Aktivität des Organismus ermittelt, die zur Bildung von Säure und zur Änderung des pH-Werts führt.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen in dem Medium enthaltenen pH-Indikator vorzuschlagen, der die Farbe bei der geringsten Änderung in Richtung eines sauren pH-Werts ändert, so daß sich die Lichtdurchlässigkeit des Mediums sehr schnell ändert und dadurch eine sehr schnelle Bestimmung des Mikro Organismus ermöglicht wird, der durch den oben beschriebenen Mechanismus zur Untersuchung von Proben identifiziert werden soll.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird ein Verfahren zur Reduktion des Farbstoffs Anilinblau vorgeschlagen, so daß dieser einer Farbänderung bei Verschiebung des pH-Werts in Richtung eines sauren pH-Werts unterliegt und dadurch die Lichtdurchlässigkeit eines Mediums, in dem der Farbstoff enthalten ist, ,ändert. Eine derartige Änderung des pH-Werts wird durch Bildung von Säure verursacht. Die Farbe des reduzierten Anilinblaus ist bei einem pH von 7,0 gelbbraun oder farblos. Nach Bildung von Säure durch unbekannte Mikroorganismen verändert sich die Farbe des reduzierten Anilinblaus in blau. Diese Änderung findet innerhalb von 12 bis 18 Stunden statt, wodurch eine schnelle Feststellung von Mikroorganismen in klinischen Proben mit dem Analysenmechanismus, der Blau feststellt, ermöglicht wird.

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Das Reduktionsmittel der Erfindung ist Natriumthioglykolat (sodium thioglycollate). Dieses Reduktionsmittel ist bei der Erfindung geeignet, weil es nicht das Wachstum von Mikroorganismen hemmt, wie es sonst brauchbare chemische Reduktionsmittel tun.

Die Erfindung schlägt ein Verfahren zur Reduktion von Anilinblau vor, so daß das reduzierte Anilinblau als hochempfindlicher pH-Indikator in Kulturmedien wirken kann, die zur Verwendung in den Karten und Behältern eines Analysenmechanismus vorgesehen sind.

Das Reduktionsmittel gemäß der Erfindung ist Natriumthioglykolat. Dieses Reduktionsmittel ist von Bedeutung, weil es nicht das Wachstum der Mikroorganismen hemmt, die durch den oben beschriebenen Mechanismus festgestellt werden sollen.

Der Indikator aus reduziertem Anilinblau zeigt die Bildung von Säure sehr schnell an. Außerdem unterliegt der Indikator nicht Fehlern, die durch Anwesenheit von Protein in Kulturmedien verursacht werden.

Der Anilinblau-Indikator der Erfindung wird durch Reduktion von Anilinblau mit Natriumthioglykolat hergestellt.

Das Anilinblau ist wasserlöslich und kann vorteilhafterweise

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von Nutritional Biochemical Co. bezogen werden. Zur Herstellung einer Grundlösung von Anilinblau sollen etwa 4»0 bis etwa 6,0 g Anilinblau je 500 ml Grundlösung und vorzugsweise 5»0 g je 500 ml verwendet werden.

Im allgemeinen ist Anilinblau kein besonders wertvoller pH-Indikator, weil er ziemlich langsam auf pH-Änderungen bei Umsetzungen anspricht. Außerdem unterliegt er in Gegenwart von Protein leicht Fehlern.

Das Anilinblau ist durch das Verfahren der Erfindung verändert worden, indem es reduziert worden ist und mindestens eine Aminogruppe und möglicherweise zwei Amingruppen entfernt worden ist bzw. sind. Durch diese Reduktion wird sehr stark die Geschwindigkeit erhöht, mit der Anilinblau Änderungen des pH-Werts anzeigen kann. Außerdem ergibt das Anilinblau zuverlässige Resultate in Gegenwart von Protein.

Das Verfahren zur Reduktion von Anilinblau wird durchgeführt, indem man das Anilinblau in Gegenwart von Natriumthioglykolat (vorzugsweise von Nutritional Biochemical Company) kocht.

Anilinblau könnte durch andere Reduktionsmittel reduziert werden. Das durch ein Reduktionsverfahren unter Verwendung eines anderen Reduktionsmittels als Natriumthioglykolat gebildete reduzierte

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Anilinblau neigt jedoch zu einer Hemmung des Wachstums von Mikro Organismen, die nachgewiesen werden sollen.

Es ist erwünscht, daß 100 % des zu verwendenden Anilinblaus reduziert worden sind. Wenn weniger als 100 % reduziert worden sind, ist der Indikator unbeständig, d.h. oxidiert er sich leicht beim Stehen.

Bei einem pH von 7,0 ist das reduzierte Anilinblau der Erfindung von gelbbrauner Farbe bis farblos. Unter sauren Bedingungen ändert sich die Farbe des reduzierten Anilinblaus von Gelbbraun oder vom Farblosen zu Blau. Diese Änderung wird von dem Analysenmechanismus festgestellt und aufgezeichnet.

Grundsätzlich erfordert das Verfahren zur Reduktion von Anilinblau, so daß letzteres für eine Verwendung als Indikator für E.coli in einer Untersuchungsbrühe und für Candida-Hefe und andere Pilze geeignet ist, die folgenden Schritte:

(1) Auflösen von 5 g wasserlöslichen Anilinblaus in einer Mischung, die 100 ml 1-n Natronlauge und 400 ml destilliertes Wasser enthält, durch Rühren, begleitet von leichtem Erwärmen;

(2) Zugeben von 7,5 g Natriumthioglykolat zu dem Gemisch des Schritts 1 und Kochen des erhaltenen Gemische für etwa 45 Minuten, wobei das 500rml-Volumen erhalten bleibt;

(3) Wiederholen des Schritts 2 mit kleineren Mengen Natrium-

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thioglykolat und kürzeren Kochzeitspannen, bis 100 % des Anilin blaus reduziert worden sind;

(4) Abkühlen der Zubereitung mit reduziertem Anilinblau;

(5) Einstellen der Lösung auf 500 Teile durch Zugabe von destilliertem Wasser.

Die Verwendung von überschüssigem Natriumthioglykolat ist für das Verfahren nicht nachteilig. Das Haupterfordern!s ist, daß 100 % des Anilinblaus reduziert worden sind.

Die vorstehend beschriebene Behandlung führt zu einer Entwicklung von Ammoniak aus dem Anilinblaumolekül und ergibt ein Gemisch von Farbstoffen, die hochgradig pH-empfindlich sind, d.h. diese Farbstoffe reagieren bei einer geringen Änderung des pH-Werts. Der Indikator aus reduziertem Anilinblau beginnt in Gegenwart von Säure, die Farbe zu ändern. Beim pH 7,0 ist reduziertes Anilinblau gelbbraun bis farblos. Unter saufer Bedingung ist reduziertes Anilinblau blau. Das Anilinblau verändert bei pH-Werten von 6,4 bis 6,6 vollständig die Farbe.

Beispiel

In eine 1000-ml-Mensur werden 5,0 g Anilinblau, 100 ml 1-n Natronlauge und 400 ml destilliertes Wasser eingetragen. Das Gemisch wird gerührt, um das Anilinblau zu lösen. Die Lösung wird dann etwas erwärmt. Danach wird die Lösung zum Sieden erwärmt

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und bei dieser Temperatur für 45 Minuten gehalten. 2,5 g llatriumthioglykolat v/erden zu der Lösung gegeben, und letztere wird dann für 10 Minuten am Sieden gehalten. Dann werden 2,0 g Natriumthioglykolat zu der Lösung gegeben und wird letztere für 3 Minuten am Sieden gehalten. Die Lösung kann sich dann abkühlen. Destilliertes Wasser wird zugegeben, bis das Volumen 500 ml erreicht hat. Der letzte Schritt sollte in einer Mensur ausgeführt werden.

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McDonnell Douglas Goriooration, Long Beach, California, V.St.A.

Empfindlicher pH-Indikator

Patentansprüche

1. Verfahren zur Reduktion von Anilinblau, dadurch gekennzeichnet, daß man Anilinblau in einer alkalischen Lösung löst und

^: die Lösung in Gegenwart von Hatriunthioglykolat kocht, bis das ι Anilinblau reduziert worden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

man etwa 8 bis etwa 12 g Anilinblau je Liter verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichjnet, daß man als alkalische Lösung Natronlauge verwendet.

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a. Vcr3?ahron nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man etwa 10 bis etwa 1G g Uatriuintliioglykolat je Liter verwendet.

5. Verfahren nach einer.i der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nan die Kochstuze unter Verblendung fortschreitend kleinerer Mengen ITatriunthioglykolat und für fortschrei}-tend kürzere Zeitspannen wiederholt, bis das gesamte Anilinblau reduziert worden ist, und man die Lösung von reduziertem Anilinblau abkühlt.

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