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DE2641840C2 - Verfahren zum Reinigen eines Antiserums - Google Patents

Verfahren zum Reinigen eines Antiserums

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DE2641840C2
DE2641840C2 DE2641840A DE2641840A DE2641840C2 DE 2641840 C2 DE2641840 C2 DE 2641840C2 DE 2641840 A DE2641840 A DE 2641840A DE 2641840 A DE2641840 A DE 2641840A DE 2641840 C2 DE2641840 C2 DE 2641840C2
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plasma
antiserum
blood
blood plasma
complex
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DE2641840A
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Desire Winksele Collen
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Katholieke Universiteit Leuven
Original Assignee
Katholieke Universiteit Leuven
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
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    • G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin
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Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reinigen Antiserums gegen einen Enzym-Inhibitor-Komplex, der Teil des aktivierten Blut-Koagulations- oder fibrinolytischen Systems des Blutplasmas ist
Antiseren der genannten Art sind bekannt und beispielsweise in der Literaturstelle »Collen, Thrombosis Research«, 7 (1975), S. 235-238, beschrieben. Sie dienen der Diagnose von intravaskulären Blut-Koagulationen sowie Hyperfibronolyse des Blutplasmas durch La- bor-Verfahren.
Nach Operationen, Geburten, schweren Verletzungen oder Infektionen steigt bekanntlich die Gefahr venöser Thrombosen, während sonst arterielle Thrombosen häufiger sind. Des weiteren ist es bekannt, daß man- ehe Patienten ein abweichendes Verhalten zeigen, welches als Hyperfibrinolyse bekannt ist. Im Hinblick auf die beachtlichen Folgen dieser Phänomene, wie Embolien, Gehirnblutungen, Herzinfarkte usw. ist es erwünscht, über einen klinischen Diagnosetest zu verfü- gen, mit dem es möglich ist, intravenöse Blut-Koagulationen bereits in einem frühen Stadium zu erkennen. Ein derartiger Test ist der in der Literaturstelle »Collen« beschriebene Aglutinations-Inhibitionstest.
In der erwähnten Literaturstelle ist auch ein Reinigungsverfahren für die erforderlichen Thrombin-Antithrombin- und Plasmin-Antiplasmin-Antiseren beschrieben. Das Verfahren wird durch Immunopräzibitation mit frischem Blutplasma oder in anderer Ausführungsform durch Chromatographie über insolubisier- tem frischem Blutplasma durchgeführt. Diese Verfahren sind verhältnismäßig kompliziert, so daß die Aufgabe besteht, ein weiteres Reinigungsverfahren für die erwähnten Antiseren anzugeben.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird vorgeschlagen, daß das Antiserum mit Plasminogen und frischem Blutplasma inkubiert, darauf die Gamma-Globulin-Fraktion aus dem Antiserum isoliert und resuspendiert wird. Das Verfahren ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß es bei einem Plasmin-Antiplasmin-Antiserum angewandt wird.
Des weiteren wird speziell zur Herstellung eines Reagenzes zur Anwendung bei einem immunochemischen Bestimmungsverfahren vorgeschlagen, daß ein Latexformteilchen aus synthetischem Harz mit einem Antiserum in Berührung gebracht wird, welches nach den erwähnten Verfahrensschritten hergestellt worden ist Das so gewonnene Reagenz kann mit Vorteil bei einem Verfahren zur Bestimmung einer Aktivierung des Blut-Koagulations- und fibrinolytischen Systems im Blutplasma angewandt werden, indem es mit dem zu untersuchenden Blutplasma zusammengebracht und die Aglutinationsreaktion beobachtet wird.
Die Erfindung wird im folgenden anhand einiger Ausführungsbeispiele näher erläutert
Beispiel 1
Isolation des Plasmin-lnhibitor-Kompiexes aus Blutplasma
Die Plasmin-lnhibitor-Komplexe werden aus Blutplasma isoliert, weiche mit Streptokinase oder Urokinase, zu welcher Spuren von radioaktiv markiertem Plasminogen gegeben wurden, aktiviert Die Isolation wurde durch Oberflächenchromatographie an Lysin-Agarose und Gelfiltration an Sephadex G-200 ausgeführt
Ausgangsmaterial
Blutbank-Plasma von normalen Spendern, gebunden an einen ACD-Koagulator, diente als Ausgangsmaterial. Streptokinase (Kabikinase der Firma Kabi AB, Stockholm) und Urokinase (von Abbott, Nord Chicago, Illinois, USA) wurden als Aktivatoren verwendet Das radioaktiv markierte Plasminogen wurde wie folgt hergestellt: Menschliches Plasminogen wurde aus einer frisch gefrorenen Plasmaprobe durch Oberflächenchromatographie an Lysin-Agarose, Gelfiltration an Sephadex G-150 und Chromatographie an DEAE-Sephadex erhalten, wie dies in der Arbeit von D. Collen, »Plasminogen- und Prothrombinmetabolismus des Menschen«, Universität von Leuven, Belgien, 1974, beschrieben ist. Aus diesem höchst gereinigten Material wurden die beiden Hauptformen des Plasminogen durch Oberflächenchromatographie an Lysin-Agarose abgeschieden. Die beiden Formen, welche als Plasminogen Ai (erster peak) und Plasminogen A2 (zweiter peak) identifiziert wurden, wurden jeweils mit 125J und 131J markiert; entsprechend der Anweisung von McFarlane in der Zeitschrift» Nature«, (London) 182,53,158.
Isolation
Spuren von l25J-Plasminogen-Ai und l3lJ-Plasminogen-A2 wurden zu je ein Liter Blutplasma gegeben, und danach wurde das Plasma durch Zusatz von 250 bzw. 500 CTA-Einheiten Aktivator pro ml Blutplasma aktiviert und bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Danach wurde das aktivierte Plasma durch eine Lysin-Agarose-Kolonne von 2,5 χ 45 cm Abmessungen geleitet, die mit einem 0,1 m-Phosphatpuffer von pH 7,5 bei einer Geschwindigkeit von 50—70 ml pro Stunde äquilibriert war. Nicht absorbiertes Protein wurde durch Waschen mit dem Äquilibrationspuffer entfernt. Unter die-
sen Umständen wurden wenigstens 90% der Radioaktivität in der Kolonne zurückgehalten. Die Elution wurde mit linearem Gradienten, enthaltend 500 ml 0,1 m-Phosphatpuffer von pH 7,5 als Startpuffer, ausgeführt und 500 ml 0,1 m Phosphat 0,013 m s-Aminocapron-Säure von pH 7,5 als Endpuffer. Das Elutionsprofil der Radioaktivität enthielt sechs peaks, die, in der Folge der Elution, wie folgt identifiziert wurden: (1) l25J-Plasmin Ai-«2-Makroglobulin, (2) 131J-PIasmin A2-«2-MakrogIobulin, (3) ' 25J-PIaSmIn At-Antiplasmin, (4) und (5) 131J-Plasmin A2-Antiplasmin und als Rückstand 125J-Plasminogen Ai und (6) als Rückstandi31 J-Plasminogen A2.
Verschiedene Fraktionen des Chromatogramms wurden durch Ultrafiltration konzentriert und durch Gelfiltration auf Sephadex G-200 weiter gereinigt, wonach die Elutionssequenz war: (1) 12SJ-PIasmin Ar«2-Makroglobulin-Komplex und 131J-Plasmin A2-«2-Makroglobu-Iin-Komplex im Füllvolumen der Kolonne, (2) 125J-PIaS-min Ai-Antiplasmin und 13IJ-Plasmin A2-AntiplasKiin, kurz vor dem Olobulinpeak durch Chromatographie des Plasmas erhalten, und (3) 125J-P!asmmogen At und 131 J-Plasminogen A2. eluiert aus dem Bereich zwischen Globulinen und Albuminen.
Die Fraktionen verschiedener Sephadex G-200-Kolonnen wurden später zu drei großen Fraktionen entsprechend den eben aufgeführten Gruppen 1, 2 und 3 vereinigt Diese Fraktionen wurden dialysiert gegen destilliertes Wasser und lyophilisiert Die durchschnittlichen Ausbeuten aus ach Isolationstests von einem Liter Blutplasma waren: 14,5 Einheiten O.D. bei 280 nm pro 100 ml des Plasnris der ersten Fraktion (im folgenden als Ρ-Λ2Μ bezeichnet) und 73 Einheiten pro 100 ml des Plasmas in der zweiten Fraktion (im folgenden als P-AP bezeichnet).
35
Identifikation
Bei der Gel-Elektrophorese der Fraktion Ρ-λ2Μ an SDS-Polyacrylamid wurde ein Proteinband beobachtet, welches praktisch nicht in das Gel wanderte (Molekulargewicht über 400 000). Bei der Wiederholung dieses Testes nach Reduktion mit Dithiothreitol (DTT) wurden verschiedene Bänder beobachtet, von denen das erste ein Molekulargewicht von 95 000 aufwies. Die Immuno-Elektrophorese nach Laurell in einem Gel mit «2-Makroglobulin-Antiserum bestätigte die Identität mit dem P-«2-M-KompIex. Der Komplex reagierte nicht mit Antisera gegen «i-Antitrypsin, Ci-lnhibitor, Antithrombin III und Inter-«-Trypsin-lnhibitor.
Bei der Gel-Elektrophorese von P-AP an Polyacrylamid wurden zwei Proteinbande erhalten mit einem Molekulargewicht von rund 120 000 und rund 140 000. Nach Reduktion mit DTT wurden zwei Proteinbande mit Molekulargewichten von rund 65 000 und rund 15 000 beobachtet. Bei der Immuno-Elektrophorese nach Laurell in Gelen mit Antisera gegen *i-Antitrypsin, as-Makroglobulin, Ci-Esteraseinhibitor, Inter-Λ-Trypsininhibitor, Antithrombin III und «2-Antichymotrypsin wurde keine Bildung von Niederschlägen beobachtet. Auf der anderen Seite wurde bei diesem Test eine Reaktion mit Antiserum gegen P-AP Komplex erhalten, welches mit gereinigtem Plasminogen absorbiert war. Dies deutet an, daß P-AP ein Komplex zwischen Plasmin und einem Plasmaprotein mit Antiplasmineigenschaften ist, die vorher nicht identifiziert worden sind und welche im folgenden Antiplasmin genannt wer e\pn sollen
Beispiel 2
Isolation des
Thrombin-Antithrombin-III-KompIexes
aus Blutplasma
Der Thrombin-Antithrombin-HI-Komplex wurde aus Blutplasma isoliert, welches mit Reptilase defibriniert und bei dem der Koagulationsmechanismus aj$ dem beschriebenen Weg aktiviert war. Die Isolation wurde durch Oberflächenchromatographie an Heparin-Sepharose und Gelfiltration an Sephadex G-200 ausgeführt.
Ausgangsmaterial
Blutbankplasma von normalen Spendern, gebunden an ACD-Antikoagulant, diente als Ausgangsmaterial. Zur Defibrination wurde Reptilase (eine Defibrase der Firma Pentapharm, Basel) verwendet, während für die Aktivierung des Koagulationssystems Kalziumchlorid und ein Phospholipoid (Thrombofax der Firma Ortho Pharmaceutical Company) angewandt wurde. Darüber hinaus wurde radioaktiv markiertes Prothrombin verwendet, welches durch Markieren von gereinigtem menschlichem Prothrombin mit 125J in der Arbeitsweise von McFarlane erhalten worden war.
Aktivierung
Zu zwei Literportionen des Blutplasmas wurde Defibrase in einer Menge von 1 ml pro Liter gegeben, wonach das Plasma zur Koagulation 4 Stunden lang auf 37ttC erwärmt und dann über Nacht in einem kühlen Raum gelagert wurde. Das gebildete Fibrin wurde gradweise entfernt durch Auswalzen auf einem Glasblock. Eine Spur von 12SJ-Prothrombin wurde zum defibrinierten Plasma gegeben, wonach das Koagulationssystem durch Zugabe von 28 ml 1 m CaCb und 40 ml Thrombofrax pro Liter defibriniertes Plasma s^tiviert wurde. Die Aktivation des Koagulationssystems folgte auf der Basis der graduellen Reduktion des anwesenden Prothrombins. Nach etwa 1 Stunde war der Restgehalt an Prothrombin kleiner als 5%.
Isolation
Zur Durchführung der Absorptionschromatographie wurde Heparin-Sepharose benutzt, welche gewaschen und ins Gleichgewicht gesetzt wurde mit 0,1 m tris-HCl, 0,15 m NaCl, 0,01 m Zitratpuffer von pH 7,5.150 ml dieser Heparin-Sepharose (Volumen nach Sedimentation) wi'rde mit 2000 ml defibriniertem und in der oben beschriebenen Weise für 2 Stunden bei Raumtemperatur aktiviertem Blutplasma gemischt. Alsdann wurde das Gel auf einem Buchner-Trichter mit 3 I Gleichgewichtspuffer gewaschen und in eine Kolonne geschüttet. Das absorbierte Material wurde mit einem Salzgradienten eluiert, enthaltend 500 ml 0,01 m tris-HCl, 0,15 m NaCl, 0,01 m Zitratpuffer pH 7,5 als Startpuffer und 0,01 m tris-HCl, 1 m NaCl und 0,01 m tris-HCl, 1 m NaCl und 0,01 m Zitrat pH 7,5 als Schlußpuffer.
Es wurden drei verschiedene Fraktionen erhalten, nämlich: (1) Lipoproteine, die speziell bei Beginn des Durchlaufes eluiert wurden und deren Gehalt von Präparat zu Präparat variierte; (2) ein Thrombin-Antithrombin III Komplex, der durch gleichzeitige Elution mit 125J und einem Antigen, bezogen auf Antithrombin III. bei einer Salzkonzentration von rund 0,4 m aufge-
deckt wurde, und (3) restliches Antithrombin III, welches im Anschluß an den peak der vorausgehenden Fraktion eluiert wurde.
Die Thrombin-Antithrombin III Fraktionen der verschiedenen Versuche wurden miteinander kombiniert und durch Ultrafiltration konzentriert. An dieser Stufe der Präparation wurde mit Lipoproteinen verschnitten, die aus ihrer Trübung in Lösung sowie ihrer geringen Beweglichkeit in einem Polyacrylamidgel bekannt waren. Danach wurde die Präparation weiter durch Gelfiltration an einer Kolonne aus Ultragel AcA 22 mit 2,5 χ 45 cm Abmessungen gereinigt, die im Gleichgewicht stand mit einem Puffer aus 0,1 m NaCl, 0,05 m Phosphat, 0,02% Azid pH=7,5. Hierbei wurden die Lipoproteine nahe dem FOllvoIumen der Kolonne eluiert Der Thrombin-Antithrombin Komplex (im folgenden als T-AT bezeichnet), der nach der Reinigung die Tendenz zur Aggregatbüdung zeigte, wurde in einem breiten peak eluiert Das freie Antithrombin III eluierte später. Die T-AT Fraktion aus verschiedenen Versuchen, lokalisiert durch Messung der l25J-Aktivität und eines Antigens zum Antithrombin III wurden kombiniert und durch Vakuumdialyse konzentriert Die Durchschnittsausbeute von vier Isolationstests, jeder mit einem Ausgangsmaterial von 2 1 Blutplasma begonnen, ergab 25 Einheiten O.D. pro Liter Plasma.
Identifikation Bestimmung des Titers
Für die Durchführung der Agglutinations-Tests wurde ein spezielles Reagenz aus roten Blutkörperchen hergestellt, welche mit einem gereinigten Komplex des Typs P-AP, P-«2m oder T-AT an der Oberfläche angereichert waren. Das Reagenz wurde durch Gerben von menschlichen roten Blutzellen der Blutgruppe 0 und anschließendes Kontaktieren mit einem der gereinigten Komplexe in der Weise hergestellt wie dies von Merskey et al für fibrinogene Spaltprodukfe beschrieben worden ist (siehe Proc. Soc. Exp. Biol. Med, 131, 871, 1969). Die verwendeten Mengen der Komplexe waren: eine Einheit O.D. (bei 280 nm) des P-AP-Komplexes, 2
Einheiten O.D. des T-AT-Komplexes und 5 Einheiten O.D. des P-«2m-Komplexes, gelöst in 100 ml Zitratpuffer. Das Reagenz wurde bei 4° C aufbewahrt und während eines Monats verbraucht
Von den Antisera wurden verschiedene Verdünnungen hergestellt worauf jede Verdünnung mit einem korrespondierenden Reagenz in Berührung gebracht wurde, worauf dann das Vorkommen der Hämaglutination beobachtet wurde. Die höchste Verdünnung, bei der Hämaglutination klar erkennbar war, wurde festgestellt und als Titer des Antiserums betrachtet. Es wurde gefunden, daß die erhaltenen Werte in beträchtlichem Maße divergieren, in Abhängigkeit von den verwendeten Versuchstieren und im Augenblick der Blutentnahme/
Bei der Elektrophorese von TAT auf einem SDS-Polyacrylamidgel wurde eine scharfe Proteinbande mit einem Molekulargewicht von rund 65 000 (freies Antithrombin III) beobachtet sowie ferner verwaschene Banden mit langsamer Wandergeschwindigkeit Nach der Reduktion mit DTT wurden drei scharfe Bänder erhalten, deren Molekulargewicht zwischen 65 000 und 95 000 bestimmt wurde. Unter diesen Bändern befanden sich Anthithrombin III und Thrombin-Antithrombin III.
Beispiel 3
Herstellung von Antisera
Präparation
Ratten wurden mit Plasmin-Antiplasmin-Komplex immunisiert (5 Ratten), mit Plasmin-«2-Makroglobulin-Komplex (2 Ratten) und mit Thrombin-Antithrombin HI-Komplex (4 Ratten). Zu diesem Zweck wurde der Komplex in 0,15 m Kochsalzlösung mit einer Konzentrat^ von 2 mg pro ml gelöst und mit 1 ml Zusatzmittel nach Freund vermischt. Von dieser Mischung wurde jeder Ratte 1 ml injiziert, und zwar verteilt auf die Fußsohlen, das S'ubkutangewebe des Nackens sowie die Oberschenkelmuskulatur. Dreimal danach, jedesmal mit einem Intervall von 1 oder 2 Wochen wurde eine gleiche Menge von Antigen verabfolgt, vermischt mit unvollständigem Zusatzmittel nach Freund und verteilt auf die subkutanen und intramuskulären Regionen. Beginnend etwa 1 Woche nach der vierten Infektion wurden 30—80 ml Blut zweimal die Woche durch Punktion aus den Ohrenarterien entnommen. Jedesmal wurden die Seren von 3 oder 4 aufeinanderfolgenden Blutentnahmen miteinander kombiniert und zusammen weiterverarbeitet. Die Titer der Antisera wurden mit Hilfe e;nes Hämagglutiantionr-i3stes bestimmt. Während einer Zeit von 3 Monaten wurden bis zu 500 ml Serum pro Ratte gewonnen.
Bestimmung anderer Bewertungsziffern
Um noch andere Bewertungsziffern zu erhalten, wurden zahlreiche Agglutinations-Inhibitierungs-Tests mit den erhaltenen Antisera ausgeführt bei denen das je-
weilige Antiserum mit einem Reagenz in Kontakt gebracht wurde, welches aus roten Blutzellen der oben beschriebenen Weise sowie einem Drittmaterial kontaktiert wurde, wonach das Vorkommen oder Nichtvorkommen der Agglutination festgestellt wurde. Frisches
in Blutplasma, Blutserum und urokinaseaktiviertes Plasma dienten als Drittmaterial. Das Serum wurde hergestellt durch koagulieren von Blut während einer Stunde bei einer Temperatur von 37° C, und es enthielt weniger als 5% Rest-Prothrombin. Das urokhraseaktMerte Plasma wurde durch Zusatz von 500 CTA-Einheiten Urokinase pro ml frisches Plasma und Inkobieren des Plasmas für 30 Minuten bei 25°C erhalten.
Bei jedem Versuch wurde der Titer des Drittmaterials durch Bestimmung der Verdünnung festgestellt, bei der Hämagglutinaiion eintrat. Jeder Titer wurde durch Bildung des Kehrwertes der gefundenen Verdünnung bestimmt.
Es wurde gefunden, daß frisches Plasma einen Titer von 32-512 foe T-AT, einen Titer von 32-64 für P-AP und einen Titer von 32-128 von P-«2rr. hatte. Serum inhibitierte 2—4mal mehr als Plasma aus T-AT, während urokinaseaktiviertes Plasma 4— 16mal besser inhibiiierte als frisches Plasma aus P-AP und 1— 2mal besser für Ρ-λ2γγ, Aus der Gesamtzahl dieser Versuche wurden die folgenden Bewertungsziffern abgeleitet: Em Serumplasma zeigte das Verhältnis 2—4 für T-AT und ein UK Piasma-zu-Plasmaverhältnis von 4—15 für P-AP und 1,2 für Ρ-λ2ιτ).
Inaktivierung von nicht spezifischen
Antikörpern
Bei graduellem Zusatz von frischem Plasma zu Antisera (bis zu einem Gehalt von 50% VoIVVoM wurde der
Titer des frischen Plasmas 2—4mal erniedrigt. Bei den Versuchen mit T-AT und P-AP und 1— 2mal bei den Versuchen mit P-«2m. Das Verhältnis zwischen den Titern des Serums und frischen Plasmas für T-AT erhöhte sich 2—4mai, ebenso das Verhältnis von UK Plasma zu Plasma für P-AP.
Beispiel 4
Reinigung des Antiserums
Ein P-AP-Antiserum, welches gemäß Beispiel 3 erhalten wurde, wurde gereinigt durch Inkubation mit Plasminogen und frischem Blutplasma, abgetrennt von der Gamma-Globulin-Fraktion und resuspendiert.
Zu einer frischen Antiserummenge von 1000 KIU Aprotinin (Trasylol von Bayer, Leverkusen, ein Protease-lnhibitor), 0,1 ml von gereinigtem Plasminogen und 0,16 ml frisches menschliches Blutplasma wurden pro ml hinzugefügt. Nach 15 rviinüien Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurde der Niederschlag durch Separation entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde im Verhältnis 1 :2 mit einem Puffer verdünnt (0,1 m NaCI, 0,05 m Phosphat, pH 7,0), wonach die Gamma-Globulin-Fraktion bei 4°C durch Zusatz von Ammoniumsulfat bis zur Sättigung (37,5%) abgeschieden wurde. Nach 30 Minuten langem Rühren wurde der Niederschlag abgetrennt, im ursprünglichen Volumen 0,1 m tris-HCI von pH 8.6 gelöst und gegen einen Puffer für eine Zeit von 2 Stunden dialysiert und schließlich durch Separation geklärt.
Beispiel 5
Latexreagenz für den Diagnostik-Test
Ein spezielles Reagenz für die Durchführung des klinischer. Diagnostik-Testes wurde durch Überziehender Oberfläche von Teilchen aus synthetischem Harz mit spezifischen Antikörpern gegen den P-AP-Komplex hergestellt.
Ein Latex aus Teilchen von synthetischem Harz(Bacto-Latex 0.81 der Difco Laboratories,' Detroit, Mich., USA) wurde zweimal mit einer Pufferlösung (0,02 m Glycin, 0,03 m NaCl, pH 9,0) gewaschen und danach die Teilchen abgetrennt (Sorvall RC2, lOOOOrpm. 5 Minuten). Anschließend wurde in derselben Pufferlösung resuspendiert (1,6 χ das Ursprungsvolumen). Pro ml Suspension wurden 0,1 ml Gamma-Globulinlösung zugesetzt, die entsprechend Beispiel 5 erhalten worden waren, und 60 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Die beladenen Teilchen des synthetischen Harzes wurden abgetrennt, mit Pufferlösung gewaschen (0,02 m Glycin, 0,03 m NaCl, pH 9,0) und in einer anderen Pufferlösung (0,1 m Glycin, 0,15 m NaCl, pH 9,0) resuspendiert und schließlich 1% Kows Albumin (Povite, Amsterdam) und 0,1% Natriumazid zugesetzt. Das erhaltene Reagenz war zur Durchführung des unmittelbaren Agglutinationstestes geeignet
Beispiel 6
Ergebnis des Diagnostik-Testes
A. Bei der Durchführung des Diagnostik-Testes mit verschiedenen Proben konnten klare Resultate erhalten werden.
Frisches Plasma agglutinierte die Teilchen von synthetischem Harz in Verdünnungen von 1 :5 bis 1 :8 (so daß der Titer war 5 — 8), wogegen der gereinigte P-AP-Komplex (in einer Konzentration von 20 mg pro 100 ml) einen Titer von 1.024-2.048 zeigte. Wenn 500 CTA-Einheiten von Urokinase pro ml zu frischem Plasma hinzugefügt wurden, gefolgt von einer Inkubination bei Raumtemperatur, trat eine Agglutinationsaktivität ein, welche nach 30 Minuten einen Titer von 640 erreichte. Dies zeigt eine klare Anreicherung des P-AP-Komplexes in der Probe, die in vitro aktiviert worden ist, an.
ίο Frisches Serum eines Patienten mit Rheumafaktor im Serum wurde ebenfalls als agglutinierend befunden und daher mit einem hohen Titer bezeichnet. Bei der Behandlung des Serums mit unlöslich gemachtem menschlichem Gamma-Globulin konnte diese Agglutinations-
is aktivität im Gegensatz zur Agglutinationsaktivität, die durch Urokinase ausgelöst wurde, absorbiert werden.
B. In der Folge wurden Diagnostik-Tests mit Blutproben von Patienten durchgeführt, die sich einer Behandlung mit Streptokinase oder Repüase unterzogen hatten. Eine derartige Behandlung bewirkt eine primäre bzw. sekundäre Aktivation des fibrinolytischen Systems in vivo.
Die Streptokinasebehandlung bestand in einer intravenösen Injektion von 600 000 IE während 30 Minuten.
Blutproben wurden über Kalziumoxalat genommen (Endkonzentration 0,25%) vor sowie 1,2,3 und 24 Stunden nach dem Beginn der Behandlung. Die Repilasebehandlung '-.»stand in einer intravenösen Injektion von 2 ml Repilase (Defibrase) für 1 Stunde. Die Blutproben wurden über Trinatriumzitrat (Endkonzentration 0,313%) genommen, und zwar ebenfalls vor sowie 3.6,9, 15 und 24 Stunden nach dem Beginn der Behandlung. Die Gegenwart des P-A P-Komplexes in den Proben wurde mit den in den Beispielen 8—11 beschriebenen Verfahren bestimmt.
Bei den Proben der Streptokinasebehandlung wurde ein starkes Ansteigen des P-AP-Titers erhalten (mit beiden Methoden) jeweils am Ende der Behandlung. Diese Proben reichten an diejenigen Plasmaproben heran, welche in vitro mit Urokinase aktiviert worden waren. Für die ersten 3 Stunden nach der Behandlung blieben die Titer meist unverändert, um dann nach 24 Stunden anzusteigen.
Bei den Blutproben der Repilasebehandlung nach beiden Verfahren wurde ebenfalls bei Ende der Behandlung bis 24 Stunden danach ein starkes Ansteigen beobachtet, wobei ein submaximaler Titer festgestellt wurde, welcher das Ansteigen des P-AP-Gehaltes im Plasma kennzeichnet. Dies spricht für eine sekundäre Aktivation des fibrinolytischen Systems.
Die Ergebnisse, welche an den Blutproben, die in vivo aktiviert wurden, erhalten worden sind, entsprechen deshalb denjenigen Ergebnissen, die an den Proben, die in vitro aktiviert wurden, gemessen worden sind.
C. Mit Hilfe des Diagnostik Testes wurden die P-AP-Titer in 234 Plasmaproben bestimmt, welche von Patienten eines Krankenhauses erhalten wurden.
Die Plasmaproben wurden 1:10 verdünnt mit einer Pufferlösung (0,1 m Glycin, 0,15 m NaCi, 1% Albumin, pH 9,0). Diejenigen Proben, welche Agglutination bewirkten, wurden auf das Vorhandensein eines Rheumafaktors untersucht (RF Latex Test, Behringwerke) und, falls negativ, weiterhin austitriert. Insgesamt ergaben 13 Proben eine positive Rheumareaktion; 163 Proben waren negativ in einer 1 :10-Verdünnung, 25 Proben waren positiv in einer Verdünnung von 1 :40 oder mehr.
Von den zuletzt genannten 25 Proben wurde der Titer mit den Resultaten des Hämostase-Testes verglichen.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Reinigen eines Antiserums gegen einen Enzym-Inhibitor-Komplex, der Teil des aktivierten Blut-Koagulations- oder fibrinofytischen Systems des Blutplasmas ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Antiserum mit Plasminogen und frischem Blutplasma inkubiert, darauf die Gamma-Globulin-Fraktion aus dem Antiserum isoliert und resuspendiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung bei einem Plasmin-Antiplasmin-Antiserum angewandt wird.
3. Verfahren zum Herstellen eines Reagenzes zur Anwendung bei einem immunochemischen Bestimmungsverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß ein Latex von Teilchen aus synthetischem Harz mit einem nach Anspruch 1 oder 2 hergestellten Antiserum in Berührung gebracht wird.
4. Anwendung des nach Anspruch 3 hergestellten Reagenzes bei einem Verfahren zur Bestimmung einer Aktivierung des Blut-Koagulations- und fibrinolytischen Systems im Blutplasma durch Zusammenbringen des zu untersuchenden Blutplasmas mit dem erwähnten Reagenz und Beobachtung der Aglutinationsreaktion.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3016575A1 (de) * 1980-04-30 1981-11-05 Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt Verfahren zur immunologischen bestimmung von enzymen, mittel zur durchfuehrung des verfahrens und seine verwandung
JPS56163729A (en) * 1980-05-20 1981-12-16 Sumitomo Metal Ind Ltd Dehumidifying method of air for combustion
US4753875A (en) * 1981-11-02 1988-06-28 Ryan James W Method for assaying proteases with tagged proteinaceous inhibitors
JPS60172284A (ja) * 1984-02-17 1985-09-05 Ajinomoto Co Inc 酵素を利用した有用物質の製造方法及び装置
US4668621A (en) * 1985-04-22 1987-05-26 Wake Forest University Detecting blood clotting factors with immobilized fibrinogen and labeled fibrinogen
US5372812A (en) * 1988-04-04 1994-12-13 The General Hospital Corporation Composition and method for acceleration of clot lysis
US5071745A (en) * 1988-12-14 1991-12-10 Elcatech, Inc. Fibrinolytic assay
JP2569383B2 (ja) * 1989-01-19 1997-01-08 帝人株式会社 免疫学的測定方法、試薬及びキツト
KR100207351B1 (ko) * 1990-12-20 1999-07-15 야수오 후지이 항 인체 플라스민-알파2-플라스민 억제물질 복합체 항체, 하이브리도마 및 면역학적 측정방법
DE4115993A1 (de) * 1991-05-16 1992-11-19 Behringwerke Ag Monoklonale antikoerper gegen den plasmin-atiplasmin komplex, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung
AT398004B (de) * 1992-04-14 1994-08-25 Berbi Gmbh Verfahren zur bestimmung von plasmin-alpha2- antiplasmin-komplexen unter verwendung eines komplexspezifischen monoklonalen antikörpers
FR2706466B1 (fr) * 1993-06-14 1995-08-25 Aetsrn Concentré d'immunoglobulines G à usage thérapeutique et procédé de production dudit concentré.
CN1111739C (zh) * 1997-02-04 2003-06-18 许文俊 凝血、纤溶功能动态测定试剂
CN101732700B (zh) * 2009-12-18 2012-07-25 刘天银 一种保健酒及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1362776A (en) * 1970-07-17 1974-08-07 Wellcome Found Immunological reagent

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IT1125181B (it) 1986-05-14

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