DE2532151C3 - Antisenim zur quantitativen Bestimmung der Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogen« und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents
Antisenim zur quantitativen Bestimmung der Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogen« und Verfahren zu seiner HerstellungInfo
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Description
Dif Erfindung bezieht sich auf ein Antiserum zur
quantitiativen Bestimmung der Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogens und ein Verfahren zu seiner
Herstellung.
Durch die Einwirkung von Plasmin auf Fibrinogen entstehen Fibrinogen-Abbauprodukte bzw. Spaltprodukte
(FSP = Fibrinogen-Spaltprodukte oder auch FDP = Fibrinogen Degradation Products), die bei der
Diagnose und Behandlung von erworbenen »hämorrhagischen Diathesen« zunehmend an Bedeutung
gewonnen haben. Ihr Nachweis kann bei einer Reihe von Erkrankungen als wertvoller diagnostischer Hinweis
dienen. Die wichtigsten Erkrankungen, bei denen Fibrinogen-Abbauprodukte auftreten, sind im folgenden
kurz aufgeführt:
thrombotische Erkrankungen, wie venöse Thrombosen,
Lungenembolie, Myocard-Infärkt, Coronar-Thrombose,
2, bakterielle Infektionen,
3. Carzinom,
4, Nieren^ und Lebererkrankungen,
5. obstetrische Komplikationen.
Die bisher verwendeten Methoden zur Erkennung von FSP sind in der neueren Literatur miteinander
verglichen worden, siehe Marder, V. J., et al, in Am. J.
Med, 51: 71-82 [1971], Th ο m a s, D. P, et al, in N.
Engl. J. Med, 283:663-668 [1970], sowie C a r ν a I h ο,
A. C. A, et aL, in Am. J. Clin. Pathol, 62:107-112(1974).
Alle diese Methoden haben so viele Nachteile, daß sie bisher keinen Eingang in die klinische Routine-Untersuchung
gefunden haben.
ίο Bei der Proteolyse des Fibrinogens mit Plasmin
entsteht als erstes erkennbares Abbauprodukt das Fg-X-Spaltprodukt Es hat eine Molekulargewicht von
etwa 270 000. Fg-X kann durch Thrombin zur Gerinnung gebracht werden, wodurch es sich von allen
'S anderen aus Fibrinogen entstehenden Abbanprodukten
unterscheidet Im Verlauf der weiteren Spaltung des Fibrinogens durch Plasmin entsteht aus fg-X ein
Fragment fg-Y und ein fg-D. Fg-Y hat ein Molelulargewicht
von 190 000 und wird selbst weiter in ein fg-D und ein fg-E gespalten, vgl. Marder, F. J.: »Immunologie
structure of fibrinogen and its plasmin degradation products. Theoretical and clinical considerations«, in:
Fibrinogen, ed. L a k i, K, New York and London, 1969,
Seite 339-358, ferner Pizzo, S. V, et. aL, in J. Bio).
Chem, 248:4574-4583 (1973).
Die Fragmente fg-D und fg-E werden als Plasmin resistente Bruchstücke des Fibrinogens bezeichnet
(B u d ζ y η s k i, A. Z., et aL in Biochem. Biophys. Acta,
147: 313-323 [1967]). Sie umfassen etwa 70% des ursprünglichen Fibrinogenmoleküls. Ihre Antigene
können nur im Serum bestimmt werden, wie es z. B. in der DE-OS 2134 928 beschrieben ist, während die
Fragmente X und Y im Plasma bestimmt werde.".. ϋ:ε ^Spaltprodukte des Fibrins (fb) ähneln denen des
Fibrinogens, außer daß Fibrin-X (fb-X) durch Thrombin nicht mehr gerinnbar ist, da ihm die A- und B-Peptide
fehlen, die noch im fg-X vorhanden sind.
Zusätzlich können die Fibrinogen-Spaltprodukte lösliche Komplexe mit noch nicht abgebautem Fibrinogen
bilden, ebenso wie mit Fibrinmonomeren. Die Molekulargewicht e der so gebildeten Komplexe reichen
von 400 000 bis zu 1 000 000.
Die wichtigste biologische Wirkung der Fibrinogen-Spaltprodukle
beruht auf ihrer Antithrombin-Aktivität (solche Produkte werden auch als Antithrombin
VI bezeichne)). Ote Antithrombin-Aktivität der frühen
Spaltprodukte (fg-X und fg-Y) ist etwa lOmal größer als
die der spiten Spaltprodukte (fg-D und fg-E). Elektronenmkroskopische Untersuchungen (Bang,
N. V., et. aL in J. Clin. Invest, 41:935-948 [1962], Part I.)
haben gezeigt, daß in Gegenwart von hbrinogenspaltprodukten
gebildetes Fibrin sich stark von normalem Fibrin unterscheidet, wahrscheinlich in Folge einer
anormalen Polymerisation.
Die Fibrin- und Fibrinogen-Spaltprodukte werden meistens mit immunologischen Methoden bestimmt, bei
denen ein Fibrinogen-Antiserum verwendet wird. Diese Methoden sind zur Bestimmung solcher Spaltprodukte
im Plasma ungeeignet, da das im Plasma enthaltene Fibrinogen auch mit dem Fibrinogen-Antiserum reagiert.
Da die frühen FSP, wie das fg-X und die größeren Komplexe mit Thrombin gerinnbar sind und daher beim
Gerinnungsvorgang aus dem Plasma entfernt Werden, enthält Serum nicht das ganze Spektrum der Fibrin^ und
Fibrinogen^Spaltprodukte, Nur die Fragmente Y1D und
E sowie die kleineren Peptide sind im Serum vorhanden, nicht jedoch das fg-X.
Bekannt sind Antiseren gegen fg-D und fg-E. Sie
zeigen keine Kreüzreaktionen gegen Antifibrinogen und auch nicht untereinander. Sie werden zur
Unterscheidung verschiedener Fibrin- und Fibrinogen-Spaltprodukte
verwendet Bisher ist es nicht möglich gewesen, auch Antiseren gegen fg-X bzw. fb-X oder
fg-Y bzw. fb-Y herzustellen, also die frühen Spaltprodukte des Fibrinogens. Wegen der ausgeprägten
Antithrombinwirkung dieser Fibrin- bzw. Fibrinogen-Spaltprodukte wäre es wünschenswert, auch gegen
diese Produkte Antiseren zu haben, um diese Spaltprodukte direkt im Plasma nachweisen zu können.
Gegenstand der Erfindung ist ein für diagnostische Zwecke geeignetes spezifisches Antiserum zur quantitativen
Bestimmung der Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es
spezifisch gegen die Abbauprodukte X und Y des Fibrins und Fibrinogens gerichtet ist.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Antiserums, das
dadurch gekennzeichnet ist, daß man Versuchstiere mit
den gereinigten AbHauprodukten X und Y des Fibrins und Fibrinogens immunisiert und das gewonnene Serum
anschließend so iange bzw. so oft adsorbiert, bis das
spezifische Antiserum gewonnen wird.
Ein Antiserum gemäß der Erfindung zeigt nur noch mit den frühen Abbauprodukten des Fibrins oder
Fibrinogens in der Immundiffusionstechnik nach Ouchterlony eine Reaktion, nicht aber mehr mit
Plasma, Serum oder Fibrinogen.
Geeignete Adsorptionsmittel sind Heparinplasma,
Citratplasma oder Plasmen, die mit anderen bekannten AntikoagL landen stabilisiert werden, wie z. B. Oxalate,
Äthylendiamintetraessigsäure oder Mischungen aus diesen Plasmen. Diese Plasme/i muss.η so gewonnen
werden, daß in ihnen keine Fibrin- oder Fibrinogen-Spaltprodukte entstehen können.
Besser für die Adsorption geeignet als die aufgeführten Plasmen sind Plasmen, die mit Glutaraldehyd
polymerisiert wurden. Die Herstellung von Immunadsorbentien
unter Verwendung von Glutaraldehyd und Protein-Lesungen ist von Avrameas, Sl, beschrieben
worden (Immunochemistry, 6: 53—66 [1966]). Die Protein-Lösung, die für die Herstellung des Immunadsorbens
verwendet wird, kann sehr unterschiedlicher Zusammensetzung sein. Wichtig ist nur, daß in ihr alle
Proteine enthalten sind, die in humanem Plasma vorkommen, mit Ausnahme der hochmolekularen
Fibrinogen-Abbauprodukte.
Das einfachste und schnellste Verfahren zur Herstellung des spezifischen Antiserums gegen die frühen
Abbauprodukte des Fibrinogens verwendet über Bromcyan an Sepharose gekuppeltes Plasma. Hierbei wird in
Analogie zu Arbeiten von Cuatrecasas, P, et. al.
Sepharose mit Proteinlösungen über Bromcyan (BrCN) verbunden. Dieses bekannte Verfahren zur Reinigung
und Isolierung von Proteinen wird als Affinitätschromatographie bezeichnet (Proceedings of the National
Academy of Sciences USA, 61 [ 1968], S. 636 - 643).
Die verwendeten Anliseren sollten bereits vor der Aufarbeitung einen möglichst hohen Antikörper-Titer
in der Doppeldiffusions-Technik nach Ouchterlony (Archiv Kemie Mineral. Geol. Bd. 26 B, Nr. 14: i-9
[1948]) gegen die frühen Fibrin^ und Fibrinogen-Abbauprodukte haben, da während der häufigen Adsorptionsprozesse auch Antikörper gegen die frühen Abbau-Produkte
verlorengehen. Daher ist es zweckmäßig, den Titer des Serums jedes einzelnen Kaninchens vor der
Adsorption zu bestimmen und nur solche Seren zu verwenden, deren Titer zufriedenstellend sind. Man
stellt sich dann einen Pool aus mehreren ausgewählten Kaninehen-Antiseren her und gibt das Adsorptionsmittel
zu dem gepoolten Antiserum. Antikörper, die nicht gegen die frühen Fibrinogen-Abbauprodukte gerichtet
sind, werden an das Adsorptionsmittel gebunden und werden anschließend, wie nachstehend beschrieben, in
geeigneter Weise aus dem Serum entfernt. Durch Wiederholung der Adsorption gelangt man schließlich
zu einem Antiserum, das spezifisch mit den früjen Fibrin- oder Fibrinogen-Abbauprodukten fg-X, fg-Y,
fb-X und fb-Y reagiert
Das Antiserum kann dann direkt verwendet werden, wird aber vorteilhafterweise zur Erhöhung des Titers,
d. h. Anreicherung des Immunglobulin-Gehalts, fraktionier?
Vorteilhaft ist es sogar, wenn man vor Beginn der Adsorptionsprozesse die Immunglobulin-G-Fraktion
der Antiseren gewinnt. Besonders bewährt hat sich die Chromatographie des Serums an modifizierten f)extränen,
z. B. Sephadex G 150, und Isolierung der Immunglobulin-G-Fraktion aus den gewonnenen Fraktionen
der Gelchromatographie. Die isolierte Gammagiobuiin-Fraktion
wird dann mit geeigneten Adsorptionsmitteln so lange adsorbiert, bis die Fraktion
spezifisch nur noch mit den frühen Abbauprodukten des Fibrins oder Fibrinogens reagiert
Das gewonnene Antiserum eignet sich besonders zum Nachweis von hochmolekularen Abbauprodukten des
Fibrins und Fibrinogens im Plasma, was bisher nicht möglich gewesen ist In einer einfachen Versuchsanordnung
können mit Hilfe dieses Antiserums quantitativ die frühen Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogens im
Plasma bestimmt werden. Dazu werden gleiche Volumina einer entsprechend verdünnten Menge des
Antiserums zu einem gleichen Volumen eines verdünnten Plasmas, das Fibrinogen-Abbauprodukte enthält,
gegeben, und nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten wird die entstandene Trübung bei einer
Extinktion E 436 Hg gemessen. Von diesem Meßwert ist eine Leerwertbestimmung, die mit eine.1^ Normalplasma
erstellt wird, abzuziehen. Der verbleibende Extinktionswert gibt mit Hilfe einer Bezugskurve den Gehalt
an Fibrinogen-Abbauprodukten des geprüften Plasmas an.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Die durch Immunisierung von Kaninchen mit gereinigten frühen Abbauprodukten des Fibrins und
Fibrinogens erhaltenen Antiseren wurden gepoolt. Zu 100 ml Kaninchenserum wurden 200 mg lyophilisiertes
Heparin-Plasmii gegeben und die Mischung 4 Stunden bei 37"C belasten. Anschließend wurde die Mischung
für etwa 16 Stunden bei etwa +4"C stehengelassen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt.
Der Überstand wurde dann erneut mit Heparin-Plasma (200 mg/100 ml) versetzt, bei 37°C 4 Stunden inkubiert
und anschließend erneut etwa 16 Stunden bei +40C
stehengelassen und der gebildete Niederschlag erneut abzentrifuigiert. Der Erfolg eines jeden dieser Adsorpiionsschriilte
wurde mit der Immundiffusionstechnik nach Ouchterlony überprüft Der beschriebene
Adsorptionsvorgang ist so oft zu wiederholen, bis das Antiserum in der Immundiffusion mit den frühen Fibrinünd
Fibrinogen-Abbauprodukten eine Präzipitailionslinie
zeigt, jedoch nicht mehr mit Fibrinogen odel· einem Normalpliisma oder einem Normalserum reagiert.
Erfahrungsgemäß ist die Adsorption 12- bis 15mal zu wiederholen, bevor das Antiserum spezifisch ist
Das spezifische Antiserum wurde an einer Sephadex G 150 Säule chromatographiert, wobei physiologische
Kochsalzlösung als Elulionspuffer verwendet wurde. Der 2. Elutionspeak enthält die Immunglobulin-G-Fraktion
des Antiserums. Diese F aktion wurde gepoolt und mit Hilfe eines Ankowzentrierungsgerätes auf eine
Protein-Konzentration von etwa 5% gebracht
In diesem Beispiel sind Adsorptionsbedingungen beschrieben, die zu besonders guten Ergebnissen
geführt haben. Die angegebenen Bedingungen, die sich auf die Adsorptionsdauer, Adsorptionstemperalur und
die verwendete Menge Adsorplionsplasma beziehen, lassen sich in weiten Größen variieren, ohne daß dies zu
anderen als den beschriebenen Ergebnissen führt
Das durch Immunisierung mit den frühen Abbauprodukten des Fibrins und Fibrinogens gewonnene
Antiserum von Kaninchen wurde an Sephadex G 150 chromatographiert wobei physiologische Kochsalzlösung
als Elutionspuffer verwendet wurde. Der 2. Elutions-Peak der Chromatographie wurdt mit einem
Ankonzentrierur.gsgerät auf eine Proteinkcnzentration von etwa 5% gebracht Zu 100 ml dieser Fraktion
wui den 200 mg lyophilisiertes Heparin-Plasma und die Adsorption, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
Der Adsorptionsschritt wurde so oft wiederholt, bis die behandelte Fraktion in der Immundiffusion nach
Ouchterlony nur noch mit den frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukten reagiert, nicht aber mebmit
Fibrinogen, Normalplasma und/oder Normalserum. Anschließend wurde die mit Heparin-Plasma adsorbierte
Antiserum-Fraklion nochmals an modifiziertem Dextran (Sephadex G 150) chromatographiert und die
Immunglobulin-G enthallende Fraktion gepoolt und auf
einen Proteinwert von 5% ankonzentriert.
In diesem Beispiel ist die Herstellung eines mit Glutaraldehyd polymerisierien Plasmas beschrieben.
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Zur Adsorption des Kaninchen-Antiserums wurde wie folgt ein Immun-Adsorbens hergestellt. 100 ml
Ionenaustauscher-Plasma wurden mit 1 M Acetat-Puffer, pH 5,0, auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt. Zu
100 ml dieses Plasmas wurden tropfenweise unter Rühren bei Zimmertemperatur 30 ml einer 25%igen
Glutardialdehyd-Lösung gegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen und
der Niederschlag durch Zentrifugation abgetrennt. Der Niederschlag wurde mit 100 ml physiologischer Kochsalzlösung
suspendiert und 15 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Anschließend wurde zentrifugiert und
der Niederschlag erneut mit physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert, 15 Minuten bei Zimmertemperatur
gerührt und erneut zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde noch einmal wiederholt. Das polymerisierte
Plasma wurde anschließend durch ein feinmaschiges Sieb gepreßt Der oben beschriebene Waschprozeß
wurde dann noch dreimal mit dem gesiebten polymcrisierten Plasma wiederholt
Zu 100 m! Kaninchenserum wurden 1,5 g des mit
Glutaraldehyd polymerisierien Plasmas gegeben und die Mischung 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt.
Anschließend blieb die Mischung für etwa 16 Stunden bei etwa +4"C stehen. Der Niederschlag wurde durch
Zentrifugation abgetrennt Der Oberstand wurde dann erneut wie bei der oben beschriebenen 1. Adsorption
mit Glutaraldehyd polymerisiertem Plasma behandelt Dieser Adsorptionsschritt ist so oft zu wiederholen, bis
das Antiserum in der Immundiffusion mit den frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukten eine Präzipitaüonslinie
zeigt jedoch nicht mehr mit Fibrinogen oder einem Nonralplasma oder einem Normalserum reagiert
Das spezifische Antiserum kann dann zur Erhöhung des Titera gegen die frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukte,
wie im Beispiel 1 bc^-hrieben, weiterverarbeitet werdea Wie im Beispiel 2 beschrieben, ist es
auch möglich, das Kaninchenserum vor der Adsorption
an Sephadex G 150 zu Chromatographieren und die isolierte Immunglobulin-G-Fraktion mit dem polymerisiert^;
Plasma zu adsorbieren.
100 ml Sepharose 4 B wurden mit 100 ml H2O
verrührt Zu dieser Suspension wurden unter Rühren bei
Zimmertemperatur 10 g BrCN in 100 ml H2O gelöst
gegeben. Der pH-Wert wurde mit 4 N-NaOH auf pH 11 gebracht und für 30 Minuten durch weitere Zugabe von
NaOH auf diesem pH-Wert gehaHen. Die Suspension wurde anschließend auf einer Nutsche mit 800 ml 0,1 M
NaHCO3-Lösung vom pH 85 gewaschen. Anschließend
wurde die aktivierte Sepharose mit 100 ml 0,1 M NaHCOj pH 9,8 suspendiert und mit 10 g frischem
Plasma 24 Stunden bei etwa +4°C gerührc Diese Mischung wurde dann in ein Chromatographie-Rohr
gegeben und mit 0.9%iger Kochsalzlösung gewaschen, bis kein Protein mehr eluiert wurde. 5 ml des
Kaninchen-Antiserums wurden dann auf der Säule chromatographiert Das Eluat wurde in Fraktionen
gesammelt die Proteinfraktionen vereint und auf einen Proteingehalt von etwa 6% ankonzentriert.
Der Erfolg dieser Affinitätschromatographie wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, mit der Immundiffusionstechnik
nach Ouchterlony überprüft
Die beschriebene Affinitäts-Chromatographie war so oft zu wiederholen, bis das Antiserum in der
Immundiffusion spezifisch mit den frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukten reagiert
".ic in diesem Beispiel beschriebenen Bedigungen
können in bezug auf die angegebenen Mengenverhältnisse und die andren aufgeführten Parameter geändert
werden, ohne daß dadurch wesentlich andere Ergebnisse erzielt werden.
Claims (9)
1. Antiserum zur quantitativen Bestimmung der
Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogens, dadurch gekennzeichnet, daß es spezifisch
gegen die Abbauprodukte X und Y des Fibrins und Fibrinogens gerichtet ist.
2. Verfahren ?uf Herstellung eines Antiserums
nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Versuchstiere mit den gereinigten Abbau produkten
X und Y des Fibrins und Fibrinogens immunisiert und das gewonnene Serum anschließend so lange
bzw. so oft adsorbiert, bis das spezifische Antiserum gewonnen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man wiederholt mit Heparin-Plasma
bzrf. Citrat-, Oxa'at- oder Äthylendiamintetraacetat-Plasma
adsorbiert
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antiserum wiederholt mit
durch Glutaraldehyd versetztem Plasma adsorbiert
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Antiserum wiederholt mit
Bromcynn aktivierter Sepharose adsorbiert, an das
Plasma gekuppelt ist.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das spezifische Antiserum an
Sephadex filtriert und die Immunglobulin-G-Fraktion
isoliert.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Fraktionierung des
speziiiscnen Antiserums die Immung!obulin-G-Fraktion
isoliert.
%. Verfahren nach einem der Ansprüche 2—5,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Adsorption 12- bis 15ma'· wiederholt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2—8, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Aufarbeitung
ein Antiserum mit hohem Antikörper-Titer verwendet.
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