DE2536646C3

DE2536646C3 - Vorrichtung zur Ausfuhrung von Doppel- und Radialimmundiffusionsverfahren

Info

Publication number: DE2536646C3
Application number: DE2536646A
Authority: DE
Inventors: Alberto Bracciali; Sergio Prof. Piazzi; Sandra Dr. Sordi
Original assignee: ISTITUTO SIEROTERAPICO E VACCINOGENO TOSCANO SCLAVO SpA SIENA (ITALIEN)
Current assignee: ISTITUTO SIEROTERAPICO E VACCINOGENO TOSCANO SCLAVO SpA SIENA (ITALIEN)
Priority date: 1974-08-20
Filing date: 1975-08-16
Publication date: 1979-01-11
Also published as: GB1512417A; US3990852A; IT1018223B; FR2282469A1; FR2282469B1; DE2536646B2; DE2536646A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Ausführung von Doppel- und Radialimmundiffusiensverfahren mit einer Agargelschicht oder dergleichen, welche eine an die Gelschicht angrenzende Platte mit durchgehenden Löchern, die an der von der Gelschicht begrenzten Plattenoberfläche einen geringeren Querschnitt aufweisen als an der gegenüberliegenden Oberfläche, Wo die Löcher durch einen dichten Klebestreifen abgedeckt sind, sowie eine Abdeckplatte zur Bildung einer Feuchtigkeitskammer für die Agargelschicht besitzt.

Eine Vorrichtung dieser Art ist aus der US-PS

35 54 704 bekannt Dabei erfolgt Verdampfung nur umfänglich, so daß die in das Gel diffundierenden Probelösungen bevorzugte Diffusionslinien ausbilden, die die Resultate beeinflussen.

Dieser Nachteil wird zwar bei der aus der DT-AS 15 98 163 bekannten Vorrichtung zur Bestimmung von Antigenen vermieden, bei welcher die Agargekchicht von einer umfänglichen Kante umgeben ist, durch ίο welche in Zusammenwirken mit einer Abdeckplatte eine Feuchtigkeitskammer gebildet wird, weiche an die freie Oberfläche der Gelschicht angrenzt, jedoch fehlt die an die Gelschicht angrenzende Lochplatte, so daß man die Probelösungen in die in die Gelschicht gestantzen Löcher einbringen muß. Diese Vorrichtung weist Nachteile auf. Die direkt in die Agargelschicht gestanzten Löcher nehmen nur kleinste Mengen Antigen auf, so daß die Vorrichtung nicht verwendet werden kann, wenn zur Sichtbarmachung der Reaktion -° Antigen-Antikörper vergleichsweise große Volumina erforderlich sind. Außerdem besteht die Gefahr, daß die Agargelschicht bei der Einbringung abgemessener Probemengen beschädigt wird.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die geschilderten Nachteile der bekannten Vorrichtungen bei gleichzeitiger Erhöhung der Empfindlichkeit der Methode zu beseitigen.

Die erfindungsgemäße Lösung besteht bei einer Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art darin, daß die Agargelschicht von einer umfänglichen Kante umgeben ist, durch weiche in Zusammenwirkung mit der Abdeckplatte die Feuchtigkeitskammer gebildet wird, welche an die freie Oberfläche der Gelschicht angrenzt.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform ist die die Agargelschicht tragende Platte durch einen umfänglichen Rand begrenzt, dessen Höhe gleich der Höhe der Agarschicht ist. Dadurch wird eine die Resultate beeinträchtigende Meniskusbildung vermieden. Vorteilhafterweise bildet der umfängliche Rand zwischen der umfänglichen Kante und der Platte eins Stufe.

Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, daß die Dicke der Platte geringer ist als die Tiefe der Löcher und daß die letzteren von aus der Platte herausstehenden Wänden begrenzt sind und daß auf deren Endrand der Klebestreifen angebracht ist.

Zur leichteren Handhabung hat es sich als zweckmäßig herausgestellt, daß die Platte auf der Seite der Löcher eine umfängliche Wand trägt, welche bis zur Höhe der Wände der Löcher vorsteht.

Bei einer Vorrichtung zur Verwendung bei Radialimmundiffusionsverfahren steht in der Mitte der Platte auf der Seite der Gelschicht ein Kern aus der Platte vor, der ringförmig von der Gelschicht umgeben ist.

Zur Verwendung der Vorrichtung bei Doppelimmun-⁵^ diffusionsverfahren sind die unteren öffnungen der Löcher in bezug auf die Löcher außermittig und nach der Platte zu verschoben. Vorteilhafterweise besitzt die Platte in der Mitte ein Loch mit einem siebartigen Einsatz.

Im folgenden wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung an Hand der Zeichnung beschrieben. Es zeigt

F ί g. 1 eine Draufsicht einer Vorrichtung für Radialimmundiffüsionsverfähren,

Fig.2 einen Schnitt auf der Linie H-Il von Fig, I, ^b5 welcher die getrennten Teile erkennen läßt,

Fig.3 einen gleichen Schnitt wie Fig.2 mit den zusammengepaßten Teilen_f

F i g. 4 eine Draufsicht einer Vorrichtung für Doppel-

immundiffusionsverfahren,

F i g, 5 einen Schnitt auf der gebrochenen Linie V-V von Fig.4, der die verschiedenen getrennten Teile erkennen läßt,

Fig.6 einen gleichen Schnitt wie Fig.5 mit den zusammengepaßten Teilen.

Gemäß Fig. 1 bis 3 besitzt die Platte 11 mit einer vergleichsweise geringen Stärke eine umfängliche Kante 13, weiche mit dem umfänglichen Rand der Platte 11 eine Stufe 15 bildet, welche einen Rand 15/1 zur Begrenzung der Fläche 11Λ der Platte bildet. In der Mitte der Fläche HA der Platte 11 ist ein (eventuell hohler) Kern 17 vorgesehen. Auf der Fläche HA zwischen der Wand 15/1 und derjenigen der Stufe MC der Seitenwand YIB des Kerns 17 ist die Agargelschicht

18 verteilt Von der der Fläche 11Λ gegenüberliegenden Seite der Platte 11 erstrecken sich zylindrische Wände

19 und diese Wände 19 begrenzen Löcher 21 zur Aufnahme der zu analysierenden Proben. Diese Löcher 21 sind am Ende etwas verjüngt und bilden untere öffnungen 21Λ entsprechend der Fläche IM. Die öffnungen 21A haben im wesentlichen gleichen Abstand von der Kante 15/1 und von der Seitenwand 17ZJ des Kerns 17, um auf diese Weise unterschiedliche Einflüsse in zentripetalen und zentrifugalen Richtungen auf die Vorgänge, weiche auf der Agargelschicht 18 bewirkt werden, zu vermeiden.

Durch die Stufe 15, 15/1 und die Stufe 17C deren Höhe der Dicke der Agargelschicht 18 entspricht, wird die Bildung eines (meistens konkaven) Meniskus an der Peripherie der Schicht 18 vermieden. Durch diese beiden Stufen 15,15/1 bzw. 17Csind der äußere und der innere Umkreis der Schicht 18 begrenzt. Diese Umkreise haben in der radialen Richtung von den Löchern 21Λ gleichen Abstand und keinen Meniskus.

Die Platte 11 ist mit einer Abdeckplatte 23 versehen, deren Rand 23Λ mit dem Endteil der Kante 13 zusammenwirkt. Auf den oberen Rändern der Wände 19 der Löcher 21 ist ein Klebefilm 25 angebracht. Auf die Platte, die in Bezug auf die Darstellung von F i g. 2 und 3 umgekehrt und vorteilhafterweise schon mit dem Film 25 versehen ist, wird die Agargelschicht 18 aufgebracht und dann wird die Abdeckplatte 23 angebracht. Auf diese Weise kann die Vorrichtung bis zum Augenblick der Verwendung aufbewahrt werden. Zur Verwendung entfernt man bei der Anordnung von Fig. 3 den selbstklebenden Streifen 25. Die Löcher 21 werden mit Proben der durch Radialimmundiffusion zu untersuchenden Substanzen gefülh -jnd dann kann der Streifen 25 schließlich wieder aufgebracht werden. Die Substanzen können leicht mit Spritzen oder dergleichen eingebracht werden. Anstatt des Streifens 25 kann man die aus der in Fig.3 dargestellten Lage entfernte Abdeckplatte 23 auf den oberen Rand der Wände 19 der Löcher 21 legen, wobei dann die Platte 11 direkt mit der Kante 13 auf die Arbeitsebene (Glas, Marmor oder dergleichen) gelegt wird. Als Alternative kann man auch die Löcher auf andere Weise abdecken. Da die Platte 11 transparent ist und man eine Meßeinrichtung an jedes Loch anlegen käiln, ist die Ausmessung der Veränderungen in der Agargelschicht einfach und genau.

In Fig,4 bis 6 ist eine Vorrichtung, die sich zur Doppelimmundiffusion eignet, dargestellt In diesem Fall besitzt eine Platte 31 eine zentrale zylindrische oder prismatische Wand 33, die ein Loch 35 begrenzt, das mit einem weiten, siebartige? Boden 37 versehen ist. Zusätzliche Löcher 39 sind durch Wände 41 an dem Umfang gebildet, die mit einer umfänglichen Kante 43

zusammenwirken. Die Löcher 39 besitzen untere öffnungen 45, die außermittig und nach der Mitte dei Platte 31 verschoben sind. Entsprechend der umfänglichen Wand 43 ist auf der gegenüberliegenden Seite in bezug auf die Platte 31 eine umfängliche Kante 47 gebildet, wobei der umfängliche Rand 49 zwischen dieser Kante und der Platte 31 eine Stufe 49 bildet Im Innern der umfänglichen Stufe 49 ist auf der Fläche der Platte 31, die der Fläche gegenüberliegt, von der die Wände 33 und 41 der Löcher 35 und 39 ausgehen, eine Agargelschicht 51 verteilt Der siebartige Boden 37 verhindert, daß die Agargelschicht in das Loch 35 eindringt Die Anordnung der öffnungen 45 verhindert das Eindringen der Gelschicht in die Löcher 39. Die Schicht bildet keinen Meniskus, da ihre Dicke der Höhe der Stufe 49 entspricht

Es kann eine Abdeckplatte 53 auf der Kante 47 angebracht werden, um die Kammer, in der sich die Schicht 51 zur Aufbewahrung befindf«, abzuschließen, wie in F i g. 6 dargestellt ist Ein selbstiuebender Streifen 55 ist auf die Ränder der Kante 43 und aer Löcher 35 und 39 aufgebracht

Die Abdeckplatte 53 kann in der in F^; g. 6 dargestellten Lage bleiben, wenn man die Proben in die Löcher Ja und 39 nach Entfernen des Streifens 55 einführt Alternativ kann die Abdeckplatte 53 zum Verschluß der Löcher 35 und 39 dienen, indem man sie mit ihrem stufenartigen Rand 53/1 außen an die Kante 43 paßt

Der Boden der Löcher 39 ist vorteilhafterweise nach der unteren öffnung 45 trichterförmig verjüngt.

Da die unteren öffnungen 45 der Löcher 39 in bezug auf die Löcher außermittig und nach der Mitte der Platte 31 zu verschoben sind, kann der Plattendurchmesser bei gleichem Abstand von der umfänglichen Kante 47 und gleichem Durchmesser der Öffnungen 45 reduziert werden.

Da die Stufen 15, 15Λ 17Cbzw. 49 die Meniskusbildung der Agarschicht verhindern, werden Unstimmigkeiten in der Diffusion in Richtung auf die Plattenmitte zu vermieden, die durch einen Meniskus hervorgerufen würden, weil dieser leichter trocken wird und diffundierende Lösung aufsaugen würde.

Die Vorrichtung wird mit der Abdeckp'atte 23 (oder 53), der aufgelegten Schicht 18 (oder 51) und leeren Löchern 21 (oder 35, 39) und verschlossen durch den Klebestreifen 25 (oder 55), der lösbar und wiederanbringbar ist, geliefert. Der Benutzer braucht nur mit einer Mikrospritze oder dergleichen die zu untersuchenden Proben in der gewünschten Menge bis zu beispielsweise 120Mikroliter in die Löcher einzubringen. Zu diesem Zweck wird der Klebestreifen abgehoben, werden die Proben eingebracht und diffundiert, nachdem man die Löcher mit dtm Klebestreifen verschlossen hat. Die Feuchtigkeitskammer wird nicht benötigt, da die Diffusion unter Umgebungsbedingungen bewirkt wird.

Während die Agargelschicht bei den vorbekannten und erprobten Vorrichtungen zwischen Oberflächen angeordnet äst, welche die Verdampfung verlangsamen und die Diffusionszeiten in bezug auf die klassische Analyse auf dem Objektträger länger sind, wird man durch die erfindungsgemäßige Vorrichtung zu den klassischen Bedingungen geführt Die besondere Lage des Agars oder dergleichen in der erfindungsgemäßen Vorrichtung erlaubt und gewährleistet in der Tat eine Vollständige Verdampfung, welche zum Einhalten der Diffusionszekeit benötigt wird, welche bei höheren

Volumen zu lang würden.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es möglich, die Volumen der Prüfmuster unabhängig von den Durchmessern der unteren öffnungen der Löcher zu variieren. Wenn man die Durchmesser der unteren Öffnungen der Löcher und die Entfernung zwischen dem Antigenloch und dem Antiköfpefloch unvefändeft läßt, kann das Volumen des Antigens beispielsweise bis zu 120 Mikroliter variiert werden und ebenso kann das des Antikörpers beispielsweise bis zu 120 Mikrolitern variiert werden. Dieses Merkmal macht die Vorrichtung zur Ausführung einer Radial- und Doppelimmundiffusionsärialyse bereit iifi Gegensatz zu den rierkörnrriH-chen Methoden, wo mäh" jedesmal je nach den zu analysierenden Proben sowohl die Entfernung zwischen dem Antigenloch und dem Antikörperloch als auch die 'Durchmesser'dieser'Löcherauswählen muß.

Γι

Beispiele für mit der Vorrichtung durchführbare Verfahren sind:

die Analyse von Anligeneri, welche von Mikroorganismen herrühren, und der entsprechenden Antikörper; die Analyse menschlicher Plasma-Fraktionen und biologischer Flüssigkeiten im normalen und pathologischen Zustand; die Analyse von Antigenen pflanzlichen Ursprungs; die Analyse von Hormonen etc.

Die Doppel- und Radialdiffusionstechniken gelten im allgemeinen als wenig empfindlich im Hinblick auf andere Techniken — wie die Radio-Immünanalyse, die Komplementenfixierung und dergleichen ^ aber sie spielen weiter eine bedeutende Rolle ifi der Immunologie. Die mit der erfindüngsgemäßen Vorrichtung erzielte erhöhte Empfindlichkeit kann diese Techniken zu einer breiteren Anwendung führen.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zur Ausführung von Doppel- und Radialimmundiffusionsverfahren mit einer Agargelschicht oder dergleichen, welche eine an die Gelschicht angrenzende Platte mit durchgehenden Löchern, die an der von der Gelschicht begrenzten Plattenoberfläche einen geringeren Querschnitt aufweisen als an der gegenüberliegenden Oberfläche, wo die Löcher durch einen dichten Klebestreifen abgedeckt sind, sowie eine Abdeckplatte zur Bildung einer Feuchtigkeitskammer für Agargelschicht besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß die Agargelschicht (18, 51) von einer umfänglichen Kante (13, 47) umgeben ist, durch welche in Zusammenwirkung mit der Abdeckplatte (23,53) die Feuchtigkeitskammer gebildet wird, welche an die freie Oberfläche der Gelschicht (18,51) angrenzt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die die Agargelschicht (18, 51) tragende Platte (11, 31) durch einen umfänglichen Rand (15, 49) begrenzt ist, dessen Höhe gleich der Höhe der Agarschicht ist

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der umfängliche Rand (15, 49) zwischen der umfänglichen Kante (13, 47) und der PIatte(ll,31)eineStufe(15,15A17C; 49) bildet

4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke der Platte (11; 31) geringer ist als die Tiefe der Löcher und daß die letzteren on aus der Platte herausstehenden Wänden (19- 41) begrenzt sind und daß auf deren Endrand der Kleb streifen (25; 55) angebracht ist

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet daß die Platte (11, 31) auf der Seite der Löcher (39) eine umfängliche Wand (43) trägt, welche bis zur Höhe der Wände der Löcher (41) vorsteht

6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung bei Radialimmundiffusionsverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß in der Mitte der Platte (11) auf der Seite der Gelschicht (18) ein Kern (17, 17B) aus der Platte vorsteht, der ringförmig von der Gelschicht (18) umgeben ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung bei Doppelimmundiffusionsverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß die unteren öffnungen (45) der Löcher in bezug auf die Löcher außermittig und nach der Mitte der Platte (31) zu verschoben sind.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte (31) in der Mitte ein Loch (35) mit einem siebartigen Einsatz (37) besitzt.