DE2340354A1

DE2340354A1 - Dynamisches, mehrere stationen aufweisendes photometer-fluorometer

Info

Publication number: DE2340354A1
Application number: DE19732340354
Authority: DE
Inventors: James Clifford Mailen; Louis Howard Thacker; Thomas Oliver Tiffany
Original assignee: US Atomic Energy Commission (AEC)
Current assignee: US Atomic Energy Commission (AEC)
Priority date: 1972-08-22
Filing date: 1973-08-09
Publication date: 1974-02-28
Also published as: BE803504A; GB1402225A; NO138304C; AU5841273A; NL7311481A; DE2340354C2; ES417311A1; IL42689A0; JPS4960580A; NL180357B; AU475853B2; CA969773A; NL180357C; DK141917B; BR7306055D0; SE383207B; NO138304B; IT992996B; DK141917C; AT326933B

Description

United States Atomic Energy Commission, Washington, D.C. 20545, U.S.A.

Dynamisches, mehrere Stationen aufweisendes Photometer-Fluorometer.

Die Erfindung bezieht sich auf eine Lös-angsanalysiervorrichtung zur gleichzeitigen Bestimmung der Lösungskonzeritration einer Vielzahl in entsprechenden Küvetten einer Rotoranordnung enthaltenen diskreten Proben. Allgemein bezieht sich die Erfindung dabei auf Lösungskonzentrationsmeßinstrumente, und zwar insbesondere auf ein dynamisches, mehrere Stationen aufweisendes Photometer-Fluorometer.

Bei einem Instrument, welches sowohl als ein Absorptions-Photometer als auch als ein Fluorometer benutzt werden soll, besteht die nächstliegende Anordnung darin, daß man eine Lichtquelle auf der einen Seite der eine Probe enthaltenden Küvette

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und einen Photodetektor auf der anderen Seite anordnet. Dabei läßt man Licht mit einer speziellen Wellenlänge durch die Küvette laufen und fängt den austretenden Strahl auf. Durch geeignete Filter wird das Anregungslicht eliminiert und nur die emittierte Fluoreszenz läuft hindurch, die in der Flüssigkeit, deren Fluoreszenz gemessen werden soll, erzeugt wird. Ähnliche Anordnungen werden in großem Umfang in schnellen Analysiervorrichtungen benutzt, wie sie beispielsweise in den US Patenten 3 547 547 und 3 555 284 der U.S. Atomic Energy Commission beschrieben sind. In der Praxis erhält man jedoch mit einer derartigen Anordnung die gewünschten fluorometrisehen Messungen nicht ohne weiteres, weil es schwierig ist. Signale zu erhalten, die sich merklich gegenüber dem Hintergrundrauschen unterscheiden. Die Elimination des störenden Erregungslichtes kann auch durch eine unter einem Winkel gegenüber der Anregungsemission erfolgenden Feststellung erreicht werden, wobei der Erregungsstrahl um 90 gegenüber dem Photodetektor verschoben ist, der die emittierte Fluoreszenz mißt.

Ein weiteres Problem tritt bei der Bestimmung der Lösungskonzentration durch Fluoreszenzmessungen dann auf, wenn die Probe eine relativ hohe Absorptionsfähigkeit besitzt.· Der zwischen dem Küvettenfenster und einem Probenvolumeninkrementenelement liegende Teil der Probe dämpft den Erregungsstrahl und vermindert somit die emittierte Fluoreszenzstrahlung. Die emittierte Strahlung wird dabei in der gleichen Weise, jedoch in einem geringeren Ausmaße als die mit dem Erregungsstrahl verbundene Strahlung gedämpft. Dieses Problem wird als der "Innenfiltereffekt" bezeichnet.

Es wäre also zweckmäßig, einen optischen Aufbau für Fluoreszenzmessungen vorzusehen, in welchem die Bahnlängen des Erregungsstrahls und des emittierten Strahls kurz sind. In einem solchen Aufbau wurden die Fehler infolge des Innenfiltereffekts minimiert sein und der effektive Lösungskonzentrationsberexch des Fluorometers würde erweitert werden.

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Andererseits erfordern fotometrische Messungen eine optische Anordnung mit einer relativ langen Bahnlänge (ungefähr 1 cm) für den einfallenden Lichtstrahl, damit ein effektiver Bereich der Lösungskonzentration gemessen werden kann. Demnach stehen die Anforderungen an die Küvettenbahnlänge für photometrische Messungen in Konflikt mit den Küvettenbahnlängenanforderungen für fluorometrische Messungen. Die vorliegende Erfindung bezweckt eine dynamische, mehrere Stationen aufweisende schnelle Analysiervorrichtung anzugeben, mit welcher sowohl photometrische als auch fluorometrische Messungen ausgeführt werden können.

Ein weiteres spezielleres Ziel der Erfindung besteht darin, einen dynamischen, mehrere Stationen aufweisenden schnellen Analysator vorzusehen, dessen Küvettenausbildung sowohl für photometrische als auch für fluorometrische Messungen geeignet ist. Weitere Ziele der Erfindung ergeben sich auch aus der folgenden Beschreibung.

Zur Erreichung der genannten Ziele sieht die Erfindung insbesondere die in den Ansprüchen angegebenen Maßnahmen vor. Insbesondere sieht die Erfindung mehrere speziell ausgebildete Probenanalyseküvetten vor, die in kreisförmiger Anordnung innerhalb eines Zentrxfugenrotors vorgesehen sind und ein drehbares Küvettensystem bilden. Jede Küvette ist mit einem flachen Teil mit einem durchsichtigen Fenster auf nur einer Seite vorgesehen, um die fluorometrischen Messungen durchzuführen, und ein Teil mit einer größeren Tiefe und durchsichtigen Fenstern auf beiden Seiten dient zur Durchführung der photometrischen Messungen. Eine Fluoreszenzanregungslichtquelle erzeugt einen unter einem Winkel verlaufenden Anregungslichtstrahl, der auf den flachen Küvettenteil einfällt. Auf der entgegengesetzten Seite des Rotors ist eine photometrische Lichtquelle vorgesehen, die einen auf die Küvetten einfallenden Lichtstrahl an einer solchen Stelle erzeugt, wo deren Tiefe größer ist. Ein Photodetektor ist so angeordnet, daß er entweder die emittierte Fluoreszenz oder den durchgelassenen Strahl von der photometrischen Lichtquelle aufnimmt, um fluorometrische und/oder photometrische Messungen der Küvetteninhalte zu erzeugen.

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Weitere Vorteile, Ziele und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung von Ausführungsbeispielen an Hand der Zeichnung; in der Zeichnung zeigt:

Fig. 1 eine teilweise aufgeschnittene perspektivische Ansicht eines gemäß der Erfindung ausgebildeten dynamischen, mehrere Stationen aufweisenden Fluorometer-Photometers;

Fig. 2 eine Draufsicht auf einen Teil des im Fluorometer-Photometer der Fig. 1 verwendeten Rotors, wobei die Form der darin verwendeten Küvetten dargestellt ist;

Fig. 3 eine Querschnxttsansicht des Rotorteils der Fig. 2, wobei die Wirkung der Lichtstrahlen bei Ausführung der fluorometrischen und photometrischen Messungen der Küvetteninhalte dargestellt ist;

Fig. 4 eine Draufsicht auf eine alternative Küvettenausbildung, bei welcher Einsätze verwendet werden, um die flachen Teile in den Küvetten zu bilden;

Fig. 5 einen Schnitt durch die Rotoranordnung der Fig. 4;

Fig. 6 eine Darstellung der relativen Intensität abhängig vom Fluorescein für Küvetten mit Bahnlängen von 0,2 cm und mehr als 0,2 cm;

Fig. 7 eine Darstellung der relativen Intensität und der Absorption abhängig vom Fluorescein, wobei ein Fluorometer gemäß dem Stand der Technik mit einem erfindungsgemäßen Gerät verglichen wird.

In der Fig. 1 ist eine perspektivische, teilweise aufgeschnittene Ansicht eines kombinierten dynamischen, mehrere Stationen aufweisenden gemäß der Erfindung ausgebildeten Fluorometer-Photometers dargestellt. Eine im ganzen pfannkuchenartige Rotoranordnung weist einen geflanschten Stahlrotorkörper 1, Quarzfenster 2 und 3, einen sandwichartig zwischen den Quarzfenstern 2 und 3 angeordneten geschlitzten Polytetrafluoräthylen-Küvettenring 4, Polytetrafluoräthylen-Halteringe 5 und 6 sowie einen mit Stahlbolzen befestigten

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Flanschring 7 auf. Die Halteringe 5 und 6, die Fenster 2 und. 3 und der Küvettenring 4 sind zwischen dem Rotorkörper 1 und dem Flanschring 7 zusammengepreßt, um eine Vielzahl von radial orientierten Küvetten 8 im geschlitzten Küvettenring 4 zu bilden. Mit Abstand angeordnete öffnungen 9, 10 und 11 sind in entsprechender Weise im Flanschring 7 und in den Halteringen 5 und 6 in axialer Ausrichtung mit den Küvetten 8 vorgesehen, damit ein Lichtstrahl von einer unterhalb des Rotors angeordneten Photometer- oder Spektrometer-Lichtrohr- und Spiegelanordnung 31 hindurch zu einem oberhalb der Rotoranordnung angeordneten Photodetektor 12 laufen kann. Ein Fluoreszenzanregungslichtrohr ist durch eine unmittelbar oberhalb des Flanschrings 7 in Ausrichtung mit den Öffnungen 9 angeordnete Oberflächenfluoreszenzanregungs- und Emissionsdetektorkopf anordnung 14 befestigt. Das Lichtrohr 13 ist bezüglich des Photodetektors 12 mit einem Winkel angeordnet, damit eine unter einem Winkel erfolgende Fluoreszenzemissionsfeststellung erfolgt. Die Kopfanordnung 14 ordnet das Lichtrohr 13 bezüglich eines Emissionsfensteis 15 an, welches' zum Photodetektor 12 führt. Zwischen der Kopfanordnung 14 und dem Photodetektor 12 ist ej.n Emissionsfilterhalter oder eine Monochromatoranordnung 16 vorgesehen.

In den Figuren 2 und 3 sind Küvetten 8 in einer bevorzugten Ausgestaltung dargestellt. Wie man erkennt, weist jede Küvette 8 einen ersten Teil 17 auf, der sich axial durch den Küvettenring 4 erstreckt, wobei ferner ein flacher abgestufter Teil 18 längs einer Seite der Küvette verlaufend vorgesehen ist. Sin sur atrömungsmittelentfernung dienender Siphon 19 erstreckt sich vom radialen Ende/ Küvette aus zum Umfang des Küvettenrings 4 hin, wo der Abfluß in einen stationären Sammelbehälter 20 erfogt, v?ie dies in Fig. 1 dargestellt ist. Die Fluoreszenzmessungen erfolgen im flachen Teil 18, wo die in der Flüssigkeit liegende Bahnlänge des Anregungsstrahls 21 auf 0,2 cm oder weniger beschränkt ist. Der Anregungsstrahl 21 ist mit einem Winkeltvon ungefähr 30 gegenüber dem Fenster 3 und der Oberfläche 22 des flachen Teils 18 orientiert. Dies gestattet die Feststellung des Emissionsstrahls . 23 unter einem anderen Winkel als demjenigen Reflexionswinkel, der

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normalerweise mit auf der Oberfläche 22 einfallender Strahlung verbunden ist. Der Lichtstrahl 24 liefert photometrische Messungen durch den Teil 17 jeder Küvette hindurch, und zwar entsprechend dem US Patent 3 555 284.

In den Figuren 4 und 5 ist eine alternative Küvettenausbildung dargestellt, wobei eine undurchsichtige Platte 25 in in den Seiten einer Küvette ausgebildete^ Nuten 26 eingesetzt ist, um einen flachen Teil 27 innerhalb der Küvette zu bilden, der eine für fluorometrische Messungen geeignete Tiefe besitzt. Die fluorometrischen Messungen werden in dem flachen Teil 27 durchgeführt, während die photometrischen Messungen in dem verbleibenden, durch das Einsetzen der Platte 25 nicht veränderten Teil der Küvette vorgenommen werden. Bereits vorhandene photometrische Analysato-

gemäß

ren der Drehküvettenbauart. können in einfacher Weise/diesem Ausführungsbeispiel umgebaut werden, indem man Nuten in den Seiten der Küvetten ausbildet und geeignete Platten einsetzt.

Wenn - wie in Fig. 1 gezeigt - nur ein einziger Photodetektor verwendet wird, um sowohl die emittierte Fluoreszenz als auch den von der Photometerquelle übertragenen Strahl festzustellen, können die fluorometrischen und photometrischen Messungen nicht gleichzeitig durchgeführt werden. Das System der Fig. 1 würde jedoch keine erneute Anordnung des Photodetektors erforderlich machen, da die Messungen an der gleichen Radialstellung der Rotoranordnung vorgenojrsnen werden. Ein zweiter, winkelmäßig gegenüber dem ersten versetzter Photodetektor könnte verwendet werden, um sowohl die fluoroitietrischen als auch die photometrischen Messungen gleichzeitig vorzunehmen. In diesem Falle würden Fluoreszenzer r egungs lichtrohr 13, Kopfanordnung 14 und Photodetektor 12 an der in Fig. 1 gezeigten Stelle verbleiben, während ein zweiter Photodetektor axial mit dem Photometerlichtrohr und der Spiegelanordnung 11 ausgerichtet würde, und zwar an einer Stelle, die winkelmäßig gegenüber dem Photodetektor 12 versetzt ist. Das alternative Ausführungsbeispiel der Fig. 4 und 5 erfordert eine radiale Verschiebung des Photodetektors 12 beim Übergang von einer fluorometrischen zu einer photometrisehen Betriebsart, wenn

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nur ein Photodetektor verwendet wird.

Fig. 6 zeigt eine Darstellung der relativen Intensität abhängig vom Fluorescein, wobei die Ergebnisse dynamischer Fluoreszenzmessungen dargestellt sind. Die in dieser Figur dargestellten Versuchsergebnisse veranschaulichen die Wirkung der Bahnlänge des Anregungslichtes auf den meßbaren Bereich der Lösungskonzentration.

Die Küvetten eines dynamischen, mehrere Stationen aufweisenden Photometers wurden entsprechend dem Ausführungsbeispiel der Figuren 4 und 5 abgewandelt und als Fluoreszenzküvetten unter dynamischen Bedingungen verwendet. Ein kollimierter Strahl einer 470 nm Xenon-Anregungsquelle fiel - bei Verwendung einer 0,5 bis 1,0 mm Schlitzbreite - auf die Oberflächen der Küvetten unter einem Einfallswinkel von 30° ein. Die Fluoreszenzemission lief durch ein 500-600 nm-Filter und wurde unter einem Winkel senkrecht zu den Küvettenoberflachen festgestellt. Die relativen Intensitäten wurden für Lösungen gemessen, welche Fluorescein in Pufferlösungen in Konzentrationen bis zu 100 Mikrogramm/ml enthielten. Die Messungen wurden unter identischen Bedingungen durchgeführt, mit der Ausnahme allerdings, daß zwei verschiedene Bahnlängen für die Oberflächenanregung verwendet wurden. In einem Falle war die Bahnlänge 0,2 cm und im anderen Falle ungefähr 0,5 cm. Fig. 6 zeigt deutlich, daß die Verwendung der kürzeren Bahnlänge einen wesentlich größeren Liniearbereich für die Konzentrationsbestimmung lieferte.

In einem zweiten Versuch wurde ein im Handel verfügbares Spektrofluorometer mit 0,5 cm Bahnlänge mit einem dynamischen, mehrere Stationen aufweisenden Photometer verglichen, welches entsprechend den Figuren 4 und 5 abgewandelt war, um eine Bahnlänge von 0,2 cm zu liefern. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt, wobei sich ein Vergleich der relativen Intensitäten der Emissionswerte ergibt, die mit ansteigender Fluoresceinkonzentration erhalten werden. Es sei bemerkt, daß bei dem Instrument mit 0,5 cm

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Bahnlänge die Intensität tatsächlich unter eine Fluresceinkonzentration von ungefähr 80 Mikrogramm pro Milliliter absank, was eine Lösungskonzentrationsanalyse oberhalb dieses Wertes sinnlos macht. Die Kurve für das abgewandelte 0,2 cm Bahnlängen-Instrument zeigt jedoch an, daß eine Messung über einen stark erweiterten Konzentrationsbereich hinweg möglich ist.

In dem US Patent 3 514 613 sind elektronische Bauteile beschrieben, welche die Photodetektorausgangsgröße weiter verarbeiten . und eine Anzeige der Ergebnisse für die entsprechenden Küvetten unter dynamischen Verhältnissen gestatten. Diese Bauteile werden hier nicht beschrieben, da die vorliegende Erfindung sich auf die mechanische Ausbildung der Küvetten und der zugehörigen Lichtquelle und der Anordnung des Photodetektors bezieht.

Vorstehend wurden zwei Ausführungsbeispiele der Erfindung zum Zwecke der Erläuterung beschrieben, wobei aber die Erfindung nicht auf diese Ausführungsbeispiele beschränkt ist. Beispielsweise kann mehr als ein Photodetektor verwendet werden, so daß photometrische und fluorometrische Messungen gleichzeitig ausgeführt werden können.

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Claims

ANSPRÜCHE

/ 1./ Lösungsanalysiervorrichtung für die gleichzeitige Bestimmung der Lösungskonzentration in einer Vielzahl diskreter Proben, die in entsprechenden Küvetten in einer Rotoranordnung enthalten sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Küvetten (8) einen flachen Teil (18, 17) aufweisen, der auf der einen Seite durch ein durchsichtiges Fenster und auf der entgegengesetzten Seite durch eine undurchsichtige Wand begrenzt ist, die parallel zu dem durchsichtigen Fenster verläuft, und wobei ein Teil mit einer größeren Tiefe als der flache Teil an zwei Seiten durch parallel verlaufende durchsichtige Fenster begrenzt ist,

daß Mittel zur Feststellung (Detektormittel) der von der Pro-Teil
benlösung_im flachen/ emittierten Fluoreszenz vorhanden sind,

daß Mittel einen Lichtstrahl durch den Teil mit größerer Tiefe richten, und daß schließlich

Detektori^ittel für die Feit?te^lluRa des? dichtes vorhanden sind, welchen durch den Teil mit größerer Tiefe übertrafen v/ird
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der flache Teile eine Tiefe von nicht mehr als 0,2 cm besitzt.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Feststellung der Fluoreszenz einen Photodetektor aufweisen, der in der Lage ist, unter einem Winkel von 60 gegenüber dem Anregungslichtstrahl emittierte Fluoreszenz festzustellen.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß

der Photodetektor in der Lage ist, Fluoreszenz festzustellen, die in einer Richtung senkrecht zu den durchsichtigen und undurchsichtigen Wänden ausgesandt wird.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Analysiervorrichtung für eine kombinierte fluorometrische und photometrische Messung der

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flache Teile nicht tiefer als 0,2 cm ist, während der Teil mit der größeren Tiefe eine Tiefe von ungefähr 1 cm besitzt.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die undurchsichtige Wand eine in einer Nut angeordnete Platte aufweist.

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