DE2151325B2

DE2151325B2 - Verfahren zur herstellung von nicotinsaeureamidadenindinucleotidphosphat

Info

Publication number: DE2151325B2
Application number: DE19712151325
Authority: DE
Inventors: Fumio; Yamaguchi Akira; Tatano Toshio; Shimizu Yoshiaki; Shizuoka Kato (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1970-10-27
Filing date: 1971-10-15
Publication date: 1976-11-18
Also published as: US3728222A; CA974908A; FR2131242A5; GB1369068A; DE2151325A1; JPS5133191B1

Description

Nicotinsäureamidadenindinucleotidphosphat (NADP), welches auch als Coenzym II, Dehydrierungscoenzym 11 oder Triphosphopyridinnucleotid (TPN) bezeichnet wird, ist eine auf biologischem Gebiet wichtige Verbindung, die folgende Strukturformel aufweist:

NH,

CONH₂

OH OH

Es ist bekannt, Nicotinsäureamidadenindinucleotidnhosnhat durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium üblicher Zusammensetzung bei üblichen pH-Wert- und Temperaturverhältnissen herzustellen. Dabei können z. B. gemäß Chemical Abstracts, Vol. 63 (1965), Spalte 5946a, Mikroorganismen der Arten Candida utilis, Hansenula, Saccharomyces und Toluropsis eingesetzt werden.

Auch ist ein Verfahren zur Herstellung von NADP durch Reaktion von Diphosphopyridinnucleotid (DPN) mit Adenosintriphosphat (ATP) in Gegenwart von DPN-Kinase von Hühnerleber bekannt (vgl. Chemical Abstracts, Vol. 73 [1970], Spalte 62 701 v). Nachteilig erscheint hierbei, daß das erforderliche Enzym aus Hühnerleber isoliert und gereinigt werden muß. Andererseits sind die beim erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzenden Mikroorganismen gemäß der FR-PS 15 52 859 bereits unter aeroben Bedingungen in einem hierfür üblichen Kulturmedium bei hierfür üblichen pH-Wert- und Temperaturverhältnissen in Gegenwart von

a) Nicotinsäure und/oder Nicotinsäureamid und/oder Nicotinsäuremononucleotid und/oder Nicotinsäureamidmononucleotid und/oder Nicotinsäureibosid und/oder Nicotinsäureamidribosid und/oder Nicotinsäureadenindinucleotid und

b) Adenin und/oder Adeninribosid

gezüchtet worden, wobei jedoch Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) aus der Zuchtbrühe isoliert worden ist.

Demgegenüber bezieht sich die Erfindung auf ein auf jo der aeroben Züchtung von Mikroorganismen beruhendes Verfahren zur Herstellung von NADP.

Die Erfindung besteht darin, daß man als Mikroorganismus

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562, Arthrobacter citreus ATCC 11 624, Corynebacterium rathayi ATCC13 659, Micrococcus varians ATCC 399, Serratia Marcescens ATCC 19 180, Candida utilis ATCC 9950,
Saccharomyces cerevisiae ATCC 15 248 oder Streptomyces Aureus ATCC 3309

einsetzt und die Züchtung im Kulturmedium in Gegenwart von

a) Nicotinsäure und/oder Nicotinsäureamid und/oder Nicotinsäuremononucleotid und/oder Nicotinsäureamidmononucleotid und/oder Nicotinsäureribosid und/oder Nicotinsäureamidribosid und/oder Nicotinsäureadenindinucleotid und

b) Adenin und/oder Adeninribosid und/oder Adeninribotidund

c) einer oberflächenaktiven Substanz

durchführt.

Das Kulturmedium weist eine übliche Zusammensetzung auf und enthält Kohlenstoffquellen wie Glukose, Stärkehydrolysat, Melasse, Kohlenwasserstoffe, Stick-

60. stoffqueilen wie Harnstoff. Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, anorganischen Substanzen wie Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Kaliumchlorid und stickstoffhaltige Naturstoffe wie Maiswasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl. Benötigt der jeweils

(15 verwendete Mikroorganismus für seine Züchtung besondere Nährstoffe, werden letztere derr Kulturmedium zugesetzt.

Die oben unter a) und b) genannten Substanzen

werden dem Kulturmedium zu Beginn der Züchtung oder auch einige Zeit später zugesetzt, und zwar vorzugsweise in einer Menge von 50 mg/1 bis 30 g/l. Als oberflächenaktive Substanzen, die vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 bis 0,5% eingesetzt werden, können kationische wie

Cetyltrimethylammoniumbromid, Cetylpyridinchlorid, Triniethyloctadecylammoniumchlorid, Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid, Polyoxyäthylenalkylamin, Derivate von Hydroxyäthylglyoxalizin, Lauryltrimethylammoniumchlorid, Polyoxyäthylenstearylamin; anionische wie Natriumlaurylsulfat,Natriumoleylamidsulfat

und nichtionische wie

Trioxyäthylensorbitanmonostearat, Trioxyäthylensorbitanmonopalmitat

verwendet werden.

Die aerobe Züchtung, die in einer Schüttelkultur oder Unterwasserkultur mit Belüften und Rühren vorgenommen werden kann, wird vorzugsweise bei einem pH von 5,5 bis 9,0 und bei einer Temperatur von 20 bis 40° C für 2 bis 8 Tage durchgeführt Das im Kulturmedium angesammelte NADP kann nach bekannten Methoden isoliert werden, z. B. unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes oder durch Adsorption.

Die durch die Erfindung erreichten Vorteile sind darin zu sehen, daß auf einfache Weise NADP in hoher Ausbeute gewonnen werden kann, was auch die nachfolgenden Ausführungsbeisp'cle zeigen.

Beispiel 1

Es wurde ein Nährmedium aus 3% Glukose, 1% Fleischextrakt, 1% Pepton und 0,25% NaCl zubereitet und mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Das Nährmedium wurde in 300-ml-Portionen unterteilt, in konische 2-Liter-Kolben eingebracht und danach durch Erhitzen sterilisiert. Getrennt sterilisierter Harnstoff wurde in einer Menge von 0,25 Gew.-% dem Nährmedium zugesetzt, welches anschließend mit Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 beimpft wurde. Das beimpfte Nährmedium wurde dann bei 28°C 24 Std. lang unter Schütteln gezüchtet, so daß man eine Impfkultur erhielt.

Alsdann wurde ein Kulturmedium aus 14% Glukose, 0,6% Fleischextrakt, 1,4% K₂HPO₄,1.4% KH₂PO₄,1,4% MgSO₄, 0,01% CaCl₂, 0,001% FeSO₄, 0,001% ZnSO₄, 20 mg/1 1-Cystin, 5 mg/1 ß-Alanin, 30 μg/l Biotin, 5 mg/1 Thiamin und 100μg/l MnSO₄ zubereitet, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und anschließend zur Sterilisierung gekocht. Daraufhin wurde noch 0,2% steriliserter Harnstoff zugesetzt.

Das so präparierte Kulturmedium (3 Liter) wurde mit ¹Ao des Volumens Impfkultur beimpft und in einen 5-Liter-Glasfermenter eingefüllt. Das beimpfte Kulturmedium wurde dann bei 32°C unter Rühren (650 U.p.M.) und Belüften (3 Liter/Min.) gezüchtet, wobei der pH-Wert mit NH₃ auf 7,0 gehalten wurde. Nach 30 Std. Züchten wurden je 3 g/l (Konzentration nach Zusatz) Adenin und Nikotinsäure, die beide getrennt sterilisert

waren, zugesetzt. Außerdem wurden nach weiteren 48 Std. Züchten 2 g/l (Konzentration nach Zusatz) einer handelsüblichen von Hydroxyäthylglyoxaüzin abgeleiteten oberflächenaktiven Substanz zugesetzt, welche getrennt sterilisert worden war. Danach wurde noch weitere 96 Std. gezüchtet In der Zuchtbrühe wurden 0,8 g/l NADP angesammelt, die durch lonenaustauscherbehandlung isoliert wurden.

Beispiel 2

Das Züchten wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise ausgeführt, jedoch wurden die Nikotinsäure durch 3 g/l Nikotinsäureamid und das genannte oberflächenaktive Mittel durch 2,5 g/l Polyoxyäthylenalkylamin ersetzt. Es wurden 1.2 g/l NADP in der Zuchtbrühe angesammelt.

Beispiel 3

Es wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise eine impfkullur bereitet. Ein Medium, das aus 3% Glukose, 1% Fleischextrakt, 1% Pepion, 0,1% KjHPO₄. 0,1% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄, 0,002% FeSO.. 0,001% ZnSO₄, 5 mg/1 ^-Alanin, 5 μg/l Biotin, 0,5 mg/1 Thiamin und 100 μg/l MnSO₄ bestand, wurde in einem 200-Liter-Fermenter mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7.2 eingestellt und durch Kochen sterilisiert. 1001 des Mediums wurden mit V₅₀ des Volumens Impfkullur beimpft, und es wurde unter Rühren (250 U.p.M.) und Belüften (60 Liter/Min.) bei 32° C gezüchtet.

Nach 18 Std. Züchten wurden 100 1 des Zuchimediums auf 1000 Liter eines Kulturmediums, das auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise bereitet war. in einem 2000-Liter-Fermenter geimpft. Nach 24 Std. Züchten wurde Glukose in einer Konzentration von 7,5% (nach Zusatz) zugegeben. Die Züchtung wurde auf die im Beispiel 2 beschriebene Weise weitere 96 Std. fortgesetzt, wobei sich 1,8 g/l NADP in der Zuchtbrühc ansammelten.

Beispiel 4

Die nachfolgend aufgeführten Mikroorganismen wurden auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise gezüchtet — mit dem einzigen Unterschied, daß der pH-Wert des Kulturmediums für Candida ulilis ATCC 9950 mit NHj auf 6,0 gehalten wurde. Nach Vollendung der Züchtung hatten sich in der Zuchtbrühe die nachfolgend angegebenen Mengen NADP angesammelt:

50 Brevibacterium ammoniagenes	0,7 g/l
ATCC 6871
Arthrobacter ureafaciens	0,4 g/l
ATCC 7562	0.5 g/l
Arthrobacter citreus ATCC 11 624
55 Corynebacterium rathayi	0,6 g/l
ATCC 13 659	0.5 g/l
Micrococcus vaiians ATCC399	0,3 g/l
Serratia Mareescens ATCC 19 180	0.20 g/l
Candida utilis ATCC 9950
(ro Saccharom>cescerevisiae	0,2 g/l
ATCC 15 248	0.3 g/l
Sireptomyces aureus ATCC 3309

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Nicotinsäureamidadenindinucleotidphospbat durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium üblicher Zusammensetzung bei hierfür üblichen pH-Wert- und Temperaturverhältnissen und Isolierung des angereicherten Produkts, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872. Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562, Arhtrobacter citreus ATCC11 624, Corynebacterium rathayi ATCC 13 659, Micrococcus Varians ATCC 399, Serratia marcescens ATCC 19 180, Candida utilis ATCC 9950,
Saccharomyces cerevisiae ATCC 15 248 oder Streptomyces aureus ATCC 3309

einsetzt und die Züchtung in Gegenwart von

a) Nicotinsäure und/oder Nicotinsäurer.inid und/oder Nicotinsäuremononucleotid und/oder Nicotinsäureamidmononucleotid und/oder Nicotinsäureribosid und/oder Nieoiinsäureamidribosid und/oder Nicotinsäureadenindinucleotid und

b) Adenin und/oder Adeninribosid und/oder Adeninribotid und

c) einer oberflächenaktiven Substanz

durchführt.