DE2120995A1

DE2120995A1 - Verfahren zum Modifizieren interzellularer Reaktionen

Info

Publication number: DE2120995A1
Application number: DE19712120995
Authority: DE
Inventors: der Anmelder. P ist
Original assignee: Grassetti, Davide Riccardo, Berkeley, Calif. (V.StA.)
Priority date: 1970-05-05
Filing date: 1971-04-29
Publication date: 1971-11-18
Also published as: ZA712898B; PH12181A; IL36587A0; FR2100631B1; NL173242B; FR2100631A1; CA985170A; GB1416018A; NL173242C; IL36587A; NL7106127A; BE766123A

Description

DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTER BEII

ALFRED HOiPPENER

DR. JUR. DiPL-CHEM. H.-J. WOLFP

DR. JUR. Ha.JS Chili. BEIL

623 FRANKFURT AM MAIN-HöCHST

Unsere Fummer 17 045

Davide Eiccardo G-rassetti, Berkeley, CaI., USA

Verfahren zum Modifizieren interzellularer Reaktionen

Es v^oirde jetzt gefunden, daß es möglich, ist, Zeiloberflächenreaktionen zu modifizieren, indem man mit Hilfe geeigneter Reagenzien eine Umsetzung mit der Zelle herbeiführt, durch welche die SuIfhydrylgruppen der Zelloberfläche blockiert werden.

Verabreicht man Säugetieren bestimmte chemische Substanzen, die vorzugsweise mit den peripheren Sulfhydrylgruppen der Zellen und nicht mit den Sulfhydrylgruppen in den Zellen zu reagieren vermögen, so kann man erreichen, daß die Prozesse der Tumormetastase und -Ausbreitung im lebenden Säugetier unterbunden werden. Durch die betreffenden Substanzen wird auch erreicht, daß neben der Blockierung der peripheren Sulfhydrylgruppen der Zellen auch eine Änderung der elektrischen ladung der Zelloberfläche eintritt.

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Zu den chemischen Substanzen "bezw. Verbindungen, die die vorstehend beschriebene Fähigkeit zur Blockierung der peripheren Sulfhydrylgruppen von Zellen besitzen, gehören, v/ie jetzt erfindungsgemäß festgestellt werden konnte, bestimmte Arten von Mthioverbindungen der Formel R-S-S-K, in welcher R einen organischen Rest bedeutet. Unter den genannten Dithioverbindungen besitzen diejenigen, deren R-Reste auch Gruppen wie beispielsweise -COOH oder -SO-,Η, die bei pH -Werten über 7 eine negative Ladung tragen, enthalten, auch die Fähigkeit zur Änderung der elektrischen Ladung der Zelloberflache„

Unter den Verbindungen, die vorzugsweise zur Reaktion mit den peripheren Sulffiydrylgruppen der Zelle befähigt sind, befinden sich beispielsweise das Ujli'-Diacetylcystamin und ß-Mercaptopropionsäuredisulfid, die zum linearen Typgehöreh. Viele der außerdem geeigneten Verbindungen gehören jedoch in die Klasse der heterocyclischen Bisdithioverbindungen. Diese letztgenannten Verbindungen bzw. Substanzen entsprechen der Formel

1 f ^ ^r \ 1
R¹ __a O-S»S-G ,«—-R.

in welcher die -R -Reste, welche gleich oder verschieden voneinander sein können, heterocyclische Reste mit 1 bis 5 Stickstoffatomen und gegebenenfalls Schwefel neben den Kohlenstoffatomen im Ring darstellen. Me Reste können substituiert oder nicht-substituiert sein und können aus einfachen oder verschmolzenen aromatischen Ringen bestehen·

Es konnte festgestellt werden, daß innerhalb dieser großen Klasse von heterocyclischen Bisdithioverbindungen verschiedene Verbindungen und Gruppen von Verbindungen existieren, die die Fähigkeit besitzen, vorzugsweise mit den peripheren zellularen

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SulfhydrylgrupOen und nicht mit den SulfhydrylgrupOen in der Zelle zu reagieren. Eine dieser Gruppen von Verbindungen ist die, in welchen die R -Reste Pyridylringe,· welche als SuTdstituenten anionische Gruppen tragen, darstellen; diese Verbindungen besitzen außergewöhnliche Eigenschaften, die sie zu einer Verwendung in Säugetiersystemen zur reversiblen Blockierung der periOheren zellularen Sulfhydrylgruppen besonders geeignet erscheinen lassen. Diese Verbindungen sind im übrigen praktisch nicht toxisch, obwohl sie die- Fähigkeit besitzen mit den
peripheren anstelle der interzellularen Sulfhydrylgruppen zu reagieren. Diese Verbindungen besitzen außerdem die Eigenschaft, die elektripche Ladung der behandelten Zelloberfläche in der gewünschten '."eise zu modifizieren. Die Verbindungen in dieser bevorzugten Gruppe entsprechen einer der beiden folgenden
Strukturen

.(Ä²)_n

u — O-

oder

S-S

III

In den vorstellenden Fonnein bedeutet η eine ganze Zahl von

1 bis 4 und die S -Reste stellen Carboxygruppen oder die Salz-, Ester- oder Amidderivate dieser Carboxygruppen dar. Geeignete

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Salze "bilden sich beispielsweise mit Alkali- oder Brdalkali.-metallen sowie außerdem mit Ammoniak oder Aminen wie Cyclohexylamine ITorpholin oder anderen aliphatischen, alicyclischen, aromatischen oder heterocyclischen Aminen. Bei den "ISster-Iiesten kann es sich um Methyl-, Äthyl- oder höhere Alkylgruppen sowie um Öyclohexylgruppen. oder andere alicyclische Gruppen handeln. Beispiele für Amidgruppen, die als kubstituenten an den Pyridylringen vorhanden sein können, sind -COITHp sowie entsprechende Gruppen, in welchen ein Wasserstoff atom oder "beide '.-,'asserstoffatome an den Amidstickstoffatom durch aliphatisch^, heterocyclische, alicyclische oder aromatische Grupoen - die gegebenenfalls ihrerseits substituiert sein können - ersetzt sind; typische Gruppen dieser Art sind ß-Aminoäthanol und L'Iorpholin.

Beispiele für Verbindungen, die zur Gruppe eier Verbindungen mit den Strukturen II oder III gehören, sind: 4,4'I>ithiodin.icotinsäure, -6,6'Dithiodinicotinsäure, 2,2'-Dithiodinicotinsäure, 2,2^f-I)ithiobis-(isonicotinsäure) , 6,6 '-Dithiodipicolinsäure, 4,4,^f-Dithiodipicolinsä:ure, einschließlich der Natriumsalze ■ dieser Verbindungen, das Kalium-, Magnesium- und Ammoniunsalz der 6,6'-I)ithiodinicotinsäure, das Kaliumsalz der 4,4-'-Dithio- dipicolinsäure, 4,4'-I)ithiobis(2-,5-pyridindicarbonsa,ure, 4,4'-Dithiobis-(2,6-pyridindicarbonsäure), 2,2'-liithiobis-(3,4-PSrridindicarbonsäure, A,4-'-Dithiobis-(3 , 5-pyridindicarbonsäure) ,-das IJatriumsalz der 4,4 '-Dithiobis-(2 , ö-pyridindicarbonsäure), 4,d'-Dithiobis-(2,3,5-pyridintricarbonsäure),. 2,2'-Dithiobis-(3,4,5-P3^rridintricarbonsä.ure) und 2,2 '-Dithiobis-(3,4,5,6-nyridintetra-cerbonsaure).

Gute Ergebnisse lassen sich auch mit Yerbindungen der Formeln II oder III erzielen, wenn die Pyridylringe durch -GEL· oder andere Alkylgruppen, -OK, -ClT, Halogen oder -CITO substituiert sind. Die -COOH-Gruppe oder Berive.te dieser Gruppe können ." gegebenenfalls e,uch am Hing" vorhanden sein.

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BAD ORIGINAL

Alle vorstehend genannten Verbindungen, die der Formel II oder III entsprechen, besitzen die Fähigkeit, mit einer Sulfhydrylgruppe unter Bildung eines Th ions zu reagieren,· die^ertfndvngen werden infolgedessen auch als "thion-bildende" Reagentien bezeichnet. Eine typische Umsetzung, die zwischen einer Verbindung dieser Flasse (6,6'-Oithiodinicotinsäure) und einer perip.heren -SH-G-ruppe an einer Zelle abläuft., kann durch folgende Formelgleichung dargestellt werden, in welcher das nicht an die Zelle gebundene Reaktionsprodukt 6-Thiononicotinsäure ist:

(Zelle)!

3ΪΤ + HOOC -,

S -S

COOH

(Zelle)!

.-000H

(2)

der vorstehend als Beispiel genannten 6,6'-üithiodinicotinsäure sind auch noch andere heterocyclische Dithiobis-Verbindungen zu der beschriebenen Reaktion mit den peripheren Sulfhydrylgrup-nen der Zellen befähigt; zu diesen v/eiteren Verbindungen gehören 2-Mercaptouracildisulfid, 6,6'-Dithiodiisonicotinsäure und 2,2'-Dithiobis-(5-amidopyridin) einschließlich der llatriumsalze derjenigen Verbindungen,die Carboxylgruppen enthalten. Die letztgenannten Gruppen, gleichgültig ob als solche oder in Form ihrer Salze· vorhanden, tragen bei einem pH-Wert von v/enigstens 7 eine negative ladung und sind infolgedessen zur Modifizierung der elektrischen ladung der Zelle befähigt, wenn diese mit solchen Verbindungen be-, handelt wird.

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EAO ORIGINAL

Es ist auch möglich, die geyrünschte Blockierung der peripheren zellularen Sulfhydrylgruppen herbeizuführen, wenn man heterocyclische Bi sdithio-Verb in düngen verwendet, in welchen die substituierten Pyridylringe, welche weiter vorn in Verbindung mit den Eormeln II und III erwähnt worden sind, in 3-3teilung übe-p eine -S-S-G-ruppe aneiiisad«r gebunden sind. In diesem Pall bildet sich Jedoch bei der Umsetzung nicht ein Reaktionsnebenprodukt vom Shion—Typ»

Auch Verbindungen dieser Art, die einen anionischen Substituenten tragen, besitzen die !Fähigkeit zur Modifizierung der Oberflächenladung der Zelle. Auch ein lineares Disulfid wie das weiter "vorn erwähnte ß—Kercaptopropionsä-uredisulfid ist, obwohl es kein thionbildendes lieagenz ist, zur Llodifizierung der beiladung befähigt, währ-nd es vorzugsweise mit den peripheren -SH-Gruppen an der Zelle reagiert.

Es konnte jetzt erfindungsgemäS auch festgestellt werden, daß beim Behandeln von Säugetierzellen mit einer heteroeyelisehen Bisdithio—Verbindung oder einem anderen organischen Disulfid., welche in der mehrfach erläuterten ¥eise zu reagieren vermögen, die Möglichkeit gegeben ist, reversibel alle oder nahezu alle peripheren zellularen Sulfhydrylgruppen zu blockieren, ohne das Ausmaß der Zellatmung und der G-lycolyse in nennenswertem Haß zu verändern* Es ist wichtig zu betonen, daß die Bloeklernngs-pLeaktion reversibel ist· läuft die Reaktion also im Körper eines lebenden Säugetieres ab, so kehren die blockierten Gruppen innerlmlb verhältnismäßig kurzer Zeit (gewöhnlich einige Stunden) zu ihrer ursprünglichen -SH-Form zurück, und zwar als Folge üblicher StoffweehselpiOzesse, vorausgesetzt, daß keine weiteren Mengen des cyclischen Seagenzes für eine Reaktion in der Zwischenzeit vorhanden waren. Die Verabreichung eines Thiols derArt, die sich in Säugetier— geweben findet, leitet ebenfalls eine rasche Wiederherstellung der freien peripheren —SH-G-ruppen ein. Diese Iiebloekierungs—

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BADOfUGlNAL

Reaktion kann wie folgt dargestellt v/erden, wobei das Glutathion mit E SH -and das benutzte Reagenz mit 6,6VDithiodinicotinsäure bezeichnet sind:

1-COOH
(ZeIIe)I-S-P,

(ZeIIe)J -RH +

Durch wiederholte oder kontinuierliche Verabreichung der heterocyclischen Bisdithioverbindungen oder der anderen organischen Disulfide an Säugetiere kann man aber das Zeilgewebe auch in federn beliebigen Zustand der Blockierung der peripheren Sulfhydrylgruppen halten, ohne daß eine Schädigung der Eelle eintritt.

Der Einfachheit halber werden die Verbindungen,, die den Pornein II oder ITI entsprechen, sowie die Verbindungen, in welchen ähnlich substituierte Fyridylringe über eine Msulfid-Gruppe in 3-Stellung verbunden sind, im vorliegenden Zusannenhang (d.h. in der Beschreibung und in den Ansprüchen) gemeinsam als "Dithiobis-(carboxypyridin)-Verbindungen" oder noch einfacher als "dieyelische Reagentien" bezeichnet. DieRe Verbindungen können Id.cht durch. Oxydation der entsprechenden einkernigen Ringverbinftimgen hergestellt werden, in welchen der Pyridyl ring bzw. -kern zusätzlich zu der Carboxy— oder Carboxyderivatgruppe oder den anderen Substituenten auch eine Sulfhydrylgruppe (-SH) an einem Ringkohlenstoffatom enthält. In der folgenden Oxydati ons reaktion verbinden sich zwei Koleküle der Ausgangsverbin-

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BAD ORIGINAL

dung -ber die Schwefelatome der üulfliydrylgrupoen. Diese Oxydation kp.nn mit Hilfe vcn *7asse?.'-^r--toff peroxid durchgeführt werden, wobei man mit den stöchiometrisch erforderlichen I"en;;en oder-mit einem geringen überschuh-arbeitet. "Die isi.'Loetzung wird bei Tempere türen unter etwa 35 C entweder in einem wässrigen I-Tedium oder in einen lösungsFiittel wie .Benzol or"er 'ceton, in welchem das Ausganr'.material löslich ist, curch-'ef'ijirt. Es ist auch rv'glich, die Oxydation so durchzufahren, da'; ivn Jod su einer lA'sung des als Ausgangsmaterial dienenden 'Hhiols in einer, geeigneten wässrigen oder organischen. Löfjun^eL.ittel, viel ehe s "'ich iiatrium- oder KaliLimjodid entliält, ^ribt. Das Jod kann entweder als solches oder- beisiielswqif-e in Forn einer Lösung in wässrigem Tal ium j ο aid zugesetzt werden, vac bei die Reaktion als-been·.-,et angesehen '/,'erden kann, wenn üie Jodfsrbe beim führen in der Lösung erholten bleii.t. Das gev^iinschte Produkt der Umsetzung scheidet sich als niederschlag aus und kann in üblicher ,/eise abgetrennt und gereinigt werden,, wobei es am einfachsten ist, die Verbindung abzufiltrieren und anachlieSend mit ",.'asser und/oder Aceton zu waschen. Um festzustellen, welche heagentien vorzugsweise zu einer Umsetzung.nit peripheren .zellularen Gruppen befähigt, sind, v.-ird ein Überschuß der zu prüfenden 3ubstanz zunächst mit einer !.Iacse intakter Zellen und dann mit einer entsprechenden !,lasse honogeninior.-ter o-ver zerkleinerter Zellen derselben Art zur Iieaktion gebiv/.oht. ) Ist die relative !!enge der als .Produkt entstehenden Thionverbindung bei der umsetzung mit den ganzen Zellen erheblich viel kleine.! als die tlenge, die bei -1er Umsetzung mit den homogenisierten'Zellen gebildet wird, so liegt die gewünschte Fähigkeit vor. Diese. Arbeitsweise wird in c.em folgenden Beispiel 1 beschrieben.' -

IAD ORiGINAL

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21Z0995

Beispiel 1

-ilirlicli-Ascites-TTinorsellerL wurden von 7 bis 10 Tage alten ΪΓί-iiGOlanten in weiblichen schweizer Mäusen geerntet und anschließend in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise blutfrei gewaschen* "j)in Teil der Zellen wurde unverändert gelassen, v-r!· r:erA der andere Teil in ein Homogenat verwandelt wurde, in velehem praktisch keine ganzen Zellen mehr vorhanden waren. 15 ng-Proben (Trockengewicht) der intakten und der homogen!- siebten Zellen wurden eine stunde bei 37⁰C inkubiert, und zwar suoar:;r:en r.iit 5 ml lüiP-Puffer, welcher 5/uMol eines der dröi in der folgenden Tabelle 2 aufgezählten Disulfid—Heagentien enthielt. -.Vähreiid des Inkubierens wurde an der Luft. geschüttelt₀ Ijie Ilenge war ausreichend, ein Gemisch zu bilden, welches das

—3 Mergenz in einer Konzentration von 1 χ 10 m enthielt. ITach dem Filtrieren durch Q-lP-spapier (v/hatman G-F/C) vmrde die Kenge des gebildeten Thions aus der Absorption bei der in der Tabelle angegebenen Wellenlänge bestimmt» Im l?a.lle des 2,2 '-Dithiodi-■ojridiris lag die ilenge des diirch die Umsetzung mit den ganzen Zellen gebildeten Thions wenigstens so hoch (9,61 /uluol) ^Xe bei der Umsetzung mit dem Homogenat (6,52 /läMol), wobei der höhere „'ert, der in diesem Fall mit den ganzen Zellen erzielt wurde j der ehzymatisehen Y/irkuhg zuzuschreiben ist, die in intakten oder stoffwechseläktiven Zellen 2ü beobachten ist. Alle diese ./efte wurden dann als 100 ?* in die folgende Tabelle 1 eingesetzt. Die beiden anderen PLeagentien ergaben etwa dieselbe Menge Thion-Produkt, \venh sie mit dem Homogenat umgesetzt wurden; die Thion-Kenge jedoch^ die mit diesen beiden Se^entien erzielt wurde, wenn sie mit ganzen Zellen umgesetzt wurden, betrug nur etwa 20 fi des 7ertesy der mit dem ^,^'-Dithiqp erzielt worden war. Das zeigt deutlich, daß diese DithioT oxypyridin)-i{eagentien sich selektiv an die peripheren und nicht an die intrazellularen Sulfhydrylgrup.^en ankuppeln. Diese Daten ergeben sich auch aus der folgenden Tabelle' 1.

10 9 8 4 7/1832 BAD ORIGINAL

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BAD ORiGiNAL

Führt nan entsprechende Verimehe durch, verwendet jedoch die ent.--orr;eilenden Uatrium-salze 'der 6,6 '-Uithiodinicötinsäure und 2,2'-Dithiol.)ic-(i..-onicotinsäure) r-nstelle der freien Säuren, so entvorocien die ThionOrod; ktwerte praktisch denen, die in Tabelle 1 angereben sind. .

Beispiel 2

Shrlich-Ascites-Flüssi-rkeit vrurde von 7 bis 10 Tarre alten Trr~nsplanten in weiblichen sclr.veiser L! usen geerntet; die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit abge-· trennt, dann in KRP-Puffer (Krebs-Ringer-rhosrihatpuffer mit pH 7,2 + 0,2) suspendiert und erneut zentrifugiert* Die Zellen wurden dann mit KRP-Puffer mehrere Haie in Gegenwart' von Heparin (20 "J. S.Γ.-Einheiten/ml) gevaschen, um die roten Blutkörperchen su entfernen. Die Zellen werden dann in den ERP-Puffer resuspendiert, so daß nrii ein Produkt mit 8CG χ 10 Zellen in 10 ml Puffer erhielt; dieses Material wurde denn· 5 I.'inuten "bei 25°C ohne (Eontrolle) und iriit 1C /ul.'ol 6,6^-Dithiodinicotlnsäure (diese I!enr;e reicht aus, ura eine 1C -molare Konzentration der Säure zu erreichen) inkubiert. Sin Teil der entstandenen, säurebeh^ndelten Mischung wurde donn als solche für die naiior.etricchen Verbuche verwendet. Die restlichen säurebehmnelten Zellen wurdejn dann abzentrifugiert, ZYi'eiir.al mit deri Puffer gevraschen und dann wieder in demselben Puffer resiispendiert, so daß man eine Vorratnsuspension erhielt, die etwa 150 χ 1^" Zellen pro ml enthielt; diese vniräe dann für die manometrischen Versuche verwendet» Bei diesen Versuchen. vrarden die einzelnen Ansätze eine Stunde bei 37 "G behandelt_T v/obei die angewandte Arbeitsweise der Methode entsprach, die in allein Einzelheiten in der Arbeit "The Effect of Some.Sulfur-Containing Pyridine Derivatives on the Carbohydrate Metabolism of Ehrlich Ascites Tumor" von Grassetti et al. in Journal of !Medicinal Chemistry, 8, (1965) beschrieben ist, jedoch mit der Ausnahme, daß bei den vorliegenden Versuchen kein weiteres Heparin verwendet wurde,

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■ * BAD ORJGlNAl

nachdem die erete fjtufe des V/apc-iOnn der Zellen aungefiiurt '.Tar. Die il.rgebnisse, die bei den Yorruohen erzielt ν/υ]-.;!en, .sind in rⁿer folgenden Tabelle 2 Kii^arcnerigeetel'] t, wobei die einzelnen .',^nnbole in der Tabelle folgende Bedeutum; iiO.-ei;:

""Op =■ owners toff auf nähme in /ul C-_n/h/mg TrockengeT/vioht. Die . Gasphase bestand sue? Luft, dan Trockengewicht betrug 26,6 ng/Kolben, die i\r\7,^r\s.l. der Zellen l'-.g bei 60 χ 1C⁶.

"'■.^ (G) = Die Pedeutune- iot die bleiche wie lei 0._r , jedoch •2 ^J "^J '2

nit der A"Tsnahirie, da" ai.-ch Glukoce bis-zu einer Konzentration von '-,05 m züge rietst wurde.

= Aerobe 00p-^nt\^r;icklun2 in /ul GOp/h/rag Trocken,^rjevioht. IjIg Gasphase bectand aus Op-GO₂ (95=:5). Eas Trockengewiciit, die .Vn?,',hl der Zellen und die Glukosekonzentrntion waren die gleicie wie bei ._r (G).
"2

'.naerobe OC₉-Entwicklung in /ul 00_o/h/mg TrocV/engevricrit. Die Casr)-hase best?inc aus IT₂-OO₂ (95:5), drs Trockengewicht betrug 13,3 mg/Kolben, die Anzahl der Zellen-leg bei 30 χ 10 r>ro PIoIben und die Glukosekonzentration nachte 0,01 m aus.-

In jeder. Fall betrug das Gesaratfl'ä.-sigkeitsvolunien pro I'Iolben 3,0 ml. '

BAD ORIGINAL
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BAD ORIGINAL

Die in. der vorstellenden tabelle 2 enthaltenen ^T,/erte zeigen, daß die Behandlung von Ehrlich-Ascites-Zellen mit 6,6'Dithiodinicotinsäure in einer Konzentration von 10^m sowie das anschließende laschen das Ausmaß der Atmung und der Glycolyse nicht verändern. Die Atmung und die Glycolyse von. Ehrlich-Ascites-Zellen bleiben auch in Gegenwart von '\0~^J m 6,6 '-Dithiodinicotinsäure im wesentlichen unverändert.

Uird die vorstehend beschriebene Arbeitsweise mit 2,2'-Ditriiodipyridin als Reagenz v/iederholt, so hört die Entwicklung von GOp und Op nach wenigen Minuten praktisch auf, was anzeigt, daß dieses lieagenz die Zellglycolyse und die Zellatmung stark .behindert und so zu einer Zellschädigung führt.

Beispiel 'j

a) Der in folgenden beschriebene Versuch wurde durchgeführt, um das Ausmaß der Beständigkeit der Zellblockierung im lebenden Säugetier zu bestimmen. Schweizer Mäuse, die mit Aseites-Zellen etwa 6 lage vor dem "Versuch geimpft worden waren, erhielten alle eine intraperitoneale Injektion mit einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 6 mg des ITatriumsalzes von 6,6'-Dithiod!nicotinsäure; diese Dosis entsprach einer Menge von 300 mg Reagenz pro ,kg Körpergewicht. Das benutzte Salz war hergestellt worden, indem man die Säure zu äner wässrigen Lösung von Uatriumbicarbonat gab, wobei letzteres in der stöchiometrisch. zur Neutralisation der Säure und damit zum Löslichmachen derselben in einer wässrigen Lösung erforderlichen Menge vorhanden war. Die Lösung wurde dann mit Hilfe von KRP-Puffer auf einen pH-¥ert von 7_f2 eingestellt, bevor sie jeder Maus injiziert wurde. 17ie aus der folgenden Tabelle 3 hervorgeht, wurde eine bestimmte Anzahl von Mäusen in Abständen von 1, 4, 3 und 20 Stunden nach der Injektion der Verbindung geopfert. Fach der angegebenen Zeit wurde die Ascites-Plüssigkeit aus dem Tier abgezogen und zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen, welche dann 5 mal mit KBP-Puffer gewaschen wurden. Jede so gewonnene Zellmenge (wobei die Anzahl der Zellen in jeder Maus durchschnittlieh etwa 1 - 2 χ 1O^ betrug) wurde mit einer

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* ^VJ " ^: BAD ORGiNAL

Losung von 5 /Ullol Cystein "behandelt. Das gewonnene Produkt wurde zentrifugiert (5 Minuten bei 800 χ g), worauf die überstehende Flüssigkeit 5 Hin. bei 95°C denaturiert und anschließend auf ihren Thiongehalt analysiert wurde, und zwar mit Hilfe der Beobachtung des Peaks 344 m/u. Der am Ende der ersten Stunde beobachtete Wert wurde willkürlieh mit 100 angenommen und so in die Tabelle 3 aufgenommen. Man erkennt, daß die Zellblockierung im wesentlichen zwiahen der 4. und 8. Stunde aufhört. .

Tabelle 3

Geschwindigkeit der Freigabe der blokkierten -SH Gruppen an Ascites-Zellen in lebenden Mäusen

Anzahl der Stunden nach verbleibende Anzahl der blok-Mäuse der Behandlung blockierte kierten -SH Grup-

Zellen, jS pen pro Ascites-

Zelle *

.5 1 100 1,7 x 10⁸

4 4 33 5,5 x 10⁷

6 S 1 1,9 x 10⁶

4 -20 0 0,00

Jede -SH Gruppe, die bei PH 7»2 + 0,2 eine elektrische ladung von 0 aufweist, ist durch eine Carboxylgruppe ersetzt, die bei diesem physiologischen pH-Wert eine negative Ladung aufweist.

b) Die Mäuse, äie bei dem vorstehend beschriebenen Versuch behandelt wurden, zeigten keine Anzeichen von Hisbehagen, wenn ihnen die Salze der Säuren indiziert wurden. In Vergleichsversuchen jedoch, die in derselben Weise, jedoch unter Verwendung einer Suspension der freien 6,6^f-Dithiodinicotinsäure in einer 3 ^igen Gunaai arabicum-LÖsung in KRP^-Puffer mit PH 7*2 durchgeführt wuraen, zeigten die 5 Muse, die für

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.i-' BADORiGlNAL

den 'Versuch, verwendet wurden, mehrere Stunden lang Träghei-t bzw. Schlafrigkeit. Am Ende der vierstündigen Behandlung zeigte sich außerdem, daß 65 ^c/o der peripheren -SI-I G-ruppen an den Ascites-Zellen noch, immer blockiert waren* Dies war auf die Tatsache zurückzuführen, daß das injizierte Reagenz, welches unlöslich ist, mit nur geringer Geschwindigkeit aufgenommen wurde, was dazu führte, daß eine kontinuierliche Reaktion mit den peripheren Zellgruppen stattfand, und zwar in dem Maße, wie die Verbindung in vivo langsam in die lösliche Salzform umgewandelt wurde.

c) Bei einem weiteren Versuch, der als Kont '.-ollversuch durchgeführt wurde, wurde den Mäusen eine salzartige Suspension " von 6,6'-Dithiod!nicotinsäure injiziert; auch hier zeigten sich wieder die Symptome der Trägheit Tdzw. Schläfrigkeit, was ■bedeutet, daß das bei dem vorstehenden Versuch benutzte Gummi arabicum nicht der die Schläfrigkeit hervorrufende Faktor v/ar.

Beispiel 4

6 gesunden Mäusen, die frei von Tumoren¹jeglicher Art sowie anderen Krankheiten waren, wurden je 18 mg des Ifatriumsalzes der 6,6'-Dithiodinicotinsäure pro Tag an 21 aufeinanderfolgenden Tagen injiziert; die angegebene tägliche Dosis bedeutet eine I-Ienge an aktiver Substanz von 450 mg pro kg Körpergewicht. Hie injizierte Verbindung lag in wässriger Form, bei 7,2 pH vor, wie dies in Beispiel 3(a) beschrieben ist. Die Hause zeigten während des Versuches und auch danach keinerlei sichtbare Anzeichen von Trägheit oder Schläfrigkeit oder andere Krankheit sSymptome. Ihr Appetit blieb gut und ein Gewichtsverlust wurde nxht beobachtet.

Beispiel 5

Ehrlich-Ascites-liumorzellexL wurden einer oder mehreren 6 - 7-tägigen Ascites-Mäusen entnommen; die Zellen wurden gezählt und mit physiologischer Salzlösung bis auf eine geeignete Konzentration verdünnt. Iionzentrattonen zwischen etwa 100 000 und 5,00 000 Zejlen pro O,O|.ml wurden benutzt. Die bevorzugte

BAD ORIGINAL

Konzentration betrug etwa 200 000 Zellen pro 0,01 ml. Eine solche Zellsuspension (200 000 Zellen; 0,01 ml) -wurde in das G-eliirn von 48 Hausen injiziert, wobei man eine Ilamilton-Spritze mit einer 6,35 /u Nadel (1,6 cm lang) benutzte. Ein Teil der Nadel war mit einem Polyäthylen-Rohr (0,018 ID) bedeckt, so daß die Eindringtiefe, der Nadel in das Gehirn auf 6 mm begrenzt; war. Die Nadel wurde in das Hittelhirn durch die Squalüo ρ e t r ο s a 1 f i s s ur eingeführt.

Di- rläuoe -wurden in zwei Gruppen mit je 24 Tieren eingeteilt. Die Tiere der Gruppe Λ erhielten Injektionen IP von 2 mg 6,6'— Dithiodinicotinsäure in Natrlumbicarbonatlösung (0,1 ml) alle, vier Stunden - wobei man nicht früher als eine Stunde und nicht später als drei Stunden nach der Ihtracerebralinjektion begann - und zwar an sieben aufeinanderfolgednden Tagen und !lachten, d. ti. 42 Injektionen insgesamt. Alle Mäuse der zweiten Gruppe B erhielten Injektionen mit physiologischer Salzlösung (0,1 ml IP) alle vier Stunden, die an sieben aufeinanderfolgenden Tagen und Nachten zur selben Zeit wie die Injektionen der Gruppe Λ verabfolgt -wurden, d. h. also auch 42 Injektionen insgesamt.

Nach Ablauf der sieben Tage wurden die Hause getötet und ihre Lungen herausoperiert und zerkleinert. Zwei Proben von etwa 80 mg des zerkleinerten Lungengewebes jeder Maus wurden subkutan in den Retroscapularbereich einer gesunden Maus implantiert, und zwar auf beiden Seiten. Danach existierten also 24 Hause mit 48 Liingenimplanten von Mäusen der Gruppe A und 24' Mäuse mit 48 Lungenimplanten von Mäusen der Gruppe B.

Diese Mäuse wurden dann 30 Tage lang ohne besondere Behandlung gehalten und danach getütet; alle Tumoren, die sich an der Stelle der Lungenimplante gebildet hatten, wurden ausgeschnitten und gewogen. Ein Tumor, dessen Gewalt 100 mg oder mehr betrug, wurde als " Start" angesehen, d.h. das Lungengewebe, aup dem er entstanden war, enthielt eine Metastase.

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BAD ORIGINAL

Die Ergebnisse, die bei diesen Versuchen erzielt wurden, sind im Folgenden zusammengestellt:

	Anzahl d. "Starts"	Starts	Durchschn.
	Anzahl d. Implante	67 17	^G^oren^ä(?)
Gruppe B (nicht behandelt) Gruppe A (behandeLt)	24/36 8/46	179 mg 59

(1) Durchschnittliches Gesamtgewicht aller 2umoren einschließlich derjenigen, die weniger oder mehr als 100 mg wogen.

Aus den Ergebnissen erkennt man, daß 6,6'-Dithioöinieotin*- säure bei einer Verabreichung in der angegebenen ^T,7eise die Wirkung hat, die Anzahl der "Starts" auf 25 $ der Zahl bei unbehandelten Hausen zu senken und die Gesamttumormasse auf 33/j derjenigen bei unbehandelten Mäusen zu verringern. Dabei ist festzustellen, daß noch höhere Dosen an 6,6'-Dithiodinicotinsäure, die zu einer v/eiteren Verbesserung führen können, noch gut vertragen werden.

Beispiel 6

Der Versuch von Beispiel 5 wurde wiederholt, wobei folgönde Ergebnisse erzielt wurden?

Anzahl d. "Starts"

Gruppe B
(nicht behandelt)

Gruppe A
(behandelt)

Anzahl d. Implante

28/44 7/46

Starts	Durchschn. Gewicht der Sumoren (1)
64	547
15	177

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Beispiel 7

Anzahl der "Starts" ^c/o Durch-

Starts schnittl.

Anzahl der Implante Gewicht d.

Tumor en

Gruppe B (nicht behandelt)

Gruppe A (behandelt)

14/43 /44

155 mg

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Die Dosierung der dicyclischen Verbindungen und anderen Reagenzien, die erfindungsgemäß verwendet v/erden sollen, kann innerhalb weiter Grenzen verändert v/erden. Im allgemeinen erzielt man gute Ergebnisse, wenn man die Verbindungen in solchen

—6 —3 Mengen verabreicht, daß sich im Blut eine 10 bis 10 molare Konsentration ergibt. Bei einer derartigen Anwendung sind die Verbindungen nicht toxisch und können zur Blockierung der peripheren -SH Gruppen der Zellen verwendet werden und bewirken so eine Ausschaltung oder Begrenzung unerwünschter interzellularer Reaktionen einschließlich der Tumormetastase und - ausbreitung. Beispielsweise kann die hier beschriebene 6,6'-Dithiod!nicotinsäure in ausreichenden Dosen bei ilrebsoperationen verwendet werden. Es ist bekannt, daß durch die 1-Ianipulationen mit dem Tumor während der Operation eine ^nzahl Krebszellen in den Blutstrom übertritt, was immer mit der großen Gefahr einer Bildung von Iletastasen verbunden ist. Die Behandlung mit den erfindungsgemäßen Verbindungen sollte eine ausreichende Seitspanne sowohl vor als auch nach der Operation durchgeführt v/erden, bis die natürlichen Abwehrkräfte des Organismus die verbleibenden zirkulierenden Krebssellen zerstört haben.

Die erfindungsgemäß beschriebenen Verbindungen, die die -SH Gruppen an den Zellen blockieren, können lebenden Säugetieren in jjeder beliebigen Weise verabreicht werden, beispielsweise durch Injektion in den Blutstrom, in den Kuskel oder in das Körpergewebe. Acu eine orale Verabreichung kann wirksam sein.

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BAD ORtGINAL

Me Verbindungen können als solche oder zusammen mit öligen oder anderen Vehikeln verwendet werde-n, die ihre Abnorptionsgeschvindigkeit vermindern. Es ist auch möglich, eine Verbindung der vorstehend beschriebenen Art-, v/elche durch !uinbau anes oder mehrerer radioaktiver ICo hl ens t off-, Schv/efel- oder Iritiümatome radioalctiv gemacht v/orden ist, su verv/endeti. Durch Anv/endung dieser letztgenannten Hetliode lcann der I/irlcungsgrad radioaktiver Elemente stark vergrößert -,-/erden, v/eil sie v/ährend ihrer Wirkungsdauer chemisch an die Zellen, gebunden v/erden.

BAD

Claims

DR. JUR. DIFL-CHEM. H.-J. WOLFF FRANKFURT AM MAIN-HOCHST Betr.: Patentanmeldung P 21 20 995.0 D.R. Grassetti - unsere Nr. 17 045 - Patent a η s ρ r ü c h e:

1. Arzneimittel 25ur Hemmung der Tumormetastase und -ausbreitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Verbindung der Formel

R-S-S-R in der R^weils einen organischen Rest bedeutet,als Wirkstoff.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verbindung der Formel

II oder

S-S

III

worin η eine Zahl zwischen 1 und 4 und R Carbo«ygruppen oder Salze oder andere Derivate von Carboxygruppen bedeuten, als Wirkstoff enthält.

10 9 8 4 7/1832=

_ rf _

3. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es 6,6'-Dithiodinikotinsäure als Wirkstoff enthält.

'-\. Arzneimittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es neben dem Wirkstoff ein pharmazeutisch verträgliches Streck- oder Verdünnungsmittel enthält.

Für

D.R. Grassetti

(Dr..H. It. Wolff) Rechtsanwalt

499g