DE2106154C3 - Verfahren zur Herstellung eines Milchsäurebakterien-Präparates - Google Patents

Description

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Sulfonamide resistsnten Stamm aus und züchtet Dabei werden im Fall von CM bis 30 bis 40, im diesen Stamm auf Medien, die jeweils Streptomycin Fall von TC 40 bis 50, im Fall von EM16 bis 17 pm nachstehenden als SM abgekürzt), Chlorampheni- und im Fall von ABPC 20 bis 30 aufeinanderfolgende col {im nachstehenden als CM abgekürzt), Tetra- Übertragungszüchtungen durchgeführt, um dem Bakcyclhj (im nachstehenden als TC abgekürzt), 5 terium hohe Resistenz gegen jedes Arzneimittel zu Erythromycin (im nachstehenden als EM abgekürzt) verleihen. Der Resistenzgrad des so erhaltenen Milchbzw. AminobenzoylpeniciUin (im nachstehenden als Säurebakterienstammes BIO-4R, also einem Milch-ABPC abgekürzt) enthalten, und zwai derart, daß der säurebakterium mit multipler Arzneimittelbeständigbesagte Stamm zunächst unter Anwendung der Sub- keit, ist im folgenden für jedes obengenannte Antistanzgradienten-Agarschalen-Methode und dann io biotikum angegeben, bezogen auf den Resistenzgrad durch wiederholte Überführung in Medien mit sub- des Mutterstammes (BIO): inhibierender Substanzkonzentration mehrmals in _ςΜ mehr al« 2Onnfaeh

Anwesenheit der oben angegebenen Antibiotika in ™ uvvE

der Reihenfolge SM, CM, TC, EM und ABPC kulti- ^ lOOfach

viert wird, bis die gewünschte Widerstandsfähigkeit 15 _EM 500fach

des Stammes gegen diese Substanzen erreicht ist. ™ 33fach

Nach diesem Verfahren erlangt der Stamm Resi- ρ lOOfach

stenz außerdem auch gegen Kanamycin, Fradiomy- ABPC 30fach

ein, Oleandomycin, Licomycin, Leucomycin, Peni- m«,„.i«™,«·«

Μ>· t-v f L.1 ·λ· r> 1 · ο · - Oleandomycin

cflün GK, Cephalondm, Gentamycm, Spiramycm, ao τ ii

Bicfflin,Syncillin,OracUlin,Staphcillin,StaphcillinV,
Methocillin S, Staphcillin A und Natacillin.

Die Erfindung beruht somit auf dem im Patentansprach angegebenen Verfahren.

Der Mutterstamm, der nach der Erfindung zur a₅ «SSwän 250rach

Ableitung eines Milchsäurebakteriums mit Resistenz _n?,..^y _v - -xitarh

gegen verschiedene Arten von Antibiotika und SuI- Svnculin 32fach

fonamiden verwendet wird, ist ein sulfonamidbestän- Jr^ .... , _finf__u

diger Stamm von Streptococcus faecalis, und wird c£Sir„' ^If^'.h S,

als BIO-Stamm öapanische Patentschrift 567 370) 30 JJJv ;;;;;;;;; ^JJ **

Sm |esen BIO-Stamm gegen die vorgenannten ^

verschiedenen Arten von Antibiotika resistent werden _M , .„.

zu lassen, unterwirft man ihn den folgenden Behänd- XNaiacuim

lungen: 35 Ferner wurde eine mehr als 200fache Resistenz

a) Zuerst kultiviert man nach der Streifenmethode 8^e8^{en SA aIs beim Stamm} Staphylococcus 209 P festdiesen Stamm in lactosegefälltem Calciumcar- ^8e!i.^eIlt· , .. . ~, _T . ,. .. » bonat-Agar-Medium (im nachstehenden als ^Das Substanzgradienten-Agar (Ca-LA-MediuEi), Ca-LA-Medium abgekürzt), welches SM ent- ^da« erfindungsgemäß zur Resistentmachung des hält, 72 Stunden bei einer Temperatur von 37° C ⁴° Milchsaurebaktenenstammes BIO gegen verschiedene in einer Substanzgradienten-Agarschale; ^{Arten von} Arzneimitteln verwendet wird, läßt sich

b) sodann wählt man verschiedene Kolonien aus, ^{we ίο1}8^{ι herstelIen:}

die aus den über die gesamte Schale verbreite- Fleischextrakt 10 g

ten Mikroorganismen auf der Stelle mit der Pepton 10 g

höchsten SM-Konzentration gewachsen sind, und ⁴^ Salz (NaCl) 2 g

impft jede dieser Kolonien in ein Ca-LA- Lactose 20 g

Medium ein, das eine höhere SM-Konzentration Hefeextrakt 20 ml

aufweist, um es nach der Streifenmethode zu gefälltes Calciumcarbonat 10g

züchten; Agar-Agar 14 g

c) ferner wird die so gewonnene Kultur selektiert, ⁵° „ _ , ., . .„. indem sie nacheinander 16- bis 17mal in ein ^Dl.^{e vo}^^enannten Bestandteüe werden gemischt Medium übertragen wird, welches das Anti- und m 1000 nJ destilliertem Wasser gelost. 10 ml der biotikum (SM) in subinhibierender Konzentra- erhaltenen Flüssigkeit werden sterilisiert und nach tion enthält Einstellung des pH-Wertes in eme sterilisierte Petn-

55 schale gegossen. Die Flüssigkeit wird in einem unge-

Nach der vorgenannten Methode kann ein BIO- fähren Neigungswinkel von 10° verfestigt und nach

Stamm, der eine hohe Resistenz gegen SM besitzt, der Verfestigung in die horizontale Lage zurück'

erhalten werden. Anschließend werden die gleichen gebracht, worauf eine Menge von 10 ml der vorge-

Veriahrensschritte für die anderen Antibiotika wie- nannten Flüssigkeit mit der benötigten Konzentration

derholt, und zwar in der Reihenfolge CM, TC, EM 60 an Antibiotikum versetzt auf das verfestigte Medium

und ABPC, wodurch ein Milchsäurebakterium ge- aufgegossen und in Schichtform erstarren gelassen

wonnen wird, welches multiple Arzneimittelbestän- wird. Der so bereitete Substanzgradienten-Agar kann

digkeit besitzt und erfindungsgemäß verwendet wer- mit Vorteil als Kulturmedium zur Erzielung der Resi-

deii kann. Dieses Milchsäurebakterium ist als BIO- stenz gegen verschiedene Arten von Antibiotika ver-

4R-Stamm bezeichnet und unter Nr. 184 der Agency 65 wendet werden. Der Milchsäurebakterienstamm BIO-

of Industrial Science and Technology, Fermentation 4 R, der in einem solchen Medium nach der vorge-

Research Institute, hinterlegt worden, welches die nannten Methode in der Reihenfolge SM, CM, TC,

autorisierte Bakterienhinterlegungsstelle in Japan ist. EM und ABPC resistent gemacht worden ist, wird

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dann in einer Flasche auf eine kleine Menge Milch- mit der höchsten SM-Konzentration gewachsen war, medium aufgeimpft, insgesamt eiwa 10 bis 15 ml, aus den auf der Platte gewachsenen Kolonien ausge- und längere Zeit bei einer Temperatur von 37^C C wählt und wiederholt der sukzessiven Übertragungsgezüchtet. Die Kultur, die die Milch verfestigt, wird kultur unter Verwendung derselben Art von Medium dann ausgewählt und zur Weiterzüchtung von neuem 5 unterworfen. Nach lomaliger Durchführung dieses in frisches Milchmedium geimpft Nach aufeinander- Verfahrens wurde ein Milchsäurebakterium mit hoher folgender, mehr als zehnmaliger Übertragung wird Resistenz gegen SM erhaltender Stamm, der eine hohe Wuchsfähigkeit in Milch- Anschließend wurde dieses SM-restistente Milchmedium hat, ausgewählt Durch eine solche sukzes- säurebakterium insgesamt 30mal der sukzessiven sive Ubertragungskultur wird der Stamm, der bei der io Übertragungskultur unterworfen, und zwar in der ersten Züchtung in Milchmedium nur eine Wachs- gleichen Weise wie oben, jedoch unter Verwendung tumsgeschwindigkeit von 50 bis 60% hat, schließlich eines mit CM versetzten Mediums. Dadurch wurde auf 100% gebracht, und die Verfestigung der Milch ein Milchsäurebakterium erhalten, welches gegen SM dauert dabei regelmäßig 2 bis 3 Tage. und CM resistent ist Nun wurde dieses SM- und CM-

Der MilchaSurebakterienstamm BIO-4R, der auf 15 resistente Milchsäurebakterium 40mal in der gleichen diese Weise erhalten worden ist, wächst leicht in Weise, jedoch mit TC-haltigen Medium der sukzeseinem Milchmedium, dessen Hauptbestandteil Trok- siven Übertragungskultur unterworfen, bis ein Milchkenmagermilch ist und das deshalb leicht durch säurebakterium erhalten wurde, das gegen SM, CM Sprühtrocknung pulverisiert werden kann. Die Tech- und TC resistent war. Sodann wurde dieses SM-, CM-nik zum Sprühtrocknen von Milchsäurebakterienkul- ao und TC-resistente Milchsäurebakterium 16mal in der türen zwecks Herstellung stabiler, pulverförmiger gleichen Weise wie oben, jedoch unter Verwendung Milchsäurebakterien-Präparate ist in der japanischen eines mit EM versetzten Mediums der sukzessiven Patentschrift 502 315 beschrieben. Das wesentliche Übcrtragungskuitur unterworfen, aus dem das Milchdabei ist, mittels eines Zerstäubungstrockners die KuI- säurebakterium ιτ>>: Resistenz gegen SM, CM, TC tür zu pulverisieren, die durch Züchtung des vor- 25 und EM entnommen wurde. Schließlich wurde dieses genannten Milchsäurebakterienstammes mit mehr- Milchsäurebakterium mit SM-, CM-, TC- und EM-facher Arzneimittelresistenz in dem Medium mit Resistenz 20mal in der gleichen Weise, jedoch unter hoher Konzentration an entrahmter Milch erhalten Verwendung eines mit ABPC versetzten Mediums der worden ist. Gewöhnlich wird zur Herstellung des sukzessiven Übertragungskultur unterworfen, wonach Präparates noch eine Trägersubstanz zu dem so er- 30 ein Milchsäurebakterium BIO-4R isoliert wurde, haltenen Pulver zugesetzt. welches nicht nur gegen SM, CM, TC, EM und

Es wurde folgende Prüfung durchgeführt, um die ABPC, sondern auch gegen die anderen obenerwähnmultiple Resistenz und den Effekt der gemäß der ten Antibiotika sowie gegen Sulfonamide resistent Erfindung erhaltenen Milchsäurebakterien-Präpa- war.
ration zu bestätigen: 35 Es konnte bestätigt werden, daß der Resistenzgrad

Das Präparat nach der Erfindung wurde zusammen gegen die vorgenannten verschiedenen Arten von mit SM täglich oral an Mäuse verabreicht. Dabei Arzneimitteln einen Grenzwert erreicht, wenn die aufkonnte eine abnormale Zunahme von Bakterien wie einanderfolgende Übertragungskultur 16- bis 17mal Hefe in den Exkrementen nicht festgestellt werden. im Fall von SM, 30- bis 40mal im Fall von CM, 40-AIs dagegen nur SM gegeben wurde, stieg der Gehalt 40 bis 50mal im Fall von TC, 16- bis 17mal im Fall von der Exkremente an Bakterien wie Hefe bemerkens- EM und 20- bis 30mal im Fall von ABPC durchwert an. Ferner wurden Mäuse mit SM und EM ge- geführt wird.

füttert und mit dem Stamm Salmonella enteritidis Der in der beschriebenen Weise erhaltene Milch-

Nr. 11 infiziert, wonach die Mortalität auf 80 bis säurebakterienstamm BIO-4R mit mehrfacher Arz-100% anstieg. Als dagegen das Milchsäusebakterien- 45 neimittelbeständigkeit wurde dann in ein Milch-Präparat aus BIO-4R gemäß der Erfindung gleich- medium eingeimpft (etwa 15 ml), das durch Einzeitig mit oder vor der Verabreichung von SM mischen von 200Oj-ZmI SM (mg), 15 y/ml CM, 10 j-Zml und EM gegeben wurde, sank die Mortalität auf etwa TC, 100 yZml EM und 20 γΐπύ ABPC bereitet worden 50%. Man kann somit feststellen, daß das Milch- war, worauf der Stamm, der eine hohe Fähigkeit zur säurebakterienpräparat nach der Erfindung gegen SM 50 Verfestigung von Milch hatte, selektiert wurde. Die- und EM resistent ist und gleichzeitig die abnormale ser ausgewählte Stamm wurde etwa 10- bis 15mal Zunahme von Hefe (Phänomen der Superinfektion) nacheinander einer solchen Behandlung unterworfen, kontrolliert sowie die Infizierbarkeit durch Salmo- um einen Stamm zu erzielen, der eine beständige nella enteritidis herabsetzt. Fähigkeit zur Milchverfestigung hat, d. h. eine hohe

Die Erfindung ist im nachstehenden beispielsweise 55 Wachstumsfähigkeit in Müchmedium zeigt. Dann erläutert. wurde der so erhaltene Stamm in einem Medium

Beispiel kultiviert, das ungefähr 18% entrahmte Milch ent

hielt. Nach 96stündiger Züchtung war das Milch-

Der Stamm Streptococcus faecalis BIO wurde auf säurebakterium genügend gewachsen, und die Kultur das Substanzgradienten-Agar (Ca-LA-Medium) auf- 60 wurde durch sofortige Sprühtrocknung bei einer geimpft, das wie oben beschrieben hergestellt und Temperatur von 70 bis 100° C pulverisiert. Nach der mit SM versetzt »vorden war. Dieser Stamm wurde Pulverisation kann man nach Wunsch eine Trägernach der Streifenmethode 72 Stunden bei einer Tem- substanz oder verschiedene Arten von Enzymen, peratur von 37° C gezüchtet. Vitaminen und Aromastoffen zu dem pulverisierten

Anschließend wurde die Kolonie, die an der Stelle 65 Präparat zumischen.

Claims (1)

1. werden, hat ein derartiges Mlchsäurebakterien-Prä-

   Paientanspruch: parat, welches lediglich gegen ein bestimmtes Antibiotikum Resistenz aufweist, einen nur geringen ; Verfahren zur Herstellung eines aktiven Milch- praktischen Wert

   __t Säurebakterienpräparates mit Antibiotikaresistenz 5 Es wurde gefunden, daß Milchsäurebakterien-Kdurch sukzessives Züchten von Streptococcus Präparate, um medizinisch interessant zu sein, die i faecalis in einem das jeweilige Antibiotikum ent- folgenden Bedingungen erfüllen müssen: haltenden Nährmedium, Stabilisieren der erhal- Erstens ist es notwendig, daß die Milchsäurebak-

   tenen Antibiotikaresistenz durch mehrmaliges terien in dem betreffenden Präparat bei gleichzeitiger Züchten des so erhaltenen Streptococcus faecalis io Anwesenheit verschiedener Arten von Antibiotika in einem Milchmedium, das die entsprechenden und Sulfonamiden resistent bleiben, d. h., die Milch-Antibiotika zusammen enthält, und Spriihtrock- säurebakterien müssen eine multiple Arzneimittelnen der so erhaltenen Kultur, dadurch ge- beständigkeit aufweisen. Man hat also diejenigen kennzeichnet, daß man als Streptococcus Milchsäurebakterien zu selektieren, die gleichzeitig faecalis einen sulfonamidresistenien Stamm von 15 gegenüber zwei oder mehr verschiedenen Arten von Streptococcus faecalis nach der Substanzgra- Antibiotika resistent zu werden vermögen. Es wird dienten-Agarmethode und durch sukzessive Über- dadurch vermieden, daß das Milchsäurebakterium tragung auf Medien mit subinhibierender Kon- zwar gegen Streptomycin, aber nicht oder nur schwiezentration in der Reihenfolge Streptomycin, rig gegen andere Antibiotika resistent wird oder daß Chloramphenicol, Tetracyclin, Erythromycin und ao das Milchsäurebakterium gegen andere Antibiotika Aminobenzoylpenicillin selektiert und nach der als Streptomycin resistent wird, jedoch seine bereits Stabilisierung und einer weiteren Züchtung in vorhandene Resistenz gegen Streptomycin mehr oder einem Magermilchmedium die Kultur sprüh- weniger verliert.

   trocknet. Zweitens ist es wichtig, daß das Milchsäurebakte-

   »5 rium seine Resistenz nicht auf andere Mikroorganis-

   men überträgt, weil sonst bei der Verabreichung der

   Milchsäurebakterien-Präparate Viren und CoIi-Keime, die in dem Darmkanal vorhanden sind, ebenin neuerer Zeit ist entsprechend der Entwicklung falls resistent werden und dadurch die Therapie des von Antibiotika die Chemotherapie auch auf die Be- 30 Patienten in gefährlicher Weise beeinträchtigt wird, handlung von epidemischen Verdauungsstörungen Drittens muß das Milchsäurebakterium eine beanwendbar geworden und zeigt bemerkenswerte! ständige Resistenz aufweisen und darf nicht von betherapeutische Effekte. Eine ungeeignete Anwendung stimmten Arzneimitteln abhängig sein. Der Grund von Antibiotika verursacht jedoch auch das Auf- i_st, daß das Milchsäurebakterium, selbst wenn es treten von resistenten Dysenterie-Bakterien, ein An- 35 Resistenz gegen verschiedene Arten von Antibiotika t?teigen der Superinfektion und die Abnahme odeir _und Sulfonamiden erlangt hat, seinen Wert als PräZerstörung nützlicher Bakterien im Darmtrakt _parat verliert, falls diese Resistenz leicht nachläßt. In den letzten Jahren hat sich deshalb die von Milchsäurebakterien mit Resistenz gegen ein be-Metchinikow vorgeschlagene Verabreichung stimmtes Arzneimittel wie Streptomycin können eine von Milchsäurebakterien-Präparaten wieder für die 40 Abhängigkeit von letzterem zeigen, die so weit gehen Behandlung und Vorbeugung von epidemischen Ver- kann, daß sie dieses als unentbehrliche Substanz für dauungsstörungen wie Dysenterie, Salmonellosis ihr Wachstum benötigen. Man ist dann gezwungen, u. dgl. sowie die Behandlung und Vorbeugung vom die Antibiotika, von denen eine Abhängigkeit bei der Superinfektion eingeführt, und die Kenntnis der da- Züchtung besteht, zu dem Medium hinzuzufügen bzw. durch erzielbaren Wirkungen verbreitet sich immer 45 gleichzeitig mit den Milchsäurebakterien zu verab^menrreichen.

   Da jedoch die Milchsäurebakterien, die zur Her- Vienens und letztens ist es notwendig, daß das

   stellung der herkömmlichen Präparate verwendet Milchsäurebakterien-Präparat in eine stabile Pulverwerden, gegenüber Antibiotika empfindlich sind, zubereitung übergeführt werden kann, nachdem die besteht der Nachteil, daß sie therapeutisch unwirk- 50 Milchsäurebakterien gezüchtet worden sind. Die sam werden, wenn das Präparat gleichzeitig mit der Wachstumsgeschwindigkeit des Milchsäurebakteriums Chemotherapie unter Verwendung von Antibiotika ,_n dem Kulturmedium muß also hoch sein. Im allgeeingesetzt wird. meinen zeigen Milchsäurebakterien, die gegen Arznei-

   Aufgabe der Erfindung ist daher, die Entwicklung mittel resistent geworden sind, einen deutlichen von Milchsäurebakterien-Präparaten aus Milchsäure- 55 Rückgang ihrer Wachstumsgeschwindigkeit in dem bakterien, die ihre Aktivität nicht verlieren, wenn sie Kulturmedium, und man muß deswegen das Milchgleichzeitig mit verschiedenen Arten von Antibiotika säurebakterium auswählen, dessen Wachstumsge- und Sulfonamiden verabreicht werden, und die einen schwindigkeit wegen der Arzneimiitelresistenz nicht breiten Resistenzbereich gegen verschiedene Arten abnimmt.

   von Antibiotika und Sulfonamiden haben. 60 Auf Grund von Arbeiten über die Selektion bzw.

   In der japanischen Patentschrift 567 370 wurde Züchtung von Milchsäurebakterien wurde gefunden, bereits ein Verfahren zur Herstellung eines Präparates daß ein Milchsäurebakterium, welches die vorgenannaus einem Stamm von Streptococcus faecalis ten vier Bedingungen erfüllt und gegen die folgenden B 10-SMR beschrieben, einem Milchsäurebakterium, Antibiotika sowie verschiedene Sulfonamide Residas gegenüber Streptomycin resistent ist. Da in der 6₅ stenz zeigt, nach dem folgenden Verfahren gewonneueren Chemotherapie jedoch viele Möglichkeiten, nen werden kann:

   gegeben sind, bei denen mehr als zwei Arten von Man wählt aus den Milchsäurebakterienstämmen,

   Antibiotika und Sulfonamiden gleichzeitig eingesetzt welche zu Streptococcus faecalis gehören, einen gegen