DE2064482A1 - Verfahren zur Reinigung von niederen Alkylestern des alpha-L-Aspartyl L-phenyl= alanins

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Description

Claims

DE2064482A1

Publication number: DE2064482A1
Application number: DE19702064482
Authority: DE
Inventors: Yasuo Yokohama; Yamatani Tetsuo; Uchiyama Noboru; Kawasaki Kanagawa; Sato Naotake Tokio; Ariyosru (Japan)
Original assignee: Ajmomoto Co., Inc., Tokio
Priority date: 1969-12-30
Filing date: 1970-12-30
Publication date: 1971-07-22
Also published as: US3678026A; CH522596A; FR2074496A5; CA909254A; GB1284618A

RATENTAKVfKlTE DR.E.WIEGAND DIPL-ING. W. NIEMANN 2064482

DR. M. KÖHLER DIPL-ING. C GERNHARDT

MÖNCHEN HAMBURG TELEFON= 55547« . 8000 MÖNCHEN 15, TELEGRAMMEiKARPATENT NUSSBAUMSTRASSE 10

30. Dezember 1970 V. 40264/70 - WNe

Ajinomoto Co. Inc. Tokyo, Japan

Verfahren zur Reinigung von niederen Alkylestern des a-L-Aspartyl-L-phenylalanins

Die niederen Alkylester des cc-L-Aspartyl-L-phenylalanins ergeben neue Addukte mit spezifischen, aromatischen Carbonsäuren oder substituierten Phenolen, die in wässrigen Medien unlöslich sind oder"nur geringfügig löslich sind und deshalb von den verunreinigenden Verunreinigungen abgetrennt werden können.

Die Erfindung befasst sich mit der Reinigung von niederen Alkylestern des oc-L-Aspartyl-L-phenylalanins.

Die Ester sind bekannte Süsser mit einem Geschmack ähnlich zu Rohrzucker (belgische Patentschrift 717 373)· Obwohl diese a-Aspartyl-Derivate üblicherweise über das Asparginsäureanhydrid hergestellt werden können, werden die entsprechenden ß-Derivate, also die niedrigen Alkyl-

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ester des ß-L-Aspartyl--L~phenylalanins,"gleichzeitig als Nebenprodukte erhalten. Die ß-Derivate müssen ausreichend· von den gewünschten α-Derivaten abgetrennt werden, da da © ß-Derivate einen ziemlich bitteren Geschmack besitzen und als Süssungsmittel nicht geeignet sind. Die wiederholte Umkristallisation aus Wasser wurde zur Gewinnung der α-Derivate aus Gemischen mit den ß-Derivaten angewandt. Dieses Verfahren kann jedoch lediglich angewandt werden, wenn die Mengen des verunreinigenden ß-Derivates klein sind, da die unterschiedlichen Löslichkeiten zwischen dem α- und ß-Derivat in Wasser oder organischen Lösungsmittel nicht gross sind. Weiterhin neigen die α-Derivate, da sie α-gebundene Dipeptidester darstellen, leicht zu einer Änderung in die entsprechenden Diketopiperazin-Derivate während wiederholter Umkristallisationen.

Wenn die α-Derivate nach anderen Verfahren hergestellt werden, enthalten die Reaktionsgemische stets gewisse Verunreinigungen, wie Ausgangsmaterialien und Nebenprodukte. Verfahren zur Gewinnung der α-Derivate aus derartigen Eeaktionsgemischen sind bisher nicht bekannt.

Im Rahmen der Erfindung wurde nun gefunden, dass die niedrigen Alkylester des a-L-Aspartyl-L-phenylalanins neue Addukte mit aromatischen Carbonsäuren oder substituierten Phenolen aus der Gruppe von ß-Fheny!propionsäure, Cinnaminsäure, o-Fluorbenzoesäure, p-Hydroxybenzoesäure, Gentisinsäure, ß-Eesorcinsäure, 5-Chlorsalicylsäure, 3j5-Dinitrobenzoesäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 2-Naphthoesäure, ß-Naphthoxyessigsäure, 2,4-Dichlorphenol, 2,5-Dichlorphenol und 2_?6-Dichlor-4-nitrophenol bilden. Die gebildeten Addukte sind unlöslich oder nur spärlich löslich in wässrigen Medien innerhalb eines pH-Bereiches von 2 bis 7»

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überraschenderweise bilden die vorstehend aufgeführten Mederschlagsmittel keine unlöslichen Addukte in wässrigen Lösungen unter den gleichen Bedingungen mit den ß-Aspartyl-Derivaten und anderen Verunreinigungen, wie Asparaginsäure, Aspartylasparaginsäure und niederen Alkylphenylalaninaten. Die a-Aspartyl-Derivate können dadurch leicht aus den Gemischen mit Verunreinigungen abgetrennt werden. Das Ausfällungsverfahren gemäss. der Erfindung kann erfolgreich aus Synthese-Gemischen,die die α-Derivate mit anderen organischen und anorganischen Verbindungen enthalten, einschliesslich anorganischen Salzen und organischen, färbenden Materialien, angewandt werden.

Die Umsetzung des α-Derivats mit dem Ausfällungsmittel wird durch Kontaktierung in einem wässrigen Lösungsmittel, das gegenüber den Reaktionsteilnehmern inert ist, ausgeführt. Geeignete Lösungsmittel umfassen, ohne hierauf begrenzt zu sein, Wasser oder Gemische von Wasser und wasserlöslichen, organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Äthylenglyko1, Isobutylenglykol, Aceton, Methyläthylketon, Diäthylketon, !Tetrahydrofuran, Dioxan, Acetonitril, Dimethylformamid, Diäthylsulfoxid und γ-Butyrolacton. Das Reaktionsgemisch kann bevorzugt auf einen pH-Bereich von 3 bis 5,5 zur Erzielung des Adduktes in höherer Ausbeute eingestellt werden.

Die Menge des exngesetzten Ausfällungsmittels ist nicht kritisch. Üblicherweise ist es am günstigsten, das Ausfällungsmittel in Mengen von 1 bis 3 Mol je Mol α-Derivat anzuwenden. Die wasserlöslichen Salze der Ausfällungsmittel, beispielsweise die Kalium- und Natriumsalze, sind auch als freie Mittel wirksam.

Die Addukte können aus dem Reaktionsgemisch nach übliehen Verfahren, wie Filtration, Zentrifugetion und De-

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kantation abgetrennt werden. Die erhaltenen Addukte werden leicht durch übliche Verfahren, beispielsweise Behandlung derselben in stark wässrigen Medien, beispielsweise Salzsäur elö sung en, Schwefelsäurelösungen, Benzolsulfonsäurelösungen und dgl. mit einem pH-Wert nicht höher als 2 oder Kontaktierung der Addukte oder deren wässriger Suspensionen mit einem wasserunlöslichen, organischen Lösungsmittel und Extraktion des Ausfällungsmittels, beispielsweise Kohlenwasserstoffen, wie Benzol und Toluol, halogenierten Kohlenwasserstoffen, wie Chloroform und Ithylendichlorid, Estern, wie Ithylacetat und aliphatischen Ä'thern, wie Di ä thy lather, zersetzt.

Falls Säuren verwendet werden, verbleibt das Ausfällungsmittel unlöslich und wird leicht gewonnen und das α-Derivat wird gleichfalls aus der Mutterlauge durch Einstellung derselben auf einen pH-Wert von 4- bis 5i5 mit Alkali, wie Alkalibicarbonat, Alkalicarbonat und Alkalihydroxid, gewonnen.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung:

Beispiel 1

Eine Lösung von 1,0 g a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester und 0,5 g ß-Hesorcinsäure in 100 ml Wasser wurde in einem Kühlschrank Übernacht aufbewahrt.

Die ausgefällten, seidenartigen Kristalle wurden abfiltriert und gesammelt. Ihr Gewicht betrug 0,5 g und der Schmelzpunkt betrug 182 bis 186° C. Sie wurden als das Addukt des Dipeptids mit ß-ßesorcinsäure in einem Molarverhältnis von 1 : 2 auf Grund von Infrarotspektrum und Elementaranalyse identifiziert.

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	^(C28^H30°13^N2⁾	O	2	H	H (%)
Gefunden:	Beispiel	55,79	5,04	4,83
Berechnet	55,81	5,02	4,65

Gemäss Beispiel 1 wurden 0,5 S Gentisinsaure anstelle von ß-Resorcinsäure verwendet.

Es wurden nadeiförmige Kristalle in einem Gewicht von 0,8 g mit einem Schmelzpunkt von-133 bis 134° O erhalten. Diese wurden als Addukt des Dipeptide mit Gentisinsaure in einem Molarverhältnis von 1:1 auf Grund von Infrarotspektrum und Elementaranalyse identifiziert«

Eine Lösung von 1,0 g a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester und 1,0 g Cinnaminsäure in 100 ml einer 50%igen, wässrigen Äthanollösung wurde in einem Kühlschrank während 2 Tagen gehalten.

Die ausgefällten, nadeiförmigen Kristalle wurden abfiltriert und getrocknet. Ihr Gewicht betrug 0,9 6 und ihr Schmelzpunkt 140 bis 141° G, Sie wurden als Addukt des Dipeptide mit Ginnarainsäure in einem Molarverhältnis von 1 : 1 auf Grund von Iijifrarotspektrum und Elementaranalyse identifiziert:

	^(C23^H26°7^N2·	H₂O)	59	C	6	H	6	N C
Gefunden:			59	,8	6	,29	6	,55
Berechnet		»99	,13	,08

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Beispiel 4

3,0 g Cinnaminsäure wurden zu einer Lösung von .5*° g gc-L-Aspartyl-L-phahylalanin-niethylester und 5,0 g ß-Ir-A'spartyl-L-phenylalanin-methylester, gelöst in .5QO ml Wasser, zugesetzt. Es wurde 5 Stunden gerührt und das Gemisch, in einem Kühlschrank übernacht stehengelassen, Bie ausgefällten Kristalle wurden abfiltriert, getrocknet und wogen 6,3 g· Sie wurden als Addukte gemäss Beispiel 3 auf Grund von Schmelzpunkt und Infrarotspektrum identifiziert.

5 Ul des Filtrates wurden durch Papierelektrophorese in wässriger Essigsäure mit einem pH-Wert von 2,8 und 25 V/cm untersucht. Bei der Färbung mit Cadmium-ninhydrin nach dem Verfahren von J. Heilmann und Mitarbeiter (Z. Physiol. Chem., 309, 219 (1957)) zeigte das Chromatogramm zwei Flecken, die jeweils dem α- und ß-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester entsprachen. Die Flecken wurden ausgeschnitten, mit Methanol eluiert und die Absorptionen der Eluate bei 510 mu -bestimmt. Das Filtrat enthielt 1,0g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester und 4,6 g des ß-Isomeren. Das Filtrat (pH 3,7) wurde auf pH 2 mit Salzsäure eingestellt und mit 200 ml Äther zur Entfernung der Cinnaminsäure gewaschen. Die wässrige Schicht wurde . auf pH 5iO mit Natriumbicarbonat eingestellt und zur Trockene im Vakuum abgedampft. Der Rückstand ergab nach Umkristallisation aus Wasser 3>6 g reines ß-Isomeres (Ausbeute 72 %), welches bei 189 bis 190° C schmolz und weiterhin durch die Elementaranalyse identifiziert wurde:

Gefunden 9,30

Berechnet (C₁₄H₁₈O₅N₂-I^ H₃C) 9,24

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Die Kristalle waren frei vom α-Isomeren auf Grund der Papierelektrophorese.

Andererseits wurden 6,3 g des vorstehenden Adduktes in 500 ml Wasser suspendiert und auf pH 2,0 mit Salzsäure eingestellt. Die gebildete Cinnaminsäure wurde mit 200 ml Äther extrahiert. Die wässrige Schicht wurde auf pH 5»0 mit Natriumbicarbonat eingestellt und zur Trockene im Vakuum abgedampft. Der Rückstand ergab nach Umkristallisation aus Wasser 3,5 g des reinen α-Isomeren (70 % Gewinnung), welches bei 235 "bis 236° C schmolz, und das weiterhin durch die Elementaranalyse identifiziert wurde:

C HN (%)

Gefunden 55»50 6,21 9,35

Berechnet (C₁₄H₁₈O₅N₂.1/2H₂O)55,44 6,31 9,24-

Die Kristalle waren vom ß-Isomeren auf Grund der Papierelektrophorese frei.

Beispiel 5

6,0 g ß-Resorcinsäure wurden zu einer Lösung von "5,0 g a-L-Aspartyl'-L-phenylalanin-methylester und 5»0 g ß-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, gelöst in 500 ml Wasser, zugesetzt. Es wurde 5 Stunden gerührt und das Gemisch in einen Eisschrank Übernacht gegeben. Die ausgefällten Kristalle wurden abfiltriert, getrocknet und wogen 9,3 g. Sie wurden als das in Beispiel 1 erhaltene Addukt auf Grund von Schmelzpunkt und Infrarotspektrum identifiziert.

Wenn 5 J*l des Filtrates papierelektrophoretisch wie in Beispiel 4- untersucht wurden, enthielt das Filtrat 1,0 g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester und 4-,9 g· des ß-Isomeren. Das ilitra.t (pH 2,6) wurde auf pH 2,0

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gebracht und mit 25Ö ml Äther gewaschen, um die ß-Resorcinsäure zu entfernen. Die wässrige Schicht wurde auf pH 5,0 eingestellt und im Vakuum zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand ergab nach der Umkristallisation aus Wasser 3,9 g reines ß-Isomeres (78 % Gewinnung), welches bei 189 bis 190° C schmolz, das weiterhin durch Elementaranalyse identifiziert wurde:

	H₂O)	N	(%)
Gefunden:	9	,30.
Berechnet (C₁₄H,	9	,24


I₈U₅JU₂* V2

Die Kristalle waren frei vom α-Isomeren auf Grund von Elektrophorese.

Andererseits wurden 9,6 g des vorstehenden Adduktes in 5OO ml Wasser suspendiert, auf pH 2,0 eingestellt und mit 250 ml Äther zur Entfernung der ß-Resorcinsäure gewaschen.. Die wässrige Schichte wurde auf pH 5,0 eingestellt und im Vakuum abgedampft. Der Rückstand ergab nach Umkristallisation aus Wasser 3,3 g des reinen oc-Isomeren (66 % Gewinnung), die bei 235 bis 236° C schmolzen und weiterhin durch Papierelektrophorese identifiziert wurden.

Beispiel 6

2,8 g Natriumbicarbonat wurden zu einer Lösung von 5,0 g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 5,0 g ß-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 0,4 g L-Asparaginsäure, 7,1 g Methyl-L-phenylalaninat-hydrochlorid und 1,9 S Natriumchlorid, gelöst in 5OO ml Wasser, zugesetzt. Die Lösung wurde mit 250 ml Äthylacetat gewaschen und das Methyl-L-phenylalaninat in einer Ausbeute von 75 % erhalten. Die wässrige Schicht wurde im Vakuum eingedampft, bis das Äthylacetat abdestilliert war. Die konzentrierte

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wässrige Schicht wurde auf 500 ml mit Wasser aufgefüllt.

12 g ß-Resorcinsäure wurden zu dieser wässrigen Lösung unter Rühren bei Raumtemperatur zugegeben. Nach dem Rühren während 5 Stunden wurde das Reaktionsgemisch in einen Kühlschrank Übernacht gegeben. Die ausgefällten Kristalle wurden abfiltriert, getrocknet und wogen 1315 g· Sie wurden in der gleichen Weise wie das in Beispiel 1 erhaltene Addukt identifiziert.

Das Filtrat enthielt 0,2 g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester und 4,8 g ß-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester auf Grund der Elektrophorese wie in Beispiel Nachdem das Piltrat nach dem Verfahren gemäss Beispiel 5 behandelt worden war, wurden 4,1 g reines ß-Isomeres (82 % Gewinnung) erhalten.

Andererseits ergaben 13,5 g des Adduktes, wenn sie in 500 ml Wasser suspendiert wurden, und nach dem Verfahren gemäss Beispiel 5 behandelt wurden, 3j2 g reines α-Isomeres (64 % Gewinnung).

Beispiel 7

Jeweils eines der in Tabelle I aufgeführten Ausfällungsmittel wurde zu jeweils 100 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 1,0 g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester und 1,0g ß-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester in Mengen der 1,2fachen Molzahl des darin enthaltenen α-Isomeren zugesetzt. Es wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden gerührt und das Gemisch dann übernacht in einen Kühlschrank gestellt. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet. Er wurde als Addukt des α-Isomeren mit dem verwendeten Ausfällungsmittel durch Zusetzung in Wasser mit Salzsäure und Gewinnung des α-Isomeren und des Ausfällungsmittels identifiziert.

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Das illtrat wurde durch Papierelektrophorese wie, in Beispiel 4 untersucht und die Mengen der α- und ß-Isomeren, die als Addukt entfernt worden waren, angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle I für jedes AusfällungSHiittel angegeben.

Tabelle I Ausfällungsmittel

Prozent	der	ß-Isomeres
Ausfällung (%}	1,3
α-Isomeres	0
82	0
66	0
94	4
74
94

5-Chlorsalicylsäure 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 2,5-Dichlorphenol 2,6-Diclilor-4-ni trophenol ß-Resorcinsäure*

Prozent der Ausfällung (%) = /Prozentsatz jedes Isomeren,

entfernt als Addukt/

* In diesem Fall wurden die α- und ß-Isomeren des L-Aspartyl-L-phenylalanin-äthylesters anstelle der entsprechenden Methylester verwendet und ß-Resorcinsäure in Mengen der 2,4fachen Molzahl des α-Isomeren eingesetzt.

Beispiel 8

Jeweils eines der in Tabelle II aufgeführten Ausfällungsmittel wurde zu jeweils 100 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 1,0g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 0,1 g L-Asparaginsäure und 0,1 g Methyl-L-phenylalaninat in Mengen der 1,2fachen Molzahl des Dipeptide zugesetzt. Es wurde 5 Stunden gerührt und das Gemisch in einem Kühlschrank übernacht stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet. Er wurde als Addukt des Dipeptids mit dem

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Ausfällungsmittel durch Zersetzung desselben in Wasser mit Salzsäure und Gewinnung des Dipeptide und des Ausfällungsmittels identifiziert.

Das Filtrat wurde durch Papierelektrophorese wie in Beispiel 4 untersucht und der Prozentsatz der Ausfällung bezüglich des α-Isomeren erhalten.

Die Ergebnisse sind in Tabelle II für jedes Ausfällungsmittel aufgeführt.

Tabelle II Ausfällungsmittel

ß-Phenylpropionsäure Cinnaminsäure o-Fluorbenzoesäure p-Hydroxybenzoesäure Gentisinsäure ^-Chlorsalicylsäure 3,5-Dinitrobenzoesäure 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 2-Naphthoesäure ß-Naphthoxyessigsä'ure 2,4-Dichlorpheiiol 2,5-Dichlorphenol 2,6-Dichlor-4-nitrophenol

Die Zahlen in Klammern sind die Prozentsätze der Ausfällung im Fall des a-L-Aspartyl-L-phenylalaninäthylesters anstelle des entsprechenden Methylesters.

Prozentsati	5 der Aus-	(70)
fällung {%]	)
65
73
24
69	(90)
73
86
93	(82)
77	(91)
67
80
93
74

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^₂₄O₉N₂-H₂O)

Berechnet (Cp

Patentansprüche

Γ 1. Addukt eines niederen Alkylesters von oc-L-Aspärtyl-L-phenylalanin mit einer aromatischen Carbonsäure oder einem substituierten Phenol, bestehend aus ß-Pheny!propionsäure, Cinnaminsäure, o-Fluorbenzoesäure, p-Hydroxybenzoesäure, Gentisinsäure, ß-Resorcinsäure, Jp-Chlorsalicylsäure, 3,5-Dinitrobenzoesäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 2-Naphthöesäure, ß-Naphthoxyessigsäure, 2,4-DiChIOrPhBnOl, 2,5-Dichlorphenol und 2,6-Dichlor-4-nitrophenol. ■
2. Verfahren zur Herstellung des Adduktes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Dipeptidester mit der aromatischen Carbonsäure oder dem substituierten Phenol in einem wässrigen Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 2 bis 7 umgesetzt wird, bis das Addukt ausgefällt ist und das"ausgefällte Addukt von dem Rest der Lösung abgetrennt wird.

J. Verfahren zur Reinigung eines niederen Alkylesters des a-L-Aspartyl-L-phenylalanins, dadurch gekennzeichnet, dass der Dipeptidester mit einem der Ausfällungsmittel ß-Pheny!propionsäure, Cinnaminsäure, o-Pluorbenzoesäure, p-Hydroxybenzoesäure, Gentisinsäure, ß-Resorcinsäure, ^-Chlorsalicylsäure, 3,5~Dinitrobenzoesäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 2-Naphthoesäure, ß-Naphthoxyessigsäure, 2,4-Dichlorphenol, 2,5-Dichiorphenol oder 2,6-Dichlor-4~nitrophenol in einem wässrigen Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 2 bis 7 umgesetzt wird, bis das Addukt des Dip ep ti de st er s mit dem Ausfällungsniittel aus der Lösung ausgefallen ist, das ausgefällte Addukt von der Lösung abgetrennt wird und das Addukt zersetzt wird. "

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