DE20220744U1

DE20220744U1 - Mittel zur Hemmung von Lentiviren

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Publication number: DE20220744U1
Application number: DE20220744U
Authority: DE
Original assignee: VIROMICS GmbH
Current assignee: VIROMICS GmbH
Priority date: 2001-10-25
Filing date: 2002-10-25
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2012-10-26
Also published as: WO2003038032A8; WO2003038032A3; EP1439853A2; AU2002347102A1; WO2003038032A2

Abstract

Mittel zur Hemmung des Primaten-Lentivirusproteins R (Vpr) der Immundefizienzviren HIV-1, HIV-2 und SIV, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponenten Inhibitoren von zellulären Chaperonen enthalten, welche für die korrekte Faltung, Stabilität und damit die biologische Funktion von Vpr notwendig sind.

Description

Die Erfindung betrifft Mittel zur Hemmung von Lentiviren und insbesondere von PPIase-Inhibitoren als Mittel zur Hemmung des Lentivirusproteins R von Primaten (Virusprotein R – Vpr), vor allem der Humanen Immundefizienzviren Typ 1 und 2 (HIV-1 und HIV-2) sowie der Affen- (Simian)-Immunodefizienzviren (SIV). Diese Mittel sind insbesondere dazu geeignet, die Wechselwirkung von Vpr mit einer Klasse von zellulären Chaperonen, den cis/trans Peptidylprolyl-Isomerasen (PPIasen), zu unterbinden. Dabei wird insbesondere festgestellt, dass Vpr mit dem Enzym Cyclophilin A (CyPA) in Wechselwirkung tritt und dass diese Wechselwirkung durch das Mittel Cyclosporin (CsA) gehemmt werden kann. Diese Wechselwirkung Vpr-CyPA ist essentiell für die Proteinstabilität, die Faltung und die Funktion von Vpr. Durch das Mittel CsA, sowie anderen Hemmern von PPIasen, kann aufgrund dieses neu erkannten Zusammenhanges die Funktion von Vpr blockiert werden. Die Erfindung beschreibt die neue Erkenntnis, dass nach Behandlung einer HIV-infizierten Zelle mit dem Inhibitor CsA das Vpr instabil wird und daher seine Funktion im Replikationszyklus von HIV nicht mehr ausüben kann. Aufgrund der Tatsache, dass Vpr ein wichtiger Pathogenitätsfaktor in dem Krankheitsbild einer HIV-Infektion ist, können CsA und andere PPIase-Inhibitoren für die Behandlung von AIDS als neuartige anti-retrovirale Therapie eingesetzt werden.
Stand des Wissens
1. Immunophiline (PPIasen) als zelluläre Chaperone
Peptidylprolyl-Isomerasen (PPIasen) stellen eine Gruppe von zytosolischen Enzymen dar, welche ursprünglich durch ihre Fähigkeit charakterisiert wurden, die cis-trans Isomerisierung von cis-Peptidylprolylbindungen innerhalb eines Proteins zu katalysieren. Später hat sich herausgestellt, dass eben diese PPIasen das direkte Target von bestimmten immunosuppressiven Medikamenten sind, dazu zählen Cyclosporin A (CsA), FK506 und Rapamycin. Neuere Medikamente, welche nicht wie CsA immunosuppressiv wirken, sind die von der Firma Novartis entwickelten Substanzen "SDZ NIM811" und "SanglipherinA". Diese PPIasen werden auch als Immunophiline bezeichnet. Immunophiline sind weit verbreitet und hoch exprimiert in höheren Eukaryoten. Es ist daher anzunehmen, dass PPIasen eine wichtige Rolle in der Zellphysiologie spielen. Diese Rolle ist bislang noch nicht verstanden, wesentlich und der Natur von PPIasen entsprechend, haben diese Enzyme eine wichtige Funktion für die korrekte Faltung und Expression von Proteinen, dazu zählen Multiproteinkomplexe wie zum Beispiel Ca⁽²⁺⁾-Ionenkanäle, Steroid-Rezeptorkomplexe und Rezeptoren für die Thyrosinkinase. Die PPIase-Inhibitoren CsA und FK506 sind Naturprodukte aus Mikroorganismen und potente Inhibitoren, da sie einen spezifischen Komplex mit PPIasen eingehen. Als ein gut charakterisiertes Target für die Wirkung von CsA gilt die Serin/Threonin-Proteinphosphatase Calcineurin (CN). Für Review dieses Abschnittes siehe Ivery, 1999, 2000.
2. HIV und PPIasen
2.1. Replikationszyklus von HIV
Der Replikationszyklus von HIV beginnt mit der Bindung des Virus an verschiedene Zellrezeptoren, unter denen das Glykoprotein CD4 als der primäre Rezeptor fungiert. Der Viruseintritt erfolgt durch pH-unabhängige Membranfusion, gefolgt von dem "uncoating" der Viruspartikel im Zytosol. Das virale RNA-Genom wird mittels enzymatischer Aktivitäten von Reverser Transkriptase (RT), RNase H und Polymerase in doppelsträngige DNA umgeschrieben, welche dann in Assoziation mit dem Präintegrationskomplex in den Zellkern transportiert und als Provirusgenom in chromosomale DNA mittels viraler Integrase eingebaut wird. Nach Transkription und Translation werden Gag/Gag-Pol-Polyproteine sowie Hüllproteine an die Zellmembran transportiert, wo die Assemblierung von Virionen erfolgt. Nach Budding und Abschnürung reifen die Viruspartikel durch proteolytische Prozessierung der Gag/Gag-Pol-Polyproteine (für Review siehe Martin, 1993).
2.2. Bedeutung akzessorischer Virusgenprodukte im Replikationszyklus von HIV-1
Zusätzlich zu den Prototyp-Retrovirusgenen gag, pol und env kodiert HIV-1 weitere Gene: tat und rev sind essentiell für die Virusreplikation; Tat ist der Haupttransaktivator des Viruspromoters und Rev übt posttranskriptionelle Funktionen aus, indem es den Transport von nicht gespleißter gag/pol sowie einfach gespleißter vif, vpr und vpu/env mRNAs aus dem Zellkern in das Zytoplasma reguliert (für Review siehe Trono, 1995). Dagegen sind nef, vif, vpr und vpu für die Virusreplikation in Zellkulturen nicht unbedingt erforderlich und werden daher gewöhnlich als "akzessorische" Gene bezeichnet. Es mehren sich jedoch Hinweise in der Literatur, wonach diese Proteine die Infektionsausbreitung und die Krankheitsprogression einzelner Viren in vivo wesentlich bestimmen. Weiterhin haben Experimente in vitro gezeigt, dass einzelne dieser akzessorischen Proteine in bestimmten Zellkulturen, insbesondere in kultivierten primären humanen Monozyten/Makrophagen, eine essentielle Funktion für die Virusreplikation ausüben.
2.3. Das akzessorische Regulatorprotein Vpr
Das Gen vpr wurde erstmals 1987 als ein kleiner offener Leserahmen im Genom des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) beschrieben und mit dem Buchstaben "R" bezeichnet. Das vpr Gen ist unter allen bekannten Isolaten von HIV-1 und HIV-2 wie auch den Affen-Immundefizienzviren (SIV) konserviert und wird daher auch als das Lentivirus-Protein Vpr bezeichnet. Vpr besitzt diverse biologische Aktivitäten wie zum Beispiel: Oligomerisierung, Lokalisation im und Transport des viralen Präintegrationskomplexes zum Zellkern, Transkriptionsaktivierung von HIV-1 und heterologen Viruspromotoren, Induktion von Zelldifferenzierung und Zellzyklusarrest, Bindung und Wechselwirkung mit verschiedenen zellulären Proteinen, insbesondere dem Glucocorticoidrezeptor (GR) und Verstärkung der Wirkung von Steroidhormonen (für Review siehe Emerman, 1996).
2.4. Biologische Funktionen von Vpr
Studien im Tiermodell zeigten, dass Vpr für die Entwicklung von AIDS-ähnlichen Symptomen in SIV-infizierten Rhesusaffen erforderlich ist, beziehungsweise dass Punktmutationen im vpr Gen im Verlauf der Infektionsausbreitung in vivo zu funktionellem Vpr revertieren (Lang et al., 1993). Weiterhin verhindern die Doppelmutationen in vpx und vpr von SIV_mac239 die AIDS-Progression (Gibbs et al., 1995). Vpr ist das einzige akzessorische Protein, welches in signifikanten Mengen und durch einen spezifischen Mechanismus aktiv in Viruspartikel eingebaut wird. Diese Tatsache führte zu der Vermutung, dass die Wirkung von Vpr frühzeitig im HIV-Replikationszyklus erfolgt, unmittelbar nach Membranfusion und "uncoating" des eindringenden Viruspartikels. Studien über eine mögliche Anwendung von "anti-Vpr-Drogen" zeigten, dass vpr spezifische antisense-Konstrukte die HIV-1-Virusreplikation in Makrophagen unterdrücken können (Balotta et al., 1993). Vpr unterstützt die Virusreplikation in ausdifferenzierten, sich nicht mehr teilenden primären humanen Monozyten/Makrophagen (Heinzinger et al., 1994). Diese Tatsache wird dadurch begründet, dass Vpr für den Import des viralen Präintegrationskomplexes in den Zellkern von sich nicht mehr teilenden Zellen notwendig ist und dadurch HIV unabhängig von der Zellmitose ausdifferenzierte Zellen infizieren kann.
Weiterhin ist bekannt, dass Vpr Zelldifferenzierung und Zellzyklusarrest induziert und den Transport sowie verschiedene Funktionen im Zellkern bewirkt.
Da Vpr als Bestandteil des Präintegrationskomplexes elementare Prozesse der Zelle im Interesse der Virusreplikation beeinflusst, ist verständlich, dass Vpr spezifische Verbindungen mit zellulären Faktoren eingeht. Zum Beispiel wurde eine Wechselwirkung von Vpr mit einem ca. 200 kDa großen Protein sowie mit einem 41 kDa zellulären Protein als Komplex mit dem humanen Glucocorticoidrezeptor Typ II (GR-II) beobachtet (Refaeli et al., 1995). Weiterhin unterdrückt Vpr die T-Zellrezeptor-vermittelte Apoptose und T-Zellaktivierung (Aktivierung der Lymphokinexpression IL-2, IL-10, IL-12, TNF-alpha und IL-4) durch Beeinflussung der NF-_KB Aktivität (Ayyavoo et al., 1997). Weiterhin soll Vpr mit der zweiten UBA (ubiquitin associated) Domäne des humanen DNA-Reparaturproteins HHR23A eine spezifische Wechselwirkung eingehen, welche eine drei-helix-Bündelstruktur bildet (Diekmann et al., 1998). Vpr tritt ebenfalls in direkte Wechselwirkung mit dem Glucocorticoidrezeptor sowie verschiedenen Transkriptionsfaktoren und kann dadurch, sozusagen als Co-Aktivator, die Wirkung von Glucocorticoiden in verschiedenen Zelllinien erhöhen (Kino et al., 1999). Es wird angenommen, dass die Wirkung von Vpr als Glucocorticoid-Coaktivator zu einer erhöhten Glucocorticoid-Sensitivität und dadurch zur Pathogenese von AIDS beiträgt.
2.5. HIV-Gag und CyPA
Über eine Wechselwirkung von Vpr mit dem zellulären Chaperon CyPA oder anderen Cyclophilinen, wie dies erstmals in der vorliegenden Erfindungsbeschreibung dargestellt wird, wurde bislang weder in der Fach- noch in der Patentliteratur berichtet.
Bislang ist lediglich beschrieben worden, dass CyPA für die maximale Infektiosität von HIV-1, nicht aber von HIV-2 oder anderen Lentiviren notwendig ist (für Review siehe Luban, 1996). Bekannt ist, dass CyPA und Cyclophilin B (CypB) mit HIV-1 Gag Proteinen in Wechselwirkung treten und daher in signifikanten Mengen in HIV-1 Virionen während der Virusassemblierung eingebaut werden (Luban et al., 1999; Franke et al., 1994). CyPA bindet an eine Prolin-reiche Sequenz in HIV-1 Gag, ein cis/trans Isoprolin-Phänomen ist jedoch für Gag nicht bekannt. Es wird daher angenommen, dass CyPA nur an Gag bindet, jedoch keine enzymatische Funktion für die Faltung von Gag ausübt.
Der Einbau von CyPA in HIV-1 Virionen wird durch eine exponierte Prolin-reiche Loop-Sequenz in der N-terminalen Region des HIV-1 Capsid (CA), p24^CA, innerhalb des Pr55 Gag- Polyproteins, reguliert. Diese Wechselwirkung soll wesentlich für die Faltung von Gag nach Virusassemblierung sein (Dietrich et al., 2001).
Da HIV-1 Gag an eine Klasse von Peptidyl-Prolyl-Isomerasen bindet, zu denen auch CyPA und CypB zählen, wurde gezeigt, dass nach genetischer Inaktivierung durch homologe Rekombination (knock out) beider CyPA-Gene in einer humanen CD4⁺ T-Zelllinie (CyPA-/-) in der Tat in der Abwesenheit von CyPA die Infektiosität von HIV-1 verringert ist und naturgemäß der CyPA Inhibitor CsA keinen zusätzlichen inhibitorischen Einfluss mehr auf die Infektiosität von HIV-1 ausübte (Braaten und Luban, 2001). Dieser Befund war der wesentliche Beweis, dass CyPA die Infektiosität von HIV-1 reguliert. Die gleiche CyPA-/-Zelllinie wird ebenfalls in der vorliegenden Erfindungsbeschreibung verwendet, jedoch ausschließlich, um den Effekt von CyPA auf die Expression und Funktion von Vpr zu testen. Die neuartige Wechselwirkung von CyPA und Vpr, welche in der vorliegenden Erfindungsbeschreibung erstmals dargestellt ist, wurde in allen o.g. Publikationen über CyPA und HIV-1 nicht erkannt, erwähnt, und/oder beschrieben.
Weiterhin wurde kürzlich berichtet, dass ein extrazellulärer Rezeptor, CD147, mit Virusassoziierten CyPA in Wechselwirkung tritt, und dass diese Vpr-CyPA-Wechselwirkung für die frühen Schritte einer HIV-1-Infektion notwendig sind (Pushkarsky et al., 2001). Ebenfalls wurde eine Verbindung von CyPA und Vpr, wie sie in der vorliegenden Erfindungsbeschreibung erstmals genannt wird, nicht in dieser Publikation beschrieben.
In dem US-Patent 4,814,323 wird von Andrieu et al. 1989 erstmals berichtet, dass die Behandlung von AIDS-Patienten mit dem immunsuppremierenden Medikament CyclosporinA (CsA) zu einer Verbesserung der Krankheitssymptome, speziell zu einer Erhöhung der CD4-Zahl führt. In dieser Beschreibung wird angenommen, dass CsA eine allgemeine Verbesserung des Immunstatus von HIV-Infizierten bewirkt, eine direkte Inhibierung von HIV-1 wurde nicht erkannt und auch nicht geschützt. Ebenfalls wird die Klasse von PPIase-Inhibitoren nicht geschützt, lediglich nur das Medikament CsA. Der Gegenstand der vorliegenden Erfindungsbeschreibung, die Wechselwirkung von CyPA und Vpr, wird von diesem Patent nicht betroffen.
Erfindungsbeschreibung
Das HIV-1 Vpr ist in allen Lentiviren konserviert, dazu zählen die Immundefizienzinduzierenden Viren HIV-1 und HIV-2, die Erreger von AIDS beim Menschen, sowie SIV, die Erreger von Affen AIDS sowie in niederen und höheren Primaten. Daher wird Vpr auch als das Lentivirus-Protein R bezeichnet. Vpr spielt eine entscheidende Rolle in der Pathogenese von AIDS. Eine Blockierung von Vpr hat daher entscheidendes Potential für neuartige antivirale Strategien.
Für die biologische Funktion von Vpr ist es notwendig, dass dieses Protein in ausreichenden Mengen in der infizierten Zelle exprimiert wird, um darüber hinaus auch in das reifende Viruspartikel im Prozess der Assemblierung, des Buddings, und der Freisetzung von Nachkommenviren mit eingebaut zu werden. Dabei ist wesentlich, dass Vpr das einzige regulatorische HIV-Protein ist, welches in bedeutenden Mengen in Nachkommenviren eingebaut wird. Dadurch ist Vpr Bestandteil des eindringenden Virus im Prozess der Infektion und kann daher wichtige Prozesse in der frühen Phase der HIV-Infektion beeinflussen, bevor die Neusynthese von viralen Proteinen initiiert ist. Eine Inhibierung des Einbaus von Vpr in Nachkommenviren ist daher ein relevanter Ansatz für eine anti-virale Strategie.
Es ist bekannt, dass verschiedene zelluläre Proteine in Virionen von HIV enthalten sind, jedoch wird nur CyPA in signifikanten Mengen eingebaut. Die Verhinderung des Einbaus von CyPA, entweder in CyPA-/- knock out oder durch die Behandlung mit CsA, hat einen deutlichen Einfluss auf die Infektiosität von HIV-1. Dieser Zusammenhang wurde bislang jedoch nur auf die Wechselwirkung zwischen CyPA und HIV-1 Gag untersucht. Diese bereits bekannte CyPA-Gag Interaktion ist lediglich notwendig, um den Einbau von CyPA in Virionen zu regulieren. Der inhibitorische Effekt von CsA auf die HIV-Replikation kann jedoch allein durch die CyPA-Gag Interaktion nicht erklärt werden. Daher wird in der vorliegenden Erfindungsbeschreibung erstmals nachgewiesen, dass die enzymatische Aktivität von CyPA für die Faltung, Proteinstabilität und die Funktion von Vpr notwendig ist und daher der Inhibitor CsA eine neuartige Wirkung vollkommen unabhängig der CyPA-Gag Interaktion auf die Replikation von HIV-1 auswirkt. Diese neuartige inhibitorische Wirkung ist auch nicht allein auf HIV-1 beschränkt, sondern betrifft alle Lentiviren, HIV-1, HIV-2 und SIV. Als wesentlichen Vorteil im Vergleich zu bislang beschriebenen Wirkungen von CsA auf die HIV-Replikation ist die in der vorliegenden Erfindungsbeschreibung erstmals erwähnte Vpr-CyPA Wechselwirkung ist die Tatsache, dass alle bislang bekannten AIDS-Erreger durch diese Wechselwirkung betroffen sind. Im Unterschied dazu – und zum wesentlichen Nachteil für die bisher beschriebenen CyPA-Gag Wechselwirkung – ist die CyPA-Gag-Wechselwirkung nur auf HIV-1 beschränkt. Die Gag-Proteine von HIV-2 und SIV enthalten keine CypA-Bindungsmotive, während das CyPA-Bindungsmotiv in allen Vpr-Proteinen von HIV-1, HIV-2 und SIV enthalten ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Hemmung des Virusproteins R (Vpr) zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe wurde durch den Einsatz von Inhibitoren der Peptidylprolyl-Isomerasen (PPIasen) – den Peptidylprolyl-Isomerase-Inhibitoren (PPIase-Inhibitoren) – gelöst. Grundsätzlich geeignet sind alle Verbindungen, welche die enzymatische Funktion von PPIasen blockieren. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren werden in pharmazeutischen Zubereitungen verabreicht. Bei diesen Wirkstoffen handelt es sich um Verbindungen, die Inhibitoren der zellulären Chaperone der Klasse der PPIasen oder Immunophiline enthalten. Speziell sollen diese Inhibitoren die PPIasen CyPA und CyPB hemmen.
Zu diesen Mitteln, den PPIase-Inhibitoren, zählen die Medikamente CyclosporinA (CsA), FK506, Rapamycin, SDZ NIM811, und SanglipherinA.
Als Target für diese Mittel kommen alle Cyclophiline, die mit Vpr in Wechselwirkung treten können, in Frage. Dazu gehören:

– CyPA: ein 18 kDa Protein im Zytosol, Human-Genom-Name PPIA;
– CyPB: ein 18–20 kDa Protein im endoplasmatischen Retikulum, Human-Genom-Name PPIB;
– CyPC: ein 18 kDa Protein im sekretorischen Pathway, Human-Genom-Name PPIC;
– CyPF oder Cyp3: ein 18–22 kDa Protein in der inneren Membran des Mitochondriums, Human-Genom-Name PPIF;
– CyPM oder PPIL1: ein 18 kDa Protein im Zytosol, Human-Genom-Name PPIL1;
– USA-CyP oder Cyp20: ein 20 kDa Protein im Zellkern, Human-Genom-Name USA-CYP;
– CyPE oder Cyp33A: ein 40 kDa Protein im Zellkern, Human-Genom-Name PPIE;
– Cyp40: ein 40 kDa Protein im Zytosol und Zellkern, Human-Genom-Name PPID;
– Cyp60: ein 60 kDa Protein im Zellkern, Human-Genom-Name PPIL2;
– KIAA0073 oder Na1539-CyP: ein 60kDa Protein, Human-Genom-Name CYP;
– NK-TRCyP: ein 89 kDa Protein im Zellkern, Human-Genom-Name NKTR;
– RAN-BP2 oder NUP-358: ein 358 kDa Protein im Zellkern, Human-Genom-Name RAN-BPI (Braaten und Luban, 2001).

Wesentliche Charakteristik dieser Inhibitoren ist, dass sie die enzymatische Funktion von PPIasen blockieren. Dadurch kann die cis/trans Isomerisierung von Prolyl-Peptid-Bindungen in Proteinen nicht mehr erfolgen. Als eine wesentliche Konsequenz der Anwendung dieser Mittel wird dadurch der hohe Anteil von Prolyl-Resten in der cis-Konformation innerhalb des N-Terminus von Vpr konserviert. Diese cis-Konformation ist jedoch nachteilig für die Expression und die Stabilitätsfunktion von Vpr. Als Konsequenz der Anwendung dieser Mittel können somit keine funktionalen Vpr-Moleküle in einer HIV-infizierten Zelle exprimiert werden. Als Folge der Anwendung dieser Mittel wird Vpr im Verlauf einer HIV-Infektion inaktiviert. Da Vpr ein wichtiger Pathogenitätsfaktor im Krankheitsverlauf einer HIV-Infektion ist, können diese Mittel für die Behandlung von AIDS sowie für die Behandlung und Vorbeugung einer Infektion mit den Lentiviren HIV-1, HIV-2 und SIV eingesetzt werden.
Zu den erfindungswesentlichen Erkenntnissen gehört, dass Vpr mit bestimmten zellulären Faktoren interagiert. Diese Faktoren sind in der HIV-Wirtszelle Chaperone, Enzyme, welche die Faltung von Proteinen regulieren und allgemein der Klasse der cis/trans Prolylpeptidyl-Isomerasen (PPIasen) zugeordnet werden. Zu der Klasse der PPIasen zählen auch Enzyme mit dem Namen Immunophiline oder Cyclophiline. Speziell zu den Immunophilinen zählen die Enzyme CyclophilinA und B (CyPA und CyPB). Wesentlich für die Erfindung ist die neue Erkenntnis, dass konservierte Proline in dem N-Terminus von Vpr in einem ungewöhnlich hohen Anteil in der cis-Konformation vorkommen. Weiterhin ist in dem N-Terminus von Vpr eine Erkennungssequenz für PPIasen enthalten. Speziell konnte gezeigt werden, dass die PPIase CyPA an Vpr bindet. Diese Bindung wird durch den PPIase-Inhibitor CsA aufgehoben. Nach Inaktivierung von CyPA durch CsA oder nach genetischer Inaktivierung von CyPA wird Vpr instabil. Die Inaktivierung von Vpr durch CsA ist ein sehr schneller Effekt und erfolgt vermutlich sogar im Verlauf der Proteinsynthese, also ko-translational. Infolge der Inaktivierung von Vpr durch CsA tritt ein fast vollständiger Verlust der Vpr-Funktion in einer HIV-1 infizierten Zelle auf: Als Konsequenz der Erfindung und wesentlich neuartig ist die Tatsache, dass nach Inaktivierung von CyPA die Vpr vermittelten biologische Aktivitäten wie zum Beispiel Zellzyklusarrest, Apoptose und der Einbau von Vpr in Nachkommenviren vollständig blockiert werden. Damit ergibt sich eine neuartige antiretrovirale Strategie auf der Basis von PPIase-Inhibitoren.
Im N-Terminus von Vpr ist ein hoher Anteil von Prolin-Peptidbindungen in der cis-Konformation enthalten.
Mittels Methoden der Protein-Strukturaufklärung (¹H NMR, CD und Infrarot-Spektroskopie) wurde festgestellt, dass im N-Terminus von Vpr ein besonderes cis/trans-Phänomen vorkommt. Dies bedeutet, dass sich ein ungewöhnlich großer Anteil der Prolin-Reste in den Positionen 4, 10, 14 und 35 in Abwesenheit von CyPA in der cis-Konformation befindet. Dadurch neigt Vpr zu einer extremen Instabilität, die durch das Faltungsenzym CyPA reguliert werden kann. Insbesondere. wird als Teil der Erfindung beobachtet, dass ohne die Struktur-stabilisierende Wirkung von CyPA der N-Terminus von Vpr nicht stabil ist und keine definierte Sekundärstruktur annehmen kann. Dies wird durch CD-Messungen (1), NMR-Strukturberechnung (2) ermittelt. Der Anteil von Prolin-Resten in der cis-Konformation wird durch hochauflösende TOCSY (¹H NMR) Spektren bestimmt (3).
Vpr von HIV-1 bindet an CyPA.
Aufgrund dieser völlig unerwarteten und neuartigen Erkenntnis eines cis/trans Phänomens im N-Terminus von Vpr wurde untersucht, ob Vpr die Fähigkeit besitzt, mit PPIasen in Wechselwirkung zu treten und ob diese Wechselwirkung für die Proteinstabilität von Vpr wichtig ist. Ein Sequenzvergleich von über 150 bekannten Vpr-Sequenzen unterschiedlichster HIV-1-Isolate zeigt deutlich, dass alle vier Prolin-Reste, welche zu dem o.g. cis/trans-Phänomen beitragen (Prolin-Reste in den Positionen 4, 10, 14 und 35) in allen bislang bekannten Vpr-Sequenzen enthalten sind; eine biologische Funktion dieser Prolin-Reste wurde daher erfindungsgemäß weiter untersucht (4).
Zunächst wurde die vermutete Wechselwirkung zwischen Vpr und CyPA mittels Far-Western blot, einer spezifischen Form des Western blots auf Nitrozellulose, nachgewiesen. Dabei ist festgestellt worden, dass gereinigtes rekombinantes CyPA an synthetisches Vpr bindet ( 5). Weiterhin wurde die Vpr-CyPA-Wechselwirkung mittels Plasmonresonanz (BIAcore)-Spektroskopie nachgewiesen (6 bis 7). Dabei wurde spezifisch festgestellt, dass Vpr nur an den N-Terminus, und zwar nur an die ersten 40 Aminosäurepositionen, bindet. Vpr bindet nicht an den C-Terminus. Des weiteren ist festgestellt worden, dass diese Proline wichtig für die Bindung an CyPA sind, insbesondere der Rest Prolin-35 ist essentiell für die Wechselwirkung mit CyPA. Mutationen in diesen Positionen verhindern die Bindung von Vpr an CyPA. Als wesentlicher Kern der Erfindung wurde gezeigt, dass die Mutation von Prolin-35 nach Asparagin (ein konservierter Aminosäureaustausch) zum einen die Bindung von Vpr an CyPA in der BIAcore-Untersuchungen unterbindet als auch später wurde in biologischen Untersuchungen gezeigt, dass diese Mutation die Stabilität und damit die Funktion von Vpr in HIV-1 infizierten Zellen komplett unterdrückt.
CyPA Inhibitoren reduzieren die Proteinstabilität und Expression von HIV-1 Vpr und blockieren dadurch die biologische Funktion von Vpr in einer HIV-infizierten Zelle.
Es gehört weiterhin zu den erfindungswesentlichen Erkenntnissen, dass die Hemmer von CyPA die Expression, die Stabilität und damit die Menge an Vpr in einer HIV-infizierten Zelle reduzieren und damit konsequenterweise jene Menge an Vpr, die in ein reifendes Nachkommenvirus eingebaut werden kann, drastisch in einem solchen Umfang reduziert, dass nach Applikation von CyPA-Inhibitoren keine biologische Aktivität von Vpr mehr nachweisbar ist. Da eine spezifische Wechselwirkung zwischen CyPA und Vpr festgestellt wurde und dadurch die Faltung und die Stabilität von Vpr beeinflusst wird, wurde untersucht – abgeleitet von den erfindungsgemäßen molekularen, biochemischen und strukturellen Erkenntnissen (wie oben angegeben) – ob Inhibitoren von CyPA (diese sind bekannt und wurden in der Behandlung von bestimmten Krankheiten als Immunsuppressiva seit Jahren angewendet), ob also Inhibitoren von CyPA, speziell der Inhibitor CsA, die Expression von Vpr regulieren, beeinflussen oder möglicherweise sogar blockieren. Dabei wurde völlig überraschend festgestellt, dass CsA die Wechselwirkung von Vpr mit CyPA unterbindet. Weiterhin wurde gegen jede Erwartung erkannt, dass der Inhibitor CsA die Stabilität und damit die Expression von Vpr dramatisch reduziert.
Überraschenderweise wurde weiterhin festgestellt, dass mit Hemmern von CyPA, zum Beispiel dem Medikament CyclosporinA (CsA), die Funktion von Vpr in einer HIV-1-infizierten Zelle unterbunden werden kann, insbesondere die Vpr-induzierte Apoptose und der Zellzyklusarrest. Zunächst wurde festgestellt, dass nach Zugabe von CsA Vpr nicht mehr an CyPA bindet. Daraufhin ließ sich nachweisen, dass alle wesentlichen Funktionen von Vpr durch CsA blockiert werden können. Dazu zählen

– der Vpr-induzierte Zellzyklusarrest in der G2-Phase (G2-Arrest),
– die Vpr-induzierte Apoptose,
– die Vpr-übermittelte Erhöhung der Virusproduktion in HIV-infizierten Monozyten / Makrophagen sowie
– die Vpr-vermittelte Ko-Aktivierung des Glykocorticoidrezeptors. Es wurde weiterhin festgestellt,
– dass CsA den Einbau von Vpr in Virionen verhindert,
– dass CsA die Wechselwirkung von Vpr mit anderen zellulären Faktoren, wie zum Beispiel mit dem Glykocorticoid-Rezeptor, unterbindet und
– dass CsA den Transport von Vpr in der Zelle, speziell zum Zellkern, verhindert.

Als wesentlicher Mechanismus in diesen Beobachtungen wurde völlig überraschend erkannt, dass CsA die Menge an Vpr in einer HIV-infizierten Zelle reduziert (9). Es wurde weiterhin beobachtet, dass nach Zugabe von CsA in einem Dosis-abhängigen Mechanismus die Menge an Vpr in der Zelle (10) wie auch in den freigesetzten Virionen reduziert ist.
Damit wird erstmals beobachtet, dass die Bindung von CyPA an Vpr für dessen Stabilität essentiell ist.
Es wurde weiterhin erkannt, dass nach Inaktivierung von CyPA durch die Gabe von CsA das Vpr nach Hemmung der hauptsächlichen Protease, nach Applikation von Proteasom-Inhibitoren, dass der extrem schnelle Verlust von Vpr nicht wieder hergestellt werden kann. Daraus lässt sich ableiten, dass die Wechselwirkung von CyPA mit Vpr für die de novo Synthese von Vpr, sprich für die Expression, also für die ko-translationale Faltung von Vpr, notwendig ist. Damit wird erstmals eine Funktion von CyPA für die ko-translationale Faltung eines Proteins, insbesondere eines viralen, insbesondere eines HIV-Proteins, festgestellt. Der Mechanismus, dass CyPA ko-translational die Faltung von Vpr reguliert, ist relativ neu. Obwohl es vorläufige Hinweise dafür gibt, dass neu synthetisierte Proteine unmittelbar nach Synthese mit Faltungsenzymen in Wechselwirkung treten, um die optimale Proteinfaltung zu gewähren (für Review siehe Frydman, 2001), liegen bislang keine Hinweise darauf vor, dass an diesen ko-translationalen Prozessen CyPA beteiligt ist.
Der Mechanismus der Beobachtung wird darin gesehen, dass CyPA an den N-Terminus von Vpr im Prozess der Proteinsynthese binden muss, um die weitere Stabilität und Faltung und damit die volle biologische Wirksamkeit des Proteins zu gewährleisten.
In einer weiteren Folge der Erfindung wird festgehalten, dass bei vollkommener Abwesenheit von CyPA bedeutend weniger Vpr in einer HIV-infizierten Zelle exprimiert wird. Hierzu wurde eine genetisch manipulierte humane CD4+ T-Zelllinie eingesetzt, die in beiden Allelen des CyPA-Gens mutiert ist und daher kein zelluläres CyPA exprimieren kann. In diese CyPA knock out Zelllinie, genannt CyPA-/-, ist die Menge an viralen Vpr intrazellulär sehr stark reduziert oder fast gar nicht nachweisbar (12). Ebenfalls werden keine Vpr-enthaltenden Virionen, nachgewiesen, die von HIV-1-infizierten CyPA-/-Zellen freigesetzt werden. Ebenfalls wird festgestellt, dass der Vpr-induzierte G2-Zellzyklusarrest in CyPA-/- nicht nachweisbar ist:
Die erfindungsgemäße Lösung erbringt damit den Beweis dafür, dass ohne die Wirkung des Faltungsenzyms CyPA und/oder anderer PPIasen (entweder nach Inhibierung durch PPIase-Inhibitoren, wie zum Beispiel dem CyPA-Inhibitor CsA, oder nach genetischer Inaktivierung) die Funktion von Vpr verloren geht.
Die inhibitorische Wirkung von PPIase-Inhibitoren, wie zum Beispiel CsA, auf die Vpr-Stabilität kann in verschiedenen Expressionssystemen für Vpr nachgewiesen werden. Hierzu zählen:

– Infektion mit HIV-1, HIV-2, SIV oder chimären Viren davon,
– Transfektion mit der DNA von Vpr kodierenden Expressionsvektoren,
– Infektion mit rekombinanten und Vpr kodierenden Retroviren,
– Infektion mit rekombinanten und Vpr kodierenden Adenoviren,
– Infektion mit rekombinanten und Vpr kodierenden Vakziniaviren,
– Infektion mit rekombinanten und Vpr kodierenden Bacculoviren.

Die neuartige anti-virale Wirkung von CsA und anderer PPIase-Inhibitoren besteht darin, dass sie die Funktion des essentiellen Regulatorproteins Vpr durch die erfindungsgemäßen Mittel ausschalten und dadurch den HIV-Replikationszyklus unterbinden, ausschalten, blockieren, negativ regulieren oder beeinflussen.
Da Vpr ein wichtiger Pathogenitätsfaktor einer HIV-Infektion und den damit verbundenen Krankheitsbildern – wie zum Beispiel AIDS – ist, ergibt sich durch die Anwendung von CsA und anderen PPIase-Hemmern eine vollkommen neuartige anti-retrovirale Strategie, insbesondere dadurch, dass ein Großteil der bislang bekannten PPIase-Inhibitoren bereits als Medikamente eingesetzt wurden und nunmehr als anti-retrovirale Mittel Verwendung finden. Die Entdeckung, dass CyPA mit dem HIV-1-Strukturprotein p24^CA in Wechselwirkung tritt und dadurch der Inhibitor CsA die Infektiosität von HIV reduziert, hat zwei wesentliche Nachteile gegenüber der erfinderischen Lösung:

– CyPA tritt nur in Wechselwirkung mit p24^CA von HIV-1, nicht aber mit den Gag-Proteinen anderer Lentiviren,
– die anti-virale Wirkung von CsA auf HIV-1 beinhaltet nicht die Funktion von Vpr. Eine bereits mit HIV-1 infizierte Zelle wird durch CsA nicht mehr beeinflusst; die hemmende Wirkung von CsA auf p24^CA wird nur im Infektionsvorgang aktiv.

Der wesentliche Neuheitswert der Erfindung im Vergleich mit bislang im Zusammenhang von HIV und CyPA publizierten Daten kann wie folgt zusammengefasst werden:

– Es besteht ein neues Target für die anti-virale Wirkung von CyPA – das Lentivirus-Protein Vpr.
– Es besteht ein neuartiger Mechanismus, und zwar der, dass CyPA ko-translational die Faltung, Expression und Stabilität eines viralen Proteins reguliert. Ein solcher Mechanismus wurde bislang für kein virales oder zelluläres Protein nachgewiesen.
– Dieser Mechanismus beinhaltet nicht nur die bloße Bindung (wie im Falle von HIV-1 CA p24^CA ), sondern auch die enzymatische Aktivität von CyPA, welche die Konformations-Umwandlung der Prolin-Peptidyl-Bindungen in dem N-terminalen Bereich von Vpr aus einer cis in eine stabilere trans-Konformation bewirkt.
– Neu und vorteilhaft ist ferner, dass das neue Target für PPIase-Inhibitoren in allen bislang bekannten Lentiviren (HIV-1, HIV-2 und SIV) enthalten ist und dadurch im wesentlichen Unterschied zu der bislang beschriebenen inhibitorischen Wirkung von CsA auf HIV-1 p24^CA nicht allein auf HIV-1 beschränkt ist.

Das Wesen der Erfindung liegt im Einsatz bekannter Mittel zu einem neuen Zweck und in einer Kombination bekannter Elemente – den Inhibitoren der Peptidylprolyl-Isomerasen (PPIase-Inhibitoren) – und einer neuen Wirkung – ihrem Einsatz zur Beeinflussung der Primaten-Lentiviren HIV-1, HIV-2 und SIV – die in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Vorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, dass nunmehr Mittel zur Hemmung des für die Virusreplikation notwendigen Virusproteins R zur Verfügung stehen.
Die Erfindung richtet sich ferner auf den Einsatz von PPIase-Inhibitoren zur Herstellung von Mitteln zur Hemmung von Primaten-Lentiviren. Dazu gehört ihr Einsatz zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe von HIV-Infektionen, AIDS und damit verwandter pathologischer Erscheinungen, wie zum Beispiel HIV-induzierter Demenz, HIV-induzierten Störungen im Lipidstoffwechsel, speziell dem HLS-Syndrom (HIV-associated lipodystrophy syndrome) sowie von HIV-induzierten Störungen in der Nierenfunktion, speziell dem HIVAN-Syndrom (HIV associated nephropathy).
Die Erfindung betrifft zusammengefasst den Einsatz von PPIase-Inhbitoren als Mittel zur Hemmung von Primaten-Lentiviren, Humane Immundefizienzviren Typ 1 und 2 (HIV-1 und HIV-2) sowie Simian Immundefizienzviren (SIV). Am Beispiel des HIV-1 Virusproteins R (Vpr) wird gezeigt, dass Inhibitoren von zellulären cis/trans Peptidylprolyl-Isomerasen (PPIasen) sowohl die Expression, Faltung, Proteinstabilität als auch die biologische Wirksamkeit von Vpr hemmen. Die anti-virale Wirkung von PPIase-Inhbitoren, speziell von CyclosporinA, beruht auf einer spezifischen Wechselwirkung von PPIasen, speziell von CyclophilinA, mit Pralinen im N-Terminus von Vpr. Anwendungsgebiete sind die antiretrovirale Therapie und Vorbeugung bei Infektionen mit Immundefizienz verursachenden Lentiviren bei Tieren und Menschen, insbesondere von AIDS oder HIV-induzierten pathologischen Erscheinungen, auch in Kombination mit anderen anti-retroviralen Medikamenten.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Nachweis der Vpr-CyPA Wechselwirkung mittels BIAcore Spektroskopie
Oberflächen-Plasmon-Resonanz (surface plasmon resonance) Biosensor-Analyse (BIAcore-Sprektroskopie) wurde verwendet, um die neuartige Wechselwirkung zwischen CyPA und Vpr zu untersuchen. Hierzu wurde das synthetisch hergestellte Peptid Vpr^1–40 sowie gereinigtes rekombinantes CypA (Sigma) verwendet. Surface plasmon resonance Messungen wurden bei 25°C mit einem BIACORE 2000 (Biacore AB, Uppsala Schweden) Spektrometer durchgeführt, welches mit einen CMS Forschungsgrad Sensor-Chip ausgerüstet war. CypA wurde in einer Menge von 4200 bis 11200 RU (resonance units) (Fließzellen 2, 3 und 4) unter Verwendung von Standard Amino-Kopplungsreaktionen immobilisiert. Die Fließzelle 1 wurde als Referenz ohne CyPA-Kopplung eingesetzt. Das Peptid Vpr^1–40 wurde in einen Fließpuffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 50 μM EDTA, 0.005% Tween 20, pH 7.4) über alle Fließzellen injiziert in einem Konzentrationsbereich von 1 bis 250 μM, bei einer Flussrate von 5 μl/min. Alle Daten wurden bei 2.5 Hz während einer 120 sec langen Assoziations- und Dissoziationsphase gemessen. In der Regel erreichte die CyPA-Vpr^1–40 Interaktion das Gleichgewicht innerhalb von 30 sec.
Vpr^1–40 wurde in einem Konzentrationsbereich von 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 und 250 μM eingesetzt, CyPA war mit konstanter Konzentration an die chip-Matrix gebunden.
Alle Daten wurden an den RU-Daten der Kontroll-Zelle (ohne CyPA) korrigiert. Die Messungen wurden mindestens drei Mal mit verschiedenen CyPA und Vpr-Präparationen wiederholt und waren zu allen Zeitpunkten reproduzierbar.
Neben der Wildtyp-Sequenz von HIV-1N_L4–3 Vpr (6, Panel A, Vpr^1–40) wurden ebenfalls folgende Mutanten getestet, welche Pro-Asn Aminosäureaustausche in den für die CyPA-Interaktion kritischen Positionen enthalten: Mutante Vpr^1–40, P^5,10,14-N (Pro-Asn Austausch in den Positionen 5, 10 und 14, 6 Panel B); Mutante Vpr^1–40, P³⁵-N (Pro-Asn Austausch in der Position 35, 6 Panel C); Mutante Vpr^1–40, P^5,10,14,35-N (Pro-Asn Austausch in den Positionen 5, 10, 14 und 35 6 Panel D).
Ähnliche BIAcore Ergebnisse wurden unter Verwendung des Peptides Vpr^21–40 sowie dessen Mutante Vpr^21–40, P³⁵-N erzielt (7). Dieses Fragment von Vpr hat spezifische Affinität für CyPA, welche durch Mutation von Pro-35 aufgehoben werden kann. Im Unterschied dazu konnte für das N-terminale Fragment Vpr^1–20 keine Bindung an CyPA nachgewiesen werden (8).
Im Ergebnis dieser BIAcore Studien konnte die neuartige CyPA-Vpr-Wechselwirkung überzeugend demonstriert werden. Anhand dieser Daten kann festgestellt werden, dass CyPA an den N-Terminus von Vpr in Form des Peptides Vpr^1–40 bindet und dass für diese Bindung Prolin in Position 35 essentiell ist.
Beispiel 2: Nachweis der Vpr-CyPA Wechselwirkung mittels Far-Western blot
Um die Wechselwirkung zwischen Vpr und Cyp in dem Kontext von Gesamt-Vpr zu untersuchen, wurde die Far-Western blot Technik eingesetzt. Die Wechselwirkung von Gesamt-Vpr mit CyPA konnte nicht direkt mittels BIAcore untersucht werden, da Gesamt-Vpr eine starke Tendenz zur Selbstassoziation zeigt und daher eine unspezifische Bindung bei Resonanz-Messungen ergeben kann.
Für die Far-Western blot Technik wurde rekombinantes CyPA in einem 15% SDS PAGE bei einer Konzentration von ca. ⁓150 ng CyPA pro Spur im SDS-PAGE aufgetrennt. Das Protein wurde dann auf Nitrozellulose elektrotransferiert und einzelne Streifen dieses Western blots wurden für 4 hr mit 3% BSA in TBS blockiert. Die so gewonnenen CyPA-Western blot Streifen wurden dann für 12 hr bei 4°C mit synthetischem Gesamt-Vpr, dem Peptid Vpr^1–96, bei einer Konzentration von 1 μg/ml entweder ohne Detergenzien (5, Spur 1) oder in TBS/T mit 0,5 % Triton X100 (5, Spur 2) inkubiert. Anschließend wurden die Streifen 3 Mal in TBS/T für 10 min gewaschen, dann mit anti-Vpr^1–96 (polyklonales Antiserum aus Kaninchen) in einer Verdünnung von 1:2000 in 3% BSA/TBS/T, für 4 hr bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wurden die gebundenen anti-Vpr-Antikörper durch anti-Kaninchen IgG-Peroxidase-Konjugat sowie "enhanced chemiluminescence" (ECL) Reaktion sichtbar gemacht. Eine 5 min Exposition mit Kodak-Röntgenfilm ist in 5 dargestellt.
Mit diesen Untersuchungen wird erstmals gezeigt, dass beide Proteine, Vpr und CyPA, eine spezifische Wechselwirkung eingehen, dass diese Wechselwirkung nicht nur den N-Terminus von Vpr, sondern auch das gesamte Protein betrifft und dass die hohe Affinität von CyPA an Vpr selbst die Wechselwirkung mit CyPA ermöglicht, welches an Nitrocellulose gebunden und nach SDS-PAGE an der Nitrozellulose renaturiert wurde.
Beispiel 3: Die Expression von Vpr in HIV-1 infizierten Zellen CyPA-/- knock out Zellen wird reduziert
Jurkat-Zellen, humane CD4+ T-Zellen, entweder als Wildtyp oder als eine genetisch veränderte Variante, in der beide CypA Gen-Allele durch genetisch knock out mutiert sind (CypA-/-) (Braaten und Luban, 12001), wurden mit HIV-1N_L4–3 infiziert und für 7 Tage kultiviert. Zum Zeitpunkt der maximalen Virusexpression wurden beide Kulturen einem pulse-chase-Experiment unterzogen (5 min pulse, 8 hr chase). Gag- und Vpr-Proteine wurden mittels anti-Gag und anti-Vpr Antikörpern immunpräzipitiert, in 10–16% SDS-PAGE aufgetrennt und durch Fluorographie sichtbar gemacht (12).
Es ist zu erkennen, dass die Menge an Vpr relativ zur Menge an p24CA in der knock out Kultur CypA -/- deutlich reduziert ist. Dadurch wird erfindungsgemäß demonstriert, dass CypA für die Expression und Stabilität von Vpr notwendig ist.
Legenden zu den Figuren
1: Nachweis einer strukturellen Instabilität von Vpr N-Terminus mittels CD-Spektroskopie.
2: Hochauflösende Struktur von Vpr N-Terminus mittels ¹H NMR an Vpr^1–40.
3: Nachweis von cis/trans Isomerien in Prolin-Resten von Vpr mittels ¹H NMR Spektroskopie.
4: Ein CyPA Bindungsmotiv ist im N-Terminus vom Vpr konserviert.
In der Abbildung ist die Aminosäuresequenz von Vpr des Isolates HIV-1_NL4–3 dargestellt. Die in allen bislang bekannten HIV-1-Isolaten konservierten Aminosäurepositionen sind fett markiert. Dabei ist zu erkennen, dass die im Rahmen der Erfindung festgestellten Aminosäurepositionen, Pro-4, Pro-10, Pro-14 und Pro-35, welche für die Interaktion zwischen Vpr und CypA wichtig sind, einen hohen Konservierungsgrad aufweisen. Die Sekundärstrukturelemente im N-Terminus von Vpr sind dargestellt.
5 Nachweis von Vpr-CyPA Wechselwirkung mittels Far-Western blot.
6 bis 8: Bindungsstudien an Vpr und CypA mittels BIAcore oder Plasmonresonanzspektroskopie.
Im Rahmen der Erfindung wird festgestellt, dass

– der N-Terminus in Form des Peptides Vpr^1–40 spezifisch an CypA bindet,
– besonders das Fragment Vpr21-40 an CypA bindet,
– die Mutante Vpr21-40 mit Pro-Asn Austausch nicht an CypA bindet,
– das C-terminale Fragment Vpr47-96 nicht an CypA bindet.

9: Der CyPA Inhibitor CsA bewirkt Instabilität von Vpr in HIV-1-infizierten Zellen. HeLa-Zellen wurden mit den proviralen pNL4-3 transfiziert, für 25 min mit [³⁵S]-Methionin radioaktiv markiert und anschließend einem 8-Stunden chase in der Abwesenheit von Radioaktivität unterzogen. Vpr wurde mit polyklonalen Antiserum und Gag-Proteine mit anti-p24^CA-Antikörpern immunpräzipitiert. Die relativ kleine Menge an Vpr wie auch die prozentuale Stabilität sind dargestellt. Im Rahmen der Erfindung wird gezeigt, dass nach Zugabe von CsA (50 microg/ml) sowohl die Menge an Vpr unmittelbar nach der [³⁵S]-Met pulse-Markierung ca. l0-fach reduziert ist als auch die Halbwertszeit von Vpr deutlich reduziert ist. Als Kontrolle hat die Behandlung mit CspA keinen Einfluss auf die Expression und die proteolytische Prozessierung von HIV Gag-Strukturprotein.
Obwohl bekannt ist, dass CypA auch an HIV-1 Gag-Proteine bindet, bewirkt nur die im Rahmen der Erfindung neuartig festgestellte Vpr-CypA Interaktion eine dramatische Reduktion der Expression und Stabilität von Vpr.
10: CsA bewirkt einen sehr schnellen Verlust von Vpr.
HeLa-Zellen wurden mit dem Vpr-Expressionsvektor CMV-VprFlag transfiziert, für 5 min mit [³⁵S]-Met pulse-markiert und einem 60 min chase unterzogen. Nach Zelllyse wurden die Zelllysate durch Zentrifugation in Zellkern- und Zytosol-Fraktionen getrennt, und Vpr wurde mittels anti-Flag monoklonalen Antikörpern immunpräzipitiert. Im Ergebnis wird festgestellt, dass in Gegenwart von CspA sowohl in der Zellkern als auch in der Zytosol-Fraktion weniger Vpr enthalten ist. Da dieser Verlust sehr schnell auftritt – bereits nach der kurzen pulse-Zeit von 5 min – wird erfindungsgemäß festgestellt, dass die Inaktivierung von CypA durch Csp die Instabilität und daher den Verlust der Vpr-Expression bewirkt.
11: Proteasom-Inhibitoren restaurieren nicht die Stabilität von Vpr nach CsA-Behandlung.
12: Die Expression on Vpr in CypA knock out Zellen ist reduziert.
Jurkat-Zellen, humane CD4+ T-Zellen, entweder als Wildtyp oder als eine genetisch veränderte Variante, in der beide CypA Allele durch genetisch knock out mutiert sind (CypA-/-), wurden mit HIV-1NL4-3 infiziert und für 7 Tage kultiviert. Zum Zeitpunkt der maximalen Virusexpression wurden beide Kulturen einem pulse-chase-Experiment unterzogen (5 min pulse, 8 hr chase). Gag und Vpr Proteine wurden mittels anti-Gag und anti-Vpr Antikörpern immunpräzipiert, in 10-16% SDS-PAGE aufgetrennt und durch Fluorographie sichtbar gemacht.
Im Rahmen der Erfindung ist zu erkennen, dass die Menge an Vpr relativ zur Menge an p24CA in der knock out Kultur CypA -/- deutlich reduziert ist. Dadurch wird erfindungsgemäß demonstriert, dass CypA für die Expression und Stabilität von Vpr notwendig ist.
Abkürzungsverzeichnis

AIDS: Aquired Immunodeficiency Syndrome
BSA: Bovine serum albumin
CD: cluster of differentiation
CD4: Glykoprotein
CsA: Cyclosporin, Cyclosporin A
CyPA: Cyclophilin A
CyPB: Cyclophilin B usw.
DNA: Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
HIV: Humane Immundefizienzviren
¹H NMR: Proton NMR Spektroskopie
hr: Stunden
IL: Interleukin
kDa: Kilodalton
NMR: Nuclear Magnetic Resonance (kernmagnetische Resonanz)
PPIasen: Peptidylprolyl-Isomerasen
RT: Reverse Transkriptase
RNA: Ribonucleinsäure (ribonucleic acid)
SDS-: Natriumdodecylsulfat (Sodium Dodecylsulfat)
SDS-PAGE: SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese
SIV: Affen-Immundefizienzviren
TBS: Tris Borat Saline
TBS/T: Tris Borat Saline/Tween
TNF: Tumor Nekrose Faktor
TOCSY: total correlation spectroscopy
Vpr: Lentivirus-Protein R

Literatur

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Claims

Mittel zur Hemmung des Primaten-Lentivirusproteins R (Vpr) der Immundefizienzviren HIV-1, HIV-2 und SIV, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponenten Inhibitoren von zellulären Chaperonen enthalten, welche für die korrekte Faltung, Stabilität und damit die biologische Funktion von Vpr notwendig sind.
Mittel zur Hemmung des Lentivirusproteins R (Vpr) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponenten Inhibitoren der Peptidylprolyl-Isomerasen – PPIasen – in pharmazeutischen Zubereitungen enthalten.
Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponenten Verbindungen enthalten, welche die enzymatische Funktion von PPIasen blockieren.
Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhibitoren PPIasen hemmen, welche zu den Immunophilinen oder Cyclophilinen zählen.
Mittel nach den Ansprüchen 1, 2 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhibitoren an cis-trans Peptidylprolyl-Isomerasen (PPIasen) binden oder anderweitig mit diesen in Wechselwirkung treten und dadurch deren enzymatische Aktivität beeinflussen, regulieren oder hemmen.
Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass Vpr mit Cyclophilinen in Wechselwirkung tritt, dass diese Wechselwirkung für die Expression, die Proteinstabilität und die biologischen Funktionen von Vpr wichtig ist, und dass diese Cyclophilin-Vpr-Wechselwirkung durch die PPIase-Inhibitoren 6.1. Cyclosporin A (CsA) und/oder 6.2. FK506 und/oder 6.3. Rapamycin gehemmt wird.
Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass Vpr mit Cyclophilinen in Wechselwirkung tritt und dass diese Wechselwirkung durch die nichtimmunosuppressiv wirkenden PPIase-Inhbitoren 7.1 SDZ NIM811 und/oder 7.2 SanglipherinA gehemmt wird.
Mittel nach den Ansprüchen 1, 2, 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass Vpr mit einen oder mehreren der Enzyme 8.1 Cyclophilin A (CyPA) 8.2 Cyclophilin B (CyPB) 8.3 Cyclophilin C (CyPC) 8.4 Cyclophilin F (CyPF)/ 8.5 Cyclophilin 3 (CyP3) 8.6 Cyclophilin M (CyPM) 8.7 PPIL1 8.8 USA-Cyclophilin (USA-CyP) 8.9 Cyclophilin 20 (CyP20) 8.10 Cyclophilin E (CyPE) 8.11 Cyclophilin 33A (CyP33A) 8.12 Cyclophilin 40 (CyP40) 8.13 Cyclophilin 60 (CyP60) 8.14 KIAA0073 8.15 Hal539- Cyclophilin (Hal539-CyP) 8.16 NK-TR-Cyclophilin (NK-TRCyP) 8.17 RAN-BP2 8.18 NUP-358 in Wechselwirkung tritt und dass diese Wechselwirkungen durch PPIase-Inhbitoren gemäß den Ansprüchen 6 und 7 gehemmt werden.
Mittel nach den Ansprüchen 1, 2, 6, 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass – Vpr vorrangig an die zellulären PPIase CyPA bindet, – diese Wechselwirkung die trans-Konformation von Prolin-Peptidyl Bindungen im N-Terminus von Vpr reguliert, – und dass diese cis-nach-trans-Umlagerung durch PPIase Inhibitoren gehemmt werden kann.
Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die CyPA-Vpr-Wechselwirkung die Prolin-Reste in den Positionen 5, 10, 14, und 35 von Vpr beinhaltet und dass die cis-nach trans-Umlagerung in diesen Prolin-Positionen durch PPIase-Inhibitoren gehemmt werden kann.
Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die PPIase-Inhibitoren die CyPA-Vpr-Wechselwirkung blockieren, in dem sie eines, mehrere oder alle der vier Proline in den Positionen 5, 10, 14, und 35 von Vpr neutralisieren .
Mittel nach den Ansprüchen 1, 2 und 6, gekennzeichnet durch einen Mechanismus, nach dem CyPA ko-translationell die Expression, Faltung und Stabilität von Vpr reguliert.
Mittel nach den Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Mechanismus der stabilisierenden Wirkung von CyPA oder anderen PPIasen auf die Expression und Faltung von Vpr in – einer Zelle infiziert mit HIV-1, HIV-2, SIV, oder chimären Viren davon, – einer Zelle transfiziert mit der DNA von Vpr kodierenden Expressionsvektoren, – einer Zelle infiziert mit rekombinanten und Vpr kodierenden Retroviren, – einer Zelle infiziert mit rekombinanten und Vpr kodierenden Adenoviren, – einer Zelle infiziert mit rekombinanten und Vpr kodierenden Vakziniaviren, – einer Zelle infiziert mit rekombinanten und Vpr kodierenden Bacculoviren, wirksam wird.
Mittel nach den Ansprüchen 1, 2 und 6, sowie den Ansprüchen 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass genetische oder andere Methoden die Expression und/oder die enzymatischen Aktivitäten von CyPA oder anderen PPIasen beeinflussen und dadurch die biologischen Funktionen von Vpr – in Wirtszellen von HIV-1, in CD4⁺ T-Zellen sowie in Monozyten oder Makrophagen – beeinflussen, regulieren oder blockieren.
Mittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass diese Methoden die Expression und / oder Transfektion von anti-sense DNA oder RNA beinhalten, welche spezifisch die Translation von CyPA und / oder anderen PPIasen hemmen.
Mittel nach den Ansprüchen 1, 2 und 6 sowie den Ansprüchen 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass alle wesentlichen biologischen Funktionen von Vpr – der Vpr-induzierte Zellzyklusarrest in der G2-Phase (G2-Arrest), – die Vpr-induzierte Apoptose, – die Vpr-übermittelte Erhöhung der Virusproduktion in HIV-infizierten Monozyten / Makrophagen sowie – die Vpr-vermittelte Ko-Aktivierung des Glykocorticoidrezeptors durch die Applikation von PPIase-Inhibitoren und genetischen anti-PPIase Methoden blockiert werden.
Mittel nach den Ansprüchen 1, 2 und 6 sowie den Ansprüchen 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass PPIase-Inhibitoren und genetischen anti-PPIase Methoden – den Einbau von Vpr in Virionen verhindern, – die Wechselwirkung von Vpr mit anderen zellulären Faktoren, wie dem Glykocorticoid-Rezeptor, unterbinden und – den Transport von Vpr in der Zelle sowie zum Zellkern verhindern.
Mittel nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass durch ihren Einsatz Lentiviren a) Humanes Immundefizienzvirus Type 1 (HIV-1) oder b) Humanes Immundefizienzvirus Type 2 (HIV-2) oder c) Affenimmundefizienzvirus (SIV) gehemmt werden.
Mittel nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die in den Mitteln enthaltenen wirksamen Komponenten sowie verwendeten Methoden das Lentivirusprotein R (Vpr) beeinflussen, regulieren oder blockieren.
Mittel nach Anspruch 18 zur Bekämpfung / Behandlung von Erkrankungen / pathologischen Erscheinungen, die durch Infektionen mit Lentiviren verursacht wurden.
Mittel nach Anspruch 18 zur Bekämpfung / Behandlung von AIDS.
Mittel nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass PPIase-Inhibitoren als neuartige anti-retrovirale Therapie zur Behandlung von AIDS eingesetzt werden.
Mittel nach Anspruch 18 zur Blockierung der wesentlichen Funktionen von Vpr in vivo, im infizierten Organismus, – der Vpr-induzierte Zellzyklusarrest in der G2-Phase (G2-Arrest), – die Vpr-induzierte Apoptose, – die Vpr-übermittelte Erhöhung der Virusproduktion in HIV-infizierten Monozyten / Makrophagen sowie – die Vpr-vermittelte Ko-Aktivierung des Glykocorticoidrezeptors durch PPIase-Inhibitoren.
Mittel nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass PPIase-Inhibitoren in vivo, im infizierten Organismus, – den Vpr-induzierte Zellzyklusarrest in der G2-Phase (G2-Arrest) – die Vpr-induzierte Apoptose – den Einbau von Vpr in Virionen und/oder – den Transport von Vpr in der Zelle sowie zum Zellkern – verhindern und – die Wechselwirkung von Vpr mit anderen zellulären Faktoren, wie dem Glykocorticoid-Rezeptor, unterbinden.
Mittel nach den Ansprüchen 1 bis 24, herstellbar durch den Einsatz von Inhibitoren zellulärer Chaperone in pharmazeutischen Zubereitungen.
Mittel nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass PPIase-Inhibitoren eingesetzt werden.
Mittel nach den Ansprüchen 25 und 26, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Kombination mit 27.1 anderen anti-retroviralen Medikamenten 27.2 Blockern der Reversen Transkriptase und/oder der viralen Protease 27.3 anti-retroviralen Therapien basierend auf gentherapeutischen Interventionen 27.4 intrazellulärer Immunisierung 27.5 dem Einbringen von anti-HIV-1/HIV-2 wirksamen Genen in Stammzellen und/oder peripheren CD4⁺ Lymphozyten eingesetzt werden.