DE19905962A1

DE19905962A1 - Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Carbonsäure-thioestern

Info

Publication number: DE19905962A1
Application number: DE1999105962
Authority: DE
Inventors: Weber; Klein; Mukherjee
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 1999-02-12
Publication date: 1999-09-02

Description

Die Erfindung ist charakterisiert durch die lösungsmittelfreie Umsetzung von organischen Carbonsäuren oder Carbonsäureestern mit Thiolverbindungen in Gegenwart von Lipasen im Vakuum.

Es ist bekannt, daß Carbonsäure-thioester durch Übertragung eines Acyl-Rests auf Alkanthiole auf unterschiedliche Weise hergestellt werden können. Chemische Verfahren beruhen vor allem auf Reaktionen von Carbonsäurehalogeniden, -anhydriden oder -tosylaten mit Alkanthiolen oder Mercaptiden (Roy, K.-M., 1995, Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 26, S. 767-789). Die direkte Veresterung von Carbonsäuren mit Thiolverbindungen ist nur in Anwesenheit spezieller aktivierender Reagenzien möglich. Solche Verfahren benötigen teure, in der Regel auch toxische Reagenzien. Enzymatische Verfahren zur Herstellung von Carbonsäure-thioestern gehen von Carbonsäuren und Thiolverbindungen (Veresterung) bzw. Carbonsäureestern und Thiolverbindungen (Umesterung) aus, die in Gegenwart einer Lipase als Biokatalysator umgesetzt werden.

Bisherige Verfahren (FR 2.588.272) beschreiben die lipase-katalysierte Veresterung von organischen Carbonsäuren mit Alkanthiolen in organischen Lösungsmitteln wie zum Beispiel Heptan, tert.-Butylmethylether, Aceton und anderen, zum Teil in Gegenwart geringer Mengen Wasser, mit einem hohen Überschuß an Alkanthiolen.

In verschiedenen Veröffentlichungen wird die Synthese von kurzkettigen, als Aromastoffe geeigneten Carbonsäure-thioestern sowie von langkettigen "Thio-Wachsestern" in organischen Lösungsmitteln unter Verwendung von Molekularsieb im Reaktionsansatz zur Entfernung des gebildeten Wassers oder Alkohols beschrieben (Caussette, M., Marty A. und Combes, D., 1996, J. Chem. Techn. Biotechnol. 68: 257-262; Cavaille-Lefebvre, D. und Combes, D., 1997, Biocatal. Biotransform. 15: 265-280; Zaks, A. und Klibanov, A.M., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3192-3196; Weber, N., Klein, E., Vosmann, K. und Mukheijee, K.D., 1998, Biotechnol. Lett. 20: 687-691).

Im Unterschied zu den bekannten, oben erwähnten Verfahren wird die im folgenden ausführlich beschriebene Synthese ohne Lösungsmittel und ohne Molekularsieb oder andere Trockenmittel im Reaktionsgemisch durchgeführt. Vielmehr werden die Gemische der Reaktionspartner, d.s. Carbonsäuren oder Carbonsäureester und Thiolverbindungen, enzym katalytisch in Gegenwart von Lipasen umgesetzt und das entstandene Wasser bzw. der entstan dene kurzkettige Alkohol im Vakuum aus dem Reaktionsgemisch entfernt.
Veresterung: R₁-CO-OH + R₂-SH ⇄ R₁-CO-SR₂ + H₂O
Umesterung: R₁-CO-OR₃ + R₂-SH ⇄ R₁-CO-SR₂ + R₃OH, (Thiolyse)
wobei R₁ beispielsweise Alkylreste mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen und R₂ Alkylreste mit 8 bis 30 Kohlenstoffatomen darstellen, während es sich bei R₃ vorzugsweise um einen kurzkettigen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen handelt.

Das Verfahren ist anwendbar auf eine große Anzahl von Reaktionen von Carbonsäuren sowie Di- und Polycarbonsäuren mit linearer, verzweigtkettiger und cyclischer Struktur der Kettenlängen C₄ bis C₃₀. Als Carbonsäuren werden zum Beispiel langkettige aliphatische Carbonsäuren wie Laurinsäure, Palmitinsäure oder Montansäure verwendet. Auch verzweigtkettige und cyclische aliphatische Carbonsäuren, beispielsweise Isostearinsäure, werden als Reaktionspartner eingesetzt. Ferner werden aliphatische Di- und Polycarbonsäuren, wie z. B. Glutar-, Adipin- und 1,12-Dodecandisäure, mit Thiolverbindungen in Gegenwart von Lipasen in Di- und Polycarbonsäure-thioester bzw. deren Partialthioester umgewandelt.

Als Carbonsäureester, die für die Synthese von Carbonsäure-thioestern Verwendung finden, dienen vor allem Ester der oben genannten linearen oder verzweigtkettigen langkettigen aliphatischen Carbonsäuren oder Di- und Polycarbonsäuren, wie z. B. Ester von Myristinsäure, Stearinsäure, Cerotinsäure, Isostearinsäure oder 1,12-Dodecandisäure, mit einem kurzkettigen linearen oder verzweigtkettigen Alkohol der Kettenlange C₁ bis C₆. Auch andere Carbonsäureester, vor allem Triacylglycerine (Triglyceride) wie z. B. Tricaproin und Trilaurin werden als Acyldonoren der Umesterung eingesetzt. Natürliche Triglyceride von Fetten und Ölen, z. B. Rindertalg oder Rapsöl und Sojaöl, können ebenfalls für die Umesterung mit Alkanthiolen eingesetzt werden. Insbesondere eignen sich kurzkettige Triglyceride wie z. B. Tricaproin zur Herstellung von Carbonsäure-thioestern mit kurzen (C₄ bis C₈) Acyl-Resten:

wobei R₁ beispielsweise Alkylreste mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen und R₂ Alkylreste mit 8 bis 30 Kohlenstoffatomen darstellen.

Die Umesterung (Thiolyse) von Triglyceriden mit Thiolverbindungen benötigt im Gegensatz zur oben beschriebenen Thioestersynthese aus Carbonsäuren oder Thiolyse von Carbonsäureestern kein Vakuum, da kein Wasser bzw. kurzkettiger Alkohol gebildet wird.

Dennoch erhöht sich auch hier die Ausbeute, wenn die Reaktion im Vakuum durchgeführt wird. Als Thiolverbindungen werden vor allem lineare oder verzweigtkettige langkettige Alkanthiole der Kettenlänge C₆ bis C₃₀, wie z. B. 1-Dodecanthiol, 1-Hexadecanthiol und 1-Octadecanthiol, Alkanthiole mit cyclischen aromatischen Resten, wie z. B. Phenylethylihiol, oder Di- und Polythiole, z. B. α,ω-Alkandithiole wie 1,8-Dimercapto-octan und Thiolderivate von Polyolen wie Monomercaptopropandiol-(1,2), eingesetzt.

Für die Herstellung der Carbonsäure-thioester können alle bekannten Lipasen als Enzym katalysatoren verwendet werden, vor allem Lipasen aus Mikroorganismen, wie z. B. aus Rhizopus arrhizus, Candida antarctica, Rhizomucor miehei und Geotrichum candidum, Pankreaslipase aus verschiedenen Tierspezies sowie Lipasen aus Pflanzen, wie z. B. Papaya, Raps, Rizinus, Reis, Vernonia und Ananas.

Die lipase-katalysierten Synthesen von Carbonsäure-thioestern können bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen durchgeführt werden, die insbesondere von den ausgewählten Lipasen abhängen. Im allgemeinem werden Temperaturen zwischen 10 und 100°C angewendet, bevorzugt solche zwischen 30 und 60°C. Die molaren Verhältnisse zwischen den Reaktions partnern Carbonsäuren oder Carbonsäureestern und Thiolverbindungen sowie die Anteile der zugesetzten Lipase unterliegen keinen Einschränkungen. Die Reaktionszeit ist ebenfalls nicht beschränkt. Rühren des Reaktionsgemisches und Erhöhung der Lipasemenge im Versuchsansatz steigern die Reaktionsgeschwindigkeit und beschleunigen die Bildung der Carbonsäure-thioester. Wiederholte Verwendung der in einem Reaktionsansatz benutzten Lipase in einem neuen Ansatz ist ohne nennenswerten Leistungsverlust des Biokatalysators möglich.

Unterdrücke zwischen 900 mbar und 0,1 mbar können für die Reaktion verwendet werden; üblicherweise werden Drücke zwischen 200 mbar und 10 mbar eingehalten.

Die Reinigung der Carbonsäure-thioester kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Nach der Umsetzung wird der Enzymkatalysator vom Reaktionsgemisch durch mehrmalige Extraktion mit einem organischen, vorzugsweise apolaren Lösungsmittel und anschließende Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird das überschüssige Alkanthiol im Vakuum (vorzugsweise 0,1 bis 1 mbar) bei erhöhter Temperatur (üblicherweise 60-80°C) entfernt oder das Reaktionsgemisch in einem organischen, vorzugsweise apolaren Lösungsmittel gelöst und an einer kurzen Säule gepackt mit einem Sorbens, vorzugsweise Kieselgel, adsorbiert.

Durch Elution mit Gemischen apolarer und wenig polarer, aprotischer organischer Lösungsmittel, zum Beispiel i-Hexan/Diethylether-Gemischen, werden die Carbonsäure thioester anschließend von nicht umgesetzten Carbonsäuren bzw. Carbonsäureestern sowie Thiolverbindungen abgetrennt.

Im folgenden werden verschiedene Ausführungsbeispiele gegeben für die Herstellung von Carbonsäure-thioestern, die in beheizbaren Rührgefäßen unter Vakuum durchgeführt wird:

Beispiel 1

Carbonsäure: Laurinsäure 80 mg (0,4 mmol)
Thiolverbindung: 1-Dodecanthiol 242 mg (1,2 mmol)
Lipase: Candida antarctica, immobilisiert (Novozym®) 100 mg
Temperatur: 40°C
Druck: 500 mbar
Dauer: 96 Std.
Aufarbeitung: Nach der Umsetzung wird der Enzymkatalysator vom Reaktionsgemisch durch zweimalige Extraktion mit iso-Hexan und anschließende Zentrifugation abgetrennt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird das überschüssige 1-Dodecanthiol im Vakuum (1,0 mbar) bei einer Temperatur von 60°C entfernt oder das Reaktionsgemisch in iso-Hexan gelöst und an einer kurzen Säule (20 cm × 0,5 cm i.D.) gepackt mit Kieselgel adsorbiert. Die Elution mit einem Stufengradienten ergibt folgende Fraktionen: (1) 20 ml iso-Hexan/Diethylether (99,5:0,5, v/v), nicht umgesetztes 1- Dodecanthiol; (2) 20 ml iso-Hexan/Diethylether (95 : 5, v/v), 120-130 mg Laurinsäure-dodecylthioester.
Analyse: Die Analyse des Produktes erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (GC): 93% Laurinsäure-dodecylthioester (bezogen auf Laurinsäure)
Reinheit (GC): 98%
Schmelzbereich: 36-37°C
Massenspektrometrie [m/z (rel.%)]: 384 (0,4; [M]⁺; 215 (15,9 [M-C₁₂H₂₅]⁺; 183 (93,2 [M-C₁₂H₂₅S]⁺)

Beispiel 2 Analyse der Carbonsäure-thioester

Dünnschichtchromatographie an Kieselgelschichten Anteile der Reaktionsgemische, gelöst in iso-Hexan, werden auf Kieselgel- Dünnschichtplatten (0,3 mm Schichtdicke) punkt- oder strichförmig aufgetragen. Die Platten werden in einem Gemisch von iso-Hexan/Diethylether (99:1, v/v) entwickelt und die verschiedenen Verbindungen des Reaktionsansatzes getrennt. Verbindungen mit freien Thiol- Gruppen werden anschließend durch Besprühen der Platten mit einer wäßrig-alkoholischen Lösung von Ellman's-Reagens angefärbt. Andere Substanzen werden durch Bedampfen mit Jod sichtbar gemacht. Die Identifizierung der einzelnen Verbindungen erfolgt durch Vergleich mit bekannten Standards. Die folgenden Rf-Werte werden für die verschiedenen Verbindungen im Reaktionsgemisch unter Verwendung des obigen Laufmittels gefunden: langkettige Alkanthiole 0,6-0,7; Fettsäure-thioester, 0,35-0,45; Fettsäure-methylester, 0,05-0,1; Triglyceride, 0,05-0,1; freie Fettsäuren und andere Carbonsäuren, < 0,05.

Gaschromatographie

Anteile der Reaktionsgemische werden in iso-Hexan gelöst und die Lipasekatalysatoren durch Zentrifugation in einer Laborzentrifuge abgetrennt. Freie Carbonsäuren im Reaktionsgemisch werden durch Derivatisierung mit Diazomethan in die entsprechenden Methylester überführt.

Das resultierende Gemisch aus Carbonsäure-methylestern, nicht umgesetzten Alkanthiolen und Carbonsäure-thioestern wird gaschromatographisch analysiert. Die Trennung an einer 25 m × 0,25 mm i.D. Quadrex 400-2HT Kapillar-Gaschromatographiesäule (Wasserstoff als Trägergas mit einer linearen Strömungsgeschwindigkeit von 25-35 cm/sec; Temperaturprogramm: 120°C [2 min isotherm] gefolgt von einem linearen Temperaturanstieg von 120 bis 200°C mit 5°C/min, anschließend mit 20°C/min auf 350°C [6 min isotherm]) liefert für die verschiedenen Verbindungen im Reaktionsgemisch beispielsweise folgende Retentionszeiten (Rt): 1- Dodecanthiol (3,3 min); 1-Tetradecanthiol (6,0 min); 1-Hexadecanthiol (9,4 min); 1- Octadecanthiol (12,9 min); Laurinsäuremethylester (4,4 min); Palmitinsäure-methylester (11,0 min); Tricaproin (17,0 min); Capronsäure-octadecylthioester (20,9 min); Laurinsäure- dodecylthioester (22,0 min); Palmitinsäure-hexadecylthioester (25.1 min); Palmitinsäure- octadecylthioester (26.2 min).

Beispiel 3

Carbonsäure: Palmitinsäure 513 mg (2 mmol)
Thiolverbindung: 1-Hexadecanthiol 1551 mg (6 mmol)
Lipase: Novozym® 500 mg
Temperatur: 60°C
Druck: 50 mbar
Dauer: 48 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1, die Analyse wie in Beispiel 2 beschrieben.

Umsatz (GC): 95% Palmitinsäure-hexadecylthioester (bezogen auf Palmitinsäure)
Reinheit (GC): 98%
Schmelzbereich: 56-57°C
Massenspektrometrie [m/z (rel.%)]: 469 (0,1; [M]⁺; 271(15,1 [M-C₁₄H₂₉]⁺; 183 (52,0 [M-C₁₄H₂₉S]⁺)

Beispiel 4

Carbonsäure: Laurinsäure 901 mg (4,5 mmol)
Thiolverbindung: 1-Mercapto-propan-2,3-diol (α-Monothioglycerin) 54 mg (1,5 mequival; 0,5 mmol)
Lipase: Novozym® 50 mg
Temperatur: 60°C
Druck: 400 mbar
Dauer: 48 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie unter Beispiel 1 beschrieben mit folgenden Änderungen: Die chromatographische Reinigung an Kieselgel 60 durch Elution mit einem Stufengradienten ergibt die Fraktionen: (1) 10 ml iso-Hexan + 10 ml iso-Hexan/Diethylether (98 : 2, v/v), wenig apolare Verunreinigungen; (2) 20 ml iso-Hexan/Diethylether (95 : 5, v/v), 20-50 mg Trilauroyl-α-monothioglycerin; (3) 40 ml iso-Hexan/Diethylether (9:1, v/v), 250-300 mg Trilauroyl-α-monothioglycerin.

Umsatz (GC): 55% Trilauroyl-α-monothloglycerin (bezogen auf α-Monothioglycerin)
Die Analyse erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben mit folgenden Änderungen: Dünnschicht chromatographie in iso-Hexan-Diethylether 8 : 2, v/v: Rf 0,50; GC-Temperaturprogramm: 80°C (6 min isotherm) → 20°C/min → 420°C (5 min isotherm), Rt 19,7 min, Trilauroyl-α- monothioglycerin
Reinheit (GC): 92% Trilauroyl-α-monothioglycerin
Schmelzbereich: 36-38°C

Beispiel 5

Carbonsäure: 1,12-Dodecandisäure 46 mg (0,4 mequival; 0,2 mmol)
Thiolverbindung: 1-Hexadecanthiol 155 mg (0,6 mmol)
Lipase: Novozym® 50 mg
Temperatur: 60°C
Druck: 300 mbar
Dauer: 48 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben mit folgenden Änderungen: Der Reaktionsansatz wird nach Abtrennung des Katalysators mit Diazomethan versetzt, um Verbindungen mit freien Carboxyl-Grnppen in die entsprechenden Methylester umzuwandeln. Die chromatographische Reinigung an Kieselgel 60 durch Elution mit einem Stufengradienten ergibt die Fraktionen: (1) 20 ml iso-Hexan + 20 ml iso-Hexan/Diethylether (98 : 2, v/v), nicht umgesetztes 1-Hexadecanthiol; (2) 20 ml iso-Hexan/Diethylether (95 : 5, v/v), 50-70 mg Dihexadecylthioester der 1,12-Dodecandisäure; (3) 20 ml iso-Hexan/Diethylether (9 : 1, v/v), 20-30 mg Monohexadecylthioester des 1,12-Dodecandisäure-monomethylesters. Die Analyse erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben mit folgenden Änderungen: Dünnschicht chromatographie in iso-Hexan-Dichlormethan 1 : 1, v/v; Rf 0,44, 1,12-Dodecandisäure dihexadecylthioester; Rf 0,15, 1,12-Dodecandisäure-monomethylester-monohexadecylthioester GC-Temperaturprogramm: 140°C (2 min isotherm) → 5°C/min → 200°C → 10°C/min → 380°C (10 min isotherm); Rt 6,9 min, 1,12-Dodecandisäure-dimethylester; 24,0 min, 1,12-Dodecandi säure-monomethylester-monohexadecylthioester; 31,6 min, 1,12-Dodecandisäuredihexadecyl thioester).

Umsatz (GC): 34% 1,12-Dodecandisäure-monomethylester-monohexadecylthioester (bezogen auf 1,12-Dodecandisäure)
Reinheit (GC): 96%; Schmelzbereich: 60-62°C
50% 1,12-Dodecandisäure-dihexadecylthioester (bezogen auf 1,12-Dodecandisäure)
Reinheit (GC): 92%; Schmelzbereich: 74-75°C

Beispiel 6

Carbonsäureester: Palmitinsäure-methylester 54 mg (0,2 mmol)
Thiolverbindung: 1-Octadecanthiol 172 mg (0,6 mmol)
Lipase: Rhizomucor miehei, immobilisiert (Lipozyme®) 50 mg
Temperatur: 60°C
Druck: 20 mbar
Dauer: 72 Std.

Umsatz (GC): 76% Palmitinsäure-octadecylthioester (bezogen auf Palmitinsäure methylester)
Reinheit (GC): 98%
Schmelzbereich: 60-61°C
Massenspektrometrie [m/z (rel.%)]: 440 (0,2; [M]⁺; 271 (17,5 [M-C₁₂H₂₅]⁺; 239 (65,9 [M-C₁₂H₂₅S]⁺)

Beispiel 7

Carbonsäure: Laurinsäure 40 mg (0,2 mmol)
Thiolverbindung: 1-Dodecanthiol 121 mg (0,6 mmol)
Lipase: Papaya-Latex 50 mg
Temperatur: 60°C
Druck: 400 mbar
Dauer: 72 Std.

Umsatz (GC): 56% Laurinsäure-dodecylthioester (bezogen auf Laurinsäure)
Reinheit (GC): 95%
Schmelzbereich: 35-36°C

Beispiel 8

Triglycerid: Trihexanoylglycerin (Tricaproin) 25,8 mg (0,2 mequival; 0,066 mmol) Thiolverbindung: 1-Octadecanthiol 172 mg (0,6 mmol)
Lipase: Novozyme® 50 mg
Temperatur: 60°C
Druck: 200 mbar
Dauer: 48 Std.

Umsatz (GC): 36% Capronsäure-octadecylthioester (bezogen auf Tricaproin)
Reinheit (GC): 99%
Schmelzbereich: 37-38°C

Claims

1. Enzymatisches Verfahren zur Synthese von organischen Carbonsäure-thioestern ausgehend von organischen Carbonsäuren oder Carbonsäureestern und Alkanthiolen unter Rühren im Vakuum in Gegenwart einer Lipase.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Carbonsäure durch eine Di- oder Polycarbonsäure ersetzt ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Carbonsäureester durch einen Di- oder Polycarbonsäureester ersetzt ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Alkanthiol durch eine Di- oder Polythiol verbindung ersetzt ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Thiolverbindung sowohl Thiol- als auch Hydroxy-Gruppen besitzt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Carbonsäureester ein Triacylglycerin (Triglycerid) oder der Carbonsäure-Polyester eines anderen Polyols ist.