DE69508558T2

DE69508558T2 - Verfahren zur Fraktionierung von Fettsäuren

Info

Publication number: DE69508558T2
Application number: DE69508558T
Authority: DE
Inventors: Laurence Sandoz; Hans-Juergen Wille
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1995-05-04
Filing date: 1995-05-04
Publication date: 1999-08-26
Anticipated expiration: 2015-05-05
Also published as: CA2175734A1; EP0741183A1; JP3798467B2; JPH08302384A; AU708725B2; GR3030344T3; AU5206196A; CA2175734C; ES2130515T3; ATE178087T1; US5897994A; DK0741183T3; EP0741183B1; DE69508558D1

Description

Die Erfindung betrifft ein im wesentlichen enzymatisches Verfahren zur Fraktionierung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren.
Die Fettsäuren der Serien n-6 und n-3 haben eine Bedeutung für die Ernährung, und zwar insbesondere als Vorläufer der Biosynthese der Prostaglandine. Für verschiedene Anwendungen auf dem Gebiet der Nahrungsmittel und der Kosmetik kann es zweckmäßig sein, über Fraktionen zu verfügen, die mit diesen Fettsäuren angereichert sind. Man findet diese Fettsäuren in der Natur hauptsächlich in Form von Triglyceriden. Industriell erhält man die freien Fettsäuren aus Hydroglyceriden durch Hydrolyse bei hoher Temperatur und unter starkem Druck. Für die anschließende Fraktionierung dieser Fettsäuren hat man mehrere Methoden entwickelt, und zwar beispielsweise die Kristallisierung, die Destillierung, die Bildung von Einschlußkomplexen oder die chromatographischen Techniken. Die Anwendung dieser Methoden kann im Fall von mehrfach ungesättigten Fettsäuren einen Abbau mit sich bringen oder sich für eine industrielle Anwendung als zu teuer herausstellen.
Die enzymatischen Methoden stellen eine Alternative zu diesen Methoden dar, da sie die Durchführung der Reaktionen bei milden Bedingungen gestatten, wobei wenig Energie verbraucht wird und die verwendete Anlage weniger stark beansprucht wird.
Man kennt beispielsweise aus Matthew J. Hills et coll. in JAOCS, Bd. 67, Nr. 9, S. 561-563, enzymatische Verfahren zur Fraktionierung der Fettsäuren von Fischöl und Nachtkerzenöl, die auf der Tatsache beruhen, daß die Kinetik der Veresterung durch Butanol unter Katalyse durch die Lipasen aus Colza und Mucor miehei eine Funktion des Sättigungsgrades der zu veresternden Säure ist. Nach Veresterung der Fettsäuren mit höherem Sättigungsgrad werden die Ester von den Fettsäuren getrennt, die nicht bei Dünnschichtchromatographie reagiert haben.
JAOCS, Bd. 71, S. 563, Sp. 2 bis S. 564, Sp. 1, betrifft die enzymatische Anreicherung einer Mischung von Fettsäuren von Borretschöl und Nachtkerzenöl durch Veresterung der Fettsäuren mit n-Butanol mit einer Lipase als Katalysator und dann Abtrennung der freien Fettsäuren, die nicht reagiert haben, von den Butylestern durch Reaktion des mit Hexan versetzten Mediums mit konzentriertem Natriumcarbonat in wässrig-ethanolischem Medium und Trennung der organischen und der wässrigen Phase. Das wässrige Medium wird anschließend mit Hexan extrahiert, und die Hexanphase wird wieder mit Natriumcarbonat in wässrig-ethanolischer Lösung behandelt und die Hexanmedien einerseits werden kombiniert und die wässrigen Medien andererseits werden vereinigt. Man säuert dann die wässrige Phase mit einer konzentrierten Chlorwasserstoffsäurelösung an und extrahiert daraus die freigesetzten Fettsäuren mit Ether.
JAOCS, Bd. 71, S. 569-573 und insbesondere S. 569, Sp. 2, Abs. 2-4, derselben Autoren betrifft die Anreicherung von Borretschöl oder Nachtkerzenöl mit gamma-Linolensäure durch enzymatische Hydrolyse der Triglyceride und anschließende Trennung der nicht veresterten freien Fettsäuren durch Auflösung des Produkts der Lipolyse in Hexan und Reaktion der Fettsäuren mit konzentriertem Natriumcarbonat in wässrigethanolischer Lösung. Die folgenden Arbeitsgänge, die zum Gewinnen der beispielsweise mit gamma-Linolensäure angereicherten Fettsäurenmischung durchgeführt werden, laufen entsprechend dem oben genannten Artikel ab.
Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Fraktionierung von Fettsäuren von an mehrfach ungesättigten Fettsäuren reichen Ölen durch enzymatische Veresterung zu schaffen, das unter Vermeidung einer chromatographischen Trennung industriell anwendbar ist.
Die Erfindung betrifft ein im wesentlichen enzymatisches Verfahren zur Fraktionierung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Veresterung einer Mischung von Fettsäuren unter enzymatischer Katalyse mit Methanol durchführt, wonach man die gebildeten Methylester von den Fettsäuren, die nicht reagiert haben, durch Verseifung der Fettsäuren mit einer schwachen Base in einem wässrigen Medium abtrennt, daß man die wässrige Phase ansäuert, daß man die gebildeten Fettsäuren mit Hexan extrahiert, und daß man eine an den gewünschten mehrfach ungesättigten Fettsäuren angereicherte Fraktion gewinnt.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man eine Ausgangs-Fettsäuremischung, die vorzugsweise durch vollständige enzymatische Hydrolyse von Triglyceriden eines Öls erhalten wurde, das an mehrfach ungesättigten Fettsäuren reich ist. Diese Hydrolyse findet vorzugsweise in einem emulgierten Medium durch eine nicht regiospezifische Lipase aus Candida cylindracea statt, und zwar vorzugsweise bei Raumtemperatur bei einem neutralen oder nahezu neutralen pH und bei atmosphärischem Druck.
Als Ausgangsöl kann man jedes natürliche Öl pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder jedes synthetische Öl nennen, das mehrfach ungesättigte Fettsäuren insbesondere mit einem Ungesättigtheitsgrad 3 oder mehr enthält, beispielsweise Kernöl von schwarzen Johannisbeeren, Borretschöl, Nachtkerzenöl, die reich an gamma-Linolensäure (GLA) sind, oder "TGA"-Öl, das reich an Arachidonsäure ist.
Die Veresterung findet in Anwesenheit von Methanol und Lösungsmittel, beispielsweise Hexan oder einer geringen Menge Wasser, statt. Die Reaktion dauert 5 bis 70 h und vorzugsweise 10 bis 40 h vorzugsweise bei Raumtemperatur. Das verwendete Enzym kann immobilisiert sein oder nicht. Es ist vorzugsweise immobilisiert, um wiederverwendet werden zu können. Es kann regiospezifisch sein oder nicht.
Nach Reaktion erhält man eine Mischung von freien Fettsäuren und Methylestern von Fettsäuren. Die veresterte Fraktion ist an Fettsäuren mit hohem Unsättigkeitsgrad verarmt, beispielsweise im Fall von Kernöl von schwarzen Johannisbeeren an GLA und an Stearidonsäure (SA), was anzeigt, daß diese Säuren fast nicht verestert und in der Fraktion der freien Fettsäuren entsprechend angereichert sind.
Erfindungsgemäß findet die Abtrennung der freien Fettsäuren von den Estern durch Verseifung der Fettsäuren bei milden Bedingungen statt. Diese Bedingungen sind gekennzeichnet durch eine Reaktion mit einer schwachen Base in wässrigem Medium, beispielsweise Carbonate, Phosphate, Citrate von Natrium, Kalium oder Ammonium oder deren Mischungen, vorzugsweise Natriumcarbonat bei einer Temperatur, die von Raumtemperatur, beispielsweise 20ºC, bis etwa 80ºC geht, unter Rühren und vorzugsweise unter Verstärkung des Rührens und allmählicher Temperaturerhöhung von etwa 45ºC bis etwa 75ºC. Man stellt dabei eine Trennung zwischen einer wässrigen Phase und einer organischen Phase fest und kann diese Trennung beispielsweise durch Beigabe einer gesättigten Natriumchloridlösung verstärken.
Mit diesem Verfahren ist es möglich, nur die Fettsäuren reagieren zu lassen, die in Form von Seifen wasserlöslich werden. Die erhaltene wässrige Phase kann nun leicht von der die fettlöslichen Ester enthaltenden organischen Phase nach Absetzen beispielsweise durch Zentrifugieren abgetrennt werden. Die freien Fettsäuren können durch Ansäuerung der wässrigen Phase mit einer Säure, beispielsweise konzentrierter Chlorwasserstoffsäure, gewonnen und mit einem Lösungsmittel, beispielsweise Hexan, extrahiert werden, wobei das Lösungsmittel anschließend beispielsweise durch Verdampfung entfernt werden muß.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung. In ihnen beziehen sich die Prozentsätze und Anteile auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben wird. Die quantitative Analyse der freien Fettsäuren wird nach Methylierung mit Acetylchlorid durch Gasphasenchromatographie (CPG), d. h. also auf der Basis der Methylester, durchgeführt.

Beispiel 1

1.1 Herstellung der Ausgangs-Fettsäuremischung

Als Ausgangsmaterial benutzt man eine Fettsäuremischung, die aus der enzymatischen Hydrolyse eines Kernöls der schwarzen Johannisbeere mit Hilfe einer nicht spezifischen Lipase aus Candida cylindracea stammt. Die Fettsäuremischung wird auf die folgende Weise erhalten:
Man stellt eine Öl-in-Wasser-Emulsion her, die 20% Kernöl von schwarzen Johannisbeeren und 1,2% Sojalecithin (Asol 100®, Luca Meyer) enthält, gelöst in 78,8% einer wässrigen Phosphatpufferlösung 0,025 M mit pH 6,88, indem 5 Durchgänge durch einen Mikrofluidisierer (110T, Microfluidics Corporation, Newton) vorgenommen werden, was zu einem mittleren Durchmesser der Öltröpfchen von etwa 450 nm führt.
Man solubilisiert die Lipase aus Candida Cylindracea, Type B, Biocatalysts Ltd., Cardiff, England, in dem Phosphatpuffer und zentrifugiert sie dann bei 4000 g während 20 Minuten, um die unlöslichen Rückstände zu entfernen. Der Überstand wird für die Tests verwendet. 10 ml der vorhergehenden Emulsion (die 2 g Kernöl von schwarzen Johannisbeeren enthält) werden in einen verschlossenen Erlenmeyer-Kolben von 25 ml in einem durch Thermostat auf einer Temperatur von 37ºC gehaltenen Bad gebracht, wobei mit 250 U/min magnetisch gerührt wird, und dieser gibt man die enzymatische Lösung bei, die 0,2 g Lipase entspricht.
Nach Reaktion während 4 h zentrifugiert man das Medium mit 4000 g, um die Emulsion zu brechen, und gewinnt die Lipid phase durch Extraktion mit Ether. Man wäscht den Extrakt mit Wasser, trocknet ihn auf Natriumsulfat und entfernt dann das Lösungsmittel durch Verdampfen. Man bewahrt die erhaltenen Fettsäuren bei -25ºC vor Licht geschützt und unter Stickstoff auf.
Man gewinnt die Lipase in Lösung in einer wässrigen Phase sowie das gebildete Glycerin durch Ultrafiltration (Modul YM10, Trennschwelle 10000, Amicon, Denver, USA), was eine konzentrierte Lipasenlösung ergibt, die wiederverwendet werden kann.
Der dem Prozentsatz von während der Reaktion freigesetzten Fettsäuren entsprechende Hydrolysegrad entspricht 99,9%, bestimmt durch Säuren-Basen-Titrierung mit Hilfe eines Titroprozessors 692 von Metrohm. Die zu analysierende Probe, die in 25 ml einer volumensgleichen Mischung von Ethanol und Ethylether gelöst war, wurde durch eine alkoholische KOH-Lösung mit einer Konzentration von 0,1 N titriert.
Die Fettsäurenmischung hat die folgende Zusammensetzung, die durch CPG in Form von Methylestern bestimmt wurde:

Fettsäuren %

C 16 : 0 7,1
C 18 : 0 1,7
C 18 : 1 13,3
C 18 : 2 45,6
C 18 : 3 gamma 15,5
C 18 : 3 alpha 12,2
C 18 : 4 2,9
C 20 : 1 0,8
C 20 : 2 0,2
andere 0,8

1.2. Veresterung

Man nimmt die Veresterung der Fettsäuren mit Methanol vor, indem man 900 mg Fettsäurenmischung in einer Mischung von 11 ml Hexan und 1 ml Methanol und 1200 mg immobilisiertes Enzym, Lipozyme TM 20 aus Mucor Miehei, Novo Nordisk A/S. Dänemark, verwendet. Dieses Enzym hat eine erhöhte Spezifizität für die Positionen 1 und 3 des Skeletts des Glycerins der Triglyceride gegenüber der Position 2. Die Reaktion findet während 20 h bei Raumtemperatur in einem Glaskolben statt, der mit einem Magnetstab ausgerüstet ist und auf einem mechanischen Rührer angeordnet ist. Nach Reaktion filtert man das Enzym, das nach Spülen und Rehydratisierung mit 10 Vol.-% Wasser wiederverwendet werden kann. Man erhält eine Mischung von freien Fettsäuren und Methylestern von Fettsäuren.

1.3. Abtrennung der Fettsäuren und der Methylester

Man erhitzt 20 g der vorhergehenden Mischung von Fettsäuren und Methylestern von Fettsäuren bei 40ºC und gibt dann unter Rühren 1,1 g in Wasser gelöstes Natriumcarbonat bei. Man erhöht dann die Rührgeschwindigkeit und erhöht die Temperatur auf 75ºC. Wenn diese Temperatur erreicht ist, bricht man die Erhitzung ab und gibt 20 ml gesättigtes Salzwasser bei. Man stellt die Bildung einer organischen Phase und einer wässrigen Phase fest. Man zentrifugiert anschließend das ganze während 10 min mit 3000 U/min. trennt die beiden Phasen und säuert dann die wässrige Phase, die die Seifen enthält, mit einer Chlorwasserstoffsäurelösung an. Man extrahiert anschließend die gebildeten Fettsäuren mit Hexan und verdampft dann das Hexan. Man gewinnt auf diese Weise 1,5 g mit GLA und SA angereicherte Fettsäuren, die die folgende Zusammensetzung haben (CPG der Methylester):

Fettsäuren %

C 16 : 0 1,3
C 18 : 1 2
C 18 : 2 6,5
C 18 : 3 gamma 73,4
C 18 : 3 alpha 2,4
C 18 : 4 13,6
andere 0,8

Beispiel 2

Man geht wie in Beispiel 1 vor, nur daß man im Veresterungsschritt (entspricht 1.2 von Beispiel 1) eine Lösungsmittelmischung verwendet, die aus 9 ml Methanol und 1 ml Wasser besteht.
Man erhält auf diese Weise 64,6% GLA und 11,8% SA in der angereicherten Phase (die aus dem aus den Seifen erhaltenen nicht veresterten Teil besteht).

Beispiele 3-7

Man geht wie in Beispiel 1 vor, wobei man jedoch im Veresterungsschritt (entspricht 1.2 von Beispiel 1) die Dauer der Enzymreaktion in der angegebenen Weise ändert, und erhält die im nachstehenden angegebenen Prozente von GLA und SA in der angereicherten Phase (bestimmt durch CPG der Methylester):

Beispiele 8-15

Man nimmt wie in Beispiel 1 (Paragraph 1.2) die Veresterung einer Mischung von Fettsäuren von Kernöl von schwarzen Johannisbeeren mit Enzymen verschiedenen Ursprungs und Regiospezifizität durch Reaktion bei Raumtemperatur während 20 h vor. Man ermittelt die erhaltenen Ergebnisse, indem man die Fettsäurenzusammensetzung der veresterten Fraktion bestimmt (durch CPG in Form von Methylestern):
-: nicht quantifizierbar
Diese Ergebnisse zeigen, daß in allen Fällen die veresterte Fraktion bezüglich GLA und SA verarmt ist, was anzeigt, daß die beiden Säuren praktisch nicht verestert sind und daß damit die Fraktion der freien Fettsäuren an diesen Säuren angereichert ist.

Beispiel 16

Man verwendet als Rohstoff ein vollständiges Hydrolysat eines synthetischen TGA-Öls von Suntory Ltd, Tokyo, Japan, das aus fongus Mortierella extrahiert wird und sehr reich an Arachidonsäure ist. Nach Hydrolyse der Triglyceride verestert man die Mischung von freien Fettsäuren wie in Beispiel 1 (Absatz 1.2) mit Lipozym TM 20 während 20 h bei Raumtemperatur. Man trennt anschließend die Methylester von den freien Fettsäuren durch Dünnschichtchromatographie und analysiert dann die Zusammensetzung der Mischung von freien Fettsäuren. Die Zusammensetzung der Ausgangs-Fettsäuremischung und der nach Veresterung erhaltenen Mischung von freien Fettsäuren (bestimmt durch CPG der Methylester) sind im nachstehenden angeführt:
- : nicht quantifizierbar
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß es wie bei dem Kernöl von schwarzen Johannisbeeren vor allem die drei- und mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind, die in der Fraktion der freien Fettsäuren angereichert sind. Man stellt ferner fest, daß die GLA trotz ihres geringen Prozentsatzes im TGA-Öl gegenüber der alpha-Linolensäure (ALA) selektiv angereichert ist.

Claims

1. Im wesentlichen enzymatisches Verfahren zur Fraktionierung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man die Veresterung einer Mischung von Fettsäuren unter enzymatischer Katalyse mit Methanol durchführt, wonach man die gebildeten Methylester von den Fettsäuren, die nicht reagiert haben, durch Verseifung der Fettsäuren mit einer schwachen Base in einem wässrigen Medium abtrennt, daß man die gebildeten Seifen mit Wasser extrahiert, daß man die wässrige Phase ansäuert, daß man die gebildeten Fettsäuren mit Hexan extrahiert, und daß man eine an den gewünschten mehrfach ungesättigten Fettsäuren angereicherte Fraktion gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Ausgangs-Fettsäuremischung verwendet, die erhalten wurde durch vollständige enzymatische Hydrolyse von Triglyceriden eines Öls, das an mehrfach ungesättigten Fettsäuren reich ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Öl ein Öl ist, das reich ist an Fettsäuren der Serien n-3 bis n-6, insbesondere an gamma-Linolensäure, und das insbesondere ausgewählt ist aus Johannisbeerkernöl, Borretschöl und Nachtkerzenöl.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verseifung bewirkt durch Reaktion mit einem Carbonat, Phosphat, Citrat von Natrium, Kalium oder Ammonium oder deren Mischungen als schwache Base, und daß man eine Auftrennung des Reaktionsmilieus in eine wässrige Phase und eine organische Phase erhält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verseifung durch Reaktion mit einer wässrigen Lösung von Natriumcarbonat bewirkt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion bei einer Temperatur von 20 bis 80ºC unter Rühren durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion durchgeführt, indem man das Rühren verstärkt und die Temperatur von etwa 45ºC auf etwa 75ºC erhöht.

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Phasentrennung durch Zugabe einer gesättigten Natriumchloridlösung verbessert.

9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die die wasserlöslichen Fettsäuren enthaltende wässrige Phase von der die lipidlöslichen Ester enthaltenden organischen Phase durch Zentrifugieren abtrennt.

10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die freien Fettsäuren durch Ansäuern der wässrigen Phase mit einer Säure, insbesondere konzentrierter Chlorwasserstoffsäure, gewinnt, gefolgt von ihrer Extraktion mit Hexan und der Entfernung des Hexans, insbesondere durch Verdampfen.