DE19904754A1 - Verwendung regulatorischer cis-aktiver Elemente zur Herstellung von Promotorkonstrukten für eine schließzellspezifische Genexpression - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft kurze regulatorische cis-aktive Elemente, die die Nukleinsäuresequenz(en) TAAAG und/oder AAAAG und/oder mindestens eine zu den genannten Nukleinsäuresequenzen komplementäre Sequenz umfassen und die im Kontakt eines Promotors eine Schließzellspezifität der Genexpression vermitteln, die Verwendung derartiger cis-aktiver Elemente zur Herstellung von Promotorkonstrukten für eine schließzellenspezifische oder schließzelladditive Genexpression, rekombinante Promotoren, die mindestens eines dieser cis-aktiven Elemente umfassen, DNA-Konstrukte, insbesondere Expressionskassetten, Vektoren und andere Trägersysteme, transformierte Mikroorganismen und transgene Pflanzen, Pflanzenteile und Samen, die den erfindungsgemäßen rekombinanten Promotor in Form eines DNA-Konstrukts enthalten, sowie Verwendungen von diesen Kits, insbesondere zur Ausführung der erfindungsgemäßen Verfahren sowie ein Verfahren zur Identifizierung von in Schließzellen von Pflanzen exprimierten Genen, ausgehend von Nukleinsäuresequenzdaten.

Description

Die Erfindung betrifft kurze regulatorische cis-aktive Elemente, die die Nukleinsäuresequenz(en) TAAAG und/oder AAAAG und/oder mindestens eine zu den genannten Nukleinsäuresequenzen komplementäre Sequenz umfassen und die im Kontext eines Promo­ tors eine Schließzellspezifität der Genexpression vermitteln, die Verwendung derartiger kurzer regulatorischer cis-aktiver Elemente in einem Verfahren zur Herstellung von Promotorkon­ strukten für eine schließzellspezifische oder schließzelladditi­ ve Genexpression, Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Promotoren ausgehend von eine schließzellspezifische Genexpres­ sion bewirkenden Ausgangspromotoren, welche eine gegenüber dem Ausgangspromotor veränderte Aktivität in Schließzellen aufwei­ sen, durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche rekombi­ nante Promotoren, DNA-Konstrukte, insbesondere Expressionskas­ setten, Vektoren und andere Trägersysteme, transformierte Mikro­ organismen und transgene Pflanzen, Pflanzenteile und Samen, die den erfindungsgemäßen rekombinanten Promotor in Form eines DNA- Konstrukts enthalten, Kits insbesondere zur Ausführung der vor­ genannten erfindungsgemäßen Verfahren sowie ein Verfahren zur Identifizierung von in Schließzellen von Pflanzen exprimierten Genen ausgehend von Nukleinsäuresequenzdaten.

Bedingt durch den stetig steigenden Bedarf an Nahrungsmit­ teln und Rohstoffen, der sich aus dem beständigen Wachstum der Weltbevölkerung ergibt, und in Anbetracht der mittel- bis lang­ fristig abzusehenden Limitation von Anbauflächen ist es Aufgabe der biotechnologischen Forschung, sich um die Entwicklung er­ tragreicher und ökologisch unbedenklicher Nutzpflanzen zu bemü­ hen. Zu diesem Zweck muß die Entwicklung und der Metabolismus der Pflanzen sowie die Reaktionsfähigkeit von Pflanzen auf bio­ tische und abiotische Streßfaktoren manipuliert werden. Dies kann unter anderem durch die Veränderung der im Zellkern der Pflanzen enthaltenen Erbsubstanz, der Desoxyribonukleinsäure (DNA) erreicht werden.

Schließzellen sind hochdifferenzierte, häufig bohnenförmige Zellen in den Epidermen der oberirdischen, von Luft umgebenen grünen Teile höherer Pflanzen, die paarweise angeordnet sind und zwischen sich eine Lücke (Spalt) freilassen. Der Spalt unter­ bricht die ansonsten lückenlose Schicht der Epidermiszellen und stellt auf diese Weise die Verbindung zwischen der Außenluft und dem Interzellularsystem her. Bei den meisten Pflanzen nimmt das Porenareal bei geöffneten Spalten etwa 0,5 bis 1,5% der Blatt­ fläche ein. Infolge ihres besonderen Baus können Schließzellen ihre Gestalt durch aktive Turgoränderungen so regulieren, daß sich der Spalt zwischen ihnen schließt oder öffnet. Die Schließ­ zellen sind demzufolge Regulatoren des Gaswechsels, insbesondere der Transpiration. Die Schließzellen haben die Aufgabe, den Dif­ fusionswiderstand so zu regulieren, daß der Wasserverlust durch die Transpiration und die CO₂-Aufnahme für die photosynthetische oder die Dunkel-CO₂-Fixierung in einem den jeweiligen Bedürfnis­ sen angepaßten Verhältnis stehen. Darüber hinaus ermöglichen die Schließzellen auch die Abgabe anderer gasförmiger, von Pflanzen produzierter Substanzen, wie Methan, an die die Pflanzen umge­ bende Atmosphäre. Es gibt Hinweise darauf, daß Interaktionen oder Kommunikation zwischen Pflanzen oder zwischen Pflanzen und andersartigen, sie umgebenden Organismen, wie Insekten, zumin­ dest teilweise durch Vermittlung derartiger gasförmiger Substan­ zen erfolgen. Weiterhin gibt es Hinweise auf Inter-Pflanzen- Kommunikation z. B. durch Methyljasmonat und Methylsalicylat, die ebenfalls mit hoher Wahrscheinlichkeit in Form von Gasen durch die Spaltöffnungen der Pflanzen an die die Pflanzen umgebende Atmosphäre freigesetzt werden.

Das Öffnen und Schließen der Spaltöffnung ist auf eine Ver­ änderung des Turgors in den Schließzellen selbst und auf den Aufbau einer Differenz des Turgors in den Schließzellen zu den angrenzenden Epidermiszellen (Nachbarzellen) zurückzuführen.

Eine Steigerung des Ertrages von Nutzpflanzen kann dadurch erreicht werden, daß die Photosyntheseleistung der Pflanzen ver­ ändert wird oder der Wasserverbrauch verringert wird. Hierfür sind die Schließzellen in der Epidermis pflanzlicher Blattgewebe ein günstiger Ansatzpunkt. Weiterhin stellen die Schließzellen eine bevorzugte Eintrittstelle für eine Vielzahl von Pathogenen dar, dem durch die selektive Expression von Abwehrgenen in die­ sen Zellen entgegengewirkt werden kann. Eine selektive Beein­ flussung und Kontrolle der Expression bestimmter Gene in den Schließzellen stellt dementsprechend eine erfolgversprechende Methodik dar, um die Produktivität von Nutzpflanzen zu optimie­ ren. Darüber hinaus erscheint es möglich, durch Modulation der stomatären Öffnungsweite oder -dauer Interaktionen zwischen Pflanzen und/oder zwischen Pflanzen und andersartigen Organis­ men, wie Insekten, die durch bestimmte, von der Pflanze produ­ zierte und durch die Spaltöffnung freigesetzte gasförmige Sub­ stanzen vermittelt werden, zu beeinflussen. Daher besteht ein großes Interesse an der Identifizierung und der wirtschaftlichen Nutzbarkeit der für die spezifische Expression in den Schließ­ zellen verantwortlichen regulatorischen DNA-Sequenzen des pflanzlichen Genoms.

Bisher sind mehrere Promotoren publiziert worden, die eine präferentielle Genexpression in Schließzellen von Pflanzen ver­ mitteln (siehe allgemein zu schließzellspezifisch exprimierten Genen und Promotoren z. B. Kaldenhoff, R., et al. (1995); Müller- Röber, B., et al. (1994); Müller-Röber, B., et al. (1995); Naka­ mura, R. L. et al. (1995); Sarda, X., et al. (1997); Terryn, N., et al. (1993); Thoma, S., et al. (1994); Xia, Y., et al. (1997)). Auch die Offenlegungsschrift DE 42 07 358 A1 betrifft eine schließzellspezifische Starterregion. Dabei handelt es sich jedoch jeweils um in ihrer Gesamtheit natürlich vorkommende Starter- oder Promotorregionen zur Vermittlung einer Genexpres­ sion.

Im Gegensatz dazu besteht die Aufgabe der vorliegenden Er­ findung darin, die grundlegenden cis-aktiven regulatorischen Elemente zu ermitteln, die für die Schließzellspezifität derar­ tiger Promotoren verantwortlich sind. Dadurch wird es möglich, rekombinante Promotoren bereitzustellen, die eine schließzell­ spezifische oder ggf. auch schließzelladditive Genexpression er­ möglichen aufgrund der Integration solcher kurzer regulatori­ scher cis-aktiver Elemente, die im Kontext unterschiedlicher, zu den cis-aktiven Elementen heterologer Promotoren (Starterregio­ nen) bzw. Promotorkomponenten eine schließzellspezifische Ex­ pression vermitteln.

Die vorliegende Anmeldung löst die der Erfindung zugrunde­ liegende Aufgabe mittels der in den Ansprüchen definierten Ge­ genstände und Verfahren, und zwar aufgrund der Bereitstellung von regulatorischen cis-aktiven Elementen, die mindestens eine, bevorzugt zwei oder mehr der Nukleinsäuresequenzen TAAAG und/oder AAAAG und/oder der zu den genannten Nukleinsäuresequen­ zen komplementären Sequenzen umfassen und im Kontext eines Pro­ motors (einer Starterregion) eine schließzellspezifische Genex­ pression vermitteln können.

In speziellen Ausführungsformen der Erfindung umfaßt ein er­ findungsgemäßes regulatorisches cis-aktives Element im wesentli­ chen mindestens eine der in SEQ. ID. NO. 1, 2, 3 oder 4 angege­ benen Nukleotidsequenzen, beispielsweise ein Dimer, Trimer oder Tetramer, ggf. aber auch ein Multimer aus bis zu zwanzig oder mehr der in SEQ. ID. NO. 1, 2, 3 oder 4 angegebenen Nukleotidse­ quenzen. Dabei können einige oder auch alle der in SEQ. ID. NO. 1 bis 4 angegebenen Nukleotidsequenzen kombiniert in einem cis­ aktiven Element vorliegen.

In einer weiteren Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemä­ ßes cis-aktives Element eine Nukleinsäuresequenz, die von der Nukleinsäuresequenz eines der vorstehend erläuterten regulatori­ schen cis-aktiven Elemente, die im wesentlichen mindestens eine der in SEQ. ID. NO. 1, 2, 3 oder 4 angegebenen Nukleotidsequen­ zen umfassen, durch Mutation, insbesondere Deletion, Substituti­ on, Addition und/oder Insertion von einzelnen Nukleotiden oder kleineren Gruppe von Nukleotiden abgeleitet ist. Insbesondere wird hier an cis-aktive Elemente gedacht, deren abgeleitete Nu­ kleinsäuresequenz mit der Ausgangs-Nukleinsäuresequenz, d. h. der Nukleinsäuresequenz eines cis-aktiven Elements, das im wesentli­ chen mindestens eine der in SEQ. ID. NO. 1, 2, 3 oder 4 angege­ benen Nukleotidsequenzen aufweist, unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

Als Hybridisierung unter stringenten Bedingungen im Sinne der Erfindung wird eine Hybridisierung bei Vorgehensweise gemäß einem oder mehreren der nachstehend angegebenen Verfahren ver­ standen. Hybridisieren: Bis zu 20 Std. in PEG-Puffer nach Church und Gilbert (0,25 M Na₂HPO₄, 1 mM EDTA, 1% (w/v) BSA, 7% (w/v) SDS, pH 7,5 mit Phosphorsäure; Church, G. M. und Gilbert, W. (1984) Genomic sequencing, Proc. Acad. Sci. USA, 81, 1991-1995) bei 42°C oder in Standard-Hybridisierungspuffern mit Formamid bei 42°C oder ohne Formamid bei 68°C (siehe Sambrook, Fritsch & Maniatis (1989) Molecular cloning: a laboratory manual (2. Auf­ lage), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Waschen: 3-mal 30 min bei 65°C in 3-fach SSC-Puffer (siehe Sam­ brook, Fritsch & Maniatis (1989), a.a.O.), 0,1% SDS.

Die vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen TAAAG und AAAAG bzw. die dazu komplementären Sequenzen, die einzeln, mehr­ fach und auch in Kombination in den erfindungsgemäßen cis­ aktiven Elementen enthalten sein können, stellen die Kernsequen­ zen oder Kernelemente der Bindungsstelle für eine bestimmte Klasse von Transkriptionsfaktoren dar, die insbesondere die Schließzellspezifität eines diese Elemente umfassenden Promotors bedingen. Im Kontext der vorliegenden Unterlagen sollen bei Ver­ weis auf die genannten Nukleinsäuresequenzen TAAAG und/oder AAAAG stets die dazu komplementären Nukleinsäuresequenzen als mit umfaßt verstanden werden.

Allein aus sterischen Gründen wie auch aus Spezifitätsgrün­ den sind Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren und damit derartige cis-aktive Elemente oft größer als 5-6 Basenpaare, wo­ bei jedoch die Umgebung der Kernsequenzen oder Kernelemente ge­ genüber diesen eine untergeordnete Rolle für die Transkriptions­ faktorbindung spielt. Die entscheidende Voraussetzung für die Bindung dieser speziellen Klasse von Transkriptionsfaktoren stellt die Anwesenheit der vorstehend genannten Kernsequenzen oder Kernelemente TAAAG und/oder AAAAG und/oder von Kernelemen­ ten mit zu den aufgeführten Nukleinsäuresequenzen komplementärer Nukleinsäuresequenz dar.

Neben der nachfolgend näher erläuterten Verwendung der er­ findungsgemäßen regulatorischen cis-aktiven Elemente zur Her­ stellung rekombinanter Promotoren für eine schließzellspezifi­ sche oder -additive Genexpression können diese auch zur Identi­ fizierung von Transkriptionsfaktoren, die an dieses cis-aktive Element binden, eingesetzt werden. Diese Identifizierung von spezifisch an erfindungsgemäße cis-aktive Elemente bindenden Transkriptionsfaktoren kann insbesondere mittels des Hefe-One- Hybrid-Systems (Wang & Reed (1993)) oder des South-Western- Screening (Singh et al. (1993)) erfolgen.

Insbesondere eröffnet die Ermittlung der Schließzellspezifi­ tät vermittelnden cis-aktiven Elemente aber auch die Möglich­ keit, mit Hilfe dieser regulatorischen Elemente durch Kombinati­ on mit anderen heterologen Promotorkomponenten eine Vielzahl re­ kombinanter Promotoren oder Starterregionen für eine Genexpres­ sion in Schließzellen herzustellen. Diese können dann eine Genexpression in Schließzellen in variabler Stärke und gegebe­ nenfalls auch in Kombination mit einer Expression in anderen Ge­ weben, d. h. eine sogenannte "schließzelladditive Genexpression", vermitteln.

Die Begriffe "rekombinanter Promotor" und "rekombinante Starterregion", die in den vorliegenden Unterlagen synonym ver­ wendet werden, bezeichnen einen Promotor, in welchem sich zumin­ dest das Schließzellspezifität vermittelnde cis-aktive Element, sofern es eine Sequenz aufweist, die in ihrer Gesamtheit in der Natur vorkommt, nicht innerhalb der genetischen Umgebung, in der es natürlicherweise vorliegt, befindet. Alternativ kann das cis­ aktive Element abgesehen von mindestens einer der Kernsequenzen TAAAG und AAAAG bzw. der dazu komplementären Sequenzen, welche unverändert darin enthalten sein muß, auch Nukleotidabschnitte aufweisen, welche dazu führen, daß die gesamte Nukleinsäureab­ folge als synthetisch angesehen werden muß, also in der Natur so nicht gefunden wird.

Die das cis-aktive Element umgebenden weiteren Promotor­ elemente oder -komponenten können aus der gleichen Pflanze wie das erwähnte cis-aktive Element oder auch aus andersartigen Or­ ganismen, insbesondere eukaroytischen, aber gegebenenfalls auch aus prokaryotischen Organismen, Viren oder Phagen stammen. Al­ ternativ können weitere Promotorelemente auch rein synthetischen Ursprungs sein, kommen also in dieser Form in der Natur nicht vor. Weitere Promotorelemente sind beispielsweise die TATA-Box und die Transkriptionsinitiationsstelle, die zusammen die not­ wendigen und ausreichenden Elemente eines sogenannten "Minimal­ promotors" bilden, der eine Transkription eines unter dessen Kontrolle stehenden Gens - in der Regel jedoch nur in sehr ge­ ringem Ausmaß - ermöglicht. Noch weitere Promotorelemente, die ggf. anwesend sein können, sind beispielsweise die CCAAT-Box, die GC-Box sowie weitere cis-aktive Elemente, die die Bindung von Transkriptionsfaktoren vermitteln. Eine so vermittelte Bin­ dung von Transkriptionsfaktoren bewirkt wiederum eine verein­ fachte und damit häufiger erfolgende Bildung des Initiationskom­ plexes für die Transkription an der Transkriptionsinitiations­ stelle und damit eine verstärkte Transkription. Diese cis­ aktiven Elemente können darüber hinaus in speziellen Fällen zu­ sätzlich eine gewebe- oder zellspezifische Genexpression vermit­ teln, und können diese im vorliegenden Kontext gegebenenfalls zusätzlich zu der durch die erfindungsgemäß aufgefundenen cis­ aktiven Elemente vermittelten Schließzellspezifität bewirken. In dem letztgenannten Falle werden somit erfindungsgemäße rekombi­ nante Promotoren erhalten, die neben einer bestimmten ursprüng­ lichen Gewebe- oder Zellspezifität eine zusätzliche Genexpressi­ on in den Schließzellen ermöglichen, also eine "schließzelladdi­ tive" Genexpression.

Weitere ggf. in dem rekombinanten Promotor vorliegende cis­ aktive Elemente ermöglichen eine Induzierbarkeit oder Reprimier­ barkeit des Promotors bei Auftreten bestimmter Ereignisse, z. B. einer Verwundung oder Trockenstreß, und insbesondere in Anwesen­ heit bestimmter Substanzen, wie Phytohormone. Derartige cis­ aktive Elemente werden auch als Aktivierungs- bzw. Repressions­ elemente bezeichnet. Durch Integration derartiger cis-aktiver Elemente in einen erfindungsgemäßen rekombinanten Promotor kön­ nen durch Kombination mit stärkeren oder schwächeren Versionen der erfindungsgemäßen, Schließzellspezifität vermittelnden cis­ aktiven Elemente rekombinante Promotoren mit einer lokal auf Schließzellen beschränkten Induktions- oder Repressionsfähigkeit hergestellt werden. Beispielhaft können hier eine schließzell­ spezifische Promotorrepression und damit Repression der Genex­ pression bei Trockenstreß oder eine schließzellspezifische Akti­ vierung von Abwehrgenen bei Auftreten von Ereignissen, die in Zusammenhang mit dem Eindringen von Pathogenen in eine Pflanze auftreten, genannt werden.

Die weiteren Promotorelemente können in dem fertigen Promo­ tor ggf. auch in mehreren Kopien vorliegen. In einer Minimalver­ sion umfaßt ein erfindungsgemäßer rekombinanter Promotor ein oder ggf. auch mehrere cis-aktive Elemente, die Schließzellspe­ zifität vermitteln, in Kombination mit einem Minimalpromotor, z. B. dem 35S-Minimalpromotor.

Die Erfindung beruht auf der Identifizierung von zwei in derartigen cis-Elementen enthaltenen, fünf Nukleotide umfassen­ den Kernsequenzen oder Sequenzmotiven mit den Nukleinsäurese­ quenzen TAAAG und AAAAG bzw. den dazu komplementären Nukleinsäu­ resequenzen, die jeweils für sich im Kontext eines cis-aktiven Elements eine schließzellspezifische Genexpression vermitteln können. Dabei vermitteln die beschriebenen cis-aktiven regulato­ rischen Elemente eine spezifische Expression allein in Schließ­ zellen der Pflanzen und keine Expression in anderen Geweben. Die vorstehend erläuterten Kernsequenzen oder Sequenzmotive können dabei innerhalb eines derartigen cis-Elements einzeln oder auch gleichzeitig und ggf. jeweils auch in mehreren Kopien vorkommen. Durch gezielten Einbau der erfindungsgemäß bereitgestellten cis-aktiven Elemente bzw. Sequenzmotive oder durch gezielte Er­ zeugung derartiger cis-aktiver Elemente innerhalb eines vorgege­ benen Promotors durch Mutation einschließlich Insertion(en) und Deletion(en), die insbesondere die Nukleinsäureabfolge der vor­ stehend genannten Kernsequenz(en) TAAAG und/oder AAAAG und/oder eine zu den genannten Sequenzen komplementäre Nukleinsäureabfol­ ge erzeugt, lassen sich regulatorische Starterregionen, die bis­ lang keine Expression in Schließzellen der Pflanzen ermöglich­ ten, in Starterregionen umwandeln, die eine Expression in Schließzellen der Pflanzen sicherstellen. Im Kontext der vorlie­ genden Unterlagen sollen "Insertion" und "Deletion" von den Be­ griffen "Mutation" oder "Mutagenese" stets als mitumfaßt ver­ standen werden.

Dementsprechend umfaßt die Erfindung unter einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Promo­ tors für eine schließzellspezifische oder schließzelladditive Genexpression, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in einem Aus­ gangspromotor, der keine schließzellspezifische oder schließ­ zelladditive Genexpression bewirkt, oder zu Komponenten eines solchen Ausgangspromotors mindestens ein regulatorisches, eine schließzellspezifische Genexpression vermittelndes cis-aktives Element, welches die Nukleinsäuresequenz(en) TAAAG und/oder AAAAG und/oder mindestens eine zu den genannten Nukleinsäurese­ quenzen komplementäre Sequenz umfaßt, hinzugefügt oder durch Mu­ tation erzeugt wird. Verschiedene geeignete cis-aktive Elemente sind beispielhaft in den Figuren und in dem beigefügten Sequenz­ protokoll angegeben.

In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zur Herstellung des rekombinanten Promotors zwei bis zwanzig oder mehr, insbesondere zwei bis 18, z. B. zwei bis 8 cis-aktive Elemente, umfassend die Nukleinsäuresequenz(en) TAAAG und/oder AAAAG oder mindestens eine zu den genannten Nu­ kleinsäuresequenzen komplementäre Sequenz, verwendet.

Die Integration ein oder mehrerer Kopien der beschriebenen DNA-Sequenzen TAAAG und AAAAG oder der dazu komplementären Se­ quenzen in Form eines oder mehrerer cis-aktiver Elemente in den erfindungsgemäßen Promotor bzw. die Erzeugung derartiger Kopien mittels Mutation erlaubt dabei eine Variation der Expressions­ stärke in Schließzellen. Je mehr dieser Elemente bzw. Sequenzmo­ tive in dem Promotor enthalten sind, desto höher wird die Ex­ pressionsstärke in der Regel sein.

Zudem ermöglicht die Kenntnis der genannten cis-aktiven Ele­ mente bzw. Sequenzmotive, die Aktivität von transkriptionellen Starterregionen (Promotoren) in Schließzellen zu modulieren. Durch Hinzufügung von mindestens einem der cis-aktiven Elemente, welche die Sequenzmotive TAAAG und/oder AAAAG und/oder diejeni­ gen mit dazu komplementärer Sequenz umfassen, wie sie z. B. in den Figuren und dem beigefügten Sequenzprotokoll (SEQ. ID. NO. 1-4) aufgeführt sind, zu einer schließzellspezifischen oder schließzelladditiv wirksamen Ausgangspromotorsequenz (oder durch Erzeugung von mindestens einem der cis-aktiven Elemente in der Ausgangspromotorsequenz durch Mutation) kann die Aktivität der Genexpression spezifisch in Schließzellen erhöht werden.

Dementsprechend umfaßt die Erfindung unter einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Promo­ tors mit einer gegenüber einem Ausgangspromotor veränderten, insbesondere erhöhten Aktivität in Schließzellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in einem Ausgangspromotor, der eine schließzellspezifische oder schließzelladditive Genexpression bewirkt, mindestens eines der cis-aktiven Elemente, umfassend mindestens ein Sequenzmotiv TAAAG und/oder AAAAG und/oder minde­ stens ein Sequenzmotiv mit zu den genannten Nukleinsäuresequen­ zen komplementärer Sequenz, hinzugefügt oder durch Mutation er­ zeugt wird.

Im Gegenzug kann durch gezielte Deletion mindestens eines der Sequenzmotive TAAAG oder AAAAG oder der Sequenzmotive mit dazu komplementärer Sequenz innerhalb eines Ausgangspromotors, der eine schließzellspezifische oder -additive Genexpression be­ wirkt, und/oder Veränderung mindestens eines dieser Sequenzmoti­ ve durch Blocksubstitution bzw. -mutation und/oder Deletion, In­ sertion und/oder Substitution einzelner oder mehrerer Nukleotide die schließzellspezifische Aktivität des Promotors verringert werden. Dementsprechend umfaßt die Erfindung des weiteren auch ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Promotors mit einer gegenüber einem Ausgangspromotor veränderten, insbesondere verringerten Aktivität in Schließzellen, bei welchem in dem Aus­ gangspromotor, der eine schließzellspezifische oder -additive Genexpression bewirkt, mindestens eines der Sequenzmotive TAAAG und AAAAG oder der Sequenzmotive mit zu den angegebenen Nuklein­ säuresequenzen komplementärer Sequenz deletiert oder durch Blocksubstitution oder durch Deletion, Insertion und/oder Sub­ stitution einzelner oder mehrerer Nukleotide verändert wird. Un­ ter einer Blocksubstitution oder -mutation versteht man in dem vorliegenden Zusammenhang den vollständigen Ersatz des fünf Nu­ kleotide umfassenden Sequenzmotivs durch ein andersartiges, ebenfalls fünf Nukleotide umfassendes Sequenzmotiv. Ein Beispiel für eine derartige Blockmutation ist den Beispielen zu entneh­ men.

In einer weiteren Variante kann eine gegenüber einem Aus­ gangspromotor veränderte Promotoraktivität auch durch "Verschieben" erfindungsgemäßer cis-aktiver Elemente oder zumin­ dest der vorstehend erläuterten fünf Nukleotide umfassenden Se­ quenzmotive innerhalb der Nukleinsäureabfolge eines Ausgangspro­ motors erfolgen. Eine derartige Verschiebung oder Lageänderung bezogen auf mindestens ein weiteres Element des Promotors kann in dem Ausgangspromotor durch dem Fachmann geläufige Klonie­ rungsmaßnahmen, die mehrfache Nukleotiddeletionen, -inser-tionen und/oder -substitutionen, die in geeigneter Weise kombiniert werden, umfassen, bewirkt werden.

Ein weiterer zentraler Gegenstand der Erfindung sind rekom­ binante Promotoren, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind, die also mindestens ein regulatorisches, eine schließzellspezifische Genexpression vermittelndes cis-aktives Element, umfassend die Nukleinsäuresequenz(en) TAAAG und/oder AAAAG und/oder mindestens eine zu den genannten Nukleinsäurese­ quenzen komplementäre Sequenz, enthalten. Im übrigen wird auf die vorstehenden Ausführungen in Zusammenhang mit den Begriffen "rekombinanter Promotor" und "rekombinante Starterregion" ver­ wiesen. Die erfindungsgemäßen Promotoren können darüber hinaus in 5'- wie 3'-Richtung zusätzliche nicht-kodierende Nukleinsäu­ reabschnitte, beispielsweise Linkersequenzen mit Schnittstellen für Restriktionsenzyme, umfassen.

Im übrigen betrifft die Erfindung DNA-Konstrukte, insbeson­ dere Expressionskassetten, die einen erfindungsgemäßen rekombi­ nanten Promotor umfassen.

Weitere ggf. in dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt neben dem erfindungsgemäßen rekombinanten Promotor vorliegende geneti­ sche Elemente sind relativ kurze, in vivo zum Teil als Repeti­ tionen auftretende spezielle cis-aktive Elemente mit einer Länge von in der Regel ca. 70 bp, die als "Enhancer" bezeichnet wer­ den. In vivo verstärken Enhancer in der Regel in unterschiedli­ chem Ausmaß die Expression mancher Gene, d. h. sie verbessern die Erkennung des Promotors durch die RNA-Polymerase, wozu sie in der Regel in der 5'-flankierenden Region eines Gens etwa 100 bis 500 bp vor der "Cap"-Stelle des Gens, dessen Aktivität sie kon­ trollieren, angeordnet sind. Sie können aber auch in 5'-Richtung weiter entfernt, innerhalb der transkribierten Bereiche oder auch in der 3'-flankierenden Region liegen. Die transkriptions­ aktivierende Wirkung von Enhancern ist unabhängig von ihrem Ab­ stand zum Promotor und ihrer Orientierung bezüglich des Promo­ tors. Darüber hinaus sind Enhancer in der Regel nicht promotor­ spezifisch, so daß Enhancer verschiedener Herkunft einander funktionell ersetzen können. Viele Enhancer binden zelluläre Proteinfaktoren, von denen angenommen wird, daß sie ihrerseits mit DNA-bindenden Proteinen interagieren und die Bildung von DNA-Schlaufen, durch die entferntere DNA-Bereiche räumlich zu­ sammengeführt werden können, ermöglichen. Viele zelluläre Enhan­ cer-Elemente sind regulierbar und nur unter bestimmten zellulä­ ren Bedingungen aktiv. So werden manche Enhancer durch Substan­ zen mit Hormonwirkung reguliert. Häufig wird die gewebe- oder zellspezifische Expression von Genen durch Enhancerelemente be­ stimmt.

In einer speziellen Ausführungsform umfaßt das DNA-Konstrukt darüber hinaus einen ein Genprodukt kodierenden Nukleinsäureab­ schnitt, der operativ oder funktional mit dem rekombinanten Pro­ motor verknüpft ist. Für den Fachmann liegen die erforderlichen Maßnahmen zur operativen oder funktionalen Anfügung eines kodie­ renden Nukleinsäureabschnitts an einen Promotor im Rahmen seiner Fähigkeiten. Ein derartiges DNA-Konstrukt und insbesondere eine derartige Expressionskassette ermöglichen eine schließzellspezi­ fische oder auch - bei Vorliegen gewisser, vorstehend erläuter­ ter Gegebenheiten - schließzelladditive Expression des genannten Genprodukts in Pflanzen. Der kodierende Nukleinsäureabschnitt kann zu einer Wirtspflanze, in der dessen Expression erfolgen soll, homolog oder heterolog sein. Wird das Genprodukt in einer durch das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt zu transformierenden Schließzelle bereits exgrimiert, führt eine Transformation durch dieses und die nachfolgende Expression von dessen kodierendem Bereich zu einer Überexpression dieses Genprodukts in den Schließzellen. Wird das Genprodukt in einer Schließzelle vor der Einschleusung des DNA-Konstrukts noch nicht exprimiert, kann mittels der erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte eine erstmalige Ex­ pression eines Genprodukts in dieser Schließzelle bewirkt wer­ den.

Alternativ kann ein derartiges DNA-Konstrukt anstelle eines kodierenden Nukleinsäureabschnittes auch eine "antisense"-DNA, also eine DNA-Sequenz, die z. B. einen kodierenden Nukleinsäure­ abschnitt in "antisense"-Orientierung enthält, umfassen. Die hierdurch ermöglichte Expression eines "antisense"-Transkrip­ tionsprodukts in Pflanzen kann eine Verringerung oder sogar Eli­ minierung der Expression, und genauer, wie vermutet wird, der Translation eines in der Schließzelle normalerweise exprimierten Genprodukts aufgrund einer Hybridisierung des "antisense"- Transkriptionsprodukts mit der mRNA des unter "normalen" Bedin­ gungen exprimierten Gens bewirken.

Eine gleiche Wirkung, die Verringerung oder sogar Eliminie­ rung der Expression eines Genprodukts, das von Schließzellen vor einer Transformation mit dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt ex­ primiert wird, kann durch einen Cosuppressionseffekt bei Ein­ schleusung eines DNA-Konstrukts, welches das dieses spezielle Genprodukt kodierende Gen unter Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors enthält, erzielt werden. Ein Cosuppressionseffekt wird regelmäßig bei einigen Organismen nach Transformation bzw. Transfektion mit DNA-Konstrukten, die die Expression von Genen ermöglichen, die in den Organismenzellen bereits vorkommen, ne­ ben einer Vielzahl von transformierten Organismen, die, wie in der Regel beabsichtigt, eine Uberexpression des Zielgens auf­ grund des zusätzlich vorhandenen Konstrukts zeigen, beobachtet.

Neben dem vorstehend erwähnten "antisense"-Nukleinsäure­ abschnitt können erfindungsgemäße DNA-Konstrukte darüber hinaus noch weitere Nukleinsäureabschnitte umfassen, deren Transkripti­ on zu anderen Transkriptionsprodukten als mRNA, beispielsweise zur Erzeugung von Ribozymen, führt.

Mittels der erfindungsgemäßen rekombinanten schließzellen­ spezifischen Promotoren und der diese umfassenden Konstrukte kann durch Expression geeigneter, in die Schließzellen neu ein­ geführter Gene oder durch Variation der Konzentration endogener Genprodukte eine Veränderung stomatärer Eigenschaften, bei­ spielsweise ein permanentes Öffnen oder Schließen, eine Verlän­ gerung oder Verkürzung der Öffnungsperioden von Schließzellen, eine Veränderung der Öffnungs- und Schließkinetiken (d. h. der Geschwindigkeit des stomatären Öffnen und Schließens) oder eine Veränderung der Öffnungs- und Schließabhängigkeiten, z. B. in Ab­ hängigkeit von Phytohormonen, Umweltfaktoren oder Pathogenen, herbeigeführt werden. Dies ermöglicht eine Beeinflussung des Gasaustauschs, wie von Wasserdampf und Kohlendioxid. Darüber hinaus besteht aber auch die Möglichkeit, durch Modulation der stomatären Öffnungsweite oder -dauer Interaktionen oder die Kom­ munikation zwischen Pflanzen und/oder zwischen Pflanzen und an­ dersartigen Organismen, wie Insekten, die durch bestimmte, von der Pflanze produzierte und durch die Spaltöffnung freigesetzte gasförmige Substanzen vermittelt werden, zu beeinflussen. Wie bereits erläutert, ermöglichen die Schließzellen auch die Abgabe anderer gasförmiger, von Pflanzen produzierter Substanzen, wie Methan, Methyljasmonat und Methylsalicylat, an die die Pflanzen umgebende Atmosphäre. Nach dem gegenwärtigen Wissensstand ver­ mitteln diese Substanzen mit hoher Wahrscheinlichkeit Interak­ tionen oder Kommunikation zwischen Pflanzen oder zwischen Pflan­ zen und andersartigen, sie umgebenden Organismen, wie Insekten.

Wie gleichfalls bereits vorstehend angesprochen, kann aber auch eine gezielte Expression von Abwehrgenen gegen Pathogene in Schließzellen erreicht werden. Es ist gezeigt worden, daß Patho­ gene bevorzugt über die Stomata in Pflanzen eindringen. Daher ist von einer schließzellspezifischen konstitutiven oder insbe­ sondere auch in Abhängigkeit von der Pathogenerkennung indukti­ ven Expression von Abwehrgenen oder aber auch von Komponenten oder Proteinen, die einen Schließzellenschluß bewirken, ein Po­ tential für die Pathogenabwehr und damit für den Pflanzenschutz zu erwarten.

Ein dauerndes Offenhalten der Schließzellen sollte wegen ei­ ner vermehrten Transpiration zu einem hohen Wasserverlust bei Pflanzen führen, kann aber beispielsweise in späten Phasen des Wachstumszyklus zur Beschleuniggung des Abreifens von Kultur­ pflanzen wünschenswert sein. Darüber hinaus kann an die Produk­ tion stark transpirationsaktiver Pflanzen zum Zwecke einer kon­ trollierten Trockenlegung von Böden gedacht werden. Oberfläch­ lich wurzelnde Pflanzen können dabei über eine Absenkung der Wärmekapazität des Bodens infolge des starken Wasserentzugs durch die vermehrt transpirierenden Pflanzen eine jahreszeitlich frühere Erwärmung der Nutzflächen bewirken und so eine frühere Aussaat von temperaturempfindlichen Kulturpflanzen, wie z. B. der Zuckerrübe ermöglichen. Da die zunächst eingebrachten genetisch veränderten Hilfspflanzen in den weiteren Phasen des Wachs­ tumszyklus benachteiligt sind, führen sie nicht zu einer Behin­ derung der Entwicklung der Nutzpflanzen, sondern im Gegenteil durch eine Ausdehnung der Vegetationsphase zu einer Ertragsstei­ gerung.

Ein weitgehendes Geschlossenhalten der Spaltöffnungen würde durch einen verminderten Gasaustausch ein verlangsamtes Wachstum und infolgedessen eine zeitliche Ausdehnung der Vegetationsphase bewirken. Dies kann bei Zierpflanzen von Interesse sein. Weiter­ hin können landwirtschaftliche Hilfspflanzen produziert werden, die als transpirationsschwache Bodendecker eine Erosion der Nutzflächen in Ruhephasen oder zu Beginn der Vegetationsphase von Kulturpflanzen verhindern.

Eine Veränderung der Öffnungsperiode der Spalte erweist sich bei Kulturpflanzen als günstig. Beispielsweise kann bei grün ge­ ernteten Arten, insbesondere bei Futterpflanzen, durch Zurück­ halten des Wassers die Austrocknung älteren Blattmaterials ver­ hindert und so der Ertrag gesteigert werden. Ferner ist an eine Adaption an Standorte mit höherer atmosphärischer Kohlendioxid­ konzentration (z. B. CO₂-Begasung in Gewächshäusern) zu denken. Durch ein künstliches Verlängern der Öffnungsperiode können Ef­ fekte, wie Mineralstoffunterversorgung bei reduziertem Transpi­ rationsstrom infolge hoher Kohlendioxid-Partialdrücke in der Pflanze kompensiert werden.

Durch Kombination schließzellenspezifischer Regulatorelemen­ te mit anderen Regelkreisen können weitere Anwendungsmöglichkei­ ten entstehen. Beispielsweise kann durch eine Kopplung an chemi­ sche Sensoren ein von außen induziertes Schließen der Spaltöff­ nungen bewirkt und so z. B. ein Wachstumsstop von bestimmten Nutzpflanzen, den sogenannten "landwirtschaftlichen Hilfspflan­ zen", zu jedem gewünschten Zeitpunkt ausgelöst werden.

Wie erläutert, läßt sich eine Modifikation der Schließzellen mit Auswirkungen auf den Öffnungszustand der Stomata auf zwei Wegen erreichen: durch eine Modulation des Gehalts an endogenen, in den Schließzellen vorhandenen Proteinen, Peptiden, insbeson­ dere solchen mit Hormonwirkung, Enzymen, "carriern" oder "Pum­ pen", die Metabolite durch Membranen transportieren; oder durch Transfer und Expression von Genen homologen oder heterologen oder auch synthetischen Ursprungs, die Proteine, Peptide, Enzy­ me, "carrier" oder "Pumpen" kodieren, die nicht zur normalen Ausstattung einer Schließzelle gehören, aber deren Aktivität oder Vorhandensein den Zustand der Zelle bezüglich der Öffnung der Stomata beeinflussen.

So können die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte und insbeson­ dere Expressionskassetten zur schließzellenspezifischen oder schließzelladditiven Expression von Genen, die die Regulation von Gasaustausch und Transpiration verändern, verwendet werden. An der Regulation der Transpiration sind drei Sensorsysteme beteilgt: Sensoren zur Messung der Kohlendioxidkonzentration, Phytohormonsensoren und ein Messystem für Turgorgradienten zwi­ schen Schließzellen und angrenzenden Epidermiszellen. Turgorän­ derungen sind beispielsweise durch Beeinflussung der Aktivität von Enzymen oder Transportsystemen des Kohlenhydratmetabolismus möglich. Neben einer direkten Veränderung der Konzentration os­ motisch aktiver Kohlenhydrate, z. B. mittels cytosolischer oder vakuolärer Invertasen oder des chloroplastidären Triosephosphat­ translokators, sind Konsequenzen für die Osmoregulation zu er­ warten durch eine Anreicherung oder Reduktion von Vorläufern os­ motisch aktiver Substanzen. Beispielsweise kann mit einer Modi­ fikation der ADP-Glucose-Pyrophosphorylaseaktivität die Stärke­ synthese beeinflußt und so die Menge an Substraten für Glykolyse und Citratzyklus verändert werden, wodurch letztlich die Konzen­ tration von Malat, einer bezüglich des Zellturgors besonders wichtigen Substanz, betroffen wird. Eine Steigerung der apopla­ stischen Invertaseaktivität bei Schließzellen könnte über eine vermehrte Aufnahme von Hexosen die Stärkekonzentration erhöhen. Ein derartiger Eingriff muß schließzellenspezifisch erfolgen, da eine Erhöhung apoplastischer Invertaseaktivität in den stark photosyntheseaktiven Mesophyllzellen zu einer Reduktion des As­ similattransports und damit zu einer hohen osmotische Belastung des Gewebes führen würde (v. Schaewen et al. (1990), EMBO J. 9: 3033-3044). Ferner kann an die Steigerung der Expression einer Phosphoenolpyruvatcarboxylase oder die Expression einer verän­ derten Phosphoenolpyruvatcarboxylase gedacht werden. Das Enzym katalysiert die Reaktion von Phosphoenolpyruvat zu Oxalacetat, das wiederum ein Vorläufer für Malat ist. Außerdem können Proto­ nenpumpen (Protonen-ATPasen), die über die Bereitstellung elek­ trochemischer Gradienten Ionentransportprozesse ermöglichen, zu einer Veränderung des osmotischen Potentials beitragen.

Weitere Einflußmöglichkeiten ergeben sich bei der Aktivität der Carbonat-Dehydratase, die das Gleichgewicht zwischen gelö­ stem Kohlendioxid und Carbonat einstellt und insofern die zellu­ läre Kohlendioxidkonzentration beeinflußt, aber beispielsweise auch bei der Fructosebisphosghatase, die als Enzym aus dem rege­ nerativen Abschnitt des Calvinzyklus an der Fixierung des Koh­ lendioxids beteiligt ist.

Die erfindungsgemäßen Konstrukte und insbesondere Expressi­ onskassetten lassen sich auch zur schließzellenspezifischen Ex­ pression von Genen nutzen, die den Phytohormonspiegel von Pflan­ zen regulieren, also eine lokale Änderung des Phytohormonspiel­ gels bewirken.

Lokale Änderungen des Phytohormonspiegels sind zur Beein­ flussung der Eigenschaften von Schließzellen besonders interes­ sant: während z. B. Auxine ein Öffnen der Spalte bewirken, führt eine Applikation von Abscisinsäure zu einem raschen Spalten­ schluß. Zahlreiche Gene, deren Produkte in den Hormonhaushalt eingreifen, sind bereits kloniert worden (vgl. u. a. Klee, H. & Estelle, M. (1991) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 529-551). Die Gene 1 und 2 der T-DNA von Agrobacterium tume­ faciens kodieren für Auxinsynthese-Enzyme, während die Indolace­ tat-Lysin-Synthetase (Romano et al. (1991) Genes & Development 5: 438-446) die Inaktivierung von Auxinen katalysiert. Cytokini­ ne werden durch eine vom rol c-Gen der T-DNA von Agrobacterium rhizogenes kodierte Glucosidase freigesetzt (Estruch et al. (1991) EMBO J. 10: 3125-3128); das Genprodukt des T-DNA-Gens 6b von A. tumefaciens reduziert Cytokininaktivität (Spanier et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 219: 209-216). Die Ethylenproduktion kann in Pflanzen durch Expression der Aminocyclopropancarboxy­ lat-Synthase angeregt werden (Huang et al. (1991) Proc. Nat. Acad. Science 88: 7021-7025); eine Inhibition der Aminocyclopro­ pancarboxylat-Oxidase durch Expression von antisense-RNA senkt dagegen die Ethylenfreisetzung.

Wegen der weitreichenden Konsequenzen der Hormonwirkungen für die Pflanze ist eine Beeinflussung der Schließzellentätig­ keit auf dem beschriebenen Weg nur durch Verwendung der erfin­ dungsgemäßen DNA-Konstrukte und Expressionsvektoren für eine schließzellenspezifische Genexpression durchführbar.

Darüber hinaus kann eine Veränderung stomatärer Eigenschaf­ ten auch durch Modulation von regulatorischen Komponenten in den Schließzellen bewirkt werden. Als regulatorische Komponenten kommen unter anderem in Frage: Transkripbionsfaktoren, Protein­ kinasen und Proteinphosphatasen, Farnesyltransferasen, Enzyme des Phosphatidylinositol-Stoffwechsels, Enzyme des Stoffwechsels von cyclischer ADP-Ribose oder Proteine, deren Aktivität und Spezifität durch Calcium reguliert wird, beispielsweise Protei­ ne, die EF-Hände oder C₂-Domänen tragen. Eine Modulation und insbesondere eine Veränderung der Konzentration von regulatori­ schen Komponenten in den Schließzellen ermöglicht die Verände­ rung komplex vererbter Eigenschaften. So gelang kürzlich durch konstitutive Überexpression des Transkriptionsaktivators CBF1 in transgenen Arabidopsis-Pflanzen die Erzeugung von Pflanzen mit einer erhöhten Kältetoleranz. Arabidopsis-Pflanzen, die CBF1 verstärkt exprimieren, zeigen eine gegenüber unveränderten Pflanzen verstärkte Transkription von mehreren, durch CBF regu­ lierten Genen (Jaglo-Ottosen et al., 1998). Mittels der erfin­ dungsgemäßen rekombinanten Promotoren kann eine verstärkte Ex­ pression von CBF1 in Schließzellen von Pflanzen bewirkt werden. Die vorstehend erläuterten gezielten Veränderungen stomatä­ rer Eigenschaften, die aufgrund der vorliegenden Erfindung er­ möglicht werden, sind nicht allein für Wildtyp-Pflanzen, sondern ebenso auch für Pflanzen, die bereits hinsichtlich anderer Para­ meter gentechnisch oder durch klassische Mutation verändert wur­ den, von Bedeutung. Diese anderen Mutationsveränderungen können unter anderem Veränderungen des Stoffwechsels der Pflanze be­ treffen, beispielsweise solche Veränderungen, die zu einer ver­ minderten oder verstärkten Synthese gasförmiger Substanzen bzw. ihrer Vorläufersubstanzen führen. Eine modifizierte Transpirati­ on (Wasserabgabe in Form von Wasserdampf) einer resultierenden transgenen Pflanze kann z. B. durch Kombination einer veränderten stomatären Öffnung mit einer geeignet modifizierten Wassertrans­ portfähigkeit über das Xylem erreicht werden. So ließe sich für eine gesteigerte Wasserabgabe eine gesteigerte stomatäre Öffnung mit einer verbesserten Xylem-Wassertransportfähigkeit koppeln. Eine gesteigerte Trockentoleranz von Pflanzen könnte beispiels­ weise durch eine verringerte stomatäre Öffnung mit tiefer in das Erdreich hinabreichenden Wurzeln kombiniert werden. Veränderte Xylem- oder Wurzelparameter könnten das Ergebnis einer derarti­ gen weiteren gentechnischen Modifikation sein.

Mittels der erfindungsgemäßen rekombinanten schließzellspe­ zifischen Promotoren und der diese umfassenden Konstrukte kann es aber auch durch Expression geeigneter, in die Schließzellen erstmalig eingeführter Reportergene ermöglicht werden, den Sta­ tus zellulärer Konzentrationen an Ionen oder Metaboliten zu be­ stimmen, also Informationen über zelluläre Bedingungen innerhalb von Schließzellen zu erhalten. Als Beispiel für ein Reportergen, das eine Bestimmung der zellulären Konzentration an Ionen oder Metaboliten ermöglicht, sei Äquorin genannt, welches Informatio­ nen über die Gehalte an Calciumionen in einer Zelle liefert. Derartige Konstrukte können dementsprechend beispielsweise zur Bestimmung zellulärer Konzentrationen an Ionen oder Metaboliten in Schließzellen von Pflanzen unter bestimmten Umwelt- oder Streßbedingungen, wie Trockenstreß oder Pathogenbefall, genutzt werden.

Ein weiterer Anwendungsbereich der erfindungsgemäßen rekom­ binanten schließzellspezifischen Promotoren und der diese umfas­ senden Konstrukte liegt in der schließzellspezifischen Expressi­ on weiterer Proteine, wie Antikörper, oder von Ribozymen, die ggf. über ihre unmittelbare Wirkung innerhalb der Schließzellen indirekt auch Einfluß auf die Spaltöffnungscharakteristiken der Schließzellen ausüben können.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit für die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte besteht in einem Einsatz eines derartigen DNA- Konstrukts, in welchem der kodierende Nukleinsäureabschnitt ein Reporterprotein kodiert, in einem Verfahren zur Erzeugung von schließzellspezifischen Promotoren mit einer gegenüber dem in dem Konstrukt enthaltenen Promotor veränderten Aktivität in Schließzellen durch Mutation.

Bei einer Ausführungsweise eines solchen Verfahrens werden in ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt in vitro Mutationen ein­ geführt, welche die Schließzellspezifität möglichst bewahren, jedoch die Expressionsstärke des in dem DNA-Konstrukt enthalte­ nen. Promotors verändern sollen. Um die Aufrechterhaltung der Schließzellspezifität sicherzustellen, wird insbesondere dafür Sorge getragen werden, daß die Nukleinsäuresequenzmotive der Kernelemente TAAAG und/oder AAAAG bzw. der Kernelemente mit zu den genannten Sequenzen komplementärer Nukleinsäuresequenz durch die Mutation nicht verändert werden bzw. daß deren Anzahl in dem Promotor zumindest nicht verringert wird. Es ist anzunehmen, daß insbesondere die die genannten Kernelemente flankierenden Se­ quenzen innerhalb der erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte durch Mu­ tation (Austausch/Insertion/Deletion einzelner Nukleotide oder kleinerer Gruppen von Nukleotiden) so verändert werden können, daß die resultierenden Konstrukte insbesondere eine stärkere Ex­ pression von in diesen Konstrukten enthaltenen kodierenden Se­ quenzen ermöglichen. Dabei kann in diesen durch Mutation abge­ leiteten Konstrukten das mutierte cis-aktive Element als Einzel­ element, gegebenenfalls aber auch in mehreren Kopien, d. h. als Multimer vorliegen. Abgesehen von einem Nachweis einer verstärk­ ten Genexpression durch die mutierten DNA-Konstrukte in Pflan­ zen, wofür als kodierende Sequenzen in den mutierten DNA-Kon­ strukten bevorzugt Gene für geeignete Reporterproteine, z. B. GUS, Luciferase, GFP ("green fluorescence protein"), konditional lethale Genprodukte, eingesetzt werden, kann auch älternativ nach Klonierung der Transkriptionsfaktoren, die an das in dem unmutierten Ausgangskonstrukt enthaltene erfindungsgemäße cis­ aktive Element binden, in vitro anhand der mutierten DNA- Konstrukte nach der optimalen Bindungsstelle gesucht werden. Ein cis-aktives Element, das in diesem in vitro-Test eine verbesser­ te, d. h. stärkere Bindung der dafür spezifischen Transkriptions­ faktoren bewirkt, sollte auch in vivo eine verstärkte Aktivität und folglich eine verstärkte Genexpression über den dieses cis­ aktive Element umfassenden Promotor vermitteln.

Alternativ kann auch eine Pflanze mit einem erfindungsgemä­ ßen DNA-Konstrukt, in welchem der kodierende Nukleinsäureab­ schnitt ein Reporterprotein kodiert, transformiert werden und eine derart hergestellte transgene Pflanzenlinie einer Mutagene­ se, z. B. durch chemische Reagenzien, wie EMS, hochenergetische Strahlung oder mittels einer T-DNA- oder Transposon-Insertion, unterzogen werden. Die resultierenden Mutanten können anschlie­ ßend auf eine Veränderung der Expressionsstärke des Reporterpro­ teins analysiert werden. Die Veränderung in der Expressionsstär­ ke kann dabei auf eine Mutation des erfindungsgemäßen, Schließ­ zellspezifität vermittelnden cis-Elements selbst oder aber auch auf eine Mutation des an dieses cis-Element bindenden Transkrip­ tionsfaktors oder mehrerer solcher Faktoren zurückzuführen sein. Zusätzlich kann die für die Veränderung der Expressionsstärke verantwortliche Mutation in weiteren, in dem Promotor vorhande­ nen cis-Elementen liegen oder in Transkriptionsfaktoren und/oder weiteren Faktoren, die spezifisch an diese cis-Elemente binden. Darüber hinaus kann eine relevante Mutation beispielsweise auch im Promotorbereich der Gene für die Transkriptionsfaktoren oder die weiteren bindenden Faktoren liegen, die zu einer veränderten Transkription dieser Gene und damit zu einer höheren oder nied­ rigeren Konzentration dieser Transkriptionsfaktoren und weiteren Faktoren in der Zelle führt. Die relevanten Mutationen innerhalb des in dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt enthaltenen Promotor­ bereichs, die hier von besonderem Interesse sind, sind bei­ spielsweise durch Sequenzierung leicht ermittelbar.

Ein zusätzlicher Anwendungsbereich der erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte liegt in der Verwendung eines DNA-Konstrukts, in welchem der durch den erfindungsgemäßen Promotor kontrollierte kodierende Nukleinsäureabschnitt ein Reporterprotein kodiert, in einem Verfahren zum Nachweis des Vorliegens von Mutanten im Signalling-Pathway für Schließzellspezifität in einer Schließ­ zelle nach Mutation einer Ausgangszelle, die das DNA-Konstrukt umfaßt, oder einer Pflanze oder eines Pflanzenteils, deren bzw. dessen Zellen das DNA-Konstrukt umfassen, und gegebenenfalls zur Identifizierung einer für eine Veränderung des Signalling- Pathway für Schließzellspezifität verantwortlichen Mutation.

Hierfür wird zunächst durch Transformation oder Transfektion mit einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt, in welchem der durch den erfindungsgemäßen Promotor kontrollierte kodierende Nuklein­ säureabschnitt ein Reporterprotein kodiert, eine transformierte Schließzelle, eine transgene Pflanze oder ein transgener Pflan­ zenteil, die, wie nachfolgend detaillierter erläutert werden wird, ebenfalls Gegenstände der Erfindung sind, hergestellt. In der transformierten Schließzelle oder der transgenen Pflanze oder dem transgenen Pflanzenteil wird dann die schließzellspezi­ fische oder schließzelladditive Expression des Reportergens nachgewiesen. Diese biologischen Ausgangssysteme werden dann ei­ ner Mutation, z. B. mittels chemischer Substanzen, wie EMS, ener­ giereicher Strahlung, wie Röntgenstrahlung, oder T-DNA- oder Transposon-Insertion unterworfen. Die erhaltenen mutierten Zel­ len, Pflanzen oder Pflanzenteile werden dann hinsichtlich der Expressionsstärke und der Zellspezifität der Expression des Re­ portergens untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse werden mit je­ nen der Ausgangszellen, Pflanzen oder Pflanzenteile vor der Mu­ tation verglichen. Eine Veränderung, d. h. Erhöhung oder Verrin­ gerung der Expressionsstärke des Reportergens und/oder eine Ver­ änderung der Zellspezifität der Expression des Reportergens, d. h. ein Verlust der Expression des Reportergens in Schließzel­ len, der ggf. auch mit einer erstmalig nach der Mutation auftre­ tenden Expression des Reportergens in einem anderen Pflanzen­ zelltyp oder Pflanzengewebe verbunden sein kann, ermöglichen ei­ ne erste Aussage dahingehend, daß die mutierten Zellen, Pflanzen oder Pflanzenteile potentiell Mutanten im Signalling-Pathway für Schließzellspezifität darstellen könnten.

Als Komponenten des Signalling-Pathways für Schließzellspe­ zifität, deren Veränderung durch Mutation zu den genannten Ver­ änderungen der Expressionsstärke und/oder der Zellspezifität der Expression des Reportergens führen kann, sind alle zellulären Elemente zu nennen, die an der Vermittlung der Schließzellspezi­ fität der Genexpression beteiligt sind, d. h. beispielsweise das spezielle cis-aktive Element selbst und die an dieses cis-aktive Element bindenden Transkriptionsfaktoren, aber auch die Promo­ torbereiche der Gene dieser Transkriptionsfaktoren. Stellt man lediglich eine Veränderung der Expressionsstärke der schließ­ zellspezifischen Expression des Reportergens fest, muß zunächst ausgeschlossen werden, daß diese auf Mutationen von Komponenten des in dem DNA-Konstrukt enthaltenen Promotors/Reportergens zu­ rückzuführen sind, die für die Schließzellspezifität der Genex­ pression nicht relevant sind. Dies kann z. B. durch Sequenzierung des Promotor- und ggf. auch Reportergenbereichs und/oder insbe­ sondere auch durch geeignete Rückkreuzung leicht nachgewiesen werden. Auf diese Weise, d. h. durch Sequenzierung kann auch eine Modifizierung/Mutation des für die Schließzellspezifität verant­ wortlichen cis-aktiven Elements, die bei dem hier beschriebenen Verfahren von zentralem Interesse ist, leicht ermittelt werden. Die Ermittlung weiterer am Signalling-Pathway für Schließzell­ spezifität beteiligter Komponenten, die ggf. durch Mutation ver­ ändert sind und dadurch die Expressionsstärke und/oder Zellspe­ zifität der Expression des Reportgergens gegenüber einem nicht­ mutierten Ausgangssystem verändern, kann mittels dem Fachmann bekannter Methoden, wie "chromosomal walking" oder Reklonierung von T-DNA- oder Transposon-getaggter Gene, erfolgen.

Ein weiterer Anwendungsbereich von erfindungsgemäßen DNA- Konstrukten, in welchen der kodierende Nukleinsäureabschnitt ein Reporterprotein kodiert, liegt in deren Verwendung in einem Ver­ fahren zur Identifizierung von chemischen Verbindungen, die den Signalling-Pathway für Schließzellspezifität in einer Schließ­ zelle beeinflussen. In einem derartigen Verfahren werden wieder transgene Pflanzen oder Pflanzenteile, die ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten, mit zu testenden chemischen Verbindun­ gen, z. B. Herbiziden, behandelt und daraufhin hinsichtlich der Expressionsstärke und der Zellspezifität der Expression des Re­ portergens untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse werden mit je­ nen, die bei einer entsprechenden Untersuchung der Pflanzen bzw. Pflanzenteile vor der Behandlung mit den chemischen Substanzen erhalten worden sind, verglichen. Eine Veränderung, d. h. Erhö­ hung oder Verringerung der Expressionsstärke des Reportergens und/oder eine Veränderung der Zellspezifität der Expression des Reportergens, d. h. ein Verlust der Schließzellspezifität der Re­ portergenexpression, ermöglichen wieder einen Rückschluß auf ei­ ne potentielle Beeinflussung des Signalling-Pathway für Schließ­ zellspezifität durch die chemische Substanz.

Bezüglich der möglicherweise durch die chemische Substanz beeinflußten Komponenten des Signalling-Pathway für Schließzell­ spezifität wird auf die vorstehenden Ausführungen verwiesen. Für eine endgültige Klärung der Wirkung der chemischen Ver­ bindung muß auch hier in einem weiteren Schritt ausgeschlossen werden, daß die für die Veränderungen im Signalling-Pathway für Schließzellspezifität verantwortliche(n) Wechselwirkung(en) der chemischen Verbindung nicht mit Komponenten des in dem DNA- Konstrukt enthaltenen Promotors und Reportergens, die für die Schließzellspezifität der Genexpression nicht relevant sind, er­ folgt bzw. erfolgen.

Bei dem genannten Verfahren kann die chemische Verbindung auch in Form von Zusammensetzungen von zwei oder mehr chemischen Verbindungen, in flüssiger, fester oder gegebenenfalls auch gas­ förmiger Form für die Untersuchung eingesetzt werden.

Das Verfahren eignet sich insbesondere für ein Screening ei­ ner Vielzahl von zu testenden Substanzen, die beispielsweise in Form einer Substanzbibliothek ("synthetic combinatorial library"), wie beispielsweise in EP 0 734 530, EP 0 816 309 und EP 0 818 431 beschrieben, bereitgestellt werden können. Auf diese Weise können z. B. neue Herbizidtargets identifiziert wer­ den.

Darüber hinaus finden spezielle erfindungsgemäße DNA- Konstrukte, in welchen der kodierende Nukleinsäureabschnitt ein Reporterprotein kodiert, das es erlaubt, den Status zellulärer Konzentrationen an bestimmten Ionen oder Metaboliten zu bestim­ men, Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis des Vorliegens von Mutanten in dem Signalling-Pathway für die Erzeugung und/oder die Regulierung der intrazellulären Konzentration die­ ser Ionen oder Metabolite in einer Schließzelle nach einer Muta­ tion einer Ausgangszelle, die das DNA-Konstrukt umfaßt, oder ei­ ner Pflanze oder eines Pflanzenteils, deren bzw. dessen Zellen das DNA-Konstrukt umfassen, und gegebenenfalls zur Identifizie­ rung einer für eine Veränderung dieses Signalling-Pathway ver­ antwortlichen Mutation.

Wie bei dem unmittelbar vorangehenden Verfahren werden hier­ für durch ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt transformierte Schließzellen, transgene Pflanzen oder transgene Pflanzenteile hergestellt. Bei dem vorliegenden Verfahren kodiert der in dem für die Transformation verwendeten DNA-Konstrukt enthaltene ko­ dierende Bereich ein spezielles Reporterprotein, das es erlaubt, den Status zellulärer Konzentrationen an bestimmten Ionen oder Metaboliten zu bestimmen. Ein Beispiel für ein solches speziel­ les Reporterprotein ist Äquorin, das Informationen über den Calciumgehalt in einer Zelle liefert. In der transformierten Schließzelle, der transgenen Pflanze oder dem transgenen Pflan­ zenteil wird dann die Konzentration an dem oder den bestimmten Ion(en) oder Metabolit(en) mittels des schließzellspezifisch oder schließzelladditiv exprimierten Reporterproteins - in der Regel in Schließzellen - bestimmt. Die biologischen Ausgangssy­ steme werden dann, wie vorstehend beschrieben, einer Mutagenese unterworfen. In den erhaltenen mutierten Zellen, Pflanzen oder Pflanzenteile wird nun erneut die Konzentration an dem oder den bestimmten Ion(en) oder Metabolit(en) mittels des Reporterpro­ teins bestimmt und die erhaltenen Ergebnisse werden mit jenen der Ausgangszellen, Pflanzen oder Pflanzenteile vor der Mutation verglichen. Eine Veränderung, d. h. Erhöhung oder Verringerung der mittels des Reporterproteins bestimmten Ionen- oder Metabo­ litenkonzentration ermöglicht eine erste Aussage dahingehend, daß die mutierten Zellen, Pflanzen oder Pflanzenteile potentiell Mutanten im Signalling-Pathway für die Erzeugung und/oder die Regulierung der intrazellulären Konzentration dieser Ionen oder Metabolite darstellen könnten.

Um diese Vermutung zu bestätigen, muß jedoch in diesem Falle eine durch Mutation erfolgte Veränderung innerhalb des Si­ gnalling-Pathway für Schließzellspezifität, d. h. u. a. des Promo­ torabschnitts des DNA-Konstrukts, des bzw. der daran bindenden Transkriptionsfaktoren wie der Promotorabschnitte der diese ko­ dierenden Gene, ausgeschlossen werden. Geeignete Maßnahmen hier­ zu wurden vorstehend beschrieben oder sind dem Fachmann bekannt. Kann dies ausgeschlossen werden, kann die Ermittlung der am Si­ gnalling-Pathway für die Erzeugung und/oder die Regulierung der intrazellulären Konzentration dieser Ionen oder Metabolite be­ teiligten Komponenten, die durch Mutation verändert worden sind und dadurch zu einer veränderten Konzentration an dem oder den bestimmten Ion(en) oder Metabolit(en) gegenüber einem nicht­ mutierten Ausgangssystem führen, wieder mittels dem Fachmann be­ kannter Methoden, wie "chromosomal walking" oder Reklonierung von T-DNA- oder Transposon-getaggter Gene, erfolgen.

Erfindungsgemäße DNA-Konstrukte, in welchen der kodierende Nukleinsäureabschnitt ein Reporterprotein kodiert, das es er­ laubt, den Status zellulärer Konzentrationen an bestimmten Ionen oder Metaboliten zu bestimmen, finden darüber hinaus auch Ver­ wendung in einem Verfahren zur Identifizierung von chemischen Substanzen, die den Status zellulärer Konzentrationen an diesen Ionen oder Metaboliten verändern. In einem solchen Verfahren werden transgene Pflanzen und Pflanzenteile, die die erfindungs­ gemäßen DNA-Konstrukte enthalten, mit zu testenden chemischen Verbindungen, z. B. Herbiziden, behandelt, danach die Konzentra­ tion an dem bzw. den bestimmten Ion(en) oder Metabolit(en) in den Schließzellen der Pflanzen oder Pflanzenteile mittels des Reporterproteins bestimmt und die erhaltenen Ergebnisse mit ent­ sprechenden Ergebnissen, die von den Pflanzen oder Pflanzentei­ len vor der Behandlung mit den chemischen Verbindungen erhalten worden sind, verglichen. Wird eine Veränderung der Ionen- oder Metabolitenkonzentration nach Chemikalienbehandlung festge­ stellt, muß für eine endgültige Klärung jedoch noch ausgeschlos­ sen werden, daß für die gemessene Konzentrationsveränderung eine Wechselwirkung der zu testenden chemischen Verbindung mit dem DNA-Konstrukt und insbesondere mit dem darin enthaltenen Promo­ torbereich, der die Expression des Reporterproteins, mittels dessen die Ionen- oder Metabolitenkonzentration bestimmt wird, steuert, verantwortlich ist. Geeignete Maßnahmen hierzu sind dem Fachmann bekannt.

Die zu untersuchende chemische Verbindung kann dabei auch in Form von Zusammensetzungen von zwei oder mehreren chemischen Verbindungen, in flüssiger, halbflüssiger, fester oder gegebe­ nenfalls auch gasförmiger Form für die Untersuchung eingesetzt werden.

Das Verfahren eignet sich insbesondere für ein Screening ei­ ner Vielzahl von zu testenden Substanzen, die beispielsweise in Form einer Substanzbibliothek ("synthetic combinatorial library"), wie beispielsweise in EP 0 734 530, EP 0 816 309 und EP 0 818 431 beschrieben, bereitgestellt werden können. Auf diese Weise können z. B. neue Herbizidtargets identifiziert wer­ den.

Erfindungsgemäße DNA-Konstrukte, in welchen der kodierende Nukleinsäureabschnitt ein Reporterprotein kodiert, das es er­ laubt, den Status zellulärer Konzentrationen an bestimmten Ionen oder Metaboliten zu bestimmen, finden des weiteren auch Verwen­ dung in einem Verfahren zur Untersuchung einer Beeinflussung des Status zellulärer Konzentrationen an diesen Ionen oder Metaboli­ ten durch Umwelteinflüsse, wie Trockenstreß oder Pathogenbefall. In einem solchen Verfahren werden transgene Pflanzen und Pflan­ zenteile, die die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte enthalten, dem zu untersuchenden Umwelteinfluß unterworfen und danach die Konzentration an dem bzw. den bestimmten Ion(en) oder Metabo­ lit(en) in den Schließzellen der Pflanzen oder Pflanzenteile mittels des Reporterproteins bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse werden wieder mit entsprechenden Ergebnissen, die von den Pflan­ zen oder Pflanzenteilen vor Einwirkung des Umwelteinflusses er­ halten worden sind, verglichen. Wird eine Veränderung der Ionen- oder Metabolitenkonzentration nach Einwirkung des Umwelteinflus­ ses festgestellt, sollte auch hier für eine endgültige Klärung ausgeschlossen werden, daß für die gemessene Konzentrationsver­ änderung das möglicherweise aufgrund des Umwelteinflusses in seiner Aktivität veränderte DNA-Konstrukt und insbesondere der darin enthaltene Promotorbereich, der die Expression des Repor­ terproteins, mittels dessen die Ionen- oder Metabolitenkonzen­ tration bestimmt wird, steuert, verantwortlich ist. Auch hierfür sind dem Fachmann geeignete Maßnahmen bekannt.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch Vektoren, Plasmi­ de, Cosmide, Bacmide, Virus- und Phagengenome, die ein erfin­ dungsgemäßes DNA-Konstrukt, wie es vorstehend erläutert wurde, integriert in deren Nukleinsäuremoleküle enthalten sowie trans­ formierte Mikroorganismen, die mit einem erfindungsgemäßen DNA- Konstrukt transformiert wurden. Bezüglich der Ausgangsvektoren, -plasmide, -cosmide, -bacmide, -virus- oder -phagengenome, in die ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt zur Erzeugung der erfin­ dungsgemäßen Vektoren, Plasmide, Cosmide, Bacmide, Virus- oder Phagengenome integriert wird, gibt es keinerlei Beschränkung. Unter dem Begriff "Mikroorganismus" versteht man in dem vorlie­ genden Zusammenhang u. a. Bakterien, Bakteriophagen, Viren wie auch eukaryotische Organismen und Zellen, wie Pilze, Hefen, Pro­ tozoen, Algen und menschliche, tierische und pflanzliche Zellen. Eine Vielzahl von Techniken und Methoden zur Ausführung der erfindungsgemäßen Verfahren und allgemein zur Herstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten Promotoren und Konstrukte ausge­ hend von einem Ausgangspromotor oder -promotorelementen, wie zur Klonierung, Transformation von Mikroorganismen, DNA-Präparation und -analyse, sind dem Fachmann wohlbekannt und können bei­ spielsweise aus Standardwerken, wie Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour New York, USA, und einer unübersehbaren Anzahl von in den ein­ schlägigen Fachzeitschriften veröffentlichten Einzelprotokollen entnommen werden. Ebenso sind für die Ausführung dieser Techni­ ken und Methoden benötigte Reagenzien, wie Puffer, Vektoren und ähnliche Trägersysteme für Fremd-DNA, wie Plasmide, die insbe­ sondere zusätzlich sogenannte Markergene zum Nachweis einer er­ folgreichen Transformation eines Wirtsorganismus mit diesem Trä­ gersystem umfassen, Wirtsorganismen, wie Viren, Bakterien, He­ fen, Pilze oder auch eukaryotische Zellen dem Fachmann bekannt und für diesen aus einer Vielzahl von Quellen verfügbar oder können selbst anhand von allgemein verfügbaren und etablierten Protokollen hergestellt werden. Gleiches gilt für die Herstel­ lung oder Erzeugung der erfindungsgemäßen Vektoren, Plasmide, Cosmide, Virus- oder Phagengenome sowie transformierten Mikroor­ ganismen.

Ferner betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, Pflanzen­ teile, Pflanzenzellen oder Samen, die ein erfindungsgemäßes DNA- Konstrukt enthalten. Dabei kann das DNA-Konstrukt in das Chromo­ som der Wirtspflanze oder Wirtspflanzenzelle integriert oder ex­ trachromosomal vorliegen. Die Begriffe "Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzenzellen" umfassen jegliches Vermehrungsmaterial von Pflanzen, wie Pflanzenprotoplasten, Pflanzenzellen, Pflan­ zengewebe, z. B. Kallusgewebe, sich entwickelnde Pflänzchen, Blätter, unreife ganze Pflanzen und reife ganze Pflanzen. Er­ findungsgemäße Pflanzen umfassen alle monokotylen und dicotylen Pflanzen, und insbesondere Nutz- und Kulturpflanzen, wie Kartof­ fel, Tabak, Tomate, Zuckerrübe oder Baumwolle, landwirtschaftli­ che Hilfspflanzen, Bäume und Sträucher, sowie Zierpflanzen.

Für die Erzeugung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen, Pflanzenteile und Samen kommen nicht nur Wildtyp-Pflanzen, son­ dern ebenso auch Pflanzen, die bereits hinsichtlich anderer Pa­ rameter gentechnisch oder durch klassische Mutation verändert wurden, in Betracht. Diese anderen Mutationsveränderungen können unter anderem Veränderungen des Stoffwechsels der Pflanze be­ treffen, beispielsweise solche Veränderungen, die zu einer ver­ minderten oder verstärkten Synthese gasförmiger Substanzen bzw. ihrer Vorläufersubstanzen führen. Eine verringerte Transpiration (Wasserabgabe in Form von Wasserdampf) einer resultierenden transgenen Pflanze kann z. B. durch Kombination einer verringer­ ten stomatären Öffnung mit einer verringerten Wassertransportfä­ higkeit über das Xylem erreicht werden. Für eine gesteigerte Wasserabgabe ließe sich eine gesteigerte stomatäre Öffnung mit einer verbesserten Xylem-Wassertransportfähigkeit koppeln. Eine gesteigerte Trockentoleranz von Pflanzen könnte durch eine ver­ ringerte stomatäre Öffnung mit tiefer in das Erdreich hinabrei­ chenden Wurzeln kombiniert werden. Veränderte Xylem- oder Wur­ zelparameter könnten das Ergebnis einer derartigen weiteren gen­ technischen Modifikation sein.

Zur Herstellung transgener Pflanzen sind verschiedene Techni­ ken und Methoden zur Klonierung der entsprechenden DNA-Konstruk­ te, zur Konstruktion geeigneter Transformationsvektoren und zur Einschleusung der in dem Vektor enthaltenen genetischen Informa­ tion in eine Pflanzenzelle dem Fachmann bekannt. Die Techniken zum Einschleusen von genetischer Information in eine Pflanzen­ zelle umfassen einen direkten DNA-Transfer (z. B. in Protoplasten mittels Elektroporation oder durch Anwendung eines osmotischen Mittels hohen Molekulargewichts wie auch biolistische Methoden, bei denen mit DNA beschichtete Teilchen in Pflanzengewebe ge­ schossen werden) wie auch die Verwendung von natürlichen Wirt/Vektor-Systemen (z. B. von Agrobakterien oder Pflanzen­ viren). Für eine dauerhafte extrachromosomale Lokalisierung und Aufrechterhaltung der DNA-Konstrukte können verschiedene spezi­ fische Viren, wie das Tabakmosaikvirus (TMV) oder Kartoffel- Virus X, in deren Genom die DNA-Konstrukte in diesem Falle in­ sertiert werden, eingesetzt werden.

Die Erfindung umfaßt ferner einen Kit insbesondere zur Ver­ wendung in einem der vorstehend erläuterten erfindungsgemäßen Verfahren, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß er ein erfin­ dungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen erfindungsgemäßen Vektor oder ein erfindungsgemäßes Plasmid, Cosmid, Bacmid, Virus- oder Phagengenom umfaßt. Der Kit kann darüber hinaus geeignete Puffer und weitere Reagenzien sowie Enzyme zur Manipulation des Kon­ strukts oder des Vektor- oder andersartigen Trägersystems, wie auch, bei einem DNA-Konstrukt ohne bereits eingefügte kodierende Sequenz, Reagenzien zur Einklonierung eines vom Verwender zu be­ stimmenden Gens umfassen. Darüber hinaus kann der Kit zusätzlich zu dem DNA-Konstrukt auch ein Trägersystem, wie einen Vektor und die weiteren vorstehend ausgeführten Systeme, für eine Integra­ tion des DNA-Konstrukts sowie ggf. auch Wirtsmikroorganismen zur Aufnahme und etwaigen Weitergabe des Trägersystems mit dem DNA- Konstrukt umfassen. Als Beispiele können hier das Ti-Plasmid und Agrobacterium tumefaciens-Wirtsorganismen genannt werden, die zur Transformation von Pflanzen eingesetzt werden können. Diese zusätzlichen Reagenzien und Organismen können separat oder auch in Form von Kombination bestimmter Komponenten in dem Kit vorge­ sehen werden.

Weiterhin ermöglicht die Identifizierung der für eine schließzellspezifische Expression essenziellen Sequenzmotive TAAAG bzw. AAAAG bzw. dazu komplementären Sequenzmotive als Kennzeichen für eine derart zellspezifische Expression vermit­ telnde Elemente ein weiteres neuartiges Verfahren zur Identifi­ zierung von bisher nicht bekannten, in Schließzellen von Pflan­ zen exprimierten Genen. Dieses Verfahren greift auf bereits zur Verfügung stehende oder künftig gewonnene genomische DNA- Sequenzen 5'-regulatorischer Bereiche zurück und analysiert die­ se auf das Vorhandensein der identifizierten, für schließzell­ spezifische cis-Elemente charakteristischen Sequenzmotive TAAAG oder AAAAG und/oder der Sequenzmotive mit zu den angegebenen Nu­ kleinsäuresequenzen komplementärer Nukleinsäuresequenz. Dement­ sprechend umfaßt die Erfindung ferner ein Verfahren zur Identi­ fizierung von in Schließzellen von Pflanzen exprimierten Genen, bei welchem man durch Nukleinsäuresequenzierung von 5'- regulatorischen Bereichen von Genen gewonnene Nukleinsäurese­ quenzdaten auf das Vorhandensein mindestens eines der für ein regulatorisches, eine schließzellspezifische Genexpression ver­ mittelndes cis-aktives Element charakteristischen Nukleinsäure­ sequenzmotive TAAAG und/oder AAAAG und/oder der jeweils dazu komplementären Nukleinsäuresequenzmotive überprüft. Die Überprü­ fung kann computergestützt erfolgen, indem man sich Programmen für Sequenzhomologievergleiche bedient, oder kann auch persön­ lich durch einen Bearbeiter vorgenommen werden, der durch Nu­ kleinsäuresequenzierung erhaltene Sequenzen auf die genannten Nukleinsäuresequenzmotive durchsieht.

Bevorzugt erfolgt die Überprüfung auf das zwei- oder mehrfa­ che Vorhandensein der vorstehend angegebenen Nukleinsäurese­ quenzmotive innerhalb eines 5'-regulatorischen Bereichs.

Nach der Identifizierung eines Gens als potentiellen Kandi­ daten für eine schließzellspezifische Expression sollte dessen Promotorbereich dann auf Funktionalität und Zellspezifität durch Fusion des Promotorbereichs mit einem Reportergen und Nachweis einer schließzellspezifischen oder -additiven Expression des Re­ portergens nach stabiler oder transienter Transformation von Pflanzen bzw. Schließzellen mit dem Fusionskonstrukt getestet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit zur Vorselek­ tion von in Schließzellen aktiven Promotoren bzw. Genen einge­ setzt werden.

Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren und Beispiele, die die Erfindung lediglich veranschauli­ chen und nicht beschränken sollen, weiter beschrieben.

Beispiele

Ein für die schließzellspezifische Expression in Pflanzen wesentlicher Bereich sowie zwei darin enthaltene, für die schließzellspezifische Expression essenzielle Nukleinsäurese­ quenzmotive, die die Basis der hier beanspruchten Verfahren und Gegenstände bilden, konnten durch eine Deletionsanalyse des kstl-Promotors aus Kartoffel (Solanum tuberosum) identifiziert werden.

Nach Ermittlung eines für die schließzellspezifische Expres­ sion in Kartoffel wesentlichen Bereichs, welcher ca. 83 Nukleo­ tide, wie in SEQ. ID. NO. 1 gezeigt, umfaßt, wobei hiermit nicht ausgesagt werden soll, daß dieser Bereich nur in seiner Gesamt­ heit für eine schließzellspezifische Expression essenziell ist, wurden drei diesen Bereich repräsentierende, überlappende, dop­ pelsträngige Oligonukleotide (AB (Nukleotide 1-40), CD (Nukleotide 41-83) und EF (Nukleotide 23-62); SEQ. ID. NO. 2, 3 und 4; Fig. 2) konstruiert. Diese wurden jeweils tetrameri­ siert und an einen selbst in Schließzellen nicht aktiven Mini­ malpromotor (Δ35S), der innerhalb des Konstrukts mit einem Repor­ tergen (GUS) verknüpft war, fusioniert. Der 83 Nukleotide umfas­ sende Ausgangsbereich wurde gleichfalls in tetramerer Form in entsprechender Weise fusioniert ("83 nt"). Mit diesen Konstruk­ ten wurden mittels Agrobakterien Pflanzen stabil transformiert und die transgenen Pflanzen auf Reportergenaktivität (GUS- Aktivität) hin untersucht. Für das Tetramer des 83 Nukleotide umfassenden Ausgangsbereichs ("83 nt") wie für das Tetramer AB konnte eine starke, für die Tetramere CD und EF eine schwächere Expression in Schließzellen nachgewiesen werden (Fig. 1).

Die nicht überlappenden funktionalen Sequenzen AB und CD weisen beide das Sequenzmotiv TAAAG, die Sequenz CD zudem noch ein weiteres Element mit der Sequenz AAAAG auf (Fig. 2). Die funktionelle Bedeutung des TAAAG-Motivs wurde durch die Einfüh­ rung einer Blockmutation (CGCGA) an dieser Stelle im Kontext des Konstrukts AB × 4 (= AB-Tetramer) nachgewiesen. Diese Veränderung führte in zwei unabhängigen Experimenten (ABmut × 4 und ABmutN × 4) zu einer drastischen Abnahme der schließzellspezifischen Expres­ sion (Fig. 3). Als weiteren Vergleich wurde in Fig. 3 ein Tetra­ mer des 83 Nukleotide umfassenden Ausgangsbereichs ("90 × 4") auf­ genommen.

Die Funktionalität der Motive TAAAG und AAAAG wurde zudem auch im Kontext des auf 240 Nukleotide verkürzten Originalpromo­ tors (Kst240) nachgewiesen, dessen Nukleotidsequenz in Fig. 5 sowie in SEQ. ID. NO. 5 angegeben ist. Wie aus Fig. 5 zu ent­ nehmen ist, umfaßt er nahe des 5'-Endes den in SEQ. ID. NO. 1 angegebenen Bereich von 83 Nukleotiden, der sich für die Schließzellspezifität des Ausgangspromotors als wesentlich er­ wiesen hatte. Darüber hinaus umfaßt er im wesentlichen nur noch die mutmaßliche CCAAT-Box, die mutmaßliche TATA-Box sowie die Transkriptionsinitiationsstelle des Original- oder Ausgangspro­ motors kstl aus Solanum tuberosum. In Fig. 4 ist von dem Kst240-Promotor zur Veranschaulichung nur der hier relevante Be­ reich von Nukleotid 14 bis Nukleotid 60 aus dem in SEQ. ID. NO. 1 angegebenen Abschnitt von 83 Nukleotiden gezeigt. Die sequen­ tielle Mutation der Motive TAAAG und AAAAG zu der Sequenz CGCGA (Kst240mut1, Kst240mut2 und Kst240mut3) führt wiederum zu einer deutlichen Abnahme der schließzellspezifischen Aktivität (Fig. 4).

Beispiel 1 Klonierung des Promotorbereichs des kst1-Gens aus Kartoffel

Eine genomische Bibliothek der nukleären DNA einer monohaploiden Linie von Solanum tuberosum L. (Liu et al., 1991) wurde mit ei­ nem Sacl-Fragment der kstlcDNA (Müller-Röber et al., 1995) un­ ter stringenten Bedingungen durchmustert. Durch Restriktionsana­ lysen und stringente Hybridisierungen unter Verwendung von Tei­ len der kst1-cDNA als Sonde konnte gezeigt werden, daß der Klon L#7.5 ca. 4,5 kb Sequenz stromaufwärts vom kst1.-Startcodon ent­ hielt, der anschließend als SalI/SacI-Fragment in den ebenso ge­ schnittenen Vektor pBluescriptSKII (Stratagene) subkloniert wur­ de. Die Sequenz des kst1-Promotorbereichs wurde bis zur Position 1909 stromaufwärts vom Startcodon der kst1cDNA durch Sequenzie­ rung bestimmt (Ehrhardt, 1998).

Beispiel 2 Identifikation des für die schließzellspezifische Expression des kst1-Gens relevanten Promotorbereichs

Zur Analyse des regulatorischen Bereichs des kstl-Gens wurden zwei unterschiedlich lange Promotorfragmente transkriptionell mit dem β-Glucuronidase-Leseraster aus E.coli (Jefferson et al., 1987) fusioniert. An der Position des kstl-Startcodons wurde mittels PCR mit dem Primer KstPSmaI (5'-TTCCCCCGGGTATTATATATTGCTGCTTC) eine SmaI-Schnittstelle ein­ geführt (Konstrukt PVP2, Ehrhardt, 1998). Zur transkriptionellen Fusion an das β-Glucuronidase-Leseraster wurden ein 3 kb- BamHI/SmaI- sowie ein 1,5 kb-EcoRV/SmaI-Promotorbereich in den mit BamH/SmaI bzw. SmaI geschnittenen Vektor pBin 101.1 (Clontech) kloniert und die korrekte Orientierung durch Testver­ daue kontrolliert. Die so erhaltenen Konstrukte wurden mit pDKP1 (3kb Promotor) bzw. pDKP3 (1,5 kb Promotor) bezeichnet. Die Kon­ strukte wurden in den Agrobakterienstamm GV 2260 (Deblaere et al., 1985) transferiert, der dann zum Gentransfer auf Kartoffeln eingesetzt wurde. Transgene Kartoffelpflanzen wurden durch se­ lektive Regeneration auf Kanamycin-haltigem Medium erhalten. Für beide Konstrukte konnte in ca. 1/3 der Fälle eine Expression des Reportergens durch Nachweis der β-Glucuronidase-Aktivität (Umsatz des farblosen Substrats X-Gluc zu einem blauen Präzipitat) in Schließzellen nachgewiesen werden. Demnach sind die im Konstrukt pDKP3 enthaltenen 1,5 kb regulatorische Sequenz des kst1-Gens hinreichend für die Erzeugung von schließzellspezifischer Ex­ pression (Ehrhardt, 1998). Reportergenaktivtät zeigte sich in allen Schließzellen der Blattober- und -unterseite von Sink- und Source-Blättern sowie der Stengel durch Blaufärbung. Für dieses Konstrukt konnte eine vergleichbare Schließzellspezifität auch für Tabak und Arabidopsis nachgewiesen werden.

Beispiel 3 Eingrenzung der für die Schließzellspezifität relevanten regula­ torischen Bereiche durch eine Promotordeletionsanalyse

Durch eine schrittweise Deletionsanalyse unter Ausnutzung vor­ handener Restriktionsschnittstellen konnte der für die Schließ­ zellspezifität relevante Bereich innerhalb der 1,5 kb regulato­ rischer Sequenzen eingegrenzt werden (Fig. 1). Die Herstellung der Konstrukte pDKPl und pDKP3 wurde oben bereits beschrieben. Für das Konstrukt KstBclI900 wurde aus dem Konstrukt PVP2 ein ca. 900 bp langes BclI/Smal-Fragment isoliert und in den mit BamHI/SmaI geschnittenen Vektor pBI101.1 kloniert. Entsprechend wurden die Konstrukte KstEcoRI650 und KstBg1II300 durch Schnei­ den von PVP2 mit EcoRI/SmaI (EcoRI-Schnittstelle anschließend "gebluntet") bzw. BglII/SmaI und Klonierung in den mit Smal bzw. BamHI/SmaI geschnittenen Vektor pBI101.1 hergestellt. Die Kon­ strukte wurden, wie oben beschrieben, mittels Agrobacterium auf Kartoffelpflanzen übertragen. Durch Inkubation mit dem syntheti­ schen Substrat X-Gluc wurde die Reportergenaktivität nachgewie­ sen und die Anzahl von Pflanzen mit starker, mittlerer und schwacher Expression bestimmt. Die weitere Verkürzung des regu­ latorischen Bereichs in den Konstrukten Kst240 (Position -239, relativ zum Startcodon des kstl-Gens) und Kst200 (Position -193) erfolgte mittels der Primer Kst240dw (5'-GCAGATCTGCAAGTAGCAATGTCACG-3') und KstPSmaI bzw. Kst200dw (5'-CGGGATCCGAATCACAATAAAGAAACAC-3') und KstPSmaI unter Verwen­ dung des Klons p7-Ssub7 (Ehrhardt, 1998) als Matrize. Die mit BglII/SmaI bzw. BamHI/SmaI nachgeschnittenen Fragmente wurden in den mit BamHI/SmaI geschnittenen Vektor pBI101.1 kloniert. Wäh­ rend die Deletion Kst240 die Schließzellaktivität bewahrte, führte die weitere Verkürzung bis zur Position -193 (Konstrukt Kst200) zu einer drastischen Verringerung der Reportergenaktivi­ tät. Demnach sind für die Schließzellexpression relevante Se­ quenzmotive in dem beschriebenen 239 bp langen regulatorischen Bereich vorhanden und zumindest teilweise im Bereich zwischen den Positionen -239 und -193 lokalisiert (Abbildung1).

Beispiel 4 Beschreibung von kurzen regulatorischen Bereichen, die für die Vermittlung von schließzellspezifischer Aktivität hinreichend sind

Um kurze regulatorische Bereiche im kst1-Promotor zu definieren, die hinreichend für die Vermittlung der schließzellspezifischen Aktvität sind, wurden relevante Teile des kstl-Promotors in Form von PCR-Produkten bzw. doppelsträngigen Oligonukleotiden zur Ef­ fektverstärkung (Gosh et al., 1993) tetramerisiert und an eine bis zur Position -56 verkürzte Version des 35S-Promotors (Froh­ berg et al., 1991) als Minimalsteuerungseinheit (Minimalpromo­ tor) fusioniert. Für die Klonierung des Tetramers 90 × 4 wurde der 83bp-lange Bereich zwischen den Positionen -239 und -153 mit den Primern Kst240dw und Kst150 (5'-GGGTGATACACGGGTCAAG-3') amplifi­ ziert und in die SmaI-Schnittstelle des Vektors pKSII (Strata­ gene) kloniert. Der erhaltene Klon richtiger Orientierung (Kst240dw-Primer zur PstI-Schnittstelle gewandt) wurde mit Bam- HI/ScaI bzw. BglII/ScaI geschnitten und die jeweils das PCR- Produkt enthaltenen Fragmente miteinander ligiert. Aus dem so erhaltenen Dimer wurde nach dem selben Prinzip ein Tetramer her­ gestellt. Dieses wurde als HindIII/SpeI-Fragment isoliert und zusammen mit einem ca. 2kb-großen SpeI/SacI Fragment (355- Minimalpromotor plus dem die β-Glucuronidase kodierenden Ab­ schnitt) aus dem Vektor pDoAHpaGus (Frohberg et al., 1991) in den mit HindIIII/SacI geschnittenen Vektor pUCGusA (van de Löcht et al., 1990) kloniert. Die gesamte Kassette aus Tetramer, Mini­ malpromotor und Reportergen wurde danach aus diesem Konstrukt als HindIII/SacI-Fragment erhalten und in die entsprechenden Schnittstellen des Vektors pBI101.1 kloniert. Auf diese Weise konnte nachgewiesen werden, daß ein 83 bp langer Bereich zwi­ schen den Positionen -239 und -153 hinreichend für die Vermitt­ lung schließzellspezifischer Aktivtät ist. Dieser Bereich wurde weiterhin in drei überlappende Fragmente von ca. 40-45 bp zer­ legt und separat untersucht. Dazu wurden die Oligonukleotide KstA (5'-CCGGGCAAGTAGCAATGTCACGTTCTTAAAGCTAAATGCTTTTT-'3') und KstB (5'-CCGGAAAAAGCATTTAGCTTTAAGAACGTGACATTGCTACTTGC-3') bzw. KstC (5'-CCGGAAAAGAATCACAATAAAGAAACACTTGACCCGTGTATCAC-3') und KstD (5'-CCGGGTGATACACGGGTCAAGTGTTTCTTTATTGTGATTCTTTT-3') bzw. KstE (5'-CCGGAAAGCTAAATGCTTTTTCAAAAGAATCACAATAAAGAAA-3') und KstF (5'-CCGGTTTCTTTATTGTGATTCTTTTGAAAAAGCATTTAGCTTT-3') phosphoryliert, miteinander hybridisiert und zu Multimeren li­ giert. Diese wurden dann, um nur Fusionen der richtigen Orien­ tierung zu erhalten, mit NaeI/MroI (AB), SmaI/MroI (CD) und PinAI/MroI nachgeschnitten. Anschließend wurden Fragmente ent­ sprechend der Tetramergröße isoliert und in die XmaI (ent­ spricht der SmaI-Schnittstelle, nur mit anderem Enzym geschnit­ ten) Schnittstelle des Vektors pKSII ligiert. Klone der ge­ wünschten Orientierung und korrekter Sequenz wurden für die Her­ stellung der Fusion mit dem Minimalpromotor und dem Reportergen laut oben angegebener Strategie eingesetzt. Da für alle drei ge­ testeten Tetramere Schließzellaktivtät unterschiedlicher Stärke gefunden wurde, kann von mindestens zwei unabhängigen Elementen in diesem Bereich für die Schließzellexpression ausgegangen wer­ den. (Abb. 2)

Beispiel 5 Identifizierung eines kurzen Sequenzmotivs, das für die Aktivi­ tät in Schließzellen vorhanden sein muß

In den beiden aktiven und nicht überlappenden Sequenzen von ca. 45 Basenpaaren (AB und CD, siehe Abb. 2) konnte die Nukleotidfol­ ge 5'-TAAAG-3' als konserviertes und damit möglicherweise funk­ tionelles Element identifiziert werden. Eine Veränderung dieser Sequenz zu der Nukleotidfolge 5'-CGCGA-3' im Kontext des aktive­ ren Tetramers AB × 4 durch entsprechend veränderte Versionen der Oligonukleotide KstA bzw. KstB führte zu einer drastischen Re­ duktion der schließzellspezifischen Aktivität (Abb. 3). Die Klo­ nierung und funktionelle Analyse wurden, wie oben bereits be­ schrieben, durchgeführt.

Es kann gefolgert werden, daß die beschriebene Sequenzfolge 5'- TAAAG-3' eine zentrale Funktion für die Vermittlung von schließ­ zellspezifischer Aktivität besitzt.

Beispiel 6 Bestätigung der Funktionalität des TAAAG-Motivs im Kontext des verkürzten kst1-Promotors (-239)

Die auf 239bp verkürzte, noch aktive Version des kstl-Promotors besitzt in der charakterisierten Region bis zur Position -153 zwei TAAAG-Nukleotidfolgen und ein weiteres ähnliches, mögli­ cherweise ebenfalls aktives AAAAG-Motiv. Um die Funktionalität dieser Elemente im Kontext des verkürzten kstl-Promotors zu de­ monstrieren, wurden sie schrittweise in die nicht funktionale Sequenzfolge 5'CGCGA-3' mittels PCR überführt. Für das Konstrukt Kst240mut1 wurden die Primer St240mut1 (5'-GCAGATCTGCAAGTAGCAATGTCACGTTCTCGCGACTAAATGC-3') und KstPSmaI verwendet. Für die weiteren Konstrukte wurde eine "Megaprimer"-Strategie angewandt, bei der ein PCR-Produkt als Primer in einer folgenden PCR eingesetzt wird. Für das Konstrukt Kst240mut2 wurden die Primer St240mut1 und Kst240mutrev (5'- TTGTGATTTCGCGGAAAAAGCATTTAGC-3') verwendet und das erhaltene Produkt als Primer für eine Amplifikation mit dem Primer KstPSmaI eingesetzt. Für das Konstrukt Kst240mut3 ersetzte der Primer Kst240mut2rev (5'-CAAGTGTTTTCGCGTTGTGATTTCGCGGAAAAAGCATTTAGC-3') den Primer Kst240mutrev. Als Matrize diente jeweils der ursprüngliche geno­ mische Klon p7-Ssub7. Die Produkte wurden jeweils mit BglII/SmaI nachgeschnitten, in den mit BamHI/SmaI geschnittenen Vektor pUCGusA kloniert und sequenziert. Die gesamten Kassetten wurden wiederum als HindIII/SacI-Fragmente in den binären Vektor pBI101.1 kloniert und das so erhaltenen Konstrukt für die Trans­ formation von Kartoffelpflanzen eingesetzt. Die Einführung die­ ser Blockmutationen führte zu einer schrittweisen Reduktion der schließzellspezifischen Aktivität. Für das Konstrukt Kst240mut3, in dem alle drei Motive verändert wurden, konnte nahezu keine Schließzellaktivität nachgewiesen werden (Fig. 4).

Beschreibung der Figuren

Fig. 1: Deletionsanalyse des kstl-Promotors aus Kartoffel und Identifizierung von insgesamt drei kurzen, sich überlappenden Sequenzelementen von 40, 43 und 39 Basenpaaren (AB, CD und EF), die nach Fusion mit einer selbst inaktiven Minimalstarterregion (35S-Minimalpromotor) schließzellspezifische Aktivität vermit­ teln. Die dargestellten Promotor-Reportergenfusionen wurden in einen binären Vektor (pBI101.1, Clontech) kloniert, und mittels Agrobakterien-vermitteltem Gentransfer Kartoffelzellen transfor­ miert. Eine Reportergenexpression in Schließzellen wurde durch enzymatischen Nachweis der Reportergenaktivität (GUS-Aktivität) festgestellt.

Fig. 2: Sequenz der nicht überlappenden Fragmente AB und CD aus dem kstl-Promotor, die nach Fusion an einen 35S-Minimalpromotor schließzellspezifische Genexpression vermitteln können. Das in beiden Elementen vorkommende Sequenzmotiv TAAAG ist hervorgeho­ ben.

Fig. 3: Nachweis der Bedeutung des Motivs TAAAG für die schließzellspezifische Expression im Kontext von Minimalpromo­ torfusionen. Dargestellt ist die schließzellspezifische Aktivi­ tät verschiedener Promotorkonstrukte als Prozentsatz Pflanzen mit Reportergenaktivität in Schließzellen. Dabei zeigt sich eine drastische Reduktion der Aktivität, wenn im Kontext des Tetra­ mers AB × 4 (Tetramer von AB) das TAAAG-Element durch eine Block­ mutation (CGCGA) ersetzt wird (Konstrukt ABmut × 4 bzw. durch un­ abhängige Wiederholung des Experiments zur Herstellung des Kon­ strukts ABmut × 4 hergestelltes Konstrukt ABmutN × 4).

Fig. 4: Nachweis der Bedeutung der Motive TAAAG und AAAAG im Kontext des verkürzten Originalpromotors Kst240. Das sukzessive Ersetzen der Motive TAAAG und AAAAG durch die Blockmutation CGCGA in den Konstrukten Kst240mut1, Kst240mut2 und Kst240mut3 führt zu einer drastischen Verminderung der schließzellspezifi­ schen Aktivität des Promotors.

Fig. 5: Nukleotidsequenz des Originalpromotors Kst240. Inner­ halb der Nukleotidsequenz ist die Lage der Sequenzelemente AB, CD und EF, der mutmaßlichen TATA-Box sowie des Startcodons ange­ geben.

Literatur

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Claims (27)

1. Regulatorisches cis-aktives Element, das mindestens eine der Nukleinsäuresequenzen TAAAG und/oder AAAAG und/oder mindestens eine zu den genannten Nukleinsäuresequenzen komplementäre Se­ quenz umfaßt und im Kontext eines Promotors eine Schließzellspe­ zifität der Genexpression vermittelt.

2. Regulatorisches cis-aktives Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen mindestens eine der in SEQ. ID. NO. 1, 2, 3 oder 4 angegebenen Nukleotidsequenzen um­ faßt.

3. Regulatorisches cis-aktives Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die von der Nukleinsäuresequenz des in Anspruch 2 definierten regulato­ rischen cis-aktiven Elements durch Mutation, insbesondere Dele­ tion, Substitution, Addition und/oder Insertion von einzelnen Nukleotiden oder kleineren Gruppe von Nukleotiden abgeleitet ist.

4. Verwendung des regulatorischen cis-aktiven Elements nach ei­ nem der Ansprüche 1 bis 3 zur Identifizierung von Transkripti­ onsfaktoren, die an dieses cis-aktive Element binden.

5. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Promotors für eine schließzellspezifische oder schließzelladditive Genexpres­ sion, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Ausgangspromotor, der keine schließzellspezifische oder schließzelladditive Genexpres­ sion bewirkt, oder zu Komponenten eines solchen Ausgangspromo­ tors mindestens ein regulatorisches, eine schließzellspezifische Genexpression vermittelndes cis-aktives Element, umfassend die Nukleinsäuresequenz(en) TAAAG und/oder AAAAG und/oder mindestens eine zu den genannten Nukleinsäuresequenzen komplementäre Se­ quenz, hinzugefügt oder durch Mutation erzeugt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung des rekombinanten Promotors zwei bis zwanzig, insbe­ sondere zwei bis acht cis-aktive Elemente, umfassend die Nu­ kleinsäuresequenz(en) TAAAG und/oder AAAAG und/oder mindestens eine zu den genannten Nukleinsäuresequenzen komplementäre Se­ quenz, verwendet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das cis-aktive Element im wesentlichen eine der in SEQ. ID. NO. 1, 2, 3 oder 4 angegebenen Nukleotidsequenzen umfaßt.

8. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Promotors mit einer gegenüber einem Ausgangspromotor veränderten, insbesondere erhöhten Aktivität in Schließzellen, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Ausgangspromotor, der eine schließzellspezifische oder schließzelladditive Genexpression bewirkt, mindestens ein regu­ latives cis-aktives Element, umfassend mindestens ein Sequenzmo­ tiv TAAAG und/oder AAAAG und/oder mindestens eine zu den genann­ ten Nukleinsäuresequenzen komplementäre Sequenz, hinzugefügt oder durch Mutation erzeugt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das cis-aktive Element im wesentlichen eine der in SEQ. ID. NO. 1, 2, 3 oder 4 angegebenen Nukleotidsequenzen umfaßt.

10. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Promotors mit einer gegenüber einem Ausgangspromotor veränderten, insbesondere verringerten Aktivität in Schließzellen, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Ausgangspromotor, der eine schließzellspezifische oder schließzelladditive Genexpression bewirkt, mindestens eines der Sequenzmotive TAAAG und AAAAG oder der Sequenzmotive mit zu den angegebenen Nukleinsäuresequenzen komplementärer Sequenz de­ letiert oder durch Blocksubstitution oder durch Deletion, Inser­ tion und/oder Substitution einzelner oder mehrerer Nukleotide verändert wird.

11. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Promotors mit einer gegenüber einem Ausgangspromotor veränderten Aktivität in Schließzellen, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Ausgangspro­ motor, der eine schließzellspezifische oder schließzelladditive Genexpression bewirkt, die Lage mindestens eines Sequenzmotivs TAAAG und/oder AAAAG und/oder mindestens eines Sequenzmotivs mit einer zu den genannten Nukleinsäuresequenzen komplementären Se­ quenz bezogen auf mindestens ein weiteres Element des Promotors verändert wird.

12. Rekombinanter Promotor, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 11.

13. DNA-Konstrukt, insbesondere Expressionskassette, umfassend den rekombinanten Promotor nach Anspruch 12.

14. DNA-Konstrukt nach Anspruch 13, welches darüber hinaus einen ein Genprodukt kodierenden Nukleinsäureabschnitt, der operativ oder funktional mit dem rekombinanten Promotor verknüpft ist, umfaßt.

15. DNA-Konstrukt nach Anspruch 13, welches darüber hinaus einen Nukleinsäureabschnitt, dessen Transkription ein Transkriptions­ produkt, z. B. ein Ribozym oder eine "antisense"-DNA, erzeugt und der operativ oder funktional mit dem rekombinanten Promotor ver­ knüpft ist, umfaßt.

16. Verwendung eines DNA-Konstrukts nach Anspruch 14 zur Expres­ sion eines homologen oder heterologen Gens in Schließzellen transformierter Pflanzen.

17. Verwendung eines DNA-Konstrukts nach Anspruch 14, in welchem der kodierende Nukleinsäureabschnitt ein Reporterprotein ko­ diert, in einem Verfahren zur Erzeugung von schließzellspezifi­ schen Promotoren mit einer gegenüber dem in dem Konstrukt ent­ haltenen Promotor veränderten Aktivität in Schließzellen durch Mutation.

18. Verwendung eines DNA-Konstrukts nach Anspruch 14, in welchem der kodierende Nukleinsäureabschnitt ein Reporterprotein kodiert, in einem Verfahren zum Nachweis des Vorliegens von Mu­ tanten im Signalling-Pathway für Schließzellspezifität in einer Schließzelle nach einer Mutation einer Ausgangszelle, die das DNA-Konstrukt umfaßt, oder einer Pflanze oder eines Pflanzen­ teils, deren bzw. dessen Zellen das DNA-Konstrukt umfassen, und gegebenenfalls zur Identifizierung einer für eine Verände­ rung des Signalling-Pathway für Schließzellspezifität verant­ wortlichen Mutation.

19. Verwendung eines DNA-Konstrukts nach Anspruch 14, in welchem der kodierende Nukleinsäureabschnitt ein Reporterprotein kodiert, in einem Verfahren zur Identifizierung von chemischen Verbindungen, die den Signalling-Pathway für Schließzellspezifi­ tät in einer Schließzelle beeinflussen.

20. Verwendung eines DNA-Konstrukts nach Anspruch 14, in welchem der kodierende Nukleinsäureabschnitt ein Reporterprotein ko­ diert, das es erlaubt, den Status zellulärer Konzentrationen an bestimmten Ionen oder Metaboliten zu bestimmen, in einem Verfah­ ren zum Nachweis des Vorliegens von Mutanten in dem Signalling- Pathway für die Erzeugung und/oder die Regulierung der intrazel­ lulären Konzentration dieser Ionen oder Metabolite in einer Schließzelle nach einer Mutation einer Ausgangszelle, die das DNA-Konstrukt umfaßt, oder einer Pflanze oder eines Pflanzen­ teils, deren bzw. dessen Zellen das DNA-Konstrukt umfassen, und gegebenenfalls zur Identifizierung einer für eine Veränderung dieses Signalling-Pathway verantwortlichen Mutation.

21. Verwendung eines DNA-Konstrukts nach Anspruch 14, in welchem der kodierende Nukleinsäureabschnitt ein Reporterprotein ko­ diert, das es erlaubt, den Status zellulärer Konzentrationen an bestimmten Ionen oder Metaboliten zu bestimmen, in einem Verfah­ ren zur Identifizierung von chemischen Substanzen, die den Sta­ tus zellulärer Konzentrationen an diesen Ionen oder Metaboliten verändern.

22. Verwendung eines DNA-Konstrukts nach Anspruch 14, in welchem der kodierende Nukleinsäureabschnitt ein Reporterprotein ko­ diert, das es erlaubt, den Status zellulärer Konzentrationen an bestimmten Ionen oder Metaboliten zu bestimmen, in einem Verfah­ ren zur Untersuchung einer Beeinflussung des Status zellulärer Konzentrationen an diesen Ionen oder Metaboliten durch Um­ welteinflüsse.

23. Vektor, Plasmid, Cosmid, Bacmid, Virus- oder Phagengenom, umfassend ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 13 bis 15.

24. Transformierter Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er ein DNA-Konstrukt einem der Ansprüche 13 bis 15 enthält.

25. Transgene Pflanze, transgener Pflanzenteil, transgene Pflan­ zenzelle oder Samen, dadurch gekennzeichnet, daß sie bzw. er ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 13 bis 15 enthält.

26. Kit insbesondere zur Verwendung in einem der Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß er ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 13 bis 15 oder einen Vektor, ein Plasmid, Cosmid, Bacmid, Virus- oder Phagengenom nach Anspruch 23 umfaßt.

27. Verfahren zur Identifizierung von in Schließzellen von Pflanzen exprimierten Genen, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Nukleinsäuresequenzierung von 5'-regulatorischen Bereichen von Genen gewonnene Nukleinsäuresequenzdaten auf das Vorhanden­ sein mindestens eines der für ein regulatorisches, eine schließ­ zellspezifische Genexpression vermittelndes cis-aktives Element charakteristischen Nukleinsäuresequenzmotive TAAAG und/oder AAAAG und/oder der Sequenzmotive mit zu den angegebenen Nuklein­ säuresequenzen komplementärer Nukleinsäuresequenz überprüft.