DE19860278A1 - Method and device for the optical detection of a particle immobilized on a surface - Google Patents
Method and device for the optical detection of a particle immobilized on a surfaceInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur optischen Detek tion eines auf einer Oberfläche immobilisierten Partikels.The invention relates to a method and a device for optical detection tion of a particle immobilized on a surface.
Die optische Detektion einzelner Partikel bis hinunter zu einzelnen Molekülen ist eine etablierte Technik. Eine Überblick über die Detektion einzelner Moleküle in Flüssigkeiten und auf Oberflächen und deren Anwendungen in Chemie, Biologie und Nanotechnologie findet man z. B. in der Übersichtsarbeit von Nie und Zare [S. M. Nie und R. N. Zare, "Optical detection of single molecules", Annual Review of Biophysi cal and Biomolecular Structure 26, 567-596, 1997]. Ein Standardverfahren zur opti schen Detektion von Partikeln besteht darin, daß das zu detektierende Partikel durch einen fokussierten Laserstrahl optisch angeregt und dann ein durch das Partikel gene riertes optisches Signal (Fluoreszenz, Ramanstreuung o. ä.) detektiert wird. Die Parti kel können sich dabei frei in Lösung oder immobilisiert auf einer Oberfläche befin den.The optical detection of individual particles down to individual molecules is an established technique. An overview of the detection of individual molecules in Liquids and on surfaces and their applications in chemistry, biology and One finds nanotechnology e.g. B. in the review by Nie and Zare [p. M. Never and R. N. Zare, "Optical detection of single molecules", Annual Review of Biophysi cal and Biomolecular Structure 26, 567-596, 1997]. A standard procedure for opti The detection of particles is that the particle to be detected by a focused laser beam is optically excited and then a gene through the particle dated optical signal (fluorescence, Raman scattering, etc.) is detected. The parties celes can be freely in solution or immobilized on a surface the.
Um Hintergrundsignale zu minimieren, wird eine räumliche Einschränkung des Detektionsgebietes vermittels einer starken Fokussierung des anregenden Laserstrahls und zusätzlicher Einbringung von räumlichen Blenden in den Detektionskanal vorge nommen. Das zu detektierende Partikel wird in dieses Detektionsgebiet eingebracht entweder durch freie Diffusion, durch hydrodynamische Konvektion, oder, bei ober flächenimmobilisierten Partikeln, durch Verschiebung des Detektionsgebietes über die Oberfläche.In order to minimize background signals, a spatial restriction of the Detection area by means of strong focusing of the exciting laser beam and additional introduction of spatial diaphragms in the detection channel taken. The particle to be detected is introduced into this detection area either by free diffusion, by hydrodynamic convection, or, at top surface-immobilized particles, by shifting the detection area over the Surface.
Für chemo- und bioanalytische Zwecke ist es von großem Interesse, nicht nur einzelne Partikel an sich zu detektieren, sondern auch Aussagen über deren Eigen schaften machen zu können. Ein Weg dahin besteht darin, die optische Helligkeit (der Fluoreszenz, Ramanstreuung o. ä.) des Partikels quantitativ zu messen.It is of great interest for chemo and bioanalytical purposes, not only to detect individual particles per se, but also statements about their own to be able to do. One way to do this is to adjust the optical brightness (the To measure fluorescence, Raman scattering or similar) of the particle quantitatively.
Im allgemeinen hängt die gemessene Quantität des vom Partikel generierten op tischen Signals nicht nur von seiner Eigenhelligkeit ab, welche im wesentlichen durch den Absorptionsquerschnitt und die Quantenausbeute der optischen Signalgenerierung des Partikels bestimmt ist, sondern auch von der Art und Weise, wie das Partikel durch das Detektionsgebiet hindurch geführt wird. Das Intensitätsprofil des anregen den Laserstrahls wie auch die Detektionseffizienz der detektierenden Optik sind im allgemeinen beide Funktionen des Ortes, so daß das Partikel an verschiedenen Orten unterschiedlich stark angeregt und unterschiedlich gut detektiert wird. Befindet sich somit ein Partikel mit hoher Eigenhelligkeit am Rande des anregenden Laserstahls und/oder des durch die Detektionsoptik definierten Detektionsgebietes, so kann seine Helligkeit scheinbar wesentlich dunkler erscheinen als die eines Partikels mit geringer Eigenhelligkeit, welches jedoch im Zentrum des anregenden Laserstrahls und/oder des Detektionsgebietes positioniert ist. Wird eine Oberfläche, auf der Partikel immobili siert sind, mit einem kleinen Fokus abgetastet, so werden von ein und demselben Par tikel die unterschiedlichsten Signalstärken erfaßt, i.d.R. jedoch kleine Signalstärken, da das Partikel nur selten zentral durch den Fokus tritt. Eine quantitative Analyse der Signale ist nicht möglich.In general, the measured quantity of the op generated by the particle depends table signal not only from its inherent brightness, which is essentially due to the absorption cross section and the quantum yield of the optical signal generation of the particle is determined, but also by the way in which the particle is guided through the detection area. The intensity profile of the stimulate the laser beam as well as the detection efficiency of the detecting optics are in general both functions of the place, so that the particle in different places is excited differently and is detected differently well. Is located thus a particle with high intrinsic brightness at the edge of the exciting laser steel and / or the detection area defined by the detection optics, it can be Brightness appears to appear much darker than that of a particle with less Natural brightness, which, however, is in the center of the exciting laser beam and / or the Detection area is positioned. Becomes a surface on which particles are immobilized are scanned with a small focus, the same par the different signal strengths are recorded, usually however small signal strengths, because the particle rarely passes through the focus. A quantitative analysis of the Signals are not possible.
Für oberflächenimmobilisierte Partikel wurde in der Literatur die Möglichkeit beschrieben, die Oberfläche insgesamt möglichst homogen auszuleuchten und das durch die Partikel generierte optische Signal durch eine hochsensitive Kamera zu er fassen [M. Ishikawa, K. Hirano, T. Hayakawa, S. Hosoi und S. Brenner, "Single- Molecule Detection by Laser-Induced Fluorescence Technique with a Position- Sensitive Photon-Counting Apparatus", Japanese Journal of Applied Physics Part 1 33(3A), 1571-6, 1994]. Der Nachteil dieser Technik besteht in der Schwierigkeit, eine räumlich völlig homogene Ausleuchtung und optische Detektion zu erreichen, und besonders in den sehr hohen Kosten der Kamera, welche bei schwachem optischen Signal (wie etwa bei einzelnen Molekülen) einzelphotonenempfindlich sein muß. Au ßerdem stellt die hohe Intensität des Hintergrundsignals ein ernsthaftes Problem bei diesem Verfahren dar.The possibility has been given in the literature for surface-immobilized particles described to illuminate the surface as homogeneously as possible and that optical signal generated by the particles through a highly sensitive camera grasp [M. Ishikawa, K. Hirano, T. Hayakawa, S. Hosoi and S. Brenner, "Single Molecule Detection by Laser-Induced Fluorescence Technique with a Position- Sensitive Photon Counting Apparatus ", Japanese Journal of Applied Physics Part 1 33 (3A), 1571-6, 1994]. The disadvantage of this technique is the difficulty in finding one to achieve spatially completely homogeneous illumination and optical detection, and especially in the very high cost of the camera, which with poor optical Signal (such as for single molecules) must be single photon sensitive. Au In addition, the high intensity of the background signal poses a serious problem this procedure.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren anzugeben, die ein quantitatives Analysieren der optischen Helligkeit von auf einer Oberfläche immobilisierten Partikeln mit einfachen Mitteln erlauben.The object of the invention is to specify a device and a method, which is a quantitative analysis of the optical brightness of a surface Allow immobilized particles with simple means.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Verfahren mit den Merkmalen des Anspruch 1 bzw. durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruch 7 ge löst. This object is achieved according to the invention by a method with the features of claim 1 or by a device with the features of claim 7 ge solves.
Durch das Verfahren bzw. die Vorrichtung werden die optischen Anregungs- und Detektionsbedingungen für die optische Detektion einzelner Partikel, welche auf einer Oberfläche immobilisiert sind, für jedes Partikel im wesentlichen identisch ge staltet, also normiert. Die optische Abbildung der Blende auf die Oberfläche definiert den Bereich optimaler Detektionseffizienz innerhalb des annähernd homogen anre genden mittleren Bereichs des elongierten Fokus. Die Partikel treten aufgrund der Verschiebung durch den Fokus senkrecht zu dessen Längsachse hindurch. Sie erfah ren daher ein im wesentlichen einheitliches Anregungsprofil. Das pro Partikel detek tierte optische Signal ist dann proportional zur Eigenhelligkeit der Partikel und unab hängig von der Position des Partikels auf der Oberfläche. Die Eigenhelligkeit kann somit für chemo- und bioanalytische Zwecke quantitativ ausgewertet werden.The optical excitation and detection conditions for the optical detection of individual particles based on immobilized on a surface, are essentially identical for each particle designs, so standardized. The optical image of the aperture on the surface is defined the range of optimal detection efficiency within the approximately homogeneous range middle range of the elongated focus. The particles occur due to the Shift through the focus perpendicular to its longitudinal axis. She found out Ren therefore an essentially uniform suggestion profile. The per particle detec The optical signal is then proportional to the intrinsic brightness of the particles and independent depending on the position of the particle on the surface. The inherent brightness can thus be evaluated quantitatively for chemo and bioanalytical purposes.
Mit Hilfe der Vorrichtung kann für ein Ensemble von detektierten einzelnen Partikeln eine Helligkeitsstatistik (Histogramm der Stärke des pro Partikel detektier ten optischen Signals) erstellt werden. Da alle Partikel, welche detektiert werden, den im wesentlichen gleichen Anregungs- und Detektionsbedingungen ausgesetzt sind, widerspiegelt diese Statistik direkt die Verteilung der Eigenhelligkeiten der detektier ten Partikel. Setzt sich das Ensemble von Partikeln z. B. aus einer diskreten Anzahl verschiedener Partikelsorten unterschiedlicher Eigenhelligkeit zusammen, so wird je der Partikelsorte ein Maximum in der Helligkeitsstatistik entsprechen. Somit läßt sich aus der Helligkeitsstatistik direkt das Vorhandensein (bzw. die Abwesenheit) einer bestimmten Partikelsorte ablesen. Außerdem kann über die Kenntnis der Zahl der de tektierten Partikel in einem der Maxima der Helligkeitsstatistik die Oberflächenkon zentration der dem Maximum entsprechenden Partikelsorte bestimmt werden.With the help of the device can be detected for an ensemble of individual Particles a brightness statistic (histogram of the strength of the per particle detect th optical signal). Since all particles that are detected, the are exposed to essentially the same excitation and detection conditions, This statistic directly reflects the distribution of the self-brightness of the detectors particles. Is the ensemble of particles z. B. from a discrete number different types of particles with different inherent brightness, so each the particle type corresponds to a maximum in the brightness statistics. So you can the presence (or absence) of a directly from the brightness statistics read certain particle type. You can also know about the number of de detected particles in one of the maxima of the brightness statistics the surface con concentration of the particle type corresponding to the maximum can be determined.
Wenn die Eigenhelligkeit der Partikel proportional ist zu einer chemo- oder bio analytisch relevanten Eigenschaft der Partikel, so spiegelt die Helligkeitsstatistik di rekt die statistische Verteilung auch dieser chemo- oder bioanalytisch relevanten Ei genschaft wider. Das Verfahren ist z. B. direkt anwendbar auf die Bestimmung der Größenverteilung von Partikeln, welche mit optisch anregbaren und detektierbaren Markern derartig markiert wurden, daß die Zahl der Marker per Partikel proportional ist zur Größe der markierten Partikel.If the inherent brightness of the particles is proportional to a chemo- or bio analytically relevant property of the particles, the brightness statistics reflect di the statistical distribution of this chemically or bioanalytically relevant egg is also correct property. The process is e.g. B. directly applicable to the determination of Size distribution of particles with optically excitable and detectable Markers were marked in such a way that the number of markers per particle was proportional is the size of the marked particles.
Das Verfahren und die Vorrichtung sind auf jedes beliebige durch Licht anreg bare optische Signal von Partikeln anwendbar, wie z. B. Fluoreszenz, Ramanstreuung oder Rayleighstreuung. Das Verfahren und die Vorrichtung sind auf jede Art von Par tikeln anwendbar, welche bei optischer Anregung ein optische Signal generieren, sei en es vielatomige Teilchen oder einzelne Moleküle. Das Verfahren und die Vorrich tung sind auch auf Partikel anwendbar, bei denen das optische Signal nicht durch opti sche Anregung, sondern z. B. durch Chemolumineszenz entsteht.The method and apparatus are light stimulated to any one bare optical signal of particles applicable, such as. B. fluorescence, Raman scattering or Rayleigh scattering. The method and the device are based on any type of par Articles applicable which generate an optical signal upon optical excitation en it is multi-atomic particles or single molecules. The procedure and the device tion are also applicable to particles in which the optical signal is not through opti cal suggestion, but z. B. arises from chemiluminescence.
Zur quantitativen Analyse der Stärke des optischen Signals und zur Bestimmung der Eigenhelligkeit des Partikels ist es entscheidend, daß die Stärke des optischen Si gnals während des Durchtritts durch den Fokus in ihrem Verlauf erfaßt wird. Dies er laubt eine Integration oder sonstige Verarbeitung. Zu vermeiden ist, daß das Partikel nur an einzelnen Stellen knapp vor oder nach dem Fokus beobachtet wird. Dazu sollte die Verschiebung kontinuierlich oder mit einer Schrittweite erfolgt, die kleiner als die Länge der Querachse ist. Die Detektion muß zur Verschiebung passend ausgelegt sein. D. h. bei einer kontinuierlichen Relativverschiebung von Oberfläche bzw. Parti kel und optischer Anordnung muß die Detektion in hinreichend kleinen Zeitinterval len erfolgen.For quantitative analysis of the strength of the optical signal and for determination The intrinsic brightness of the particle, it is crucial that the strength of the optical Si gnals is detected during its passage through the focus in its course. This he permits integration or other processing. It should be avoided that the particle is observed only at individual points just before or after the focus. To do this the shift occurs continuously or with a step size that is smaller than that Length of the transverse axis. The detection must be designed to match the shift his. That is, with a continuous relative shift of surface or parti kel and optical arrangement, the detection must be in a sufficiently small time interval len done.
Wird bei der Relativverschiebung nicht die Oberfläche, sondern der Fokus ver schoben, so müssen auch die Sammeloptik, die Blende und der Detektor über die fixe Oberfläche bewegt werden. Dazu bilden sie vorteilhafterweise eine bauliche Einheit.If the relative shift does not ver the surface, but the focus the collecting optics, the aperture and the detector must also slide over the fixed one Surface to be moved. For this purpose, they advantageously form a structural unit.
Die Blende kann sowohl eine Spaltblende, deren Spalt parallel zur Oberfläche und zur Querachse des elongierten Fokus ausgerichtet ist, als auch eine Rechteckblen de sein, deren Längsachse parallel zur Oberfläche und zur Längsachse des elongierten Fokus ausgerichtet ist.The aperture can be both a slit aperture, the gap parallel to the surface and aligned with the transverse axis of the elongated focus, as well as a rectangular blen de its longitudinal axis parallel to the surface and to the longitudinal axis of the elongated Focus is focused.
Auch bei dieser optischen Anordnung ist es noch möglich, daß ein Partikel am Rand des elongierten Fokus bzw. des Abbilds der Blende angeregt wird und ein schwaches Signal liefert, obwohl seine Eigenhelligkeit im Prinzip groß ist. Die Mehr zahl der Partikel wird jedoch durch den wesentlich größeren zentralen Bereich des elongierten Fokus und des Abbilds der Blende hindurchtreten. Dies führt jeweils zu im wesentlichen konstanten und starken optischen Signalen. Die Varianz der Stärke der optischen Signale einer Vielzahl von einzelnen Partikeln (Helligkeitsstatistik) wird somit gegenüber einem einfachen konfokalen Aufbau verkleinert. Die Verteilung der optischen Signalstärke weißt ein Maximum in der Nähe des Erwartungswerts auf.With this optical arrangement it is also possible that a particle on Edge of the elongated focus or the image of the aperture is excited and a provides a weak signal, although its inherent brightness is in principle large. The more However, the number of particles is due to the much larger central area of the pass through the elongated focus and the image of the aperture. This leads to essentially constant and strong optical signals. The variance in strength the optical signals of a large number of individual particles (brightness statistics) thus reduced in size compared to a simple confocal structure. The distribution of the optical signal strength has a maximum near the expected value.
Dieses kann zur quantitativen Charakterisierung der Partikel mit hinreichender stati stischer Zuverlässigkeit verwendet werden. This can be used for the quantitative characterization of the particles with sufficient stati reliability are used.
Eine weitere Verkleinerung der Varianz der Helligkeitsstatistik kann auf folgen de Weise erreicht werden. Die Blende wird in Richtung der Längsachse des elongier ten Fokus in Schwingung versetzt. Dabei wird die Amplitude der Schwingung ent sprechend der räumlichen Ausdehnung des Übergangs von im wesentlichen maxima ler Sammeleffizienz zu im wesentlichen verschwindender Sammeleffizienz in der Ebene des elongierten Fokus gewählt. Partikel, die am Rand des Abbilds der Blende durch den Fokus treten, erfahren dann abwechselnd eine verschwindende und eine maximale Anregung. Die Stärke ihrer optischen Signale weißt dann charakteristische Modulationen auf. Um diese detektieren zu können, wird die Frequenz der Schwin gung zu den Zeitintervallen der Abtastung passend gewählt. Bei der Datenauswertung werden die jeweils detektierten optischen Signale auf eine Modulation ihrer Stärke hin untersucht. Wird eine Modulation mit der genannten Frequenz der Schwingung fest gestellt, so liegt ein Signal eines Partikels vor, das am Rande des Abbilds der Blende durch den Fokus trat. Diese Signale sind i.d.R. schwächer als es die Eigenhelligkeit erwarten läßt. Um eine Fehleinschätzung der Eigenhelligkeit dieser Partikel zu ver meiden, können sie bei einer weitergehenden Auswertung unberücksichtigt bleiben, oder ihre reduzierte Eigenhelligkeit wird rechnerisch berücksichtigen. Auf diese Wei se wird die Varianz der Helligkeitsstatistik weiter verkleinert.A further reduction in the variance of the brightness statistics can follow de way can be achieved. The aperture is in the direction of the longitudinal axis of the elongier vibrated focus. The amplitude of the vibration is ent speaking of the spatial extent of the transition from essentially maxima collection efficiency to essentially disappearing collection efficiency in the Plane of elongated focus selected. Particles on the edge of the image of the aperture step through the focus, then alternately experience a vanishing and a maximum stimulation. The strength of their optical signals then knows characteristic Modulations on. In order to be able to detect this, the frequency becomes the Schwin suitable for the time intervals of the sampling. When evaluating data the respectively detected optical signals are based on a modulation of their strength examined. If a modulation with the specified frequency of the vibration is fixed , there is a signal from a particle that is on the edge of the image of the aperture stepped through the focus. These signals are usually weaker than the inherent brightness can be expected. To avoid misjudging the inherent brightness of these particles avoid them, they can be ignored in a further evaluation, or their reduced inherent brightness will be taken into account arithmetically. In this way The variance of the brightness statistics is further reduced.
In vorteilhafter Weiterbildung der Erfindung wird die Oberfläche mit einem zir kular polarisierten Lichtstrahl bestrahlt. Dadurch wird ein eventueller Einfluß der Par tikelorientierung auf die Anregungseffizienz ausgemittelt.In an advantageous development of the invention, the surface is covered with a zir cularly polarized light beam irradiated. This will influence Par article orientation averaged over the excitation efficiency.
Eine weitere Möglichkeit, das Hintergrundsignal für die Detektion der einzelnen Partikel zu verkleinern, wird dadurch erreicht, daß der Lichtstrahl von der dem Parti kel abgewandten Seite der Oberfläche aus unter einem Winkel eingestrahlt wird, der eine totale interne Reflexion des Lichtstrahls an der das Partikel tragenden Oberfläche bewirkt, wodurch das Partikel evaneszent angeregt wird. Dadurch werden Rückrefle xionen des Anregungslichts vermieden.Another way to use the background signal for detection of each To reduce particles is achieved in that the light beam from the Parti side facing away from the surface is irradiated at an angle which total internal reflection of the light beam on the surface carrying the particle causes the particle to be excited evanescently. This will reflect back xions of the excitation light avoided.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen ge kennzeichnet.Advantageous developments of the invention are set out in the subclaims indicates.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher er läutert, die in den Figuren schematisch dargestellt sind. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeichnen dabei gleiche Elemente. Im einzelnen zeigt: The invention is explained in more detail below using exemplary embodiments refines, which are shown schematically in the figures. Same reference numbers in the individual figures denote the same elements. In detail shows:
Fig. 1 eine perspektivische Ansicht der Detektionsvorrichtung mit Auflichtan regung, und Fig. 1 is a perspective view of the detection device with Auflichtan excitation, and
Fig. 2 eine perspektivische Ansicht der Detektionsvorrichtung mit evanes zenter Anregung in Totalreflektion. Fig. 2 is a perspective view of the detection device with evanescent excitation in total reflection.
Auf einer planaren Probenoberfläche 8 (z. B. Deckgläschen) seien die zu detek tierenden Partikel immobilisert. Die optische Anregung dieser Partikel erfolgt durch einen Laserstrahl 5 mit elongiertem (z. B. elliptischem) Intensitätsprofil, welcher über den dichroitischen Spiegel 4 und die Optik 6 (z. B. Mikroskopobjektiv) auf die Pro benoberfläche 8 fokussiert wird. Auf der Probenoberfläche 8 wird damit der elongierte Anregungsfleck 7 gebildet. Der Laserstrahl kann dabei so polarisiert sein, daß die Po larisation des Anregungslichtes im Anregungsfleck 7 zirkular ist, um somit die Anre gungseffizienz der Partikel unabhängig von der oberflächenparallelen Orientierung der Partikelabsorptionsdipole zu gestalten. Das von den Partikeln in diesem Anre gungsfleck 7 erzeugte optische Signal wird über die Optik 6 gesammelt. Der dichroi tische Spiegel 4 ist reflektierend für die Anregungswellenlänge des Lasers und durch lässig für die Wellenlänge des von den Partikeln generierten optischen Signals. Somit gelangt das von den Partikeln emittierte Licht über die Spaltblende 2 in den photo elektrischen Detektor 1 (z. B. Photoelektronenvervielfacher), welcher das einfallende Licht in ein elektrisches Signal umwandelt, was durch eine nachfolgende Elektronik verarbeitet und ausgewertet werden kann. Die Längsachse des Anregungsflecks 7 steht senkrecht zur Spaltrichtung der Spaltblende 2, und die Längsausdehnung des Anregungsflecks 7 ist größer als das Abbild der Spaltenbreite der Spaltblende 2, so daß die Detektionseffizienz im Detektionsgebiet nahezu unabhängig von der Position der Partikel senkrecht zur Spaltrichtung (entlang der Längsachse des Anregungsflecks 7) ist.The particles to be detected are immobilized on a planar sample surface 8 (e.g. cover glass). The optical excitation of these particles is carried out by a laser beam 5 with an elongated (e.g. elliptical) intensity profile, which is focused on the surface beneath the sample 8 via the dichroic mirror 4 and the optics 6 (e.g. microscope objective). The elongated excitation spot 7 is thus formed on the sample surface 8 . The laser beam can be polarized so that the polarization of the excitation light in the excitation spot 7 is circular, so as to make the excitation efficiency of the particles independent of the surface-parallel orientation of the particle absorption dipoles. The optical signal generated by the particles in this excitation spot 7 is collected via the optics 6 . The dichroic mirror 4 is reflective for the excitation wavelength of the laser and permeable for the wavelength of the optical signal generated by the particles. The light emitted by the particles thus passes via the slit diaphragm 2 into the photoelectric detector 1 (for example photoelectron multiplier), which converts the incident light into an electrical signal, which can be processed and evaluated by subsequent electronics. The longitudinal axis of the excitation spot 7 is perpendicular to the slit direction of the slit aperture 2 , and the longitudinal extent of the excitation spot 7 is larger than the image of the column width of the slit aperture 2 , so that the detection efficiency in the detection area is almost independent of the position of the particles perpendicular to the slit direction (along the longitudinal axis of the excitation spot 7 ).
Um einen Einfluß der Abhängigkeit der photoelektrischen Empfindlichkeit des photoelektrischen Detektors 1 über dessen Detektorfläche auf die Detektionsempfind lichkeit auszuschließen, muß die Vergrößerung der Optik 6 so gewählt werden, so daß der Detektor 1 jeden Punkt des Detektionsgebiets gleich empfindlich detektiert. Die Detektionseffizienz hängt dann im wesentlichen nur ab von der Position der Partikel längs der Spaltrichtung der Spaltblende 2 (quer zur Längsachse des Anregungsflecks 7).In order to rule out an influence of the dependence of the photoelectric sensitivity of the photoelectric detector 1 on the detector surface on the detection sensitivity, the magnification of the optics 6 must be selected so that the detector 1 detects every point of the detection area with the same sensitivity. The detection efficiency then essentially depends only on the position of the particles along the slit direction of the slit diaphragm 2 (transverse to the longitudinal axis of the excitation spot 7 ).
Durch gleichmäßige relative Verschiebung der Probenoberfläche 8 entlang der Richtung 9 werden die zu detektierenden Partikel in das Detektionsgebiet hinein- und wieder hinaustransportiert. Die Verschiebung kann dabei kontinuierlich oder in dis kreten Schritten erfolgen. Beträgt die Ausdehnung der Querachse des Fokus 7 im beu gungsbegrenzten Fall etwa 1 µm, so empfiehlt sich eine Schrittweite der Verschie bung von deutlich unter 0,5 µm, idealerweise etwa 0,1 µm. Bei größeren Abmessun gen der Querachse kann auch die Schrittweite größer gewählt werden.The particles to be detected are transported into and out of the detection area by uniform relative displacement of the sample surface 8 in the direction 9 . The shift can take place continuously or in discrete steps. If the extent of the transverse axis of the focus 7 in the diffraction-limited case is approximately 1 μm, a step size of the displacement of significantly less than 0.5 μm, ideally approximately 0.1 μm, is recommended. For larger dimensions of the transverse axis, the step size can also be selected larger.
Simultan zur Verschiebung wird die Intensität des von den Partikeln generierten optischen Signals in Zeitintervallen gemessen. Die Länge dieser Zeitintervalle ist we sentlich kürzer als die Verweilzeit der Partikel im Anregungsfleck 7. Damit entsteht ein kontinuierlicher Datenstrom, der jedem Zeitintervall die Quantität des darin ge messenen optischen Signals zuordnet. Da die Länge eines Zeitintervalls wesentlich kürzer ist als die Verweilzeit eines Partikels im Anregungsfleck 7, wird beim Eintritt eines Partikels in das Detektionsgebiet die Quantität des gemessenen optischen Si gnals von Zeitintervall zu Zeitintervall langsam steigen und nach Erreichen eines Ma ximums wieder fallen, entsprechend dem Intensitätsprofil des Anregungslichtes quer zur Elongation des Anregungsflecks 7. Damit können diese Partikeldurchgänge als Intensitätspeaks im erfaßten Datenstrom identifiziert werden. Durch Aufsummierung des optischen Signals in diesen Intensitätspeaks kann dann jedem Partikeldurchgang eine Gesamthelligkeit zugeordnet werden. Da jedes Partikel beim Durchgang durch das Detektionsgebiet dieselben Anregungs- und Detektionsbedingungen erfährt, wird diese Gesamthelligkeit proportional zur Eigenhelligkeit der Partikel sein, was eine Auswertung der ermittelten Gesamthelligkeiten für chemo- und bioanalytische Zwec ke ermöglicht.Simultaneously to the shift, the intensity of the optical signal generated by the particles is measured in time intervals. The length of these time intervals is considerably shorter than the dwell time of the particles in the excitation spot 7 . This creates a continuous data stream that assigns the quantity of the optical signal measured therein to each time interval. Since the length of a time interval is significantly shorter than the dwell time of a particle in the excitation spot 7 , when a particle enters the detection area, the quantity of the optical signals measured will slowly increase from time interval to time interval and fall again after reaching a maximum, according to the intensity profile of the excitation light transverse to the elongation of the excitation spot 7 . These particle passes can thus be identified as intensity peaks in the recorded data stream. By summing up the optical signal in these intensity peaks, an overall brightness can then be assigned to each particle pass. Since each particle experiences the same excitation and detection conditions as it passes through the detection area, this total brightness will be proportional to the intrinsic brightness of the particles, which enables an evaluation of the total brightness determined for chemo and bioanalytical purposes.
Der Aufbau ist ähnlich zu demjenigen gemäß Ausführungsbeispiel 1, aber die optische Anregung erfolgt jetzt mit einem Laserstrahl 10 in Totalreflektion, wie in Fig. 2 gezeigt. Wiederum muß die Längsachse des Anregungsflecks 7, die Spalten breite der Spaltblende 2, deren gegenseitige Anordnung und die Vergrößerung der Optik 6 so gewählt sein, daß die Detektionseffizienz im Detektionsgebiet nahezu un abhängig von der Position der Partikel quer zur Spaltrichtung (entlang der Längsachse des Anregungsflecks 7) ist. Auch der Transport der auf der Oberfläche immobilisier ten Partikel sowie die Art und Weise der Erfassung des optischen Signals erfolgen wie in Beispiel 1.The structure is similar to that according to exemplary embodiment 1, but the optical excitation is now carried out with a laser beam 10 in total reflection, as shown in FIG. 2. Again, the longitudinal axis of the excitation spot 7 , the column width of the slit diaphragm 2 , their mutual arrangement and the magnification of the optics 6 must be chosen so that the detection efficiency in the detection area is almost independent of the position of the particles transverse to the gap direction (along the longitudinal axis of the excitation spot 7 ) is. The transport of the particles immobilized on the surface and the manner in which the optical signal is recorded are also carried out as in Example 1.
Claims (11)
wobei die Oberfläche (8) mit einem Lichtstrahl (5) derart bestrahlt wird, daß sich auf der Oberfläche ein elongierter Fokus (7) mit einer Längsachse und einer kür zeren Querachse bildet;
wobei die Oberfläche (8) mit dem immobilisierten Partikel und der Fokus (7) im wesentlichen in Richtung (9) der Querachse des elongierten Fokus relativ zueinander verschoben werden, wobei die Verschiebung kontinuierlich oder mit einer Schritt weite erfolgt, die kleiner als die Länge der Querachse ist;
wobei das im Fokus (7) erzeugte optische Signal über eine Sammeloptik (6) auf eine Blende (2) abgebildet wird, wobei Sammeloptik (6) und Blende (2) derart aufein ander abgestimmt werden, daß sich eine Sammeleffizienz für das im Fokus erzeugte optische Signal ergibt, die entlang der Längsachse des elongierten Fokus in dessen Mittelbereich im wesentlichen homogen ist und die außerhalb des Mittelbereichs im wesentlichen verschwindet; und
wobei das durch die Blende (2) tretende optische Signal von einer Detektions einrichtung (1) in Zeitintervallen detektiert wird, die das Abtasten des durch die Ver schiebung bewirkten Durchtritts des Partikels durch den elongierten Fokus (7) erlau ben.1. A method for the optical detection of a particle immobilized on a surface ( 8 ),
wherein the surface ( 8 ) is irradiated with a light beam ( 5 ) such that an elongated focus ( 7 ) with a longitudinal axis and a shorter transverse axis forms on the surface;
wherein the surface ( 8 ) with the immobilized particle and the focus ( 7 ) are essentially displaced relative to one another in the direction ( 9 ) of the transverse axis of the elongated focus, the displacement taking place continuously or with a step width that is smaller than the length of the Is transverse axis;
wherein the optical signal generated in the focus ( 7 ) is imaged via a collecting optics ( 6 ) on a diaphragm ( 2 ), the collecting optics ( 6 ) and diaphragm ( 2 ) being matched to one another in such a way that a collecting efficiency for the generated in focus results in an optical signal which is substantially homogeneous along the longitudinal axis of the elongated focus in its central region and which essentially disappears outside the central region; and
wherein the optical signal passing through the diaphragm ( 2 ) is detected by a detection device ( 1 ) at time intervals which allow the scanning of the passage of the particle caused by the displacement through the elongated focus ( 7 ).
wobei die Amplitude der Schwingung entsprechend der räumlichen Ausdehnung des Übergangs von im wesentlichen maximaler Sammeleffizienz zu im wesentlichen verschwindender Sammeleffizienz in der Ebene des elongierten Fokus gewählt wird, und
wobei die Frequenz der Schwingung zu den Zeitintervallen der Abta stung passend gewählt wird,
wodurch die optischen Signale von Partikeln, die am Rand des Abbilds der Blende durch den Fokus treten, in ihrer Stärke moduliert werden; und
daß die detektierten optischen Signale auf eine Modulation ihrer Stärke hin un tersucht und selektiert werden.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the aperture in the direction of the longitudinal axis of the elongated focus is set in vibration,
the amplitude of the oscillation being selected in accordance with the spatial extent of the transition from essentially maximum collection efficiency to essentially disappearing collection efficiency in the plane of the elongated focus, and
the frequency of the oscillation being chosen to match the time intervals of the sampling,
whereby the optical signals of particles that pass through the focus at the edge of the image of the aperture are modulated in their strength; and
that the detected optical signals are examined and selected for a modulation of their strength.
einer Lichtquelle zum Erzeugen eines Lichtstrahls (5);
einer Fokussieroptik (6) zum Erzeugen eines elongierten Fokus (7) des Licht strahls (5) auf der Oberfläche (8), wobei der Fokus eine Längsachse und einer kürze ren Querachse hat;
einer Verschiebeeinrichtung zum Bewirken einer Relativverschiebung zwischen der Oberfläche (8) und dem Fokus (7), wobei die Verschiebung im wesentlichen in Richtung (9) der Querachse des elongierten Fokus (7) und kontinuierlich oder mit ei ner Schrittweite erfolgt, die kleiner als die Länge der Querachse ist;
einer Sammeloptik (6) zum Sammeln des im Fokus (7) erzeugten optischen Si gnals,
einer Blende (2), wobei das gesammelte optische Signal auf die Blende (2) ab gebildet wird, und wobei Sammeloptik (6) und Blende (2) derart aufeinander abge stimmt sind, daß sich eine Sammeleffizienz für das im Fokus erzeugte optische Signal ergibt, die entlang der Längsachse des elongierten Fokus in dessen Mittelbereich im wesentlichen homogen ist und die außerhalb des Mittelbereichs im wesentlichen ver schwindet; und mit
einer Detektionseinrichtung (1) zum Detektieren des durch die Blende (2) tre tenden optischen Signals, wobei die Detektionseinrichtung (1) das Abtasten des durch die Verschiebeeinrichtung bewirkten Durchtritts des Partikels durch den elongierten Fokus (7) erlaubt.7. Device for optical detection of a particle immobilized on a surface ( 8 ), with
a light source for generating a light beam ( 5 );
focusing optics ( 6 ) for generating an elongated focus ( 7 ) of the light beam ( 5 ) on the surface ( 8 ), the focus having a longitudinal axis and a shorter transverse axis;
a displacement device for causing a relative displacement between the surface ( 8 ) and the focus ( 7 ), the displacement taking place essentially in the direction ( 9 ) of the transverse axis of the elongated focus ( 7 ) and continuously or with an increment that is smaller than that Length of the transverse axis;
collecting optics ( 6 ) for collecting the optical signal generated in focus ( 7 ),
an aperture ( 2 ), wherein the collected optical signal from the aperture ( 2 ) is formed, and wherein collecting optics ( 6 ) and aperture ( 2 ) are matched to one another in such a way that there is a collection efficiency for the optical signal generated in focus which is substantially homogeneous along the longitudinal axis of the elongated focus in the central region thereof and which substantially disappears outside the central region; and with
a detection device ( 1 ) for detecting the optical signal passing through the aperture ( 2 ), the detection device ( 1 ) permitting the scanning of the passage of the particle caused by the displacement device through the elongated focus ( 7 ).
Priority Applications (3)
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| EP0421736A2 (en) * | 1989-10-02 | 1991-04-10 | Louis A. Kamentsky | Method and apparatus for measuring optical properties of biological speciments |
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