DE19860278A1 - Verfahren und Vorrichtung zur optischen Detektion eines auf einer Oberfläche immobilisierten Partikels - Google Patents

Abstract

Aufgabe der Erfindung ist es, eine quantitative Analyse der optischen Helligkeit von auf einer Oberfläche immobilisierten Partikeln zu ermöglichen. Bei dem Verfahren wird die Oberfläche (8) mit einem Lichtstrahl (5) derart bestrahlt, daß sich auf der Oberfläche ein elliptischer Fokus (7) mit einer Längsachse und einer kürzeren Querachse bildet. Die Oberfläche (8) mit dem immobilisierten Partikel wird in Richtung (9) der Querachse des elliptischen Fokus verschoben, wodurch alle Partikel quer durch den Fokus wandern. Das im Fokus (7) erzeugte optische Signal der Partikel wird über eine Sammeloptik (6) auf eine Spaltblende (2) abgebildet. Durch die Spaltblende werden nur Partikel aus einem zentralen Ausschnitt des elliptischen Fokus detektiert. Diese erfahren jeweils im wesentlichen die gleiche Anregungsintensität. Ihre Signale sind daher quantitativ besser definiert. Dies erlaubt auch eine quantitative Auswertung der Signalstärken.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur optischen Detek­ tion eines auf einer Oberfläche immobilisierten Partikels.

Die optische Detektion einzelner Partikel bis hinunter zu einzelnen Molekülen ist eine etablierte Technik. Eine Überblick über die Detektion einzelner Moleküle in Flüssigkeiten und auf Oberflächen und deren Anwendungen in Chemie, Biologie und Nanotechnologie findet man z. B. in der Übersichtsarbeit von Nie und Zare [S. M. Nie und R. N. Zare, "Optical detection of single molecules", Annual Review of Biophysi­ cal and Biomolecular Structure 26, 567-596, 1997]. Ein Standardverfahren zur opti­ schen Detektion von Partikeln besteht darin, daß das zu detektierende Partikel durch einen fokussierten Laserstrahl optisch angeregt und dann ein durch das Partikel gene­ riertes optisches Signal (Fluoreszenz, Ramanstreuung o. ä.) detektiert wird. Die Parti­ kel können sich dabei frei in Lösung oder immobilisiert auf einer Oberfläche befin­ den.

Um Hintergrundsignale zu minimieren, wird eine räumliche Einschränkung des Detektionsgebietes vermittels einer starken Fokussierung des anregenden Laserstrahls und zusätzlicher Einbringung von räumlichen Blenden in den Detektionskanal vorge­ nommen. Das zu detektierende Partikel wird in dieses Detektionsgebiet eingebracht entweder durch freie Diffusion, durch hydrodynamische Konvektion, oder, bei ober­ flächenimmobilisierten Partikeln, durch Verschiebung des Detektionsgebietes über die Oberfläche.

Für chemo- und bioanalytische Zwecke ist es von großem Interesse, nicht nur einzelne Partikel an sich zu detektieren, sondern auch Aussagen über deren Eigen­ schaften machen zu können. Ein Weg dahin besteht darin, die optische Helligkeit (der Fluoreszenz, Ramanstreuung o. ä.) des Partikels quantitativ zu messen.

Im allgemeinen hängt die gemessene Quantität des vom Partikel generierten op­ tischen Signals nicht nur von seiner Eigenhelligkeit ab, welche im wesentlichen durch den Absorptionsquerschnitt und die Quantenausbeute der optischen Signalgenerierung des Partikels bestimmt ist, sondern auch von der Art und Weise, wie das Partikel durch das Detektionsgebiet hindurch geführt wird. Das Intensitätsprofil des anregen­ den Laserstrahls wie auch die Detektionseffizienz der detektierenden Optik sind im allgemeinen beide Funktionen des Ortes, so daß das Partikel an verschiedenen Orten unterschiedlich stark angeregt und unterschiedlich gut detektiert wird. Befindet sich somit ein Partikel mit hoher Eigenhelligkeit am Rande des anregenden Laserstahls und/oder des durch die Detektionsoptik definierten Detektionsgebietes, so kann seine Helligkeit scheinbar wesentlich dunkler erscheinen als die eines Partikels mit geringer Eigenhelligkeit, welches jedoch im Zentrum des anregenden Laserstrahls und/oder des Detektionsgebietes positioniert ist. Wird eine Oberfläche, auf der Partikel immobili­ siert sind, mit einem kleinen Fokus abgetastet, so werden von ein und demselben Par­ tikel die unterschiedlichsten Signalstärken erfaßt, i.d.R. jedoch kleine Signalstärken, da das Partikel nur selten zentral durch den Fokus tritt. Eine quantitative Analyse der Signale ist nicht möglich.

Für oberflächenimmobilisierte Partikel wurde in der Literatur die Möglichkeit beschrieben, die Oberfläche insgesamt möglichst homogen auszuleuchten und das durch die Partikel generierte optische Signal durch eine hochsensitive Kamera zu er­ fassen [M. Ishikawa, K. Hirano, T. Hayakawa, S. Hosoi und S. Brenner, "Single- Molecule Detection by Laser-Induced Fluorescence Technique with a Position- Sensitive Photon-Counting Apparatus", Japanese Journal of Applied Physics Part 1 33(3A), 1571-6, 1994]. Der Nachteil dieser Technik besteht in der Schwierigkeit, eine räumlich völlig homogene Ausleuchtung und optische Detektion zu erreichen, und besonders in den sehr hohen Kosten der Kamera, welche bei schwachem optischen Signal (wie etwa bei einzelnen Molekülen) einzelphotonenempfindlich sein muß. Au­ ßerdem stellt die hohe Intensität des Hintergrundsignals ein ernsthaftes Problem bei diesem Verfahren dar.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren anzugeben, die ein quantitatives Analysieren der optischen Helligkeit von auf einer Oberfläche immobilisierten Partikeln mit einfachen Mitteln erlauben.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Verfahren mit den Merkmalen des Anspruch 1 bzw. durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruch 7 ge­ löst.

Durch das Verfahren bzw. die Vorrichtung werden die optischen Anregungs- und Detektionsbedingungen für die optische Detektion einzelner Partikel, welche auf einer Oberfläche immobilisiert sind, für jedes Partikel im wesentlichen identisch ge­ staltet, also normiert. Die optische Abbildung der Blende auf die Oberfläche definiert den Bereich optimaler Detektionseffizienz innerhalb des annähernd homogen anre­ genden mittleren Bereichs des elongierten Fokus. Die Partikel treten aufgrund der Verschiebung durch den Fokus senkrecht zu dessen Längsachse hindurch. Sie erfah­ ren daher ein im wesentlichen einheitliches Anregungsprofil. Das pro Partikel detek­ tierte optische Signal ist dann proportional zur Eigenhelligkeit der Partikel und unab­ hängig von der Position des Partikels auf der Oberfläche. Die Eigenhelligkeit kann somit für chemo- und bioanalytische Zwecke quantitativ ausgewertet werden.

Mit Hilfe der Vorrichtung kann für ein Ensemble von detektierten einzelnen Partikeln eine Helligkeitsstatistik (Histogramm der Stärke des pro Partikel detektier­ ten optischen Signals) erstellt werden. Da alle Partikel, welche detektiert werden, den im wesentlichen gleichen Anregungs- und Detektionsbedingungen ausgesetzt sind, widerspiegelt diese Statistik direkt die Verteilung der Eigenhelligkeiten der detektier­ ten Partikel. Setzt sich das Ensemble von Partikeln z. B. aus einer diskreten Anzahl verschiedener Partikelsorten unterschiedlicher Eigenhelligkeit zusammen, so wird je­ der Partikelsorte ein Maximum in der Helligkeitsstatistik entsprechen. Somit läßt sich aus der Helligkeitsstatistik direkt das Vorhandensein (bzw. die Abwesenheit) einer bestimmten Partikelsorte ablesen. Außerdem kann über die Kenntnis der Zahl der de­ tektierten Partikel in einem der Maxima der Helligkeitsstatistik die Oberflächenkon­ zentration der dem Maximum entsprechenden Partikelsorte bestimmt werden.

Wenn die Eigenhelligkeit der Partikel proportional ist zu einer chemo- oder bio­ analytisch relevanten Eigenschaft der Partikel, so spiegelt die Helligkeitsstatistik di­ rekt die statistische Verteilung auch dieser chemo- oder bioanalytisch relevanten Ei­ genschaft wider. Das Verfahren ist z. B. direkt anwendbar auf die Bestimmung der Größenverteilung von Partikeln, welche mit optisch anregbaren und detektierbaren Markern derartig markiert wurden, daß die Zahl der Marker per Partikel proportional ist zur Größe der markierten Partikel.

Das Verfahren und die Vorrichtung sind auf jedes beliebige durch Licht anreg­ bare optische Signal von Partikeln anwendbar, wie z. B. Fluoreszenz, Ramanstreuung oder Rayleighstreuung. Das Verfahren und die Vorrichtung sind auf jede Art von Par­ tikeln anwendbar, welche bei optischer Anregung ein optische Signal generieren, sei­ en es vielatomige Teilchen oder einzelne Moleküle. Das Verfahren und die Vorrich­ tung sind auch auf Partikel anwendbar, bei denen das optische Signal nicht durch opti­ sche Anregung, sondern z. B. durch Chemolumineszenz entsteht.

Zur quantitativen Analyse der Stärke des optischen Signals und zur Bestimmung der Eigenhelligkeit des Partikels ist es entscheidend, daß die Stärke des optischen Si­ gnals während des Durchtritts durch den Fokus in ihrem Verlauf erfaßt wird. Dies er­ laubt eine Integration oder sonstige Verarbeitung. Zu vermeiden ist, daß das Partikel nur an einzelnen Stellen knapp vor oder nach dem Fokus beobachtet wird. Dazu sollte die Verschiebung kontinuierlich oder mit einer Schrittweite erfolgt, die kleiner als die Länge der Querachse ist. Die Detektion muß zur Verschiebung passend ausgelegt sein. D. h. bei einer kontinuierlichen Relativverschiebung von Oberfläche bzw. Parti­ kel und optischer Anordnung muß die Detektion in hinreichend kleinen Zeitinterval­ len erfolgen.

Wird bei der Relativverschiebung nicht die Oberfläche, sondern der Fokus ver­ schoben, so müssen auch die Sammeloptik, die Blende und der Detektor über die fixe Oberfläche bewegt werden. Dazu bilden sie vorteilhafterweise eine bauliche Einheit.

Die Blende kann sowohl eine Spaltblende, deren Spalt parallel zur Oberfläche und zur Querachse des elongierten Fokus ausgerichtet ist, als auch eine Rechteckblen­ de sein, deren Längsachse parallel zur Oberfläche und zur Längsachse des elongierten Fokus ausgerichtet ist.

Auch bei dieser optischen Anordnung ist es noch möglich, daß ein Partikel am Rand des elongierten Fokus bzw. des Abbilds der Blende angeregt wird und ein schwaches Signal liefert, obwohl seine Eigenhelligkeit im Prinzip groß ist. Die Mehr­ zahl der Partikel wird jedoch durch den wesentlich größeren zentralen Bereich des elongierten Fokus und des Abbilds der Blende hindurchtreten. Dies führt jeweils zu im wesentlichen konstanten und starken optischen Signalen. Die Varianz der Stärke der optischen Signale einer Vielzahl von einzelnen Partikeln (Helligkeitsstatistik) wird somit gegenüber einem einfachen konfokalen Aufbau verkleinert. Die Verteilung der optischen Signalstärke weißt ein Maximum in der Nähe des Erwartungswerts auf.

Dieses kann zur quantitativen Charakterisierung der Partikel mit hinreichender stati­ stischer Zuverlässigkeit verwendet werden.

Eine weitere Verkleinerung der Varianz der Helligkeitsstatistik kann auf folgen­ de Weise erreicht werden. Die Blende wird in Richtung der Längsachse des elongier­ ten Fokus in Schwingung versetzt. Dabei wird die Amplitude der Schwingung ent­ sprechend der räumlichen Ausdehnung des Übergangs von im wesentlichen maxima­ ler Sammeleffizienz zu im wesentlichen verschwindender Sammeleffizienz in der Ebene des elongierten Fokus gewählt. Partikel, die am Rand des Abbilds der Blende durch den Fokus treten, erfahren dann abwechselnd eine verschwindende und eine maximale Anregung. Die Stärke ihrer optischen Signale weißt dann charakteristische Modulationen auf. Um diese detektieren zu können, wird die Frequenz der Schwin­ gung zu den Zeitintervallen der Abtastung passend gewählt. Bei der Datenauswertung werden die jeweils detektierten optischen Signale auf eine Modulation ihrer Stärke hin untersucht. Wird eine Modulation mit der genannten Frequenz der Schwingung fest­ gestellt, so liegt ein Signal eines Partikels vor, das am Rande des Abbilds der Blende durch den Fokus trat. Diese Signale sind i.d.R. schwächer als es die Eigenhelligkeit erwarten läßt. Um eine Fehleinschätzung der Eigenhelligkeit dieser Partikel zu ver­ meiden, können sie bei einer weitergehenden Auswertung unberücksichtigt bleiben, oder ihre reduzierte Eigenhelligkeit wird rechnerisch berücksichtigen. Auf diese Wei­ se wird die Varianz der Helligkeitsstatistik weiter verkleinert.

In vorteilhafter Weiterbildung der Erfindung wird die Oberfläche mit einem zir­ kular polarisierten Lichtstrahl bestrahlt. Dadurch wird ein eventueller Einfluß der Par­ tikelorientierung auf die Anregungseffizienz ausgemittelt.

Eine weitere Möglichkeit, das Hintergrundsignal für die Detektion der einzelnen Partikel zu verkleinern, wird dadurch erreicht, daß der Lichtstrahl von der dem Parti­ kel abgewandten Seite der Oberfläche aus unter einem Winkel eingestrahlt wird, der eine totale interne Reflexion des Lichtstrahls an der das Partikel tragenden Oberfläche bewirkt, wodurch das Partikel evaneszent angeregt wird. Dadurch werden Rückrefle­ xionen des Anregungslichts vermieden.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen ge­ kennzeichnet.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher er­ läutert, die in den Figuren schematisch dargestellt sind. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeichnen dabei gleiche Elemente. Im einzelnen zeigt:

Fig. 1 eine perspektivische Ansicht der Detektionsvorrichtung mit Auflichtan­ regung, und

Fig. 2 eine perspektivische Ansicht der Detektionsvorrichtung mit evanes­ zenter Anregung in Totalreflektion.

1. Ausführungsbeispiel

Auf einer planaren Probenoberfläche 8 (z. B. Deckgläschen) seien die zu detek­ tierenden Partikel immobilisert. Die optische Anregung dieser Partikel erfolgt durch einen Laserstrahl 5 mit elongiertem (z. B. elliptischem) Intensitätsprofil, welcher über den dichroitischen Spiegel 4 und die Optik 6 (z. B. Mikroskopobjektiv) auf die Pro­ benoberfläche 8 fokussiert wird. Auf der Probenoberfläche 8 wird damit der elongierte Anregungsfleck 7 gebildet. Der Laserstrahl kann dabei so polarisiert sein, daß die Po­ larisation des Anregungslichtes im Anregungsfleck 7 zirkular ist, um somit die Anre­ gungseffizienz der Partikel unabhängig von der oberflächenparallelen Orientierung der Partikelabsorptionsdipole zu gestalten. Das von den Partikeln in diesem Anre­ gungsfleck 7 erzeugte optische Signal wird über die Optik 6 gesammelt. Der dichroi­ tische Spiegel 4 ist reflektierend für die Anregungswellenlänge des Lasers und durch­ lässig für die Wellenlänge des von den Partikeln generierten optischen Signals. Somit gelangt das von den Partikeln emittierte Licht über die Spaltblende 2 in den photo­ elektrischen Detektor 1 (z. B. Photoelektronenvervielfacher), welcher das einfallende Licht in ein elektrisches Signal umwandelt, was durch eine nachfolgende Elektronik verarbeitet und ausgewertet werden kann. Die Längsachse des Anregungsflecks 7 steht senkrecht zur Spaltrichtung der Spaltblende 2, und die Längsausdehnung des Anregungsflecks 7 ist größer als das Abbild der Spaltenbreite der Spaltblende 2, so daß die Detektionseffizienz im Detektionsgebiet nahezu unabhängig von der Position der Partikel senkrecht zur Spaltrichtung (entlang der Längsachse des Anregungsflecks 7) ist.

Um einen Einfluß der Abhängigkeit der photoelektrischen Empfindlichkeit des photoelektrischen Detektors 1 über dessen Detektorfläche auf die Detektionsempfind­ lichkeit auszuschließen, muß die Vergrößerung der Optik 6 so gewählt werden, so daß der Detektor 1 jeden Punkt des Detektionsgebiets gleich empfindlich detektiert. Die Detektionseffizienz hängt dann im wesentlichen nur ab von der Position der Partikel längs der Spaltrichtung der Spaltblende 2 (quer zur Längsachse des Anregungsflecks 7).

Durch gleichmäßige relative Verschiebung der Probenoberfläche 8 entlang der Richtung 9 werden die zu detektierenden Partikel in das Detektionsgebiet hinein- und wieder hinaustransportiert. Die Verschiebung kann dabei kontinuierlich oder in dis­ kreten Schritten erfolgen. Beträgt die Ausdehnung der Querachse des Fokus 7 im beu­ gungsbegrenzten Fall etwa 1 µm, so empfiehlt sich eine Schrittweite der Verschie­ bung von deutlich unter 0,5 µm, idealerweise etwa 0,1 µm. Bei größeren Abmessun­ gen der Querachse kann auch die Schrittweite größer gewählt werden.

Simultan zur Verschiebung wird die Intensität des von den Partikeln generierten optischen Signals in Zeitintervallen gemessen. Die Länge dieser Zeitintervalle ist we­ sentlich kürzer als die Verweilzeit der Partikel im Anregungsfleck 7. Damit entsteht ein kontinuierlicher Datenstrom, der jedem Zeitintervall die Quantität des darin ge­ messenen optischen Signals zuordnet. Da die Länge eines Zeitintervalls wesentlich kürzer ist als die Verweilzeit eines Partikels im Anregungsfleck 7, wird beim Eintritt eines Partikels in das Detektionsgebiet die Quantität des gemessenen optischen Si­ gnals von Zeitintervall zu Zeitintervall langsam steigen und nach Erreichen eines Ma­ ximums wieder fallen, entsprechend dem Intensitätsprofil des Anregungslichtes quer zur Elongation des Anregungsflecks 7. Damit können diese Partikeldurchgänge als Intensitätspeaks im erfaßten Datenstrom identifiziert werden. Durch Aufsummierung des optischen Signals in diesen Intensitätspeaks kann dann jedem Partikeldurchgang eine Gesamthelligkeit zugeordnet werden. Da jedes Partikel beim Durchgang durch das Detektionsgebiet dieselben Anregungs- und Detektionsbedingungen erfährt, wird diese Gesamthelligkeit proportional zur Eigenhelligkeit der Partikel sein, was eine Auswertung der ermittelten Gesamthelligkeiten für chemo- und bioanalytische Zwec­ ke ermöglicht.

2. Ausführungsbeispiel

Der Aufbau ist ähnlich zu demjenigen gemäß Ausführungsbeispiel 1, aber die optische Anregung erfolgt jetzt mit einem Laserstrahl 10 in Totalreflektion, wie in Fig. 2 gezeigt. Wiederum muß die Längsachse des Anregungsflecks 7, die Spalten­ breite der Spaltblende 2, deren gegenseitige Anordnung und die Vergrößerung der Optik 6 so gewählt sein, daß die Detektionseffizienz im Detektionsgebiet nahezu un­ abhängig von der Position der Partikel quer zur Spaltrichtung (entlang der Längsachse des Anregungsflecks 7) ist. Auch der Transport der auf der Oberfläche immobilisier­ ten Partikel sowie die Art und Weise der Erfassung des optischen Signals erfolgen wie in Beispiel 1.

Claims (11)

1. Verfahren zur optischen Detektion eines auf einer Oberfläche (8) immobili­ sierten Partikels,
wobei die Oberfläche (8) mit einem Lichtstrahl (5) derart bestrahlt wird, daß sich auf der Oberfläche ein elongierter Fokus (7) mit einer Längsachse und einer kür­ zeren Querachse bildet;
wobei die Oberfläche (8) mit dem immobilisierten Partikel und der Fokus (7) im wesentlichen in Richtung (9) der Querachse des elongierten Fokus relativ zueinander verschoben werden, wobei die Verschiebung kontinuierlich oder mit einer Schritt­ weite erfolgt, die kleiner als die Länge der Querachse ist;
wobei das im Fokus (7) erzeugte optische Signal über eine Sammeloptik (6) auf eine Blende (2) abgebildet wird, wobei Sammeloptik (6) und Blende (2) derart aufein­ ander abgestimmt werden, daß sich eine Sammeleffizienz für das im Fokus erzeugte optische Signal ergibt, die entlang der Längsachse des elongierten Fokus in dessen Mittelbereich im wesentlichen homogen ist und die außerhalb des Mittelbereichs im wesentlichen verschwindet; und
wobei das durch die Blende (2) tretende optische Signal von einer Detektions­ einrichtung (1) in Zeitintervallen detektiert wird, die das Abtasten des durch die Ver­ schiebung bewirkten Durchtritts des Partikels durch den elongierten Fokus (7) erlau­ ben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Blende (2) eine Spaltblende gewählt wird, deren Spalt parallel zur Oberfläche (8) und zur Quer­ achse des elongierten Fokus ausgerichtet ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Blende (2) eine Rechteckblende gewählt wird, deren Längsachse parallel zur Oberfläche (8) und zur Längsachse des elongierten Fokus ausgerichtet ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtstrahl (5) von der dem Partikel abgewandten Seite der Oberfläche (8) aus unter einem Winkel eingestrahlt wird, der eine totale interne Reflexion des Licht­ strahls an der das Partikel tragenden Oberfläche bewirkt, wodurch das Partikel eva­ neszent angeregt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche (8) mit einem zirkulär polarisierten Lichtstrahl (5) bestrahlt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Blende in Richtung der Längsachse des elongierten Fokus in Schwin­ gung versetzt wird,
wobei die Amplitude der Schwingung entsprechend der räumlichen Ausdehnung des Übergangs von im wesentlichen maximaler Sammeleffizienz zu im wesentlichen verschwindender Sammeleffizienz in der Ebene des elongierten Fokus gewählt wird, und
wobei die Frequenz der Schwingung zu den Zeitintervallen der Abta­ stung passend gewählt wird,
wodurch die optischen Signale von Partikeln, die am Rand des Abbilds der Blende durch den Fokus treten, in ihrer Stärke moduliert werden; und
daß die detektierten optischen Signale auf eine Modulation ihrer Stärke hin un­ tersucht und selektiert werden.

7. Vorrichtung zur optischen Detektion eines auf einer Oberfläche (8) immobili­ sierten Partikels, mit
einer Lichtquelle zum Erzeugen eines Lichtstrahls (5);
einer Fokussieroptik (6) zum Erzeugen eines elongierten Fokus (7) des Licht­ strahls (5) auf der Oberfläche (8), wobei der Fokus eine Längsachse und einer kürze­ ren Querachse hat;
einer Verschiebeeinrichtung zum Bewirken einer Relativverschiebung zwischen der Oberfläche (8) und dem Fokus (7), wobei die Verschiebung im wesentlichen in Richtung (9) der Querachse des elongierten Fokus (7) und kontinuierlich oder mit ei­ ner Schrittweite erfolgt, die kleiner als die Länge der Querachse ist;
einer Sammeloptik (6) zum Sammeln des im Fokus (7) erzeugten optischen Si­ gnals,
einer Blende (2), wobei das gesammelte optische Signal auf die Blende (2) ab­ gebildet wird, und wobei Sammeloptik (6) und Blende (2) derart aufeinander abge­ stimmt sind, daß sich eine Sammeleffizienz für das im Fokus erzeugte optische Signal ergibt, die entlang der Längsachse des elongierten Fokus in dessen Mittelbereich im wesentlichen homogen ist und die außerhalb des Mittelbereichs im wesentlichen ver­ schwindet; und mit
einer Detektionseinrichtung (1) zum Detektieren des durch die Blende (2) tre­ tenden optischen Signals, wobei die Detektionseinrichtung (1) das Abtasten des durch die Verschiebeeinrichtung bewirkten Durchtritts des Partikels durch den elongierten Fokus (7) erlaubt.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Blende (2) eine Spaltblende ist, deren Spalt parallel zur Oberfläche (8) und zur Querachse des elongierten Fokus ausgerichtet ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Blende (2) eine Rechteckblende ist, deren Längsachse parallel zur Oberfläche (8) und zur Längs­ achse des elongierten Fokus ausgerichtet ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtstrahl (5) zirkular polarisiert ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, gekennzeichnet durch ei­ ne Vibrationseinrichtung zum Versetzen der Blende in Schwingung in Richtung der Längsachse des elongierten Fokus, wobei die Amplitude der Schwingung der räumli­ chen Ausdehnung des Übergangs von im wesentlichen maximaler Sammeleffizienz zu im wesentlichen verschwindender Sammeleffizienz in der Ebene des elongierten Fo­ kus entspricht, und wobei die Frequenz der Schwingung zu den Zeitintervallen der Abtastung paßt.