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DE19845883B4 - Verfahren zur Bestimmung der Phytotoxizität einer Testsubstanz - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung der Phytotoxizität einer Testsubstanz Download PDF

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DE19845883B4 DE19845883A DE19845883A DE19845883B4 DE 19845883 B4 DE19845883 B4 DE 19845883B4 DE 19845883 A DE19845883 A DE 19845883A DE 19845883 A DE19845883 A DE 19845883A DE 19845883 B4 DE19845883 B4 DE 19845883B4
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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Abstract

Verfahren zur Bestimmung der Phytotoxizität einer Testsubstanz, wobei in einem Biotest mindestens eine biologische Probe der Testsubstanz ausgesetzt und die Phytotoxizität durch Vergleich von Daten der Probe und Referenzdaten mindestens einer neutralen Referenzprobe bestimmt wird, wobei die Daten und die Referenzdaten mittels einer digitalen Kamera aufgenommen und mittels eines Bildanalysesystems verglichen werden, wobei das Bildanalysesystem durch Vermessen eines Einheitskörpers bekannter Körpergeometrie und Farbe automatisch kalibriert wird und wobei die biologischen Proben vor Versuchsbeginn mittels des Bildanalysesystems vermessen und inhomogene Proben aussortiert werden.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Phytotoxizität einer Testsubstanz. Biotests sind bekannt. So werden z.B. biologische Kurzzeittests zur Keimung und zum weiteren Wachstum von Pflanzen insbesondere der Wurzel und des Sprosses bis zum Keimblattstadium durchgeführt.
  • Derartige Biotests werden je nach Fragestellung zur Bestimmung der Vitalität von Saatgut, besonders aber zum integralen Aufspüren von phyto/pflanzentoxischen Wirkungen von Reinstoffen, Stoffgemischen und Umweltproben (Wasser, Wasserkonzentrate, Boden, Sediment, Boden- und Sedimenteluate und -extrakte, Feststoffe) eingesetzt.
  • Sie ermöglichen die integrale Bewertung von in die Umwelt einzubringenden oder dort vorkommenden Stoffen hinsichtlich möglicher Gefährdungspotentiale z.B. durch Schadstoffeintrag aus der Luft und dem Regen in Waldgebieten. Für potentielle Schadstoffgemische mit komplexer, chemisch-analytisch gar nicht umfassend analysierbarer Zusammensetzung – z.B. Abwasser-, Deponiesickerwasserströme, Bodenextrakte besonders aus Altlasten und deren biologische Sanierungsprodukte – Verbrennungsprodukte (Abgase) aus der Chemischen Industrie, der Energieerzeuger und dem Straßenverkehr sind integrale Wirkungstests zur ökotoxikologischen Bewertung unverzichtbar.
  • Biotests können besonders bei modernen Pflanzenschutzmitteln (hoher Wirksamkeit bei geringer Aufwandmenge) in Ergänzung und Konkurrenz zur oft schwierigen chemischen Analytik treten.
  • Das Wachstum von terrestrischen oder aquatischen Gefäßpflanzen ist die lebenswichtige Grundlage für jegliches tierische und menschliche Leben auf der Erde. Trotzdem wurde die Verwendung von Gefäßpflanzen zum Aufspüren von Schadstoffen bisher stark gegenüber dem Einsatz von einzelligen Algen vernachlässigt. Gefäßpflanzen sind jedoch z.B. gegenüber au xinanalogen Herbiziden viel empfindlicher als einzellige Algen, da letztere nicht über eine auxingesteuerte Wachstumsregulation verfügen. Die Bewertung von Luftschadstoffen ist erst durch die quantitative Erfassung von höheren Pflanzen möglich.
  • Der Grund für den selteneren Einsatz von Gefäßpflanzen ist unter anderem die höhere Formenvielfalt und Komplexität von Gefäßpflanzen, welche bisher eine manuell optische und damit zeit- und kostenintensive und niemals völlig objektivierbare Auswertung erforderlich macht.
  • Der Pflanzen-Keimungs-Wurzellängentest z.B. nutzt die hohe Empfindlichkeit von Pflanzen gegenüber toxischen Stoffen während der Keimungsphase bis zur Ausbildung der Keimblätter aus.
  • Richtlinien für die Testdurchführung finden sich z.B. in:
    • – DIN Entwurf 38412 "Bestimmung der Wirkung von Abwasser auf das Wurzellängenwachstum der Gartenkresse". Dieser sieht ein dreitägiges beleuchtetes Wachstum von Kressesamen auf Edelstahlnetzen in eine Verdünnungsreihe von Abwasser vor. Als Meßgrößen dient die manuell gemessene Wurzellänge. Außerdem sollen Erscheinungen wie die Ausbildung der Wurzelhaarzone und Entwicklungszustand von Hypokotyl und Blättern protokolliert werden.
    • – Der Entwurf DIN 350 11 269 Teil 1 beschreibt die Prüfung des Wachstums vorgekeimter Gerstesamen in Bodenproben. Auch hier sollen nach 5 bis 7 Tagen und Entfernung der Erde die Länge der längsten Wurzel, gegebenenfalls auch die des Triebes gemessen werden.
    • – Die EPA-Richtlinie 600-3-88-029 sieht ein fünftägiges „Protocols for short term toxicity screening of hazardous waste sites" Wachstum z.B. von Salatsamen im hell-/dunkel-Zyklus in Petrischalen in Gegenwart der Testlösung vor. Mögliche Meßgrößen sind Keimung, Wurzellänge und Trockengewicht.
  • Allen Richtlinien ist gemeinsam, daß neben der zerstörenden Trockenmassebestimmung nur die einfachste Meßgröße des Wachstums – die Länge der Wurzel- bestimmt wird, da nur diese Längenmessung dem menschlichen Auge problemlos möglich ist.
  • Weiter bekannt sind biologische Kurzzeittests zur Wachstumshemmung/-förderung von Wasserlinsen (Lemnaceae):
    Wurzelnde oder freischwimmende Gefäßpflanzen sind neben Algen ein wesentlicher Bestandteil vieler aquatischer Ökosysteme. Wasserlinsen sind eine Nahrungsquelle für Wasservögel und viele Kleintiere. Sie dienen Fischen als Futter, Deckung und Schatten. Kleine wirbellose Tiere nutzen sie als Träger. Bei zu schnellem Wachstum können sie jedoch Licht- und Sauerstoffzufuhr soweit unterbinden, daß es zu Fischsterben kommt.
  • Ein Test ist z.B. in der ASTM Guideline E 1415-91 "Standard Guide for Conducting Static Toxicity Tests With Lemna gibba G3" dargestellt. Eine vergleichbare europäische Richtlinie gibt es noch nicht. Der Test nutzt die Tatsache aus, daß sich die Schwimmblätter von Wasserlinsen bei ausreichender Temperierung, Beleuchtung und Nährstoffversorgung sehr schnell teilen. Unter toxischer Belastung kommt es jedoch zu einer Gelbfärbung vorhandener Schwimmblätter und zu einer Verringerung der Teilungsgeschwindigkeit.
  • Dazu müssen vor Testbeginn nach Augenmaß in alle Versuchsansätze „gleichwertige" Wasserlinsenpflanzen aus der Vorzucht aussortiert und in Gefäße mit Nährlösung eingesetzt werden. Dies ist grundlegend, da sich Startunterschiede im Verlauf des Tests weiter vergrößern und damit Schadstoffeffekte verdecken können. Gleichzeitig ist die optisch manuelle Auswahl von Pflanzen mit „gleichwertiger" Blattanzahl und Größe auch in Hinblick auf die Erfordernisse der Qualitätssicherung und Dokumentation mit einem hohen subjektiven Faktor belastet. Nach Ende der normalerweise siebentägigen Wachstumsphase im Phytotron, einer sehr gleichmäßig ausgeleuchteten Klimakammer, muß anhand einer geeigneten Meßgröße die Förderung oder Hemmung des Wachstums behandelter Versuchsansätze gegenüber unbehandelten Kontrollansätzen ermittelt werden. Die häufigste und einfachste Methode ist die Zählung der einzelnen Schwimmblätter unabhängig von deren Größe. Weitere Meßgrößen sind die Anzahl der gebildeten Wurzeln, das Trockengewicht und die Gesamtlänge aller Wurzeln. Das Trockengewicht ist der objektivste und reproduzierbarste Endpunkt, ist aber nur einmal unter Zerstörung der Wasserlinsen möglich. Der Chlorophyllgehalt ist sehr aussagekräftig für die Vitalität der Pflanzen, aber ebenfalls nur unter Zerstörung direkt meßbar.
  • Nachteilig bei den genannten Testverfahren ist der hohe Arbeitsaufwand, die schlecht dokumentierbaren, da subjektiven Einflußfaktoren und/oder die objektzerstörenden Maßnahmen.
  • Im weiteren Umfeld der Erfindung offenbaren die DE 39 06 215 A1 und die auf dieser aufbauende WO 90/10273 A1 ein Verfahren und eine Vorrichtung zur automatischen optischen Klassifikation von Topfpflanzen durch bildpunktweise Klassifikation von Bildern der Topfpflanzen nach vorgegebenen Farbklassen sowie basierend auf dieser Klassifikation ein Verfahren und eine Anordnung zur Steuerung des Wachstumsprozesses von Pflänzlingen durch Regelung der Umgebungstemperatur.
  • Die WO 95/25 955 A1 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der Toxizität einer wasserlöslichen oder mit Wasser mischbaren Substanz, wobei die Bewegungsgeschwindigkeit von niederen Tieren vor und nach Zugabe der Substanz zur wässrigen Umgebung mittels einer Bilderfassungseinheit mit Objekterkennung beobachtet und gemessen wird und daraus eine relative Toxizität der Substanz ermittelt wird.
  • Aus der DE 38 36 716 A1 ist weiterhin ein Verfahren bekannt zur Auswertung von Zellbildern, wobei die Zellbilder zunächst interaktiv markiert und anschließend statistische Kenngrößen der Zellbilder aus der Anzahl und der Position der Marken ermittelt werden.
  • Die DE 42 11 904 A1 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Ermittlung des ökologischen Zustands einer flüssigen Probe, wobei automatisch anhand von Referenzobjekten Objekte unterschiedlicher Arten optisch identifiziert und gezählt werden und eine Liste der Objekte erstellt wird.
    •
  • Es ist demzufolge Aufgabe liegenden Erfindung, unter Vermeidung der aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile eine einfach durchzuführende, objektivierbare und objekterhaltende Möglichkeit zur Durchführung und Auswertung von Biotests zu schaffen.
  • Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung der Phytotoxizität einer Testsubstanz, wobei in einem Biotest mindestens eine biologische Probe der Testsubstanz ausgesetzt und die Phytotoxizität durch Vergleich von Daten der Probe und Referenzdaten mindestens einer neutralen Referenzprobe bestimmt wird, wobei die Daten und die Referenzdaten mittels einer digitalen Kamera aufgenommen und mittels eines Bildanalysesystems verglichen werden, wobei das Bildanalysesystem durch Vermessen eines Einheitskörpers bekannter Körpergeometrie und Farbe automatisch kalibriert wird und wobei die biologischen Proben vor Versuchsbeginn mittels des Bildanalysesystems vermessen und inhomogene Proben aussortiert werden.
  • Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
  • So ist es bevorzugt, wenn die Vorrichtung Mittel zur automatischen Diskriminierung von Probenbestandteilen wie z.B. Samenhülle, Sproß, Wurzel, Wurzelhaare oder von Wurzelhaaren überdeckter Fläche, und zur darauffolgenden quantitativen Vermessung der Bestandteile auf z.B. Länge, Breite und Schattenfläche aufgrund der erhobenen Daten mittels Bildanalyse aufweist.
  • Weiter vorteilhaft sind Mittel zur Wiederauffindung individueller Proben, Probenbestandteile oder Probengruppen bei periodischen Vermessungen der gleichen Probe anhand von spezifischen Formmerkmalen und Informationen über die räumlichen Veränderungsmöglichkeiten zwischen den Messungen.
  • Wenn an/in den Versuchseinheiten im Sichtfeld der Kamera Barcodes angeordnet sind, die zur sicheren Zuordnung der einzelnen Messungen jeweils bildanalytisch mit ausgewertet werden und neben Informationen zum Testansatz auch Angaben über die computergenerierte Plazierung der Schale bei randomisierten Versuchen enthalten, liegt eine weitere bevorzugte Ausführungsform vor.
  • Es ist weiter vorteilhaft, wenn eine Einrichtung zur automatischen Kalibrierung mit einem Einheitskörper bekannter Körpergeometrie und Farbe durch automatisches Vermessen von der Bildverarbeitung vorgesehen ist. Hierdurch können in einfacher Weise die Probendaten in absolute Werte umgerechnet werden.
  • Besonders vorteilhaft ist es, wenn der oder die Barcodes auf dem Einheitskörper zur Kalibrierung angeordnet sind, da so der apparative Aufwand reduziert wird.
  • Wenn dies erforderlich sein sollte, die Bildanalyse auch ohne sichtbares Licht durchzuführen, kann eine Beleuchtungseinrichtung zum Auswerten in dunkler Testumgebung mit einem Wellenlängenbereich, der die Pflanzen in ihrem Verhalten nicht beeinflußt und bei der die CCD-Kamera arbeitet, verwendet werden.
  • Insbesondere kann dies eine Infrarotbeleuchtungseinrichtung sein.
  • Die in manchen Testreihen erforderliche, nach Farben getrennte Erfassung und Auswertung der Proben wird durch eine Farbkamera oder eine optische Filtereinrichtung realisiert.
  • Vorteilhaft ist weiter, Mittel zum Vergleichen der gewonnenen Daten mit abgespeicherten Vergleichsdaten vorhanden sind. Hierdurch kann auf im Laufe der Zeit angesammeltes Referenzdatenmaterial zurückgegriffen werden.
  • Wenn die Aufnahmeeinrichtungen (CCD Kamera) und die Auswerteeinrichtungen (Bildanalysesystem) räumlich getrennt sind, kann die Auswertung in vorteilhafter Weise zentral durchgeführt wird. Hierdurch muß nicht an jedem Test-/Arbeitsplatz die volle Rechenleistung vorgehalten werden.
  • Die CCD Kamera und die Probenschalen sollte relativ zueinander beweglich angeordnet sein, damit die CCD Kamera unterschiedliche Probenbereiche anfahren, fokussieren und aufnehmen kann.
  • Bevorzugt ist weiter, wenn die Auswerteeinrichtungen (Bildanalysesystem) anhand von Farb- und Strukturmustern der Testpflanzen Rückschlüsse auf die Xenobiotika (Umweltchemikalien) ziehen kann. Xenobiotika (Umweltchemikalien) verursachen bei den genannten Pflanzen verschiedene Strukturwandlungen. Die Pflanzen können sich z.B. in Farbe, Form, Größe, Teilungsrate, Infrarotmuster oder Chlorophyllgehalt verändern. Es kann vollständiger und partieller Pigmentverlust auftreten. Es kommt zu Kolonieenaufbruch, zur Buckelbildung, zum Verlust oder zur extremen Bildung von Wurzelhaaren. Wasserlinsen können Antozyane auf der Unterseite bilden, oder sie bilden Turione. All diese Merkmale können Rückschlüsse auf vorhandene Xenobiotika zu lassen. Die meisten Merkmale sind jedoch nach heutigem Stand der Technik nur durch Zerstörung des Organismus zu bestimmen. Dadurch können immer nur einzelne Merkmale untersucht werden, und die spezifische Aussagekraft der Messung ist nicht gegeben. Durch die Integrale Erfassung aller Merkmale, kann die Auswerteeinrichtung Rückschlüsse auf die vorliegenden Xenobiotika machen. Dabei werden zwei ver schiedene Strategien verfolgt. Zum einen erkennt die Auswerteeinrichtung vorgegebene Merkmalsmuster, zum anderen werden durch eine Vielzahl von Tests neue Merkmalsverknüpfungen von der Auswerteeinrichtung selbständig gefunden.
  • Ein weiteres vorteilhaftes Merkmal des Verfahrens ist es, daß die Auswerteeinrichtungen (Bildanalysesystem) die Keimlinge aufgrund von Bewegungsmustern, Farb- und Formenklassen auch nach deren Aufwachsen wiederfinden kann. In Keimungs- und Aufwuchstest werden eine Vielzahl gleicher Pflanzen in einem Versuchsgefäß beobachtet. Durch die enorme Ähnlichkeit ist es bisher nicht möglich, einzelne Organismen wieder aufzufinden und sie eindeutig über längere Zeit zu identifizieren. Die Aufnahmeeinheit kann z.B. bis zu 100 Keimlinge gleichzeitig beobachten, und sie aufgrund der beschriebenen Merkmalsmuster einwandfrei zuordnen. Hinzu kommt die Möglichkeit der Wiedererkennung aufgrund von vorgegebenen Bewegungsmustern.
  • Objekte, die unter der Grenze der Auflösungsgröße der CCD-Kamera liegen (kleiner 1 mm), sollten bevorzugt originalgetreu wiedergegeben werden. Die normale Auflösungsgrenze von CCD Kameras mit einer Auflösung von 520·520 Pixeln liegt bei einem untersuchten Feld von 100 × 100 mm bei ca. 3 mm2 (520 Pixel a 3 Farben entsprechen 174 Pixel pro Farbe. Um ein Objekt klar darzustellen braucht man jedoch mindestens 3·3 Pixel). Da die Objekte bekannt sind, kann die Auswerteeinheit gefundene Objekte an bekannte Muster anfitten, und so die Auflösung erhöhen. Die Objekte werden dann nicht mehr als Pixel Matrix dargestellt, sondern als mathematische Funktion. Dadurch ist es möglich, die eigentlich beschränkte Auflösung der Kamera zu steigern und auch Objekte, die kleiner als 3 mm2 sind, maßstabsgetreu darzustellen.
  • Eine weitere bevorzugte Weiterbildung des Verfahrens liegt vor, wenn die Aufnahmeeinrichtung (CCD-Kamera) und die Auswerteeinrichtung durch Filtersysteme die Stoffwechselrate der Pflanze anhand von Infrarotmustern bestimmen kann. Ein wichtiges Merkmal für die Fitneß von Pflanzen ist deren Stoffwechselrate. Sowohl die Photosyntheseleistung, als auch die Oxidation von Stärke und Fetten verändern das Infrarotmuster durch Reflexion und eigener Emission von Pflanzen. Diese Veränderungen können mittels IR-Filtern durch die CCD Kamera sichtbar gemacht werden. Die Auswerteeinheit paßt die Filtersysteme selbständig an, und kann somit zwischen Photosynthesestoffwechsel und Atmung unterscheiden. Diese Merkmalsmuster konnten bisher nicht zerstörungsfrei und über längere Zeit erfaßt werden, da die IR-Spektren nicht von dem normalen Grundrauschen zu unterscheiden waren. Durch spezielle Beleuchtung und Kühlung lassen sich nun auch feinste Unterschiede feststellen.
  • Schließlich ist es vorteilhaft, wenn spezifische optische Filter für Beleuchtung und Kamera zur Messung und Quantifizierung der Fluoreszenz von Pflanzen vorgesehen sind. Bisher werden derartige Fluoreszenzsignale integral über die gesamte Bildfläche ausgewertet. Neuartig ist, daß derartige Fluoreszenzsignale mit morphologischen Filtern bearbeitet werden. Weiterhin werden die Bilddaten mit den Daten und Formen der Bildobjekte im sichtbaren und IR-Bereich überlagert und gemeinsam ausgewertet. Diese Anwendung eignet sich besonders für Kurzzeittests im Stundenbereich.
  • Die zur Durchführung des Verfahrens verwendete Vorrichtung (vgl. 1) zeichnet sich bei vollständiger Kompatibilität mit den vorhandenen Testrichtlinien durch eine Vermeidung der oben genannten Probleme bei gleichzeitiger Schaffung neuer, empfindlicherer Meßgrößen aus. Durch die automatische Bildanalyse werden subjektive Faktoren ausgeschlossen, der notwendige Personalaufwand drastisch reduziert. Damit werden Mehrfachmessungen problemlos möglich und eine valide, kontinuierliche Dokumentierbarkeit geschaffen.
  • Die eigentliche Auswertung wird nur durch die verwendete Software eingeschränkt. So ist es z.B. möglich, mit den gewonnenen Daten folgende Untersuchungen durchzuführen:
    • – Erkennung von Nekrosen, Chlorosen und Blattmißbildungen;
    • – Unterscheidung von toten und lebenden Blättern;
    • – Bestimmung der Wachstumsgeschwindigkeit und Keimungsrate und andere kontinuierliche oder engmaschige Bestimmungen von Parametern (z.B. Teilungsrate, Flächenzunahme, Chlorophyllentwicklung, Wachstumsdynamik, Absterbedynamik), die von Hand wegen des hohen Zeitaufwands kaum (wirtschaftlich) möglich sind;
    • – Bestimmung der Blattanzahl;
    • – Bestimmung der Frondzahl;
    • – Bestimmung von Gesamt- und Einzelfrondfläche;
    • – Bestimmung von Gesamt- und Einzelgrünheit;
    • – Bestimmung des Chlorophyllgehaltes über die Grünheit der Blätter
    • – Bestimmung des Trockengewichts über Volumenanalyse und Flächenanalyse;
    • – Bestimmung von Effektkonzentrationen (ECx);
    • – Bestimmung von Blattgrößen, Blattgrößenverteilungen und Blattformen;
    • – Gesamterfassung einer höheren Pflanze;
    • – automatischer Vergleich zu unbelasteten sogenannten Nullkontrollen, sowohl aus parallelen Versuchsansätzen als auch aus gespeicherten Datensätzen;
    • – Erfassung von IR-Mustern und Überlagerung mit sichtbaren morphologischen Strukturen;
    • – Archivierung der bildanalytischen Daten z.B. für eventuelle spätere Zweitgutachten.
  • Dabei ist es insbesondere möglich, die gewonnenen Daten mittels Datenfernübertragung an eine zentrale Analyseeinrichtung zu übermitteln, dort z.B. durch Vergleich mit großen Beständen an Standarddaten auswerten zu lassen und die Auswertung zurückzuübermitteln.
    •
  • Die in den 1 und 2 dargestellten Vorrichtungen können bei der Durchführung des Verfahrens verwendet werden.
  • In 1 ist eine Vorrichtung dargestellt, bei der die in einer Probenschale befindliche Probe auf einem Objekttisch angeordnet wird. Je nach Fragestellung erfolgt entweder keine Beleuchtung oder eine Beleuchtung von den neben der Kamera angeordneten Beleuchtungseinrichtungen als Auflicht oder von der unterhalb des Objekttisches angeordneten Beleuchtungseinrichtung als Durchlicht. Die Kamera, z.B. eine CCD Kamera nimmt die Bilder auf, die dann mittels einer Auswerteeinheit, vorzugsweise in Form eines PCs bildanalytisch verarbeitet werden. Die Daten werden auf einem Monitor dargestellt.
  • In 2 ist alternativ gezeigt, wie die Kamera oberhalb einer Klimakammer mit mehreren Proben verfahrbar angeordnet ist. Die Kamera kann so in vorgegebenen zeitlichen Abständen die einzelnen Proben anfahren und entsprechende Aufnahmen wie vorbeschrieben machen.
  • Nachstehend werden noch zwei Anwendungsbeispiele für das Verfahrens erläutert.
  • Anwendungsbeispiel Wurzellängentest
  • Die erfindungsgemäße computergestützte Bildanalyse erfaßt jeden Keimling einzeln. Mit bildanalytischen Methoden werden dann Samenhülle, Sproß und Wurzel, gegebenenfalls auch Wurzelhaare separiert und dann getrennt quantifiziert. Mögliche Meßgrößen sind z.B. Samenquellung, Keimung (Wurzel nach bestimmter Inkubationszeit länger als 1-4 mm), Wurzellänge, Wurzelschattenfläche, mittlerer Wurzeldurchmesser, Verhältnis der Wurzel länge zum Durchmesser, von den Wurzelhaaren bedeckte Fläche, Sproßlänge, Sproßfläche und Blattfläche.
  • Dies erlaubt es, ohne zusätzlichen Arbeitsaufwand auch bisher nur schlecht feststellbare Effekte wie eine Veränderung der Wurzeldicke oder Blattfläche unter Schadstoffeinfluß zu erkennen.
  • Die erst durch die Automatisierung praktikable periodische Vermessung aller Proben bei Petrischalentests während der Keim- und Wachstumsphase ermöglicht die Bestimmung zeitlicher Wachstumsparameter wie Keimungszeitpunkt und individuelle Wachstumskurven. Dies ermöglicht auch eine automatische Separierung von ungekeimten Samen und solchen, die in der Keimungs- oder ersten Wachstumsphase abgestorben sind. Zur individuellen Wiederauffindung der sich auf dem Untergrund bewegenden Keimlinge werden bei jeder Messung die räumliche Lage spezifischer Keimlingsmerkmale der einzelnen Keimlinge bildanalytisch ermittelt und mit abgespeichert. Diese Merkmale ermöglichen bei der nächsten Messung die individuelle Zuordnung von Keimlingen.
  • Die Auswertung des Versuchs erfolgt beim Test in Petrischalen entweder durch Herausnehmen der Schalen aus dem Inkubationsraum (gegebenenfalls Phytotron) in die Meßvorrichtung oder durch Einbau der Kamera in einen horizontal beweglichen Schlitten im Inkubationsraum. Dies gestattet vollautomatische Mehrfachmessungen und die Messung und Versuchsauswertung an arbeitsfreien Tagen.
  • Bei anderen Testvorschriften werden die Pflanzen von der Aufwuchsmatrix manuell befreit und anschließend bildanalytisch vermessen.
  • Zur Planarisierung kann eine Glasscheibe auf die Keimlinge/Pflanzen gelegt werden.
  • Alle Rohdaten können direkt statistisch ausgewertet werden.
  • Um Verwechslungen auszuschließen, kann an/in jedem Gefäß/Versuchsansatz im Sichtfeld der Kamera ein Barcode angebracht werden, der bei der Bildanalyse jeweils mit eingelesen wird. Er enthält neben Informationen zum Testansatz auch Angaben über die computergenerierte Plazierung der Schale bei randomisierten Versuchen.
  • Die Beleuchtung wird in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Pflanze als Durchlicht oder Auflicht ausgeführt. Ein spezieller Fall stellt die Infarotbeleuchtung dar. Mit Infarotbeleuchtung können die Keimlinge kontrolliert werden, ohne ihr Wachstum zu beeinflussen, da Infrarotlicht keine Auswirkungen auf die Photosynthese der Pflanzen hat. Anderseits ist die CCD Kamera dagegen empfindlich für Infrarotlicht.
  • Für eine automatische Kalibrierung der Meßgröße kann ein definierter Körper in die Schale eingebracht werden. Die Pixelwerte und deren Farbwerte, die von der Bildverarbeitung aufgenommen werden, können so in absolute Meßgrößen umgewandelt werden. Dies ermöglicht einen Vergleich mit manuellen Auswertungen.
  • Anwendungsbeispiel Wasserlinsentest
  • Die computergestützte Bildanalyse erfaßt jedes Blatt der Wasserlinsen im Testgefäß einzeln, stellt die Fläche fest und ermöglicht damit über die Anzahl hinaus Größenverteilungen und Gesamtfläche darzustellen. Dies erlaubt auch bisher nur schlecht feststellbare Effekte, wie eine Verkleinerung der Schwimmblätter unter Schadstoffeinfluß, zu erkennen.
  • Die Auswertung des Versuchs erfolgt entweder durch Herausnehmen der Schalen aus dem Phytotron und Plazierung in die Meßvorrichtung oder auch durch Einbau der Kamera auf einem beweglichen Schlitten im Phytotron selbst bzw. der Probe. Dies gestattet vollautomatische Mehrfachmessungen und die Messung und die Versuchsauswertung an arbeitsfreien Tagen.
  • Die Beleuchtung für die Messung erfolgt von oben mit einer zusätzlichen Beleuchtung rund um die Kamera, wobei ggf. das Licht des Phytotrons abgeschirmt wird. Zur besseren Unterscheidung von grünen, gelben und „weißen" Blättchen wird eine Farbkamera oder eine Graustufen-Kamera mit beweglichen Filtern verwendet und gegebenenfalls auch mit Durchlicht gearbeitet. Die Bestimmung der Summe aller Schwimmblätter erfolgt nach Abschaltung der Zusatzbeleuchtung ohne Filter. Bei direkten Messungen im Phytotron wird die Zusatzbeleuchtung abgeschaltet, so daß eine quasi indirekte Beleuchtung/Durchlicht vorliegt.
  • Zur Dokumentation der jeweiligen Startbedingungen in jedem Versuchsgefäß werden vor Versuchsbeginn alle einzusetzenden Wasserlinsengruppen mit der Bildanalyse vermessen und Gruppen, die enge Qualitätsanforderungen an die Homogenität nicht einhalten, aussor tiert. Dies verringert mögliche Standardabweichungen erheblich und schafft eine Testhomogenität, die mit dem menschlichen Auge alleine nicht erreichbar wäre.
  • Während des laufenden Versuches können gegebenenfalls in definierten Abständen ohne großen Aufwand Messungen durchgeführt und zeitliche Verschiebungen in der Wachstumsdynamik dokumentiert werden.
  • Für die Endauswertung, die statistischer Auswertung der Rohdaten und die Kennzeichnung mittels Barcodes gelten die vorstehenden Ausführungen analog.

Claims (16)

  1. Verfahren zur Bestimmung der Phytotoxizität einer Testsubstanz, wobei in einem Biotest mindestens eine biologische Probe der Testsubstanz ausgesetzt und die Phytotoxizität durch Vergleich von Daten der Probe und Referenzdaten mindestens einer neutralen Referenzprobe bestimmt wird, wobei die Daten und die Referenzdaten mittels einer digitalen Kamera aufgenommen und mittels eines Bildanalysesystems verglichen werden, wobei das Bildanalysesystem durch Vermessen eines Einheitskörpers bekannter Körpergeometrie und Farbe automatisch kalibriert wird und wobei die biologischen Proben vor Versuchsbeginn mittels des Bildanalysesystems vermessen und inhomogene Proben aussortiert werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Aufnahme der Daten und Referenzdaten, ihre Weiterleitung zu dem Bildanalysesystem und der Vergleich der Daten automatisch erfolgen.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Daten und Referenzdaten in dem Bildanalysesystem reduziert werden.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mittels des Bildanalysesystems bei wiederholter Aufnahme von Daten derselben Probe ein individueller Bestandteil dieser Probe wieder erkannt und seine räumliche Veränderung beschrieben wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Proben und Referenzproben automatisch platziert werden.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Biotest an Blattpflanzen durchgeführt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei mittels des Bildanalysesystems Bestandteile der Blattpflanzen unterschieden und quantitativ vermessen werden.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Biotest an Wasserlinsen durchgeführt wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei als Beleuchtung Infrarotlicht verwendet wird.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei ein Planarisierungselement, mittels dessen die Proben und die Referenzproben planarisierbar sind, verwendet wird.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei mittels des Bildanalysesystems an den Proben und Referenzproben angeordnete und diese identifizierende Barcodes ausgewertet werden.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei eine Beleuchtungseinrichtung zum Auswerten in dunkler Testumgebung mit einem Wellenlängenbereich, der die Proben und die Referenzproben in ihrem Verhalten nicht beeinflußt und bei der die digitale Kamera arbeitet, so dass die Bildanalyse auch ohne sichtbares Licht durchgeführt werden kann, verwendet wird.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei eine Farbkamera oder eine optische Filtereinrichtung mittels derer die Proben und Referenzproben nach Farben getrennt erfassbar und auswertbar sind, verwendet wird.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei ein Speicherelement zum Speichern von Vergleichsdaten, wobei die Daten der Proben und mit den Vergleichsdaten vergleichbar sind, verwendet wird.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die digitale Kamera und die Proben und Referenzproben relativ zueinander beweglich angeordnet werden, so dass die digitale Kamera unterschiedliche Probenbereiche anfahren, fokussieren und aufnehmen kann.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei spezifische optische Filter für Beleuchtung und Kamera zur Messung und Quantifizierung der Fluoreszenz von Pflanzen verwendet werden.
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