DE19754978A1 - Probenträger für die MALDI-Massenspektrometrie nebst Verfahren zur Herstellung der Platten und zum Aufbringen der Proben - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Probenträger für die massenspektrometrische Analyse von Biomolekü­ len, Verfahren zur Herstellung der Probenträger und Verfahren zum Beladen der Probenträger mit Proben der Biomoleküle aus vorwiegend wäßrigen Lösungen zusammen mit Matrixsub­ stanz für die Ionisierung der Substanzen durch matrix-unterstützte Laserdesorption (MALDI).

Die Erfindung besteht darin, die Oberfläche der Probenträger stark flüssigkeitsabweisend (hydrophob) zu machen, wodurch beim Eintrocknen der Probentröpfchen zu Probenflecken eine Struktur der MALDI-Matrixkristalle erzwungen wird, die für eine effektive Ionisierung günstig ist. Durch winzige, benetzungsfreundliche (hydrophile) Ankerbereiche für die Proben­ tröpfchen in dieser hydrophoben Umgebung wird der Pipettiervorgang sehr erleichtert und es können die Probenflecke auf der Probenträger sehr genau lokalisiert werden. Beim Aufpipettie­ ren von Probentröpfchen ziehen sich diese auch bei leicht ungenauer Auftragung auf die hy­ drophilen Ankerbereiche zurück und trocknen dort unter Bildung eines monolitischen Kristall­ konglomerats ein, das günstige Eigenschaften für den MALDI-Prozeß besitzt. Das Verfahren kann insbesondere für die Oligonukleotid-Analyse mit 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA) als Matrix, aber auch für andere MALDI-Präparationslösungen von Biomolekülen verwendet werden.

Stand der Technik

Für die Analyse von Biomolekülen hat sich die Massenspektrometrie mit Ionisierung durch matrix-unterstützte Laserdesorption und Ionisierung (MALDI) als ein Standardverfahren eta­ bliert. Meist werden dazu Flugzeitmassenspektrometer (TOF-MS = time-of-flight mass spectrometer) verwendet, aber auch Ionenzyklotron-Resonanzspektrometer (FT-ICR = Fou­ rier-transform ion cyclotron resonance) oder Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallenmassen­ spektrometer können hier eingesetzt werden. Die Biomoleküle befinden sich in aller Regel in wäßriger Lösung. Im folgenden werden die Biosubstanzen, deren Moleküle untersucht werden sollen, auch "Analyt" genannt.

Unter Biomolekülen sollen hier besonders die Oligonukleotide (also das Genmaterial in seinen verschiedenen Ausformungen wie DNA oder RNA) und Proteine (also die wesentlichen Bau­ steine der lebenden Welt) verstanden werden, einschließlich ihrer besonderen Analoge und Konjugate, wie beispielsweise Glycoproteine oder Lipoproteine.

Die Auswahl der Matrixsubstanz für MALDI hängt von der Art der Biomoleküle ab; es sind inzwischen weit über hundert verschiedene Matrixsubstanzen bekannt geworden. Die Matrix­ substanz hat unter anderem die Aufgabe, die Probenmoleküle möglichst einzeln festzuhalten, am Probenträger anzubinden, während des Laserschusses durch Bildung einer Dampfwolke ohne Zerstörung der Biomoleküle und möglichst ohne Anlagerung der Matrixmoleküle in die Gasphase zu übertragen, und schließlich dort unter Protonierung oder Deprotonierung zu io­ nisieren. Für diese Aufgabe hat es sich als günstig erwiesen, die Analytmoleküle in irgendeiner Art in die zumeist kristallinen Matrices bei deren Kristallisation oder zumindest in die Grenz­ flächen zwischen den Kriställchen einzubauen.

Für das Auftragen von Probe und Matrix sind eine Reihe verschiedener Methoden bekannt geworden. Die einfachste davon ist das Aufpipettieren einer Lösung mit Probe und Matrix auf einen gereinigten, metallischen Probenträger. Der Lösungstropfen bildet auf der Metalloberflä­ che eine Benetzungsfläche, deren Größe in etwa dem Tropfendurchmesser entspricht und von der Hydrophilität der Metalloberfläche und den Eigenschaften des Tröpfchens abhängt. Es bil­ det sich dabei nach dem Auftrocknen der Lösung ein Probenfleck aus kleinen Matrixkriställ­ chen in der Größe dieser Benetzungsfläche, wobei sich in der Regel aber keine gleichmäßige Belegung der Benetzungsfläche zeigt. Die Kriställchen der Matrix beginnen in wäßrigen Lö­ sungen in der Regel am Rand der Benetzung der Metallplatte mit dem Probentröpfchen zu wachsen. Sie wachsen zum Inneren der Benetzungsfläche hin. Häufig bilden sie strahlenartige Kristalle, wie zum Beispiel bei 5-Dihydroxybenzoesäure oder 3-Hydroxypicolinsäure, die sich zum Inneren des Flecks hin von der Trägerplatte abheben. Das Zentrum des Flecks ist häufig leer oder mit feinen Kriställchen bedeckt, die aber wegen ihrer hohen Konzentration an Alkali­ salzen kaum für die MALDI-Ionisierung brauchbar sind. Die Beladung mit Analytmolekülen ist sehr ungleichmäßig. Diese Belegungsart erfordert daher eine visuelle Betrachtung der Proben­ trägeroberfläche durch ein Videomikroskop, das an allen kommerziell hergestellten Massen­ spektrometern für diese Art von Analysen zu finden ist. Ionenausbeute und Massenauflösung schwanken im Probenfleck von Ort zu Ort. Es ist oft ein mühsamer Vorgang, eine günstige Stelle des Probenflecks mit guter Analytionenausbeute und guter Massenauflösung zu finden, und nur Erfahrung und Ausprobieren hilft hier bisher weiter.

Für Matrixsubstanzen, die sich nur sehr schwer oder gar nicht in Wasser lösen, wie beispiels­ weise α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure, hat es sich als günstig erwiesen, eine sehr dünne Schicht der Kristalle auf der Oberfläche vor dem Aufbringen der wäßrigen Analytlösungen zu erzeu­ gen, beispielsweise durch Aufbringen einer Lösung der Matrixsubstanz in Azeton. Diese Art der MALDI-Belegung ist bei Peptiden sehr erfolgreich (O. Vorm et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 5, (1994), 955). Die Belegung zeigt insbesondere eine ortsunabhängige Empfind­ lichkeit im Probenfleck, eine Grundvoraussetzung für jede automatisch auszuführende Analyse. Leider kann man diese Art der homogenen Präparation für wasserlösliche Matrices nicht an­ wenden, beispielsweise nicht für Oligonukleotide, für die sich bisher 3-Hydroxypicolinsäure (3- HPA) in wäßriger Lösung als günstigste Matrix erwiesen hat. Diese Matrix zeigt aber die oben beschriebenen Randeffekte in extremer Weise.

Für Oligonukleotide ist eine günstige Methode des Probenauftrags bekannt geworden, die je­ doch auf Siliziumchips beschränkt ist. Die an der Oberfläche des Chips gebundenen Oligonu­ kleotide werden mit einer piezobetriebenen Mikropipette mit Mikrotröpfchen einer Matrixlö­ sung (3-HPA) von nur einigen Hundert Picolitern beschossen, wodurch eine Kristallstruktur mit gleichmäßiger MALDI-Empfindlichkeit erzeugt wird (D. Little et al., Vortrag auf der 45. ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Palm Springs, 2. bis 5. Juni 1997).

Wie in Patent DE 196 28 178 beschrieben, kann man in Pipettenrobotern auf einem Probenträ­ ger viele Probenflecken in hoher Dichte mit Hilfe von Vielfachpipetten durch mehrmaligen Übertrag der Proben aus Mikrotiterplatten auftragen. Dabei hängt aber die Ortsgenauigkeit der Probenflecken von der Präzision des Probenroboters ab. Die kommerziell erhältlichen Proben­ roboter haben aber nur eine mechanische Präzision von bestenfalls 200 Mikrometern. Diese Auftragung führt ohne besondere Präparationstechnik zu den oben beschriebenen unregelmäßi­ gen Probenflecken.

Auch die in den Patentanmeldungen DE 196 17 011 und DE 196 18 032 angegebenen Verfah­ ren der MALDI-Technik unter Verwendung von Zellulosenitraten haben sich bisher für wasser­ lösliche Matrices und insbesondere für Oligonukleotide nicht bewährt.

Aber selbst bei Aufbringen sehr kleiner Probeflecke reproduzierbarer Empfindlichkeit ist es ein mühsames Unterfangen, die Koordinaten der Probenflecken im Massenspektrometer allein mit massenspektrometrischen Mitteln ohne weitere Hilfsvorrichtungen genau festzustellen, wenn sie ortsungenau aufgebracht wurden. Gerade für einen hohen Probendurchsatz ist es daher höchst wünschenswert, die Orte der Probenflecken vor der Analyse möglichst genau zu ken­ nen. Nur dann ist ein schnelles und automatisches Arbeiten, das heißt, ein Arbeiten ohne stän­ dige Kontrollmessungen möglich. Besonders vorteilhaft wäre ein Aufbringen der Probenflecke in einem präzisen Raster.

Für einen hohen Probendurchsatz der Analyse ist eine Automatisierbarkeit aller Analysenschrit­ te einschließlich der Vorbereitung der Proben notwendig. Während die Probenvorbereitung in Pipettierautomaten heute schon sehr gut automatisch ablaufen kann, steht die Heterogenität der MALDI-Präparationen mit wasserlöslichen Matrices und das ortsungenaue Auftragen der Probenflecke einer Automatisierbarkeit der massenspektrometrischen Messung noch stark ent­ gegen.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, einen Probenträger zu finden, der besondere Eigenschaften für eine Automatisierbarkeit der massenspektrometrischen Analyse aufweist. Es sollen die auf­ pipettierten Tröpfchen der Probenlösung für die MALDI-Präparation von Biomolekülen so eintrocknen, daß die erzeugten Probenflecken eine gute und vor allem reproduzierbare Ionisie­ rungsausbeute des MALDI-Verfahrens ergeben. Die getrockneten Probenflecken sollen auf dem Probenträger in einem präzisen Raster angeordnet sein, auch wenn die Tröpfchen mit ei­ nem wenig präzise arbeitenden Pipettenroboter aufgebracht werden. Es sollen Verfahren zur günstigen Herstellung solcher Probenträger und zum Beladen der Platten mit Proben gefunden werden.

Erfindungsgedanke

Es ist der Grundgedanke der Erfindung, die Probenträger an ihrer Oberfläche' stark flüssigkeits­ abweisend für die Probenlösung zu machen, für wäßrige Lösungen also stark hydrophob. Wird auf diese Oberfläche ein Probentröpfchen aufgebracht, das Analyt und Matrix gelöst enthält, so ergibt sich überraschend ein völlig anderes Kristallisationsverhalten im Tröpfchen, als von bis­ herigen Präparationen gewohnt. Der auf der hydrophoben Oberfläche ohne erkennbare Benet­ zung der Oberfläche aufsitzende Tropfen zieht sich beim Eintrocknen stark zusammen, even­ tuell im Inneren gebildete Kriställchen werden dabei durch die Kraft der Oberflächenspannung auf ein minimales Volumen zusammengeschoben. Im letzten Moment des Eintrocknens findet, wie unter dem Mikroskop zu beobachten ist, eine ruckartige Auskristallisation statt, anschei­ nend mit einem Füllen der Lücken zwischen den schon gebildeten Kriställchen; es entsteht da­ bei ein monolitischer Brocken mit einem mikrokristallinen Gefüge im Zentrum des Bereichs, den das Tröpfchen eingenommen hatte.

Dieser monolitische Brocken zeigt überraschenderweise eine sehr gute und von Brocken zu Brocken reproduzierbare Ionisierung der eingebrachten Biomoleküle, mindestens gleich gut wie die mit Mühe gesuchten günstigsten Stellen der bisherigen Präparationen. Wahrscheinlich sind die Biomoleküle in einer für den Desorptions- und Ionisationsprozeß sehr günstigen Lage an den Korngrenzen der mikrokristallinen Gefügestruktur eingebettet.

Aus einem Tröpfchen von 500 Nanoliter Volumen, das einen Durchmesser von einem Millime­ ter hat, wird ein kleiner, flacher Block von etwa 200 Mikrometer Durchmesser. Dieser Durch­ messer entspricht etwa dem der üblicherweise benutzten Fokusflächen des Laserlichtstrahles. Der monolitische Brocken ist auf der hydrophoben Unterlage festgeklebt, jedoch ist diese Bin­ dung nicht sehr fest. Die eingesetzte Probenmenge kann ohne Einbußen an Signal stark redu­ ziert werden. Eine klassische Präparation auf hydrophilen Flächen würde hier einen Fleck­ durchmesser von mindestens einem Millimeter ergeben.

Es ist allerdings schwierig, die Tröpfchen mit einer Pipette auf die hydrophobe Oberfläche auf­ zupipettieren. Das Tröpfchen hat die Tendenz, an der Pipettenspitze kleben zu bleiben, obwohl die Pipettenspitze in der Regel ebenfalls aus einem hydrophoben Material besteht. Ein gezieltes Ablagern des Tröpfchens auf der Oberfläche gelingt kaum.

Es ist daher ein weiterer Grundgedanke der Erfindung, die Oberfläche des Probenträgers im gewünschten Raster der Probenflecke mit winzig kleinen, benetzungsfreundlichen (hydrophi­ len) Ankerbereichen für die Probentröpfchen zu versehen. Der Durchmesser dieser Ankerbe­ reiche soll etwa ein Zehntel des Durchmessers der aufpipettierten Tröpfchen messen, ein gün­ stiger Bereich liegt zwischen einem Viertel und einem Zwanzigstel des Durchmessers der auf­ zubringenden Probentröpfchen. Die aufpipettierten Tröpfchen mit gelösten Analytmolekülen hängen sich an diese winzigen Ankerbereiche an. Die Pipette läßt sich abheben, ohne das Tröpfchen wieder mitzunehmen. Selbst bei leicht seitlich verrutschtem Aufbringen der Pipetten steht das Tröpfchen nach dem Lösen von der Pipette als Kugel exakt über dem hydrophilen Ankerbereich und trocknet dort zu dem monolitischen Mikrokristallkonglomerat ein. Es muß dabei nur durch leichtes Aufpressen der Tröpfchen eine Überlappung der aufgebrachten Tröpf­ chen mit den hydrophilen Ankerbereichen gegeben sein. Die hydrophilen Ankerbereiche sollten kleiner sein, als es dem Durchmesser der schließlich gebildeten Kristallkonglomerate ent­ spricht. Es ist ein weiterer Vorteil dieser hydrophilen Ankerbereiche, daß dort die Kristall­ konglomerate recht fest an die Oberfläche des Probenträgers binden.

Insgesamt wird durch die reproduzierbare Ionenausbeute und hohe Empfindlichkeit, durch die Ortspräzision der Probenaufbringung und durch die festsitzenden Probenflecke eine Automati­ sierbarkeit der Analyse erreichtBeschreibung der Bilder

Fig. 1 zeigt eine Folge a, b und c von schematischen Darstellungen zum Aufbringen der Pro­ bentröpfchen (3) auf den Probenträger (1) aus den Pipettenspitzen (4) einer Vielfachpipette (5) mit nachfolgendem Eintrocknen.

• (a) Die Pipetten haben die Lösungströpfchen (3) aus ihrer Spitze (4) ausgedrückt, die Tröpf­ chen (3) sind zwischen Pipettenspitzen (4) und Probenträger (1) plattgedrückt. Dadurch errei­ chen die Tröpfchen ihre hydrophilen Ankerbereiche (2), auch wenn die Pipettenspitzen (4) nicht genau über dem Ankerbereich (2) stehen, und benetzen dort den Probenträger (1).
• (b) Die Pipettenspitzen (4) sind abgehoben, die Tröpfchen (3) haben die Form einer Kugel an­ genommen und stehen genau über ihren hydrophilen Ankerbereichen (2).
• (c) Die Probentröpfchen sind eingetrocknet und hinterlassen kleine, monolitische Blöcke (6) genauer Ortsausrichtung mit mikrokristallinem Gefüge auf dem Probenträger (1).

Besonders günstige Ausführungsformen

Es soll hier unter einer "hydrophoben" Oberfläche eine benetzungsfeindliche und flüssigkeits­ abweisende Oberfläche für die benutzte Probenflüssigkeit verstanden werden, auch wenn es sich dabei (ausnahmsweise) nicht um eine wäßrige Probenlösung handeln sollte. Im Falle einer öligen Probenlösung soll es sich also entsprechend um eine lipophobe Oberfläche handeln. In der Regel lösen sich jedoch die Biomoleküle am besten in Wasser, manchmal unter Zugabe von organischen, wasserlöslichen Lösungsmitteln.

Entsprechend soll unter einer "hydrophilen" Fläche eine benetzungsfreundliche Fläche für die Art der benutzten Probenflüssigkeit gemeint sein, auch wenn es sich dabei nicht um eine wäß­ rige Lösung handeln sollte.

Die Hydrophobizität kann im Prinzip aus dem Anstellwinkel ermittelt werden, den die Flüssig­ keit unter normierten Bedingungen am Rande der Benetzungsfläche mit der festen Oberfläche ausbildet. Für Tröpfchen auf einer stark hydrophoben Oberfläche gibt es aber den Fall, daß sich überhaupt keine Benetzungsfläche ausbildet und es daher auch keinen Anstellwinkel gibt, wie es zum Beispiel für Quecksilbertröpfchen auf einer Glas- oder Holzplatte zu finden ist.

Die Oberflächen bisher verwendeter metallischer Probenträger sind in der Regel von Natur aus leicht hydrophil gegenüber den wäßrigen Probenlösungen, ein Probentröpfchen fließt normal­ lerweise etwas auseinander. Die Hydrophilität wird durch die Hydroxygruppen erzeugt die sich unter der Einwirkung von feuchter Luft auf jedem Metall (selbst auf Edelmetallen) bilden.

Um hydrophobe Oberflächen der Probenträger zu erhalten, kann die ganze Probenträger aus einem hydrophoben Material gefertigt werden, beispielsweise aus Teflon®, das übrigens sowohl hydrophob wie auch lipophob ist. Es ist aber dann dafür zu sorgen, daß die Oberfläche (bei­ spielsweise durch Einlagerung von Graphit) elektrisch leitend wird, da der MALDI-Prozeß für die gleichmäßige Beschleunigung der gebildeten Ionen einerseits ein homogenes elektrisches Feld und andererseits eine Ableitung von Ladungen braucht, deren Polarität zu der der gebilde­ ten Ionen entgegengesetzt ist. Auch eine reine Graphitoberfläche ist sehr hydrophob.

Es ist aus Gründen einfacher Herstellung durchaus zweckmäßig, bei Probenträgern aus Metall oder metallisiertem Kunststoff zu bleiben, jedoch die Oberfläche hydrophob zu machen. Das kann beispielsweise durch einen hauchdünnen, hydrophoben Lack geschehen, oder aber durch Aufkleben einer dünnen, hydrophoben Folie, beispielsweise aus Teflon®. Noch zweckmäßiger ist es aber, die Metalloberfläche durch eine monomolekulare, chemische Veränderung hydro­ phob zu machen, da dann eine gewisse elektrische Leitfähigkeit, wenn auch hochohmig, erhal­ ten bleibt.

Eine solche Hydrophobisierung einer Metalloberfläche ist an sich bekannt. Dazu werden in der Regel längere Alkanketten (beispielsweise lineare C₁₈-Ketten) über eine Schwefelbrücke kova­ lent an die Atome der Metalloberfläche gebunden. Diese Bindung ist außerordentlich fest, sie kann mit normalen Mitteln nicht abgewaschen werden. Sie hält einerjahrelangen Bewetterung stand. Noch hydrophobere Oberflächen werden erhalten, wenn die Wasserstoffatome an den Enden der Alkanketten durch Fluoratome ersetzt werden. Es gibt jedoch viele andere, äquiva­ lente Methoden der Hydrophobisierung, zum Beispiel unter Verwendung von Silikonen, Alkyl­ chlorsilanen oder zinnorganischen Verbindungen.

Der Vorteil einer so präparierten Oberfläche liegt auch darin, daß Metall- und Alkaliionen nicht mehr durch die in der Regel sauren Matrixlösungen von der Metalloberfläche abgelöst werden und sich beim MALDI-Prozeß als Addukte an die Biomolekülionen anlagern können.

Die Herstellung einer dichten Schicht von solchen Alkanketten auf der Metalloberfläche ist im Prinzip sehr einfach. Es werden dazu die entsprechenden Alkanthiole (Alkanhydrogensulfide) zunächst im Methanol gelöst. Die Metallplatten werden dann senkrecht in ein Wasserbad ge­ taucht. Gibt man nun einen Tropfen der methanolischen Lösung der Alkanthiole ins Wasser, so sammeln sich die Alkanthiole in geordneter Formation an der Oberfläche des Wassers. Alle Moleküle sind in sehr enger Anordnung parallel ausgerichtet. Die hydrophoben Alkanenden befinden sich an der Oberfläche des Wasserbades, die hydrophilen Thiolgruppen weisen ins Innere des Wassers. Zieht man nun die Metallplatte vorsichtig aus dem Wasser heraus, so wandert die geschlossene Formation der Alkanthiole an die Oberfläche der Metallplatte und geht dort unter Wahrung der parallelen Orientierung eine kovalente Bindung der Einzelmolekü­ le mit Metallatomen der Oberfläche unter Bildung von Metallthiolaten ein. Die Belegung ist außerordentlich dicht.

Die hydrophilen Ankerbereiche für die Probentröpfchen können auf vielerlei Weise erzeugt werden. Ein Beispiel ist das Abdecken der gewünschten Ankerbereiche vor der Hydrophobisie­ rung mit einem abwaschbaren oder hydrophilen Lack. Um genügend kleine Punkte zu erhalten, kann der Decklack in Form kleinster Tröpfchen mit einer piezobetriebenen Tröpfchenpipette nach Art der Tintenstrahl-Drucker aufgeschossen werden. Es ist damit eine außerordentlich gute Ortspräzion der Lackpunkte erreichbar. Nach der Hydrophobisierung können die Lack­ punkte einfach abgewaschen werden, sofern sie nicht schon als solche genügend gute hydrophi­ le Anker bilden. Die gewaschenen Ankerbereiche können auch mit besonderen Hydrophilisie­ rungsmitteln besonders hydrophil gemacht werden.

Es können solche hydrophilen Lacktröpfchen aber auch nachträglich auf der hydrophoben Oberfläche aufgedruckt werden. Dazu eignen sich besonders amphiphile Substanzen, die auf der hydrophoben Oberfläche binden und eine hydrophile Oberfläche bilden.

Die hydrophilen Ankerbereiche können aber auch in sehr einfacher Weise durch Zerstörung der hydrophoben Schicht erzeugt werden. Das kann durch Aufdrucken (beipielsweise wieder nach Art der Tintenstrahl-Drucker) von chemisch verändernden oder enzymatisch abbauenden Sub­ stanzlösungen geschehen, durch Zerstören mit glühenden Brennspitzen, aber auch durch Abla­ tion von Oberflächenmaterial, beispielsweise durch Funkenerosion oder Laserbeschuß.

Bei langer Lagerung können sich die hydrophilen Ankerbereiche leicht mit hydrophoben Mole­ külen aus der Umgebungsluft belegen. Es kann daher zweckmäßig sein, die hydrophilen An­ kerbereiche bereits kurz nach ihrer Herstellung mit einer dünnen Kristallschicht aus der MALDI-Matrixsubstanz zu belegen. Dazu kann die Oberfläche der metallischen Probenträger kurzzeitg in eine verdünnte Lösung der Matrixsubstanz eingetaucht werden. Nach dem Her­ ausheben bleibt in jeder hydrophilen Ankerbereich ein genau dosiertes Tröpfchen zurück. Das Eintrocknen dieser Tröpfchen ergibt die erwünschten Kristallschichten.

Die Probentröpfchen werden normalerweise mit Pipetten auf den Probenträger aufgebracht, wie schematisch in Fig. 1 gezeigt. Für das gleichzeitige Aufbringen vieler Probentröpfchen aus Mikrotiterplatten werden Vielfachpipetten verwendet, die von Pipettenrobotern in Pipet­ tenautomaten bewegt werden. Es ist daher günstig, Probenträger in der Größe von Mikroti­ terplatten zu verwenden und das Raster der hydrophilen Ankerbereichen an das Raster der Mi­ krotiterplatten anzupassen. Es ist weiterhin günstig, wenn die Probenträger auch die Form von Mikrotiterplatten haben, da sie dann von den handelsüblichen Pipettenrobotern bearbeitet wer­ den können. Da auf dem Probenträger eine wesentlich höhere Probendichte erreicht werden kann, als es in Mikrotiterplatten möglich ist, kann das Raster auf dem Probenträger viel feiner sein, als es dem Raster der Mikrotiterplatte entspricht. Es kann beispielsweise durch Teilung des Rasters der Mikrotiterplatten erhalten werden. Es können dann auf einen Probenträger die Proben aus mehreren Mikrotiterplatten aufgebracht werden. Das Grundraster der Ur-Mikro­ titerplatte besteht aus 96 kleinen Gefäßen im Raster von 9 Millimetern in einer Anordnung von 8 Reihen mal 12 Spalten. Die Mikrotiterplatten sind aber ohne Veränderung ihrer Größe wei­ terentwickelt worden, moderne Ausführungsformen zeigen 384 oder sogar 1536 Mikrogefäße im Raster von 4,5 und 2,25 Millimetern.

Die horizontale Ortsgenauigkeit für die Positionierung der Vielfachpipetten über dem horizon­ tal liegenden Probenträger ist auf etwa 200 Mikrometer beschränkt. Die vertikale Ortsgenauig­ keit kann leicht durch seitliche Auflageflächen der Vielfachpipetten und Anschlagsbolzen auf etwa 50 Mikrometer verbessert werden.

Die Aufgabe der Tröpfchen erfolgt zweckmäßigerweise, wenn sich die Vielfachpipette im Ab­ stand von 500 Mikrometer über dem Probenträger befindet. Es werden etwa 500 Nanoliter der Probenlösung aus jeder Pipettenspitze der Vielfachpipette auf den Probenträger pipettiert, wie schematisch in Fig. 1 gezeigt. Gewöhnlich ist die Menge der Probenlösung in der Pipetten­ spitze durch ein Gasbläschen abgeschlossen, daher ist im Kanal der Pipettenspitze anschließend keine Lösung mehr vorhanden und die Kontaktkräfte zur hydrophoben Pipettenspitze sind sehr gering.

Die Tröpfchen, die im entspannten Zustand Kugeln mit einem Durchmesser von einem Millime­ ter Durchmesser bilden, sind jetzt zwischen der Pipettenspitze und dem Probenträger zusam­ mengedrückt, wie aus Fig. 1a ersichtlich. Selbst bei einer horizontalen Fehljustierung der Pipettenspitzen können die Tröpfchen ihren jeweils zugeordneten hydrophilen Ankerbereich erreichen und sich dort festsetzen. Beim Abheben der Vielfachpipette werden die Tröpfchen auf dem Probenträger verbleiben, da sie dort ihre Anker gefunden haben. Sie stellen sich genau über die Ankerbereiche und nehmen ihre ideal runde Gestalt an, wie in Fig. 1b dargestellt Beim Eintrocknen hinterlassen die Tröpfchen die Kristallkonglomerate mit den Probenmolekü­ len exakt auf den hydrophilen Ankerbereichen, wie in Fig. 1c schematisch zu sehen ist. Die brockenförmigen MALDI-Präparate haben daher wie gewünscht eine exakte Positionierung an vorbekannten Stellen, ihre Größe entspricht den Fokusflächen der Laserstrahlen. Sie bieten außerdem eine hohe Ausbeute an Analytionen, und sind somit in idealer Weise für eine auto­ matisch erfolgende Analyse vorbereitet.

Natürlich können die Tröpfchen auch manuell aufgebracht werden, wie es überhaupt viele Verwendungsmöglichkeiten für die hier dargestellten Probenträger gibt, wie es jedem Fach­ mann auf diesem Gebiet nach diesen Ausführungen einleuchtend sein wird.

Aus Natur und Zielsetzung des Trocknungsvorgangs folgt, daß bestimmte Zusammensetzun­ gen der Probenlösung zu vermeiden sind. So ist eine Beimengung von Tensiden oder Deter­ genzien schädlich, weil dadurch eine Benetzung der hydrophoben Oberfläche stattfinden kann. Auch eine Beimengung von solchen organischen Lösemitteln, die eine Benetzung hervorrufen, ist zu vermeiden. Auch hier ist es jedem Fachmann nach diesen Ausführungen verständlich, wie er das Verfahren der Probenvorbereitung und des Aufpipettierens vorzunehmen hat, um eine fehlerhafte Probenaufgabe zu vermeiden.

Sowohl hydrophobe wie auch hydrophile Oberflächen können bei langer Lagerung in Umge­ bungsluft ihre Benetzungseigenschaften durch Belegung der Oberflächen mit Verunreinigungen aus der Luft ändern. Es ist daher zweckmäßig, die gut präparierten Probenträger im Vakuum oder unter Schutzgas zu lagern.

Claims (14)

1. Probenträger für die massenspektrometrische Analyse von Biomolekülen mit Ionisierung durch matrix-unterstützte Laserdesorption (MALDI), dadurch gekennzeichnet, daß die Fläche für das Auftragen der Proben gegenüber der Probenlösung stark flüssigkeitsab­ weisend (hydrophob) ist.

2. Probenträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich auf der sonst geschlos­ sen hydrophoben Oberfläche winzige benetzungsfreundliche (hydrophile) Ankerbereiche für die aufzubringenden Probentröpfchen befinden.

3. Probenträger nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophilen Ankerberei­ che einen Durchmesser haben, der etwa zwischen einem Viertel und einem Zwanzigstel des Durchmessers der aufzubringenden Probentröpfchen liegt

4. Probenträger nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die hy­ drophilen Ankerbereiche ein Raster bilden, das dem Grundraster einer Mikrotiterplatte (9 Millimeter) oder einem daraus durch Teilung entstandenen feineren Raster entspricht

5. Probenträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er Größe und Form einer Mikrotiterplatte hat.

6. Probenträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einem hydrophoben Grundmaterial besteht

7. Verfahren zur Herstellung eines Probenträgers nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenträger aus elektrisch leitfähigem Material hergestellt, daß danach die Oberfläche hydrophob gemacht wird und daß dann die hydrophilen Ankerbe­ reiche erzeugt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrophobie durch eine chemische Veränderung der Oberfläche, durch einen lackartigen Film, durch Aufbringen eines Polymers oder durch eine aufgeklebte dünne Folie erzeugt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophi­ len Ankerbereiche durch Aufdrucken erzeugt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophi­ len Ankerbereiche durch Zerstören der Hydrophobie der Oberfläche erzeugt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrophobie der Oberflä­ che in den Ankerbereichen durch chemischen oder enzymatischen Abbau, durch Brenn­ stempel, Funkenerosion oder Laserablation zerstört wird.

12. Verfahren zur Herstellung eines Probenträgers nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenträger aus elektrisch leitfähigem Material hergestellt, daß danach die später hydrophilen Ankerbereiche durch Aufdrucken eines abwaschbaren oder bereits hydrophilen Decklackes vor Hydrophobisierung der Oberfläche erzeugt und daß dann die restliche Oberfläche hydrophob gemacht wird.

13. Verfahren zum Aufbringen von Probentröpfchen auf die horizontale Oberfläche eines Pro­ benträgers nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Proben­ tröpfchen mit einer hydrophoben Pipettenspitze aufgebracht wird, die sich in einem so ge­ ringen Abstand über der Oberfläche des Probenträgers befindet, daß das Probentröpfchen zwischen Pipettenspitze und Probenträger plattgedrückt wird und so auch bei auch leich­ ter vertikaler Fehljustierung der Pipettenspitze den zugeordneten hydrophilen Ankerbe­ reich berührt

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß mit einer Vielfachpipette viele Probentröpfchen gleichzeitig auf die Oberfläche der Probenträger aufgetragen werden.