DE19745196C2 - Oligonukleotid für den Nachweis pflanzlicher Zusätze in Lebensmitteln - Google Patents
Oligonukleotid für den Nachweis pflanzlicher Zusätze in LebensmittelnInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Oligonukleotid und dessen
Verwendung als Primer sowie ein analytisches Verfahren zum
Nachweis von pflanzlichen Lebensmittelbestandteilen anhand der
darin vorhandenen Erbsubstanz DNA.
Es ist aus der Bot. Acta 108 (1995) 149-162 ein als Primer
benutztes Oligonukleotid mit der Bezeichnung RBCL-N bekannt, das
spezifisch für die große Untereinheit der Ribulose-1,5-
biphosphat-carboxylase in einer Polymerasekettenreaktion im
Zusammenwirken mit weiteren Primern zur Klassifizierung von
Leguminosen anhand deren DNA-Sequenzen genutzt wurde.
Weiterhin ist aus der WO 98/14607 A1 bekannt, mittels spezifischer
Oligonukleotid-Primer durch eine Polymerasekettenreaktion eine
DNA-Analyse auf verschiedene Komponenten von Fruchtnahrungsmitteln
vorzunehmen.
In der lebensmittelverarbeitenden Industrie gewinnt die Verwendung
pflanzlicher Zusätze, insbesondere in Form von Proteinen,
zunehmend an Bedeutung. Derzeitig hat das Einbringen pflanzlicher
Proteine in tierische Produkte wie Fleisch oder Wurstwaren zur
Stabilisierung und zur Gewichtserhöhung sicherlich die größte
Bedeutung, jedoch werden beispielsweise auch Pflanzenfasern als
kalorienarmer Füllstoff oder zur Ballaststoffanreicherung
eingesetzt. Insbesondere der Einsatz pflanzlicher Proteine wird
aufgrund seiner vielfältigen funktionellen Eigenschaften, seiner
biologischen Wertigkeit aber auch der im Vergleich zu
Fleischeiweiß geringen Produktionskosten eine zunehmende Anwendung
im Lebensmittelbereich finden. Die Entwicklung des
gemeinschaftlichen Lebensmittelsrechts in der Europäischen Union
läßt erwarten, daß Erzeugnisse mit Pflanzenzusätzen künftig
vermehrt und ohne rechtliche Barrieren in Deutschland auf den
Markt kommen. Daher ist für die Lebensmittelüberwachung eine
Nachweismöglichkeit pflanzlicher Zusätze von enormem Interesse.
Zur Zeit wird in der Lebensmittelanalytik für derartige
Untersuchungen vorwiegend die Spezifizität der Proteine
herangezogen. Das bedeutet, die Analyse erfolgt mittels
immunchemischer Methoden durch die Verwendung entsprechender
Antikörper gegen pflanzliche Komponenten. Diese pflanzlichen
Bestandteile, gegen die die Antikörper gerichtet sind, sind jedoch
durch Vorbehandlung der pflanzlichen Zusätze nicht mehr vorhanden
oder nicht mehr intakt, so daß keine oder keine ausreichende
Antikörper-Antigen-Wechselwirkung stattfinden kann und somit eine
immunchemische Detektion schlecht oder gar nicht funktioniert.
Bereits Ende der 80er Jahre wurde von Baur et al., Arch.
Lebensmittelhyg. 38, (1987), 172-174, gezeigt, daß die Erbsubstanz
DNA durch Hitze oder andere Verarbeitungsschritte und Zusatzstoffe
nicht oder nur gering beeinflußt wird. Weiterhin hat Meyer et al.
(DNA-Sonden 11, (74), (1994) 1237-1238, 1542-1551) DNA-Sonden
beschrieben, die für die Fleischidentifizierung der gängigen
Fleischsorten eingesetzt werden können. Für den Nachweis und die
Identifizierung pflanzlicher Zusätze in Lebensmitteln sind bis
heute keine kommerziellen Nachweismethoden verfügbar.
Für den Nachweis pflanzlicher Zusätze, die unter Umständen nur in
geringen Mengen vorkommen oder in stark prozessiertem
Untersuchungsmaterial nachzuweisen sind, sind solche DNA-Sonden
aufgrund unzureichender Empfindlichkeit nicht geeignet. Hinzu
kommt, daß die Probenaufarbeitung zur Isolation der Nukleinsäuren
für Hybridisierungsverfahren sehr zeitaufwendig ist und diese
Methode nur eine geringe Eignung zur Automatisierung besitzt.
Somit sind kostengünstige Reihenuntersuchungen und schnelle
Routinetests mit diesem Verfahren nicht möglich.
Es ist Aufgabe der Erfindung, eine Verbesserung der DNA-Analyse
pflanzlicher Produkte zu ermöglichen und dazu ein Oligonukleotid
bereitzustellen und das eingangs bezeichnete Verfahren unter
Verwendung dieses Oligonukleotids so zu verändern, daß sich
Zusätze pflanzlicher Art insbes. in Nahrungsmitteln anhand der
darin befindlichen Reste pflanzlicher DNA einfach, schnell und mit
hoher Empfindlichkeit eindeutig nachweisen lassen.
Die Lösung ist in dem Stoffanspruch sowie dem Verwendungsanspruch
und dem Verfahrensanspruch angegeben.
Das Verfahren wird mit Durchführung folgender Schritte ausgeführt:
- - Isolation der Gesamt-DNA aus dem Untersuchungsmaterial;
- - Einsatz des Primerpaares, deren Primer komplementär zur nachweisenden pflanzlichen DNA sind;
- - Vervielfältigung der pflanzlichen DNA mittel Polymeraseketten reaktion;
- - Spaltung der vervielfältigten DNA mit Restriktionsendonukleasen;
- - Elektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente;
- - Identifizierung der Pflanzenart anhand des DNA-Fragmentmusters.
Hierbei werden anhand solcher pflanzlichen DNA-Reste bestimmte
DNA-Bereiche dieser DNA in vitro vervielfältigt und anschließend
einer DNA-Restriktionsanalyse unterzogen. Mit Hilfe dieses
Verfahrens lassen sich pflanzliche Zusätze, unabhängig von der
Verarbeitung des Lebensmittels, mit hoher Empfindlichkeit
nachweisen und eindeutig identifizieren.
Für die Identifizierung pflanzlicher DNA wurde ein plastidäres
Gen gewählt, nämlich das RBCL-Gen, das für die große Untereinheit
der Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase kodiert. Dieses Gen
spielt in der Natur bei der Photosynthese eine bedeutende Rolle
und ist hochkonserviert. Dieser Umstand bietet den Vorteil, daß
man mit einem einzigen Primerpaar für die Polymerasekettenreaktion
(PCR, von polymerase chain reaction) die DNA verschiedenster
Pflanzen amplifizieren kann, indem Primer Verwendung finden, die
an Stellen binden, die eine größtmögliche Identität zu allen
nachzuweisenden Pflanzen aufweisen. Der DNA-Bereich zwischen den
beiden Primerbindungsstellen weist eine artspezifische
Variabilität auf, so daß sich nach der Spaltung mit
Restriktionsendonukleasen und elektrophoretischer Auftrennung dei
Spaltprodukte ein artspezifisisches DNA-Fragmentmuster zeigt und
für die Identifizierung herangezogen werden kann.
Die Vorbehandlung des Probenmaterials durch Hitzeeinwirkung o. ä.
hat bei dem neuen Verfahren nur einen sehr geringen Einfluß auf
die Nachweisempfindlichkeit. Darüberhinaus erlaubt dieses
Verfahren auch die Identifizierung der pflanzlichen Zusätze durch
Vergleich der erhaltenen DNA-Restriktionsmuster mit entsprechenden
Referenz-Fragmentmustern.
Anhand der Fig. 1-3 sind die Verfahren beispielhaft dargestellt.
Die Fig. 1 zeigt PCR-Produkte des RbcL-Gens von ganz unterschiedlichen Pflanzenarten.
Die Fig. 2a zeigt Restriktionsfragmentmuster der Pflanzenarten Soja, Tomate, Kartoffel, Weizen und
Gerste, die Fig. 2b die Restriktionsfragmentmuster für Buchweizen, Hafer, Dinkel und Roggen im
Vergleich.
Die Fig. 3a und 3b illustrieren die Nachweisempfindlichkeiten in thermisch unbehandelten und
thermisch behandelten Proben.
Zur Demonstration der weitgehenden Universalität der erfindungsgemäßen Primer sind in Fig. 1 die
PCR-Produkte verschiedener Pflanzenspezies aus ganz unterschiedlichen Pflanzenfamilien
dargestellt. Der Abstand der von uns verwandten Primer führt zur Amplifizierung eines DNA-
Fragmentes von etwa 1300 bp Länge und erlaubt aufgrund dieser Komplexität die Identifizierung der
verschiedenen Arten anhand der erhaltenen DNA-Fragmentmuster nach enzymatischer Spaltung
dieses PCR-Produktes. Das bedeutet, auch dieses hochkonservierte Gen verfügt über ausreichend
artspezifische Sequenzen im amplifizierten DNA-Bereich, so daß sich bei der enzymatischen Spaltung
artspezifische Fragmentmuster ergeben und somit eine eindeutige und sichere Identifizierung
ermöglichen. Man spricht in diesem Zusammenhang auch von Restriktionsfragment-
Längenpolymorphismus (RFLP).
Die Fig. 1 zeigt beispielhaft die entsprechenden PCR-Produkte für die Pflanzenarten Weizen, Soja,
Tomate, Roggen, Mais, Dinkel, Kichererbse und Haselnuß.
Die Fig. 2 zeigt exemplarisch die Unterscheidung zwischen Soja, Tomate, Kartoffel, Weizen, Gerste,
Buchweizen, Hafer, Dinkel und Roggen anhand ihrer DNA-Fragmentmuster, die sich nach Spaltung
mit entsprechenden Restriktionsenzymen ergeben. Zur Ermittlung der Nachweisempfindlichkeit der
PCR-Analytik wurden artifizielle Proben mit verschiedenen Weizen- bzw. Sojazugaben hergestellt und
in mehrfachen unabhängigen Versuchen einer Identifizierung unterzogen. Weiterhin wurden die
Proben sowohl thermisch unbehandelt (Fig. 3a) als auch thermisch behandelt (Fig. 3b) analysiert.
Wie in dem Beispiel dokumentiert ist, lassen sich noch Proteinzumischen von nur 0,1% eindeutig
nachweisen.
Beim beschriebenen Verfahren lassen sich vorteilhafterweise Standardtechniken der Gentechnologie
wie DNA-Isolierung, PCR, Restriktionsanalyse und Gelelektrophorese miteinander kombinieren. Die
DNA-Isolierung erfolgt, abhängig vom Untersuchungsmaterial, entweder durch einfaches Aufkochen
der Probe, wobei für die PCR wenige Mikroliter des wässrigen Überstandes eingesetzt werden, oder
aber durch Standard-DNA-Isolationsmethoden mit Hilfe von Zellaufschluß, Extraktion von Fett und
Proteinen und anschließender Ausfällung der Nukleinsäuren. Aufgrund der Anwendung des Ampli
fikationsverfahrens PCR und den erfindungsgemäßen Primern RBCL-N und RBCL-C sind hohe
Nachweisempfindlichkeiten gegeben. Zwangsläufig brauchen auch nur geringe Mengen an
Untersuchungsmaterial für die Isolation der Gesamt-DNA herangezogen werden, so daß die Zeit- und
Kostenersparnis gegenüber herkömmlichen Verfahren erheblich ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist universell anwendbar, da aufgrund der Auswahl entsprechender
Primer und der universellen Verbreitung dieses Zielfragmentes im Pflanzenreich eine dement
sprechend breite Anwendung gegeben ist. Im Unterschied zu anderen Verfahren gemäß dem Stand
der Technik, bei denen lediglich gezielt bestimmte Zumischungen pflanzlicher Herkunft erfaßt werden
können, werden erfindungsgemäß auch nicht bekannte Beimengungen anhand der Restriktions
muster erkannt.
Claims (4)
1. Oligonukleotid der folgenden Struktur
5'-ATA AGT TCA GTA CCT TCA CGA GCA AG-3'.
2. Verwendung eines Oligonukleotids gemäß Anspruch 1 als Primer
für die große Untereinheit der Ribulose-1,5-biphosphat
carboxylase.
3. Verfahren zum Nachweis von Lebensmittelbestandteilen anhand
deren DNA durch Amplifizierung und Identifizierung ausgewählter
DNA-Fragmente mittels Restriktionsanalyse, wobei folgende
analytische Verfahrensschritte ausgeführt werden:
- 1. Isolation der Gesamt-DNA aus der Probe,
- 2. Vervielfältigung der pflanzlichen DNA mittels Polymerasekettenreaktion in der zu prüfenden Probe unter Einsatz des Primers gemäß Anspruch 2 (RBCL-C) und des weiteren Primers RBCL-N: 5'-ATG TCA CCA CAA ACA GAA ACT AAA GC-3'
- 3. Fragmentierung der vervielfältigten DNA mit Restriktionsendonukleasen,
- 4. elektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente,
- 5. Identifizierung der Pflanzenart(en) anhand des DNA- Fragmentmusters im Vergleich mit Fragmentmustern bekannter Identität.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die
Fragmentierung der vervielfältigten DNA mit den
Restriktionsendonukleasen Alu I, Hae III, Hpa II, Eco RI und
Hinf I erfolgt.
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DE19745196A1 (de) | 1999-04-15 |
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