DE19732774A1 - Verfahren zur kovalenten Modifizierung von chemisch definierten, in flüssiger Phase vorliegenden, funktionelle Gruppen enthaltenden Verbindungen - Google Patents

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur kovalenten Modifizierung von in flüssiger Phase vorliegenden, funktionelle Gruppen enthaltenden Verbindungen sowie die Verwendung der Verfahrensprodukte.

Unter dem Begriff "funktionelle Gruppen" werden im folgenden chemische Gruppen verstanden, welche sich in bekannter Art und Weise an C-C-Doppelbindungen addieren lassen. Als Beispiele seien -OH, -NH₂, -CHO, -CH₂-Cl, -SH etc. genannt, siehe hierzu auch Jerry March: Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 3 Auflage, S. 657-779, New York 1985.

Als Verbindungen, die derartige funktionelle Gruppen enthalten, seien beispiels­ weise Monosaccharide, wie z. B. Glucose, Fructose, Mannose, etc. oder Disaccha­ ride, wie z. B. Saccharose, Lactose, etc. oder Polysaccharide, wie z. B. Stärke, Amylose, Agarose, Dextran, Agar-Agar, Arabinose, Heparin, Alginat, Cellullose, Pectin, etc. oder Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Lysin, Arginin, Cystein, etc. oder (Oligo-) Peptide, wie z. B. (gentechnologisch hergestelltes) FSH, LH, ACTH, etc. oder Proteine, wie z. B. Gelantine, Kollagen, Mikrosomen, Plasmide, Enzyme, Anti­ körper, Rezeptoren etc. ebenso genannt, wie andere chemisch definierte Verbindungen, wie z. B. Pharmaka oder Kunststoffe, z. B. Polyvinylalkohol (PVA).

O.g. Verbindungen liegen dabei in flüssiger, insbesondere physiologisch-wäßriger Phase vor. Als Beispiele seien eine 5 gew.-%ige Glucose-Lösung in de-ionisiertem Wasser, eine 5 gew.-%ige Albumin-Lösung in isotonischer Kochsalz-Lösung, eine 10 gew.-%ige Dextran-Lösung in isotonischer Kochsalzlösung (mittleres Molekular­ gewicht des Dextran 40.000), eine 20 gew.-%ige Mannit-Lösung in de-ionisiertem Wasser, eine 3 gew.-%ige Lösung eines Polymerisats abgebauter succinylierter Gelantine (mittleres Molekulargewicht 35.000) in isotoner Elektrolyt-Lösung, etc. genannt.

Der hier verwendete Begriff "kovalente Modifizierung" umschreibt, daß o.g. beispielhaft aufgeführten, in flüssiger Phase vorliegenden, funktionelle Gruppen enthaltenden Verbindungen miteinander kovalent vernetzt (engl.: crosslink) oder aber auch kovalent an die Oberflächen von Festkörpern gebunden werden. Das Vernetzen von chemisch definierten Verbindungen untereinander bzw. das Binden derartiger Verbindungen an feste Phasen ist auf dem Gebiet der Biotechnologie und der Biomaterialien bekannt und üblich, siehe hierzu beispielsweise die Kataloge der Fa. PIERCE, USA-Rockford, Illinois. - Durch das kovalente Ver­ netzen von Verbindungen untereinander, erhalten o.g. Verbindungen beispiels­ weise höhere Viskositäten und/oder höhere Sedimentationsgeschwindigkeiten und/oder veränderte immunogene Eigenschaften und/oder verändertes (biologisches) Abbauverhalten. Durch kovalente Bindung o.g. Verbindungen an Oberflächen von Festkörnern, bekommen diese neue (Oberflächen-)Eigen­ schaften: die Anzahl reaktiver Gruppen, die für weitere Reaktionen zur Verfügung stehen, wird erhöht und das (Wasser-)Benetzungsverhalten wird verändert, vorzugsweise verbessert, so daß sich dies seinerseits im Sedimentationsverhalten und in den Fließeigenschaften partikelförmiger Festkörper widerspiegelt.

Bei den bekannten Methoden zur Vernetzung von Verbindungen untereinander bzw. deren Bindung an Oberflächen von dispergierten Festkörpern werden Chemikalien verwendet, die, wie z. B. CNBr, toxisch sind oder, die zu Bindungen führen, die mit einer Halbwertszeit von ca. 18 Stunden, wie bei CDI, nur begrenzt hydrolysestabil sind oder die Reaktionsbedingungen erfordern, wie z. B. Epoxy, wo empfindliche biologisch aktive Verbindungen denaturieren.

Aufgabe der Erfindung ist es, chemisch definierte, in flüssiger Phase vorliegende, funktionelle Gruppen aufweisende Verbindungen durch den Einsatz bekannter, preiswerter, toxikologisch unbedenklicher Chemikalien, in einfacher Art und Weise und mit großer Effizienz derart miteinander zu vernetzen oder an Oberflächen von Festkörpern zu binden, daß die neu geschaffenen kovalenten Bindungen hydrolysestabil sind und sie auch mittels energiereicher elektromagnetischer Strahlung, z. B. UV, zu erzielen sind und daß die Herstellungsprodukte in einer Vielzahl von Ausbildungen, wie z. B. als Immunogen, Chromatographiematerial oder als Medizinprodukt eingesetzt werden können.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man chemisch definierte, in flüssiger Phase vorliegende, funktionelle Gruppen aufweisende Verbindungen mit anderen Verbindungen oder mit Festkörpern, die mindestens zwei siliziumgebundene Vinyl- oder Butenylgruppen pro Molekül bzw. auf der Festkörperoberfläche aufweisen, derart miteinander in innigen Kontakt bringt und Reaktionsbedingungen aussetzt, daß die funktionellen Gruppen der erstgenannten Verbindungen an die Vinyl- bzw. Butenylgruppen der zweitgenannten Verbindungen oder der Festkörper addiert werden.

Verbindungen, die mindestens zwei siliziumgebundene Vinyl- oder Butenylgruppen pro Molekül aufweisen, sind bekannt. Als Beispiele seien Tetravinylsilan, 1,3-Divinyl-tetramethyldisiloxan, Methyltrivinylsilan, Dimethyldivinylsilan, Tetra­ methyltetravinylcyclotetrasiloxan; vinylendgestoppte, lineare Polydimethylsiloxane; vinylgruppen-haltige Polymethylsiloxane mit end- und seitenständigen Vinyl­ gruppen etc. genannt.

Festkörper, die mindestens zwei siliziumgebundene Vinyl- oder Butenylgruppen auf der Festkörperoberfläche aufweisen, sind ebenfalls bekannt bzw. können leicht geschaffen werden. Als Beispiele seien mit Vinyl- oder Butenylgruppen ober­ flächen-modifizierte hochdisperse Kieselsäure (engl: fumed silica), gemahlenes Glas, offen-poriges Glas, z. B. Siran®, Bioran® oder controlled pore glass (CPG), Kieselgur, (Ouarz-) Sand, zu Partikeln zermahlene Formkörper aus Silikon­ kautschuk oder offen-poriger Silikonschaum ebenso genannt, wie fertig aus­ gebildete Formkörper aus Silikonkautschuk, wie z. B. Kontaktlinsen, Intra­ okularlinsen, (Blut-)Katheter, (Mamma-)Implantate etc. Diese jeweils mit Vinyl- oder Butenylgruppen oberflächenmodifizierten Partikel bzw. Formkörper sind bei­ spielsweise leicht dadurch zu erhalten, daß man in Anlehnung an Weethall, H.H.: Covalent Coupling Methods for Inorganic Support Materials in Methods in Enzymology (K. Mosbach, ed.), Vol. XLIV, pp 134-148 (1976), Academic Press, New York, die Partikel- bzw. Formkörperoberfläche, anstatt mit einem amino­ gruppen-haltigen Silan, sie jetzt mit einem vinylgruppen-haltigen Silan, wie z. B. Vinyltriaethoxysilan, Vinyltrimethoxysilan, Vinytriacetoxysilan, Vinyltripropenoxy­ silan, Vinyl-tris-(2-methoxyaethoxy)-silan odgl. oberflächenmodifiziert. Bevorzugte Partikel bzw. Formkörper weisen eine zwischen 0,9 und 1,3 g/ml liegende Dichte auf, haben einen zwischen 5 nm und mehreren Millimetern liegenden Partikel­ durchmesser, sind porös, sind biologisch inert und sind mit oben erwähnten vinyl- oder butenylgruppen-haltigen Silanen leicht oberflächen zu modifizieren.

Die erfindungsgemäße Vernetzung hydroxylgruppen-haltiger Verbindungen mittels Divinyldimethylsilan läßt sich formelmäßig folgendermaßen beschreiben:

Die erfindungsgemäße Bindung aminogruppen-haltiger Verbindungen an partikel- bzw. formkörperoberflächen-ständigen Vinylgruppen läßt sich formelmäßig folgendermaßen beschreiben:

Die durch Addition von funktionellen Gruppen, wie z. B. -OH, -NH₂, -CHO, -COOH, -CH₂-Cl,. . .-SH, an C-C-Doppelbindungen erhaltenen Ether-, sekundären Amin-, Ester-, Alkyl-. . . Sulfidbindungen gelten im Vergleich zum Stand der Technik als äußerst hydrolysestabil.

Das in-innigen-Kontakt-bringen der in flüssiger Phase vorliegenden, funktionelle Gruppen enthaltenden Verbindungen mit Verbindungen, die mindestens zwei siliziumgebundene Vinyl- oder Butenylgruppen pro Molekül enthalten, erfolgt in der Regel durch einfaches Vermischen der Reaktanten miteinander. Da vinyl- oder butenylgruppenhaltige Siliziumverbindungen schlecht wasserlöslich sind, muß man nach Lösemittelsysteme suchen, worin sowohl hydrophile als auch hydrophobe Verbindungen wenigstens teilweise zu lösen sind. Die geeignete Auswahl solcher Systeme ist dem Fachmann geläufig: beispielsweise kann man hydroxylgruppen­ haltige Verbindungen mit vinylgruppen-haltigen Silanen bzw. vinylgruppen-haltigen niedermolekularen Siloxanen in wäßrig-alkoholischen Lösungen, z. B. 3 Teile 2-Propanol und 1 Teil Wasser auch ohne die Verwendung von oberflächenaktiven Substanzen, wie z. B. Tensiden, in einem Homogenisator ausreichend gut emulgieren.

Das in-innigen-Kontakt-bringen der in flüssiger Phase vorliegenden, funktionelle Gruppen enthaltenden Verbindungen mit Partikeln bzw. Formkörpern, die mindestens zwei siliziumgebundene Vinyl- oder Butenylgruppen auf der Partikel- bzw. Formkörperoberfläche aufweisen, geschieht problemlos durch Einrühren der Partikel in die flüssige Phase bzw. durch Kontaktieren der Formkörper mit der flüssigen Phase. Dabei kann das Anfeuchten von vinylgruppen-haltigen Partikeln mit einem niederaliphatischen Alkohol deren Dispergierung erleichtern.

Die Reaktionsbedingungen, bei denen die funktionellen Gruppen der in flüssiger Phase vorliegenden Verbindungen an die Vinyl- oder Butenylgruppen der anderen Verbindungen, Partikel oder Formkörper addiert werden, sind dem Fachmann geläufig. Sie werden im Hinblick auf den Einsatzzweck der zu vernetzenden bzw. an eine Festkörperoberfläche zu bindenden Verbindungen, unter Berücksichtigung der Natur der jeweiligen funktionellen Gruppe, ihrer auf das Molekulargewicht bzw. auf die Festkörperoberfläche bezogenen Konzentration, der Konzentrationen der einzelnen Reaktanten, der chemischen Natur des Lösungsmittel(gemischs), des pH der Reaktionslösung, der Reaktionstemperatur, Art und Konzentration zugesetzter Katalysatoren und/oder Initiatoren und/oder Photosensibilisatoren jeweils experimentell ermittelt und optimiert.

Als Faustregel gilt: sollen empfindliche, in flüssiger Phase vorliegende, funktionelle Gruppen enthaltende Verbindungen, wie z. B. biologisch aktive Substanzen, z. B. native Enzyme, Rezeptoren oder Antikörper miteinander vernetzt oder an Fest­ körperoberflächen gebunden werden, so wählt man die Reaktionsbedingungen möglichst milde. "Möglichst milde" bedeutet, daß die eingesetzten Lösemittel und deren pH und Temperatur nicht denaturierend wirken und daß die Additions­ reaktion vorzugsweise durch Photosensibilisatoren, wie z. B. Benzophenon oder Acetophenon, und UV-Licht initiert wird. - Werden hingegen relativ unempfindliche Verbindungen, wie z. B. Saccharide miteinander vernetzt bzw. an eine Festkörper­ oberfläche gebunden, führt man vorteilhaft die Additionsreaktion bei erhöhtem Druck und erhöhter Temperatur unter Verwendung von Polymerisations­ katalysatoren, z. B. wasserlöslichen Peroxiden, durch.

Die mittels dieses Verfahrens kovalent miteinander vernetzten Verbindungen werden als injizierbares Immunogen, als injizierbares (Genprodukt-) Therapeutikum, als injizierbarer Arzneimittelträger, als Ausgangsmaterial für (affinitäts-)chromatographische Zwecke etc. eingesetzt. - Verfahrensprodukte, die durch Addition von funktionelle Gruppen aufweisenden Verbindungen an vinyl­ gruppen-haltige Partikeloberflächen geschaffen wurden, werden als (injizierbares) Immunogen, als (injizierbares) (Genprodukt-)Therapeutikum, als Ausgangsmaterial zur Immobilisierung von biologisch aktiven Substanzen, als (Basis-) Material für chromatographische Zwecke, etc. eingesetzt. - Verfahrensprodukte, die durch Addition von funktionelle Gruppen aufweisenden Verbindungen an vinylgruppen­ haltige Formkörperoberflächen geschaffen wurden, werden als mit Blut, Tränen­ flüssigkeit, Sekret, Urin, zellhaltigem Gewebe, etc. in Kontakt kommende Medizin­ produkten, wie z. B. Blutbeuteln, Kontaktlinsen oder (Blut-)Katheter oder als wasserbindende Materialien zur Erdbodenlockerung oder als. . . eingesetzt.

Beispiele Beispiel 1: kovalente Vernetzung von Dextran, MG 40.000 mittels Tetramethyl­ tetravinylcyclotetrasiloxan

50 ml Rheofusin® (Fa. Kabi Pharmacia), welches mit 1 M HCl auf pH 2 angesäuert wurde, werden mit 2 ml einer 10 vol.-%igen Lösung von Tetramethyltetravinyl­ cyclotetrasiloxan in Methanol, welcher ein Spatelspitze Benzophenon zugesetzt wurde, bei Raumtemperatur über 48 Stunden und bei Bestrahlung mit einem Quecksilber-Mitteldruckstrahler in einem rotierenden Rundkolben kontaktiert. - Deutliche Unterschiede im Lösungsverhalten zeigen sich, wenn man jeweils gleiche Volumina des so hergestellten Produkts bzw. von nativen Rheofusin® in 2-Propanol eintropft.

Beispiel 2: kovalente Vernetzung von Humanalbumin mittels Tetravinylsilan

50 ml einer 5%igen Lösung von Albumin in einer Elektrolyt-Lösung (Fa. Immuno) werden mit 5 ml einer 5 vol.-%igen Tetravinylsilan-Emulsion in de-ionisiertem Wasser wie bei Beispiel 1 beschrieben kontaktiert. - Die Tetravinylsilan-Emulsion wurde durch Zugabe von 5 vol-% Tetravinylsilan und 0,5 gew.-% Na-dodecylsulfat zu kochendem Wasser und ca. 2 minütiger Ultraschallbehandlung hergestellt. - Unterschiede im Lösungsverhalten zeigen sich beim Zutropfen gleicher Volumina von unvernetzten und mittels Tetravinylsilan vernetzten Albumin zu isotonischer Kochsalzlösung, welche 2,5 Vol.-% 96%igen Ethanol enthält.

Beispiel 3: Addition von Saccharose an diverse siliziumgebundene Vinylgruppen aufweisende Festphasenpartikel

Das Ausrüsten der Oberflächen der Partikel mit siliziumgebundenen Vinylgruppen erfolgte durch mehrtägiges Kontaktieren von offen-porigen Glas (Siran®), offen­ porigem Silikonschaum (gemäß DE-OS 195 42 687 hergestellt), Kieselgur (DIAMOL GM®, Fa. Franz Bertram GmbH, Hamburg), hochdisperser Kieselsäure (HDK T 30, Fa. Wacker-Chemie GmbH, Burghausen) und Silikonpartikeln, die durch Zermahlen von Silikonformkörpern unter Verwendung von flüssigem Stickstoff auf eine Korngröße von <800 µm gewonnen wurden, mit einer 10 vol.-%igen Vinyltnmethoxysilan-Lösung in Methanol, pH 2, anschließendem mehrstündigen Trocknen der Partikel bei ca. 50°C und abschließendem Waschen mit einer aus 1 Teil Methanol und 1 Teil de-ionisiertem Wasser bestehenden Waschlösung, deren pH mit HCl auf ca. 2 eingestellt war. - Ca. 1 Volumenteil der jeweiligen, nunmehr vinylgruppen-haltigen Festphasepartikel wurden dann im waschflüssigkeitsfeuchten Zustand in ca. 10 Volumenteilen einer 5 gew.-%igen wäßrigen Saccharose-Lösung, pH 2, dispergiert. Zu den jeweiligen Dispersionen wurden dann ca. 3 Gew.-% Ammoniumperoxodisulfat zugesetzt, bevor die Dispersionen dann für 45 min bei 121°C und 1,2 bar autoklaviert wurden. Danach wurden die Dispersionen mehrmals mit de-ionisierten Wasser gewaschen und im feuchten Zustand aufbewahrt. - Alle derart mit Saccharose oberflächen­ modifizierten Festphasepartikel sedimentieren in Wasser deutlich schneller als die entsprechenden unbehandelten Partikel. - An diese derart kovalent gebundenen Hydroxylgruppen dieser Partikel können in einem zweiten Schritt nunmehr biologisch aktive Verbindungen, z. B. Antikörper oder Enzyme, mittels etablierter Methoden, wie z. B. CNBr, CDI, Sulfonylchlorid oder FMP, gebunden werden.

Beispiel: 4: Addition von Polymin P® an diverse siliziumgebundene Vinylgruppen aufweisende Festphasenpartikel

Im wesentlichen gleiches Vorgehen wie in Beispiel 3 beschrieben: anstatt einer 5 gew.-%igen Saccharose-Lösung wird aber eine 2 gew.-%ige Ethylenimin polymer-Lösung (Fa. Fluka, Neu-Ulm), in de-ionisiertem Wasser, pH 11, eingesetzt. - Alle derart mit Polymin POR oberflächen-modifizierten Festphase­ partikel sedimentieren in Wasser deutlich schneller als die entsprechenden unbehandelten Partikel, weiterhin binden sie in Wasser gelöste anionische Farbstoffe, z. B. "Phenolrotwasserlöslich" (Fa. Fluka, Neu-Ulm).

Beispiel: 5: Addition von Sorbit an als Kontaktlinsen ausgebildete Formkörper aus Silikonkautschuk

Kontaktlinsen aus Silikonkautschuk (Fa. Wöhlk, Schönkirchen bei Kiel) wurden für ca. 8 Tage gasförmigen Vinyltrimethoxysilan ausgesetzt und zwar dadurch, daß sie bei 30°C in einem Netz aus Polypropylen oberhalb von ca. 10 ml Vinyl­ trimethoxysilan in einem Exsikkator positioniert waren. Die Kontaktlinsen wurden danach einer ca. zweistündigen Wärmebehandlung bei ca. 70°C unterzogen. Danach wurden sie in Quarzküvetten mit einer gesättigten Sorbit- Lösung in Methanol, der ca. 0,5 Gew.-% Benzophenon zugesetzt war, übergeführt. Das Ganze wurde dann für 48 Stunden mit einem Hg-Mitteldruckstrahler bestrahlt. - Da nach wurden die Kontaktlinsen in de-ionisiertem Wasser äquilibriert. Die derart behandelte Kontaktlinsenoberfläche ist nunmehr hydrophil, wobei diese Eigen­ schaft auch gegenüber Kontaktlinsenpflegemitteln ausgesprochen beständig ist.

Claims (2)

1. Verfahren zur kovalenten Modifizierung von chemisch definierten, in flüssiger Phase vorliegenden, funktionelle Gruppen enthaltenden Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Verbindungen mit anderen Verbindungen oder Festkörpern, die ihrerseits mindestens zwei siliziumgebundene Vinyl- oder Butenylgruppen pro Molekül bzw. auf der Festkörperoberfläche aufweisen, derart in innigen Kontakt miteinander bringt und Reaktionsbedingungen aussetzt, daß die funktionellen Gruppen der erstgenannten Verbindungen an die Vinyl- oder Butenylgruppen der zweitgenannten Verbindungen oder Festkörper addiert werden.

2. Verwendung der mittels des Verfahrens nach Anspruch 1 hergestellten Verfahrensprodukte als (injizierbares) Immunogen, als (injizierbares) (Genprodukt-)Therapeutikum, als (Ausgangs-) Material zur Immobilisierung von biologisch aktiven Substanzen, als (Basis-)Material für chromatographische Zwecke, als mit Blut, Tränenflüssigkeit, Sekret, Urin, zellhaltigem Gewebe, etc. in Kontakt kommende Medizinprodukte, wie z. B. Blutbeutel, Kontaktlinsen oder (Blut-)Katheter, als wasserbindendes Material zur Erdbodenlockerung oder als . . .