DE19715441C1 - Verfahren zur In-situ-Kalibrierung von in die Probenlösung eintauchenden Chemo- oder Biosensoren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur In-situ-Kalibrie­ rung von in die Probenlösung eintauchenden Chemo- oder Biosensoren.

Bei fast allen bekannten Verfahren zur In-situ-Kalibrierung wird der Sensor in eine gegenüber der Probenlösung abtrenn­ bare Kammer gebracht und mit einer oder mehreren Standardlö­ sungen kalibriert. Bei der bekannten Kalibrierung in doppellumigen Kapillar- bzw. Rohranordnungen (Biosensors & Bioelectro­ nics Vol. 11 (1996) S. 479-487 Biotechn. Bioeng. Vol. 45 (1995) S. 122-128) ist keine oder nur eine sehr eingeschränkte Anpassung der Kalibrierstandards an die in dynamischen Prozessen sich zeitlich ändernde Probenmatrix und -zusammensetzung möglich.

Aus der DE 195 10 769 A1, aus Analytica Chimica Acta Vol. 304 (1995) S. 229-236, aus Analytical Chemistry Vol. 56 (1984) S. 1188-1192 und aus Journal of Analytical Atomic Spectrome­ try Vol. 5 (1990) S. 125-133 ist ebenfalls bekannt, zur Kalibierung von Meßgeräten die Probe mit einer Standardlösung zu vermi­ schen.

Bei den Verfahren und Vorrichtungen, die in den vorgenann­ ten Druckschriften angegeben sind, erfolgt das Mischen von Probe und Kalibrierlösung an einem Ort während der Kali­ briervorgang entfernt davon an einem anderen Ort stattfin­ det. Dadurch liegt zwischen der Mischung und dem Kalibrie­ ren eine solche Zeitdifferenz, daß das Kalibrieren bei instabilen Proben, wie z. B. bei chemolumineszenten Substan­ zen, ungenau oder unmöglich wird.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur In-situ-Kalibrierung von Tauchmeßsonden zu realisieren, bei dem zwischen der Mischung von Kalibrier- und Probenlösung und der Kalibrierung des Sensors eine so geringe Zeitdiffe­ renz vorliegt, daß auch bei instabilen Proben keine oder nur geringe Veränderungen stattfinden und bei dem das Pro­ benlösungsreservoir selbst nicht durch Standardlösungen kontaminiert wird.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.

Bei diesem Verfahren zur In-situ-Kalibrierung von in die Probenlösung eintauchenden Chemo- oder Biosensoren, bei dem die Sensoren mittels einer oder mehrerer Standardlösungen kalibriert werden, wird die wechselwirkende Sensorschicht der Chemo- oder Biosensoren im inneren Lumen eines doppellu­ migen Rohrsystems angeordnet und dort direkt mit der zu ana­ lysierenden Probenlösung kontaktiert. Die Probenlösung wird über das äußere Lumen in bestimmter reproduzierbarer Zeit­ folge pulsweise oder kontinuierlich mit Standardlösungen vermischt, die eine konstante Konzentration oder einen Kon­ zentrationsgradienten aufweisen, und wobei aus den am Sensor auftretenden Signalen die tatsächlich vorliegende Probenanalytkonzentration und die Sensorkalibierfunktion berechnet werden.

Das Verfahren ist in unterschiedlicher Weise durchführbar. So ist es möglich, daß in eine das äußere Lumen durchströ­ mende Konditionierlösung eine oder verschiedene Standardlö­ sungen einmalig oder in einer bestimmten Folge mehrfach in Form präzis definierter Konzentrationsprofile injiziert werden, so daß sich bei der Detektion durch den Sensor eine Überlagerung des kontinuierlichen Probenanalytsignals mit den durch die Standardlösungen verursachten Signalen er­ gibt, wobei nach Berücksichtigung der durch die Vermi­ schung der mit der Geschwindigkeit V_A fließenden Konditio­ nierlösung mit der Probenlösung, die mit der Geschwindig­ keit V_S = V_I - V_A fließt, verursachten Verdünnung der Probenlösung und durch Extrapolation auf die Standardkonzen­ tration Null, das heißt, auf die sich nach Vermischung von Proben- und Konditionierlösung einstellende Basislinie, und die vor der Zumischung der Konditionierlösung ergebenden Basislinie durch Anwendung der Gleichung

C_S = D_ST,max . Δ^OC_{ST .} n/(1 - V_S/V_A)

die tatsächlich vorliegende Probenkonzentration C_S ermit­ telt wird, wobei

n = Δt/Δt_inj

das Verhältnis der Zeitdifferenz Δt zwischen den Schnitt­ punkten mit den Basislinien und der Zeit Δt_inj zwischen zwei aufeinanderfolgenden Standardlösungsinjektionen, D_ST, max = C^O _ST/C^O _ST, max der zwischen dem Punkt der Standardlösungsinjektion und dem Detektor auftretende Verdünnungsfaktor, der sich aus dem Verhältnis zwischen der injizierten Standardkonzentration C^O _ST zur Standardkonzen­ tration am Peakmaximum C^O _ST,max ergibt, und Δ^OC_ST die konstante Konzentrationszunahme pro Injektion ist, wobei sich aus den durch Korrelation zwischen den gemessenen Peakhöhen h_i multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor D_ST,max Gleichung (1) und den jeweiligen Standardkonzentrationen die Kalibrierfunktion für den Bestimmungsbereich zwischen C_{S .} V_S/V_I und C_S berechnen läßt.

Weiterhin ist es möglich, daß durch Steuerung der Durchfluß­ raten im äußeren und inneren Lumen des Rohrsystems und Erzeugung eines Analytkonzentrationsprofils in Form eines gleichschenkligen Dreiecks im äußeren Lumen sowie durch pulsweise Injektion der Probenlösung in den kontinuierlich in das innere Lumen fließenden Flüssigkeitsstrom eine Folge von Probenpeaksignalen erzeugt wird, wobei sich durch lineare Interpolation zwischen den Peakmaxima zwei Schnitt­ punkte mit der Signalbasislinie ergeben und die Probenkon­ zentration aus der Zeitdifferenz zwischen den Schnittpunk­ ten mittels der Gleichung

C_S = (1 - Δt/2T) . [S]_ST

ermittelt wird, wobei Δt die Zeitdifferenz zwischen zwei Äquivalentpunkten, 2T die zeitliche Breite des Dreieckskon­ zentrationsprofils und [S]_ST die Konzentration in der Stan­ dardstammlösung sind.

Das Verfahren soll in der Folge mit Hilfe der Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen:

Fig. 1a, b die In-situ-Kalibrierung eines amperometrischen Biosensors;

Fig. 2a-d die Anwendung eines Konzentrations-Zeit-Ver­ laufs des Analyten Phenol in Form eines gleich­ schenkligen Dreiecks;

In der Fig. 1a ist eine Tauchmeßsonde 1 dargestellt, die ein rohrförmiges Gehäuse 2 aufweist, in das von oben ein Rohr 3 hineinragt. Zwischen beiden ist ein äußeres Lumen 4 und im Rohr 3 ist ein inneres Lumen 5 vorhanden. Die Proben­ lösung tritt über eine Öffnung 6 des Gehäuses 2 mit der Ge­ schwindigkeit V_S in die Tauchsonde ein. Über ein Injektions­ ventil 7 und das sich anschließende äußere Lumen 4 ist die pulsweise Zuführung einer Standardlösung über die kontinu­ ierlich zugeführte Konditionierlösung mit der Geschwindig­ keit V_A möglich. Im oberen Bereich des Rohres 3 ist eine mit dem Enzym Meerettichperoxidase belegte Goldelektrode als amperometrischer Biosensor 8 angeordnet und diesem nachgeordnet eine Ag/AgCl-Referenzelektrode 9.

Die zu analysierende, Wasserstoffperoxid enthaltende Proben­ lösung tritt über das untere Ende 10 des Rohres 3 in das innere Lumen 5 ein und fließt kontinuierlich mit der Ge­ schwindigkeit V_I an dem wechelswirkenden Biosensor 8 vor­ bei. In eine über das äußere Lumen 4 fließende Lösung werden über das Injektionsventil 7 pulsweise Standardlösun­ gen injiziert, die sich mit der Probenlösung mischen und so ebenfalls am Biosensor vorbeifließen. Durch fortlaufende Injektion von Standardlösungen unterschiedlicher Analytkon­ zentration erhält man den in der Fig. 1b dargestellten Signalverlauf. In dem dort dargestellten Fall wird die Probenlösung mit der Konditionierlösung verdünnt, um sie an den durch Biosensor vorgegebenen Detektionsprozeß anzupas­ sen. Anschließend oder davor werden zu den Zeitpunkten t_i die Standardlösungen unterschiedlicher, vorher in definier­ ter Weise eingestellter Analytkonzentration in die Probenlö­ sung eingeführt. Durch Verbindung der Peakmaxima erhält man die Schnittpunkte SP mit der Signalbasislinie C_S der unverdünn­ ten und VP mit der verdünnten Probenlösung. Bei linearer Sensorkennlinie läßt sich mittels der Gleichung

C_S = D_ST,max .Δ^O C_{ST .} n/(1 - V_S/V_A)

die vorliegende Konzentration C_S berechnen.

Durch Korrelation zwischen den gemessenen Peakhöhen h multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor D_ST,max und den jeweiligen Standardkonzentrationen n . Δ^OC_ST läßt sich für den Bestimmungsbereich zwischen C_S . V_S/V_I und C_S die Kalibrierfunktion zu

C_S = h/f_cal . D_ST,max . n(1 - V_S/V_A

berechnen, wobei f_cal die Detektorempfindlichkeit ist.

In der Fig. 2a ist eine Tauchmeßsonde 1 dargestellt, die den gleichen Aufbau wie die der Fig. 1a aufweist. Als Sensor ist in diesem Fall eine Kohleelektrode 11 mit immobi­ lisierter Tyrosinase angeordnet, der eine Ag/AgCl-Referenze­ lektrode 12 zugeordnet ist. In diesem Ausführungsbeispiel wird im äußeren Lumen 4 des Rohrsystems ein bekannter und präzis definierter Konzentrations-Zeit-Verlauf des Analyten Phenol in Form eines gleichschenkligen Dreiecks erzeugt, wie es in der Fig. 2c erkennbar ist. Der Analyt fließt mit diesem Konzentrations-Zeit-Verlauf bei Übereinstimmung der Durchflußgeschwindigkeiten im äußeren Lumen 4 und im inne­ ren Lumen 5 ständig in das innere Lumen und wird durch die mit Tyrosinase modifizierte Kohleelektrode 11 bei -50 mV gegen die Referenzelektrode detektiert. Durch Modulation der Durchflußgeschwindigkeit V_A entsprechend der Fig. 2b wird pulsweise Probenlösung in den ständig mit dem vorbe­ stimmten Konzentrations-Zeit-Verlauf fließenden Analyten in­ jiziert, wodurch ein in der Fig. 2c dargestellter Konzentra­ tionsverlauf erzielt wird und die Durchflußgeschwindigkeit V_I konstant bleibt. Die für die Erzielung des gewünschten Konzentrations-Zeit-Verlaufs erforderlichen Fließgeschwin­ digkeiten werden durch Pumpen 13, 14, 15 gewährleistet.

Die Auswertung des resultierenden Signals-Verlaufs erfolgt gemäß der Fig. 2d durch Anwendung der Gleichung

C_S = (1 - Δt/2T). [S]_ST

wobei sich die Probenkonzentration C_S des zu bestimmenden Analyten aus der Zeitdifferenz Δt = t_eq,2 - t_eq,1, der zeit­ lichen Breite des Dreieckskonzentrationsprofils 2T und der Konzentration [S]_ST in der Standardstammlösung berechnet und h_ST und h die resultierenden Detektorsignale für die Standardlösungsinjektion bzw. das kontinuierlich gemessene Konzentrationssignal sind.

Claims (3)

1. Verfahren zur In-situ-Kalibrierung von in die Probenlösung eintauchenden Chemo- oder Biosensoren, bei dem die Sensoren mittels einer oder mehrerer Standardlösungen kalibriert werden, wobei die wechselwirkende Sensorschicht der Chemo- oder Biosensoren im inneren Lumen eines doppellumigen Rohrsystems angeordnet und dort direkt mit der zu analysierenden Probenlösung kontaktiert wird, wobei diese über das äußere Lumen in bestimmter reprodu­ zierbarer Zeitfolge pulsweise oder kontinuierlich mit Standardlösungen vermischt wird, die eine konstante Konzentration oder einen Konzentrations­ gradienten aufweisen, und wobei aus den am Sensor auftretenden Signalen die tatsächlich vorliegende Probenanalytkonzentration und die Sensorkalibier­ funktion berechnet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in eine das äußere Lumen durchströmende Konditionierlösung eine oder verschiedene Standardlösungen einmalig oder in einer bestimmten Folge mehrfach in Form präzis defi­ nierten Konzentrationsprofile injiziert werden, so daß sich bei der Detektion durch den Sensor eine Überlagerung des kontinuierlichen Probenanalytsi­ gnals mit den durch die Standardlösungen verursach­ ten Signalen ergibt, indem durch Extrapolation auf die Standardkonzentration Null durch Anwendung der Gleichung
C_S = D_ST,max . ^OC_ST . n/(1 - V_S/V_A)
auf die vorliegende Probenkonzentration C_S geschlos­ sen wird, wobei n mit
n = t/ t_inj
das Verhältnis der Zeitdifferenz t zwischen den Schnittpunkten mit den Basislinien und der Zeit t_inj zwischen zwei aufeinanderfolgenden Standard­ lösungsinjektionen, D_ST,max = C^O _ST/C^O _ST,max der zwischen dem Punkt der Standardlösungsinjektion und dem Detektor auftretende Verdünnungsfaktor, der sich aus dem Verhältnis zwischen der injizierten Standardkonzentration C^O _ST zur Standardkonzentrati­ on am Peakmaximum C^O _ST,max ergibt, und ^OC_ST die konstante Konzentrationszunahme pro Injektion sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei durch Steuerung der Durchflußraten im äußeren und inneren Lumen des Rohrsystems und Erzeugung eines bekannten Analytkonzentrationsprofils in Form eines gleich­ schenkligen Dreiecks im äußeren Lumen sowie durch pulsweise Injektion der Probenlösung in den kontinu­ ierlich in das innere Lumen fließenden Flüssigkeits­ strom eine Folge von Probenpeaksignalen erzeugt wird, wobei sich durch lineare Interpolation zwi­ schen den Peakmaxima zwei Schnittpunkte mit der Standardsignallinie ergeben und die Probenkonzentra­ tion aus der Zeitdifferenz zwischen den Schnittpunk­ ten mittels der Gleichung
C_S = (1 - t/2T) . [S]_ST
ermittelt wird, wobei t die Zeitdifferenz zwi­ schen zwei Äquivalentpunkten, 2T die zeitliche Breite des Dreieckskonzentrationsprofils und [S]_ST die Konzentration in der Standardstammlösung sind.