DE19630738A1 - Invertase-Inhibitoren - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die mindestens eine für ein
Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz enthält, wobei das Polypeptid zur
Reduzierung der enzymatischen Aktivität einer Invertase befähigt ist, das Poly
peptid selbst sowie transgene Pflanzen, die diese Nukleinsäuresequenz enthal
ten. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von
solchen transgenen Pflanzen mit reduziertem, lagerungsbedingtem Saccharose
Verlust.
Während der Lagerung von Zuckerrüben (Beta vulgaris), im Zeitraum zwischen
Ernte und Verarbeitung, kommt es durch Atmung bzw. Saccharose-Metabolis
mus zu einem Saccharose-Verlust von etwa 0,02% pro Tag. Mit diesem Verlust
geht ferner eine signifikante Qualitätsminderung infolge der Zunahme redu
zierender Zucker, insbesondere Fructose und Glucose, einher (Burba, M. (1976)
Atmung und Saccharosestoffwechsel lagernder Zuckerrüben. Zeitschrift für die
Zuckerindustrie 26: 647-658). Der erste metabolische Schritt beim Saccharose-
Abbau während der Rübenlagerung ist die enzymatische Hydrolyse durch eine
vakuoläre Invertase. Dieses Enzym wird in Rübengewebe nach Verwundung de
novo synthetisiert (Milling, R.J., Leigh, R.A., Hall, J.L. (1993) Synthesis of a
vacuolar acid invertase in washed discs of storage root tissue of red beet (Beta
vulgaris L.). J. Exp. Bot. 44: 1687-1694). Da die Hauptmasse der Rüben-Sac
charose in den Zellvakuolen lokalisiert ist, spielt die (wund-)induzierte vakuoläre
Invertase eine zentrale Rolle für den lagerungsbedingten Saccharose-Verlust.
Ein lagerungsbedingter Umsatz von Saccharose zu den Hexosen Glucose und
Fructose und somit ein Saccharose-Verlust findet auch während des sogenann
ten "cold sweetening" bei Kartoffeln statt. Infolge der Kältebehandlung wird in
den Kartoffelknollen eine vakuoläre Invertase induziert, die das Verhältnis von
Saccharose zu Hexosen bestimmt (Zrenner, R., Schüler, K., Sonnewald, U.
(1996) Soluble acid invertase determines the hexose-to-sucrose ratio in cold
stored potato tubers. Planta 198: 246-252). Die Bildung der Hexosen als Folge
des "cold sweetening" führt zu Qualitätseinbußen bei der Herstellung von
beispielsweise Pommes frites.
Es gibt zur Zeit keine befriedigende Lösung für das Problem lagerungsbedingter
Saccharose-Verluste (Burba, 1976). Die wichtigsten Maßnahmen im Stand der
Technik bestehen in der Einhaltung niedriger Temperaturen (unter 12°C) und
definierter Luftfeuchte (zwischen 90 und 96%). Jedoch sind alle bisher einge
setzten Maßnahmen zur Verminderung der lagerungsbedingten Verluste unbefrie
digend.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein neues System
bereitzustellen, das im wesentlichen keine lagerungsbedingten Saccharose-Ver
luste in Pflanzen hervorruft.
Diese Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen gekennzeichneten
Gegenstände der vorliegenden Erfindung gelöst.
Ein erster erfindungsgemäßer Gegenstand betrifft eine Nukleinsäure, die minde
stens eine für ein Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz enthält, wobei das
Polypeptid zur Reduzierung bzw. Erniedrigung der enzymatischen Aktivität einer
Invertase befähigt ist.
Die Begriffe "Nukleinsäure" und "Nukleinsäuresequenz" bedeuten natürliche oder
halbsynthetische oder synthetische oder modifizierte Nukleinsäuremoleküle aus
Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden und/oder modifizierten Nukleo
tiden.
Der Begriff "Polypeptid" umfaßt natürlich vorkommende Polypeptide und rekom
binante Polypeptide. Rekombinante Polypeptide bezeichnen ein mit molekularbio
logischen Techniken hergestelltes Konstrukt, dem die natürliche DNA des origi
nalen Genoms bzw. die natürliche DNA, modifiziert mit einer fremden
DNA-Sequenz, zugrundeliegt, und rekombiniert werden kann, z. B. mit Plasmiden, und
in einem geeigneten Wirtssystem repliziert und exprimiert werden kann.
Der Ausdruck "ein zur Reduzierung der enzymatischen Aktivität einer Invertase
befähigtes Polypeptid" bedeutet ein Polypeptid, welches in Folge der Bindung an
eine Invertase deren enzymatische Aktivität reduziert, wobei bei ausreichender
Menge des Inhibitorproteins eine vollständige Inhibition möglich ist. Vorzugs
weise soll durch die Inhibitorexpression in der transgenen Pflanze eine etwa
90%ige Inhibition der vakuolären Invertase erreicht werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Invertase in einer
Pflanzenzelle vakuolär lokalisiert, wobei die Invertase vorzugsweise aus der
Zuckerrübe oder der Kartoffel stammt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die
Nukleinsäure die in Fig. 1 gezeigte Nukleinsäuresequenz oder Abschnitte bzw.
Fragmente davon.
In einer anderen Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure
eine weitere, für eine Targeting-Sequenz kodierende Nukleinsäuresequenz. Der
Begriff "Targeting-Sequenz" bedeutet eine Aminosäuresequenz, welche die
zelluläre Zielsteuerung in ein definiertes zelluläres Kompartiment vermittelt,
beispielsweise die Zielsteuerung in die Vakuole.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die
Targeting-Sequenz die vakuoläre Targeting-Sequenz des Gerstenlektins mit
folgender Aminosäuresequenz:
LEGVFAEIAASNSTLVAE.
In einer anderen Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure
eine weitere, für ein Signalpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz. Der Begriff
"Signalpeptid" bedeutet eine hydrophobe Aminosäuresequenz, die vom Signal
erkennungspartikel (SRP) erkannt wird. Das SRP vermittelt die Synthese des
Gesamtpolypeptids am rauhen endoplasmatischen Reticulum (ER), mit der Folge,
daß das entstehende Polypeptid in das Lumen des ER entlassen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammt das Signalpeptid von einer
Invertase, vorzugsweise von der Zellwand-Invertase aus Tabak.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Nu
kleinsäure eine weitere Nukleinsäuresequenz, welche einen zur Expression in
Pflanzen geeigneten Promotor umfaßt. Dieser Promotor bzw. Promotorsequenz
stammt vorzugsweise aus der gleichen Pflanze wie die Invertase. In einer beson
ders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Promotor
ein Kartoffel- oder Zuckerrüben-spezifischer Promotor.
Zusammenfassend kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure die vorstehend
definierte, das Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz und gegebenenfalls
die vorstehend definierte, eine Targeting-Sequenz kodierende Nukleinsäurese
quenz und/oder die ein Signalpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz und/oder
den vorstehend definierten Promotor umfassen, wobei vorzugsweise alle eine
Aminosäuresequenz kodierenden Nukleinsäuresequenzen im Leserahmen an
geordnet sind und entsprechend dem genetischen Code degeneriert sein können.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der die
vorstehend definierte, erfindungsgemäße Nukleinsäure zur Expression des
rekombinanten Polypeptids in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen
enthält. Der erfindungsgemäße Vektor kann vorzugsweise geeignete regulatori
sche Elemente, wie Promotoren, Enhancer, Terminationssequenzen, enthalten.
Der erfindungsgemäße Vektor kann beispielsweise ein Expressionsvektor oder
ein Vektor zur vorzugsweise stabilen Integration der erfindungsgemäßen Nu
kleinsäure in das genetische Material einer Wirtszelle sein. Ein geeignetes Ex
pressionssystem umfaßt beispielsweise das Ti-Plasmid oder ein binäres Plasmid
system in Agrobacterium tumefaciens als Vektor zur stabilen Integration der
erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das genetische Material einer Pflanze.
Weiterhin kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure z. B. auch durch das Ri-Plasmid von Agrobacterium rizogenes, durch direkten Gentransfer mittels Poly ethylenglykol, durch Elektroporation oder durch Partikelbeschuß in das geneti sche Material einer Pflanze eingeführt werden.
Weiterhin kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure z. B. auch durch das Ri-Plasmid von Agrobacterium rizogenes, durch direkten Gentransfer mittels Poly ethylenglykol, durch Elektroporation oder durch Partikelbeschuß in das geneti sche Material einer Pflanze eingeführt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, welche
die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder den erfindungsgemäßen Vektor enthält.
Geeignete Wirtszellen sind beispielsweise Prokaryonten, wie E. coli, oder euka
ryotische Wirtszellen wie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces
pombe, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris und Bacculovirus-infizierte
Insektenzellen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist das Polypeptid selbst, das von
der vorstehend definierten Nukleinsäuresequenz kodiert wird, wobei die Nu
kleinsäuresequenz entsprechend dem genetischen Code degeneriert sein kann.
Das erfindungsgemäße Polypeptid enthält mindestens einen zur Reduzierung der
enzymatischen Aktivität einer Invertase befähigten Aminosäure-Sequenzab
schnitt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Polypeptid
die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz oder Abschnitte bzw. Fragmente
davon. Ferner umfaßt der Begriff "Polypeptid" beispielsweise Isoformen aus der
gleichen Pflanze sowie homologe Inhibitor-Sequenzen anderer Pflanzenarten,
wobei die Homologie auf Proteinebene vorzugsweise < 70% ist.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält das Polypeptid weiter eine
am C-Terminus des Polypeptids angeordnete Aminosäuresequenz, welche eine
vorstehend definierte Targeting-Sequenz umfaßt, und/oder eine am N-Terminus
des Polypeptids angeordnete Aminosäuresequenz, welche ein vorstehend defi
niertes Signalpeptid umfaßt.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, der erfindungsgemäße Vektor
sowie das erfindungsgemäße Polypeptid können durch im Stand der Technik
bekannte Verfahren hergestellt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Pflanze,
die mindestens die vorstehend definierte, erfindungsgemäße Nukleinsäure
enthält.
Der Begriff "transgene Pflanze" bzw. "Pflanze" umfaßt die ganze Pflanze als
solche sowie deren Teile, wie Wurzel, Stengel, Blatt, organspezifisches Gewebe
oder Zellen, deren vermehrungsfähiges Material, insbesondere Samen, und deren
Keimlinge. Ferner umfaßt dieser Begriff Stärkeknollen und -wurzeln, beispiels
weise Kartoffel, Batate und Maniok, und Zuckerpflanzen, beispielsweise Zucker
rohr und Zuckerrübe, sowie Tomate und Mais.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Wildtyp
der transgenen Pflanze eine Zuckerrübe oder eine Kartoffel.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze, worin eine Pflanzenzelle
durch stabile Integration der vorstehend definierten Nukleinsäure in das geneti
sche Material transformiert wird und die transformierte Pflanzenzelle zur trans
genen Pflanze regeneriert wird. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen
sind im Stand der Technik bekannt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der
vorstehend definierten Nukleinsäure zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit
reduziertem lagerungsbedingtem Saccharose-Verlust.
Erfindungsgemäß kann festgestellt werden, daß die Verminderung lagerungs
bedingter Saccharose-Verluste durch die Expression des vorstehend definierten
Polypeptids als "Invertase-Inhibitorprotein" in transgenen Pflanzen überraschen
derweise ein hochspezifisches, umweltschonendes Verfahren zur Verbesserung
von beispielsweise der Zuckerrüben- bzw. Kartoffelknollenqualität darstellt. Für
die Zuckerrübe wird durch die Effizienzsteigerung der Zuckergewinnung bei
vorgegebener Ertragshöhe eine Verminderung des Produktionsmitteleinsatzes
ermöglicht. Im Fall der Kartoffel wird durch Reduktion der Kälte-induzierten
Hexose-Bildung die Produktqualität der Kartoffeln, insbesondere für die Her
stellung von Pommes frites, erhöht.
Durch die Kombination der den Invertase-Inhibitor kodierenden Nukleinsäurese
quenz mit einer, eine geeigneten Targeting-Sequenz kodierenden Nukleinsäurese
quenz kann beispielsweise eine korrekte vakuoläre Zielsteuerung des exprimier
ten Invertase-Inhibitors in die Vakuole erreicht werden und somit die Expression
des Invertase-Inhibitors räumlich begrenzt werden. Ferner kann durch Verwen
dung von beispielsweise rüben- oder knollenspezifischen Promotoren die Ex
pression des Invertase-Inhibitors zeitlich begrenzt werden.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 zeigt die den Invertase-Inhibitor kodierende c-DNA aus Nicotiana taba
cum mit einer Länge von 1701 bp, wobei der offene Leserahmen ("open reading
frame", "ORF") 477 bp mit Startnukleotid 1 umfaßt. Der von dieser Nukleinsäu
resequenz kodierte Invertase-Inhibitor weist 159 Aminosäuren mit einem errech
neten Molekulargewicht Mr von 18915 und einem errechneten isoelektrischen
Punkt von 10,13 auf.
Fig. 2 zeigt die schematische Herstellung des Inhibitor-Konstrukts einer bevor
zugten erfindungsgemäßen Ausführungsform zur Transformation von Pflanzen.
Durch das nachfolgende Beispiel wird die vorliegende Erfindung näher erläutert.
Sämtliche, im folgenden Beispiel zur Anwendung kommenden Methoden für die
Herstellung der erforderlichen Genkonstrukte entsprechen Standardverfahren
molekularbiologischen Arbeitens (Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore,
D.D., Seidmann, J.G., Smith, J.A., and Struhl, K. (1987-1996) Current Proto
cols in Molecular Biology, Greene Publishing). Der Arbeitsgang gliedert sich im
wesentlichen in folgende Abschnitte:
- (1) Das Inhibitorprotein wird über selektive Salzelution des Zellwandproteins, zweifache Ionenaustauscherchromatographie und anschließende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese bis zur Homogenität gereinigt.
- (2) Das homogene Inhibitorprotein wird tryptisch verdaut und die erhaltenen Peptide des Inhibitorproteins werden über Edman-Abbau sequenziert.
- (3) Ausgehend von den erhaltenen Peptidsequenzen werden degenerierte Primer synthetisiert und mit ihrer Hilfe über PCR DNA-Fragmente der Inhibitor-cDNA aus Gesamt-cDNA amplifiziert.
- (4) Aus Tabakzellkulturen wird eine cDNA-Bank (in einem Expressionsvektor; λ-ZAP, Fa. Stratagene) hergestellt.
- (5) Die erhaltenen Partialsequenzen der Inhibitor-cDNA (siehe (2)) werden für das Screening der cDNA-Bank eingesetzt.
- (6) Der erhaltene Vollängenklon wird nach Expression in E.coli (Einklonierung in den pQE-Vektor der Fa. Qiagen) hinsichtlich seiner Funktion (Invertase- Inhibition) bestätigt.
- (7) Der für das Inhibitorprotein kodierende Abschnitt des cDNA-Klons wird
über PCR amplifiziert. Hierfür werden Primer mit Restriktionsschnittstellen
eingesetzt, die die anschließende Ligation mit der Signal- und der Targe
ting-Sequenz erlauben. Am 5′-Ende wird mit der Signalsequenz, am
3′-Ende mit der Targeting-Sequenz für die Vakuole ligiert.
Gewinnung der Signalsequenz: Die Signalsequenz wird mittels PCR aus der cDNA der Tabak-Zellwand-Invertase (Greiner, S., Weil, M., Krausgrill, S., Rausch, T. (1995) Plant Physiology 108: 825-826) amplifiziert (Be reich: Met¹-Val²³). Hierfür werden Primer mit Restriktionsschnittstellen eingesetzt, die die anschließende Ligation mit der Inhibitor cDNA erlauben. Gewinnung der Targeting-Sequenz: Die Targeting-Sequenz wird aus der cDNA für das Gerstenlektin amplifiziert (Bednarek, S.Y., Taikhel, N.V. (1991) Plant Cell 3: 1195-1206). Hierfür werden ebenfalls Primer mit Restriktionsschnittstellen eingesetzt, die die anschließende Ligation mit der Inhibitor cDNA erlauben. - (8) Das unter (7) genannte Genkonstrukt wird 5′-seitig mit einem rübenspezi fischen Promotor ligiert und das erhaltene Konstrukt in einen binären Expressionsvektor einkloniert.
- (9) Die Zielpflanze wird über eine geeignete, im Stand der Technik bekannte Transformationstechnik transformiert. Der Aufbau des für die Transforma tion benötigten Genkonstruktes ist in Fig. 2 dargestellt.
Claims (26)
1. Nukleinsäure, enthaltend mindestens eine für ein Polypeptid kodierende
Nukleinsäuresequenz, wobei das Polypeptid zur Reduzierung der enzymati
schen Aktivität einer Invertase befähigt ist.
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Invertase in einer Pflanzenzelle
vakuolär lokalisiert ist.
3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Invertase aus der
Zuckerrübe oder der Kartoffel stammt.
4. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die in Fig.
1 gezeigte Nukleinsäuresequenz oder Abschnitte davon.
5. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiter enthaltend minde
stens eine für eine Targeting-Sequenz kodierende Nukleinsäuresequenz.
6. Nukleinsäure nach Anspruch 5, wobei die Targeting-Sequenz die vakuolä
re Targeting-Sequenz des Gerstenlektins umfaßt.
7. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiter enthaltend minde
stens eine für ein Signalpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz.
8. Nukleinsäure nach Anspruch 7, wobei das Signalpeptid von einer Inver
tase stammt.
9. Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Signalpeptid von der
Zellwand-Invertasse aus Tabak stammt.
10. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9, weiter enthaltend minde
stens eine Nukleinsäuresequenz, welche einen zur Expression in Pflanzen
geeigneten Promotor umfaßt.
11. Nukleinsäure nach Anspruch 10, wobei der Promotor aus der gleichen
Pflanze stammt wie die Invertase.
12. Nukleinsäure nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Promotor ein Kar
toffel- oder Zuckerrüben-spezifischer Promotor ist.
13. Vektor, enthaltend die Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis
12.
14. Wirtszelle, enthaltend die Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis
12 oder den Vektor gemäß Anspruch 13.
15. Polypeptid, enthaltend mindestens einen zur Reduzierung der enzymati
schen Aktivität einer Invertase befähigten Aminosäure-Sequenzabschnitt.
16. Polypeptid nach Anspruch 15, umfassend die in Fig. 1 gezeigte Amino
säuresequenz oder Fragmente davon.
17. Polypeptid nach Anspruch 15 oder 16, weiter enthaltend eine am
C-Terminus des Polypeptids angeordnete Aminosäuresequenz, welche eine
Targeting-Sequenz umfaßt.
18. Polypeptid nach Anspruch 17, wobei die Targeting-Sequenz die vakuoläre
Targeting-Sequenz des Gerstenlektins umfaßt.
19. Polypeptid nach einem der Ansprüche 15 bis 18, weiter enthaltend eine
am N-Terminus des Polypeptids angeordnete Aminosäuresequenz, welche
ein Signalpeptid umfaßt.
20. Polypeptid nach Anspruch 19, wobei das Signalpeptid von einer Invertase
stammt.
21. Polypeptid nach Anspruch 19 oder 20, wobei das Signalpeptid von der
Zellwand-Invertasse aus Tabak stammt.
22. Transgene Pflanze, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem
der Ansprüche 1 bis 12.
23. Transgene Pflanze nach Anspruch 22, deren Wildtyp eine Zuckerrübe ist.
24. Transgene Pflanze nach Anspruch 22, deren Wildtyp eine Kartoffel ist.
25. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze gemäß einem der
Ansprüche 22 bis 24, worin eine Pflanzenzelle durch stabile Integration
der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 in das genetische
Material transformiert wird und die transformierte Pflanzenzelle zur trans
genen Pflanze regeneriert wird.
26. Verwendung der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur
Herstellung einer transgenen Pflanze mit reduziertem lagerungsbedingtem
Saccharose-Verlust.
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- 1996-07-30 DE DE1996130738 patent/DE19630738A1/de not_active Ceased
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