DE19548029A1 - Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays, bei dem die Kalibratorsubstanz in denaturierender Lösung vorliegt - Google Patents

Description

Zum Nachweis von Proteinen in Serum- oder Urinproben für medizinisch­ diagnostische Zwecke werden häufig wegen besonders guter Spezifität und Sensiti­ vität Immunoassays eingesetzt. Dazu bedarf es neben einem oder zwei spezifi­ schen Antikörpern eines Kalibrators, der als Vergleichsmaßstab zur Quantifi­ zierung der Patientenproben benutzt wird. Besonders für automatisierte Assays in großen Analyselaboratorien ist die Lagerung der Kalibratoren bei 4°C für mehrere Wochen bis Monate wünschenswert. Diese Anforderungen an die Stabilität der Kalibratorformulierung können je nach Analyt Schwierigkeiten bereiten, wenn z. B. die Löslichkeit unter physiologischen Salz- und pH-Bedingungen nicht gewähr­ leistet ist. Als Beispiel seien hier Troponin I und Troponin T genannt, die nur in denaturierenden Lösungen (6 M Harnstoff, 0.01 M Dithiothreitol) hinreichend stabil und löslich sind. Mit dieser denaturierenden Formulierung kann jedoch kein Immunoassay etabliert werden, da die Antikörper unter dieser Behandlung leiden. Das Probenvolumen generell zu reduzieren ist i.d.R. nicht möglich, da ein Nachweis des Analyten bis in niedrige Konzentrationsbereiche (z. B. < 1 ng/ml) ein möglichst großes Probenvolumen bedingt.

Es ist bekannt, daß Proteine in Lösung wenig stabil sind und daß sie enthaltende Reagenzien häufig in gefriergetrockneter Form vertrieben werden, mit einem Lösungsmittel geeigneter Zusammensetzung, in dem sie vor der Verwendung von dem Benutzer aufgelöst werden müssen. Wenn man die auf diese Weise erhaltenen Lösungen bei 4°C aufbewahrt, kann man sie während mehrerer Tage benutzen, selbst wenn die tägliche Bestimmung eine gewisse Veränderung der Konzentration des Reagenz zeigt. So werden im allgemeinen - und es wird auch im Fall von Troponin I und Troponin T empfohlen - die ausgehend von dem gefrierge­ trockneten Material erhaltenen Vergleichslösungen für längere Lagerung in Ein­ heitsdosisform einzufrieren. Dieses Verfahren ist zeit- und kostenaufwendig und kann durch die im folgenden beschriebene Erfindung vermieden werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays, bei dem der Kalibrator in denaturierende Lösung vorliegt und somit sehr gute Stabilität hat. Dafür wird die Kalibration nach einem anderen Versuchsschema durchgeführt, bei dem das Kalibratorvolumen so weit reduziert wird, daß die denaturierenden Agenzien im Gesamttest stark verdünnt werden. Sie stören dann bei der Durchführung des Immunoassays nicht. Damit die Standard­ kurve bei dieser Art der Kalibration vergleichbar mit der ursprünglich gewonnenen ist, wird die Konzentration des Kalibrators entsprechend erhöht. Ein Volumenaus­ gleich kann über Zugabe einer geeigneten Menge wäßriger Lösung erfolgen.

Unter denaturierenden Agenzien sind Chemikalien zu verstehen, die dazu geeignet sind Biomoleküle wie z. B. Proteine in ihrer Struktur so zu verändern, daß sie ihre eigentliche Funktion nicht mehr erfüllen können. Dabei handelt es sich z. B. um Puffersubstanzen mit unphysiologischen pH-Werten, um Lösungen unphysiolo­ gisch hoher oder niedriger Ionenstärke, um Detergenzien wie z. B. Natrium­ dodecylsulfat (SDS) oder Triton X100, um chaotrope Salze wie z. B. Guanidinium­ hydrochlorid oder Harnstoff, um organische Lösungsmittel wie z. B. Ethanol oder Dimethylsulfoxid (DMSO) oder um S-reaktive Agenzien wie z. B. β-Mercapto­ ethanol oder Dithiothreitol (DTT).

Beispiele Beispiel 1

Ein Sandwich Immunoassay für den Analyten humanes cardiales Troponin I wurde durchgeführt auf dem automatisierten Analyser Immuno I (Bayer Diagnostics). Die Troponin I Präparationen, die als Kalibratoren eingesetzt werden sollen sind in folgender Lösung über einen langen Zeitraum von mindestens 20 Monaten stabil:
6 M Harnstoff, 0.1 mM Dithiothreitol, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH = 8.0. Das Probenvolumen für Patientenproben beträgt normalerweise 65 µl. Mit dieser Lösung ist die Kalibration eines Immunoassays nicht möglich. Für die Kalibration wurde das Kalibratorvolumen auf 10 und 3,5 µl reduziert. Gleichzeitig wurde die Konzentration um einen Faktor 6,5 bzw. 20 erhöht. Anhand der gewonnenen Standardkurve wurde die Konzentration des Analyten in Patientenproben bestimmt.

Beispiel 2

Ein Sandwich Immunoassay für den Analyten humanes kardiales Troponin I wurde durchgeführt auf dem automatisierten Analyser Immuno I (Bayer Diagnostics). Die Troponin I Präparationen wurden in Ethanol oder DMSO verdünnt, um als Standardkurve zu dienen. Das Volumen für die Kalibration wurde von 65 µl auf 3.5 µl erniedrigt. Diese kleine Menge an Lösungsmittel beeinflußte den Ablauf des Immunoassays nicht sehr stark, so daß geringe Modifikationen der Assay-Konfiguration ausreichen, um die erhaltene Kurve als Standardkurve zu benutzen.

Claims (4)

1. Verfahren zur Durchführung von Immunoassays zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten unter Benutzung eines Kalibrators in denaturierender Formulierung, dadurch gekennzeichnet, daß die Kalibration nach einem Protokoll durchgeführt wird, das sich von dem für die Bestimmung des Analyten unterscheidet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kalibrator­ volumen ein anderes ist, als das Probenvolumen, was für die Bestimmung des Analyten eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Analyten um humanes Troponin I handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Kalibrator in 6-8 M Harnstofflösung vorliegt.