DE1806135A1 - Neue hypocalcaemische Peptide und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ)

Case 6306/6375/I-VS

Deutschland

Neue hypocalcämische Peptide und Verfahren zu ihrer

Herstellung

Gegenstand der Erfindung sind das neue hypocalcämisch wirksame Peptid der Formel I

H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-OH

909829/1544

und entsprechende Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginreste in den Stellungen 3* 15* 17 und 18 durch den Asparaginsäurerest und/oder der Glutaminsäurerest in Stellung 30 durch den Glutaminrest und/oder der Methioninrest in Stellung 25 durch den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin- oder Norleucinrest ersetzt sind, sowie Säureadditionssalze, Derivate und Komplexe der genannten Peptide und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren wie Salzsäure, Essigsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäuren, Sulfonsäuren zu nennen.

Als Derivate sind beispielsweise zu nennen, Ester, wie Niederalkylester, z.B. Methyl-, Aethyl-, Propyl-, tert.-Butylester und Amide, insbesondere das Amid, das statt der C-terminalen Carboxylgruppe die unsubstituierte Amidgruppe

25 α

enthält, ferner das Met -Sulfoxid, entsprechende N -acylierte Peptide und Desamino -Peptide.

Acylgruppen für die Acylierung der N -Aminogruppe sind die Reste von Carbonsäuren, wie aliphatischen, aromatischen, araliphatischen, heterocyclischen und heterocyclylaliphatisehen Carbonsäuren, insbesondere von niederen Alkansäuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäuren, von monocyclisehen aromatischen Carbonsäuren wie unsubstituierter und substituierter Benzoesäure, von unsubstituierten und Aryl-substituierten Aryl-niederalkylearbonsäuren wie Phenylessigsäure, von 5- bis 6-gliedrigen

909829/1-544

heterocyclischen Säuren mit Stickstoff, Schwefel und/oder Sauerstoff als Heteroatomen, wie Pyridincarbonsäuren, Thiophencarbonsäuren, oder von Heterocyclyl-niederalkansäuren wie Pyridylessigsäure, Imidazolylessigsäure, worin die Substituenten der Ringe z.B. Halogenatome, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederaikoxygruppen oder Niedercarbalkoxygruppen sind. Weiter sind als Acylreste von Aminosäuren, besonders α-Aminosäuren, wie z.B. der Pyroglutamylrest zu nennen, ferner Acylreste, die sich von Kohlensäure oder Thiokohlensäure bzw. ihren Estern oder Amiden ableiten, z.B. Nlederalkyloxycarbonylgruppen wie Aethoxycarbonyl oder tert.-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonylgruppen, Carbamoyl- und Thiocarbamoylgruppen wie N-substituierte Carbamoyl- und Thiocarbamoylgruppen, z.B. N-Niederalkylcarbamoyl-, N-Phenylcarbamoyl- oder N-Phenyl-thiocarbamoylgruppen, worin die Arylreste wie oben angegeben substituiert sein können.

Unter Komplexen sind die in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu langkettigen

Peptiden entstehen und diesen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche Stoffe sind beispielsweise beschrieben für ACTH und andere adrenocorticotrop wirksame Peptide. Zu nennen sind z.B. anorganische Verbindungen, die sich von Metallen wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und

909829/1544

insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze wie Phosphate, Pyrophosphate und Polyphosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle, ferner Alkalimetallpolyphosphate wie z.B. "Calgon N", "Calgon 322", "Calgon l88" oder "Polyron B 12". Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z.B. Polyoxygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextran, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphlorestinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z.B. Protamin oder PoIyglutaminsäure.

Die neuen Verbindungen, insbesondere das Amid der Verbindung der Formel I, weisen eine hypocalcämische Wirkung auf. Sie senken den Plasma- Calcium- und-Phosphatgehalt des Blutes von Säugetieren, wie durch Versuche an Wistar-Ratten nachgewiesen wurde. Ferner haben sie entzündungshemmende Eigenschaften, wie am Beispiel des Kaolinödems an der Ratte gezeigt werden konnte.

Die Verbindungen sind auch am Menschen wirksam. Bei parenteraler Gabe von 0,01 bis 1 mg in 0,1-m. Acetatpuffer vom pH 4,6 gelöstem C-terminalem Amid der Verbindung der Formel I wird das Serumcalcium und Serumphosphat gesenkt. Diese Wirkung zeigt sich nicht nur an Hypercalcämie-Patienten,

909829/1544

sondern- auch die normalcalcämischen Personen, die z.B. an O.steoporose leiden.

Die neuen Verbindungen können daher zur Behandlung von Hypercalcämie und von Knochenkrankheiten wie Oesteoporose verwendet werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen der Formel I und entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginreste durch den Asparaginsäurerest und/oder der Glutaminsäurerest durch den Glutaminrest und/oder der Methioninrest durch einen der oben genannten Reste ersetzt sind, ihrer Salze, Derivate und Komplexe ist dadurch gekennzeichnet, dass man

1. aus Verbindungen der Formel I oder den genannten Analogen oder Derivaten, worin mindestens die a-Aminogruppe und die terminale und Seitenketten-Carboxylgruppen geschützt sind, die Schutzgruppen abspaltet oder

2. Verbindungen der Formel II H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-OH ^

oder die genannten Analogen oder Derivate zu Disulfiden oxydiert oder

3· Verbindungen der Formel II oder die genannten Analogen oder Derivate, worin die Mercaptogruppe durch die Tritylgruppe geschützt sind, direkt zu Disulfiden oxydiert oder

909829/15U

4. Verbindungen der Formel III oder IV

S—. . — S ■ —

CH₂ CH₂

R-CH-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-OH R-CH-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-A

III IV

worin A 1 bis 21 der auf Cystein¹ folgenden Aminosäurereste und R Wasserstoff oder eine acylierte Aminogruppe darstellt, mit der restlichen C-terminalen Sequenz des Peptids (der Formel I abzüglich Formel III oder IV) nach in der Peptidsynthese bekannten Methoden kondensiert mit der Massgabe,, dass die Azidmethode, die Anhydridmethode oder die Methode der aktivierten Ester angewendet werden, wenn die C-terminale Sequenz eine freie Carboxylgruppe aufweist und, wenn erwünscht, die a-Acylgruppe abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Säureadditionssalze, Derivate oder Komplexe überführt.

Bei der Herstellung der Ausgangsstoffe für die 1. Variante des erfindungsgemässen Verfahrens wie auch aller in den 4 Verfahrensvärianten benötigten Zwischenprodukte kommen als Schutzgruppen besonders die von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten sowie einige neue Schutzgruppen in Betracht, die leicht abgespalten werden können, z.B. durch Hydrolyse, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazinolyse.

909829/1544

So verwendet man z.B. als Schutzgruppen für Aminogruppen Acyl- oder Aralkylgruppen wie Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, Benzolsulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, ο-Ni trophenylsulfenyl-, 2,4-Dinitropheny1sulfenylgruppen (diese SuIfenylgruppen können auch durch Einwirkung nucleophiler Reagenzien, z.B. Sulfiten, Thiosulfaten, vgl. englisches Patent 1 104 271 abgespalten werden) gegebenenfalls substituierte, wie z.B. durch Niederalkoxygruppen, besonders o- oder p-Methoxygruppen substituierte Benzyl-, oder Diphenyl- oder Triphenylmethylgruppen oder von der Kohlensäure sich ableitende Gruppen wie gegebenenfalls, z.B. durch Halogenatome wie Chlor oder Brom, Nitrogruppen oder Niederalkoxygruppen substituierte Benzyl- oder Benzhydryloxycarbonylgruppen, z.B. Carbobenzoxy, p-Brom- oder p-Chlorcarbobenzoxy, p-Nitrocarbobenzoxy oder p-Methoxycarbobenzoxy, farbige Benzyloxycarbonylgruppen wie ρ-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonyl, aliphatische Oxycarbonylgruppen wie Adamantyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Trichloräthyloxycarbonyl, tert. Amyloxycarbonyl oder vor allem tert.-Butyloxycarbonyl, aromatisch-aliphatische Oxycarbonylgruppen wie 2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl, 2-Tolyl-isopropyloxycarbonyl und insbesondere 2-p-Diphenylisopropyloxycarbonyl (vgl. Anmeldung G.Nr. 1073/67 (Case 6ΐθβ). Die Aminogruppen können auch durch Bildung von Enaminen, erhalten durch Reaktion der Aminogruppe mit 1,3-Diketonen

909829/1544

z.B. Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon, geschützt werden.

Carboxylgruppen werden beispielsweise durch Amid- oder Hydrazidbildung oder durch Veresterung geschützt. Die Amid- und Hydrazidgruppen können gegebenenfalls substituiert sein, die Amidgruppe z.B. durch die 3j4-^Dimethoxybenzyl- oder bis-(p-Methoxyphenyl)-methylgruppe, die Hydrazidgruppe z.B. durch die Carbobenzoxygruppe, die Trichloräthyloxycarbonylgruppe, die Trifluoracetylgruppe, die Tritylgruppe, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe oder die 2-p-Diphenyliso propyloxycarbonylgruppe. Zur Veresterung geeignet sind z.B. niedere gegebenenfalls substituierte Alkanole wie Methanol, Aethanol, Cyanmethylalkohol, Benzoylmethylalkohol oder insbesondere tert.-Butanol, ferner Aralkanole wie Arylniederalkanole, z.B. gegebenenfalls durch Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Halogenatome substituierte Benzyl- oder Benzhydrylalkohole wie p-Nitrobenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol oder 2,4,6-Trimethylbenzylalkohol, gegebenenfalls durch elektronenanziehende Substituenten substituierte Phenole und Thiophenole wie Thiophenole Thiokresol, p-Nitrothiophenol, 2,4,5- und 2,4,6-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, ρ-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Cyanophenol, oder p-Methansulfonylphenol, weiter z.B. N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxypiperidin, 8-Hydroxychinolin.

909829/15U

Die Hydroxygruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosinreste können z.B. durch Veresterung oder Verätherung geschützt werden. Als Acylreste bei der Veresterung sind z.B. Niederalkanoylreste wie Acetyl, Aroylreste wie Benzoyl und vor allem von der Kohlensäure sich ableitende Reste wie Benzyloxycarbonyl oder Aethyloxycarbonyl geeignet. Zur Verätherung geeignete Gruppen sind z.B. Benzyl-, Tetrahydropyranyl- oder tert. Butylreste. Ferner eignen sich zum Schutz der Hydroxylgruppen die in Ber. 100 (1967), 3838 - 38^9 beschriebenen 2,2,2-Trifluor-l-tert.-butyloxycarbonylamino- oder -1-benzyloxycarbonylaminoäthylgruppen (Weygand). Die Hydroxylgruppen brauchen aber nicht notwendig geschützt zu werden.

Die Mercaptogruppen der Cysteinreste werden z.B. durch Acylierung oder Alkylierung geschützt. Zur Acylierung geeignet ist z.B. der Acetyl- oder Benzoylrest, der Aethylcarbamoylrest oder der gegebenenfalls substituierte Carbobenzoxyrest. Zur Alkylierung geeignet sind z.B. der tert,-Butyl- oder Benzylthiomethylrest oder gegebenenfalls substituierte Arylmethylgruppen wie Benzyl, p-Nitrobenzyl, Diphenylmethyl, Dimethoxybenzhydryl oder Trityl, ferner Phenylcyclohexyl, Thienyl(2)-cyclohexyl u.a., vgl. Ber. 101 (1968), 68I.

Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidinogrup-

pierung des Arginins kommen vor allem die Nitrogruppe und die Tosylgruppe oder der Carbobenzoxyrest zur Anwendung,

909829/1544

doch braucht die Guanidinogruppe nicht geschützt zu werden»

Ebenso braucht die Irninogruppe des Histidins nicht unbedingt geschützt zu werden, jedoch kann es vorteilhaft sein, sie zu schützen, z.B. durch Benzyl, Trityl, Carbobenzoxy, Adamantyloxycarbonyl, oder die oben genannten Weygand'sehen Gruppen.

Falls die neuen Peptide nach der Merrifield'sehen Peststoffträgersynthese aufgebaut werden, können die Seitenketten von Serin, Threonin und Tyrosin z.B» durch Benzyl, die von Cystein durch Benzyl oder p-Methoxybenzyl, die von Histidin durch 1-Benzyloxycarbonylamino-2,2,2-trifluoräthy1, die von Arginin durch die Nitrogruppe und die der Glutaminsäure durch Benzyloxy geschützt werden. Als a-Aminoschutzgruppe wird beispielsweise tert.-Butyloxycarbonyl verwendet. Die Abspaltung des geschützten Peptids vom Harz und der Schutzgruppen geschieht z.B, mit wasserfreiem Fluorwasserstoff,

Vorzugsweise verwendet man bei der 1. Variante des erfindungsgemässen Verfahrens zum Schutz der Aminogruppen die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, zum Schutz der Carboxylgruppe der Seitenkette und gegebenenfalls der terminalen Carboxylgruppe die tert.-Butylestergruppe, zum Schutz der Hydroxylgruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosinreste, sofern diese überhaupt geschützt werden, die tert.-Butyläthergruppe und, wenn erwünscht, zum Schutz der Iminogruppe des Histidins die 2,2,2-Trifluor-1-tert.-butyloxycarbonylamino-

909829/1544

äthylgruppe. Alle diese Schutzgruppen können, wenn erwünscht, in einer Stufe durch saure Hydrolyse, z.B. mifteis Trifluoressigsäure, abgespalten werden. Beim Aufbau des bei der 1,Verfahrensvariante als Ausgangsmaterial verwendeten geschützten Dotriacontapeptids unter Verwendung von mit Trifluoressigsäure abspaltbaren Schutzgruppen werden die Mercaptogruppen vorzugsweise durch Benzyl oder Trityl geschützt. Die S-Tritylgruppe.n können aus dem geschützten Peptid in organischer Lösung selektiv (unter Beibehaltung der mit Trifluoressigsäure abspaltbaren Gruppen) mit Mercuriacetat und Schwefelwasserstoff abgespalten werden. Die S-Benzylgruppen können aus dem geschützten Peptid selektiv mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten werden. In beiden Fällen erhält man das geschützte Peptid mit freien Mercaptogruppen. Dieses kann zum geschützten Disulfide z.B. mit Jod in Eisessig, mit Dijodäthan in organischen Lösungsmitteln_;mit Luftsauerstoff in flüssigem Ammoniak oxydiert werden. Besonders vorteilhaft ist es, die Mercaptogruppen durch Tritylgruppen zu schützen und diese aus dem geschützten Peptid unter gleichzeitiger Bildung der Disulfidbrücke mit Jod in Methanol zu entfernen, vgl. Schweizer Anmeldung Ges.Nr. 6999/68 (Case 6461). Diese Bildung des Disulfidringes kann auf der Stufe einer die beiden Cysteinreste enthaltenden Teilsequenz, z.B. des Nonapeptids 1-9, oder auf der Stufe des Dotriacontapeptids ausgeführt werden. Bei der 2. Verfahrensvariante des erfindungs-

909829/15U

gemässen Verfahrens kann das als Ausgangsmaterial verwendete freie offenkettige Peptid der Formel II vorzugsweise ebenfalls mit den für Variante l) genannten Schutzgruppen hergestellt werden. Die S-Tritylgruppen werden zweckmässig ebenso wie alle anderen Schutzgruppen mit Trifluoressigsäure entfernt. Das freie offenkettige Peptid wird in bekannter Weise durch Kaliumferricyanid in wässeriger Lösung oder durch Jod oder mit Luft in flüssigem Ammoniak oxydiert.

Bei der 3· Verfahrensvariante werden die Tritylgruppen nach dem oben erwähnten Verfahren mit Jod und Methanol unter gleichzeitiger Disulfidbildung entfernt.

Bei der 4. Variante des erfindungsgemässen Verfahrens werden direkt aktive Derivate der in Formel I dargestellten Peptide bzw. ihrer Analogen erhalten, nämlich Peptide, deren a-Aminogruppe entweder acyliert ist oder fehlt. Eine spezielle a-Aminoschutzgruppe ist in diesem Fall nicht nötig. Die Verbindungen können jedoch, wenn erwünscht, nachträglich in an sich bekannter Weise, z.B. durch Hydrolyse oder Hydrogenolyse, in entsprechende Peptide mit freier a-Aminogruppe übergeführt werden.

Die erhaltenen freien Peptide können in an sich bekannter Weise nachträglich in ihre Säureadditionssalze, Derivate oder Komplexe übergeführt werden.

So kann man zwecks Herstellung von Na-Acylderivaten das Peptid mit freier a-Aminogruppe in üblicher

909829/15U

Welse N-acylieren, z.B. durch Umsetzung mit einem den betreffenden Acylrest enthaltenden gemischten Anhydrid oder Säureazid oder vor allem einem aktivierten Ester wie Phenyl- oder substituierten Phenylester.

Das Sulfoxid wird vorteilhaft durch Oxydation mit verdünnter Wasserstoffsuperoxydlösung in schwach saurem Medium hergestellt.

Komplexe mit anorganischen Stoffen wie schwerlöslichen Metall-, z.B. Aluminium- oder Zinkverbindungen werden in analoger Weise wie für ACTH bekannt, z.B. durch Umsetzung mit einem löslichen Salz des betreffenden Metalls, z.B. Zinkchlorid oder Zinksulfat, und Ausfällung mit einem Alkalimetallphosphat und/oder -hydroxyd hergestellt. Komplexe mit organischen Verbindungen wie Polyoxygelatine, Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyphloretinphosphat, PoIyglutaminsäure etc. werden durch Mischen dieser Substanzen mit dem Peptid in wässeriger Lösung erhalten. In gleicher Weise können auch unlösliche Verbindungen mit Alkalimetallpolyphosphaten hergestellt werden.

Die als Ausgangsstoffe verwendeten Peptide

werden erhalten, indem man die Aminosäuren, wenn erforderlich oder erwünscht unter Verwendung leicht abspaltbarer Schutzgruppen, in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft, wobei gegebenenfalls auf einer geeigneten Stufe der Synthese

• 909829/1544

die Disulfidbrücke gebildet wird. Man arbeitet zweckmässig nach den für die Herstellung langkettiger Peptide, unter Berücksichtigung der Disulfid-Brücke, geeigneten Verknüpfungsmethoden, wie sie aus der Literatur bekannt sind.

Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt daher z.B. in der Weise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter, z.B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt. Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Ueberführung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, Thiokresylester, p-Methansulfonylphenylester, p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5- oder 2,4,6-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychinolinester, N-Hydroxypiperidinester, oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimide (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid) oder N,N'-Carbonyl-

909829/1544

diimidazols, oder Isoxazoliumsalzes, z.B. Woodward Reagens, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion-mit einem Phosphit aktiviert werden. Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode> die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode, ferner die Merrifield-Methode und die Methode der N-Carboxyanhydride oder N-Thiocarboxyanhydride.

Neben der Herstellung der Endprodukte stellt auch die Herstellung der Ausgangsstoffe, vor allem des die Disulfidbrücke enthaltenden Peptidbruchstückes und dessen Verknüpfung mit dem restlichen Teil des Peptids einen besonderen Erfindungsgegenstand dar. Es wurde gefunden, dass es vorteilhaft ist, von einer Sequenz auszugehen, welche die ersten 7-12 N-terminalen Aminosäuren umfasst (1-7* 1-8, 1-9, 1-10, 1-11 oder 1-12) und mit diesem N-Terminus die gesamte restliche Sequenz, also 8-32, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32 oder 13-32 zu kondensieren. Statt dessen kann man auch die genannte N-terminale Sequenz der ersten 7-12 Aminosäuren mit dem Fragment bis zur 24. Aminosäure (Glycin) verknüpfen und das Tetracosapeptid mit dem Octapeptid der Aminosäuren 25-32 kondensieren. Die Kondensation des genannten N-terminalen Bruchstückes mit der Sequenz bis zur ■ 32,bzw. bis zur 24. Aminosäure wird zweckmässig nach der Azidmethode, ausgehend vom Azid bzw. Hydrazid, oder der

909829/1544

-Id-

Methode nach Wünsch (Carbodiimid in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid), ausgehend vom Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe durchgeführt.

Im folgenden wird die Herstellung des N-terminalen Bruchstückes an der Synthese des Nonapeptids (1-9) näher erläutert. In ganz entsprechender Weise können das Heptapeptid (1-7), das Octapeptid (1-8), das Decapeptid (l-lO), das Undecapeptid (l-ll) und das Dodecapeptid (1-12) hergestellt werden.

Die Nonapeptidsequenz wird beispielsweise aus den Sequenzen 1-4 und 5-9 oder 1-6 und 7-9 aufgebaut, wie aus den Pig. 1-9 ersichtlich; man kann jedoch auch andere Bruchstücke zum Aufbau der Sequenz 1-9 verwenden. Als Schutzgruppe für die a-Aminogruppe am Cystein wird vorzugsweise die tert.-Butyloxycarbonylgruppe oder eine äquivalente, durch saure Hydrolyse abspaltbare Gruppe verwendet, oder wenn ein N -acyliertes Dotriacontapeptid hergestellt werden soll, die entsprechende Acyl- z.B. Acetylgruppe. Daneben verwendet man zweckmässig als Mercaptoschutzgruppen solche,. die selektiv gegenüber der durch saure Hydrolyse abspaltbaren N -Aminoschutzgruppe (z.B. tert.-Butyloxycarbonylgruppe) abgespalten werden können, z.B. die Benzyl- oder Tritylgruppe. Die terminale Carboxylgruppe des Nonapeptids braucht nicht notwendig geschützt zu werden, z.B. nicht, wenn Kondensationen nach der Azid- oder Anhydridmethode ausgeführt werden (vgl.

909829/1544

z.B. Pig. 1, Spalte 5 und 8). Man kann diese Gruppe aber auch durch Veresterung, wie oben angegeben, schützen, z.B. durch Veresterung mit Methanol (Abspaltung der Estergruppe mit verdünnter Natronlauge oder Ueberführung in das Hydrazid) oder mit Benzylalkohol oder Analogen (Abspaltung der Estergruppe z.B. durch Hydrogenolyse). Der Schutz der Aminogruppen der Zwischenprodukte erfolgt mittels der üblichen Schutzgruppen, z.B. Carbobenzoxy, Trityl, tert.-Butyloxycarbonyl und vor allem 2-para-Diphenyl-isopropyloxycarbonyl. Die Carboxylgruppen der Zwischenprodukte werden, wenn erforderlich, in der üblichen Weise verestert. Die Hydroxygruppen der Serinreste und des Threoninrestes können durch Verätherung, z.B. mit tert.-Butanol oder Aequivalenten geschützt werden. In den folgenden Figuren und in den Beispielen bedeutet:

1) die Azidmethode

2) die Methode der gemischten Anhydride

3) die Methode der aktivierten Ester, besonders p-Nitrophenylester (ONP) oder Hydroxysuccinlmidester (OSU)

4) die Carbodiimidmethode

5) die Methode nach Wünsch
BOC tert.-Butyloxycarbonyl,

DPC ρ-Diphenyl-i sopropyloxycarbonyl, Z Carbobenzoxy
• TRI Trityl

909829/1544

BzI Benzyl

NPS o-Nitrophenylsulfenyl

OtBu tert.-Butylester

OBzI Benzylester

ONB p~Nitrobenzylester

ONP p-Nltrophenylester

OMe Methylester

tBu tert.-Butyläther

Ac Acetyl

TPA Trifluoressigsäure.

Die Carbobenzoxy-, p-Nltrobenzylester- und Benzylestergruppen werden durch Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladiumkohle abgespalten, die N-Tritylgruppe mit wässeriger Essigsäure, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Trifluoressigsäure, die o-Nitrophenylsulfenylgruppe mit Chlorwasserstoff in organischen Lösungsmitteln oder z.B. mit Blausäure oder schwefliger Säure wie im englischen Patent 1 104 271 beschrieben; die Diphenylisopropyloxycarbonylgruppe z.B. mit einem Gemisch von Eisessig, Ameisensäure (82,8#ig) und Wasser (7:1:2) wie in der Schweizer Anmeldung G.Nr. 1073/67 (Case 6lO6) beschrieben. Der p-Nitrobenzyl- oder Methylester wird mit Hydrazinhydrat in das Hydrazid übergeführt. Mit verdünn-

909829/1544

ter Natronlauge wird die Methylestergruppe hydrolysiert.'Der tert.-Butylester wird mit Trlfluoressigsäure gespalten, ebenso der tert.-Butyläther. Die S-Tritylgruppen werden mit ■ ". Mercurlacetat und Schwefelwasserstoff entfernt, die S-Benzylgruppe mit Natrium in flüssigem Ammoniak, wobei gegebenen.- .· falls Vorhandene p-Nitrobenzylestergruppen gleichzeitig ab- ■ gespalten werden. Der Ringschluss zum Disulfld erfolgt z.B. durch Oxydation mit 1,2-Dijodathan. ■ ·

Die mit der N-terniinalen Sequenz zu verbindend© C-terminale Sequenz umfassend die 8. bis I3. bis zur 32· Aminosäure wird vorzugsweise aus" dem C-terminalen Fragment 25 32 und der Sequenz bis zur 24. Aminosäure, also 8 - 24, 9 " 24,-10 - 24, 11 - 24, 12 - 24 oder I3 - 24 zusammengesetzt.

In der schematischen Darstellung von Fig. 11 und -12 wird die Synthese des C-terminalen Octapeptidamlds. (25 - 3²) veranschaulicht. Vorzugsweise wird das Tripeptidamid 30 - 3ä oder das Tetrapeptidamid 29 - 32 nach der Carbodiimldmethode, mit einem Fragment aus den vorhergehenden Aminosäuren verknüpft. Die 7-Carb.axylgruppe der Glutaminsäure·^ wird zweck— massig duTQh die tert.-Butylestergruppe geschützt. Die α- · Aminoschutzgruppe DPC wird wie oben angegeben mit Eisessig- . Ameisensäure (82,8 #ig)-Wasser (7:1:2) abgespalten.

Die Synthese des Bruchstücks.mit der Aminosäure- ". sequenz von der 8. - 13« bis zur 24. Aminosäure kann auf ganz verschiedene Woise durchgeführt werden. Vorzugsweise wird ■

. " ' . . 909829/15U

PO

das Peptid bis zur Aminosäure in Stellung 13 (Tryptophan), also 8 - 13, 9 - 13, 10 - 13 etc. hergestellt und dieses encweder·mit dem Undecapeptid l4 - 24 kondensiert, oder zunächst mit einem Bruchteil dieser Undecapeptldsequenz, z.B. 14 - 16, . 14 - .17, 14 - 18, 14 - 19,.und dann mit dem restlichen Bruch-/ . . stück bis zur Aminosäure 24.. verknüpft. Fig. 13 und 14 illu- . strieren die Synthese des Tetrapeptids der 10« - ^»Aminosäure in .Form des Hydrazide, das nach der Azidmethode mit den folgenden Aminosäuren, z.B. dem genannten Undecapeptid oder einem Bruchstück davon kondensiert werden kann. ■ .

Das Unde.cajpeptld mit der Sequenz 14 - 24 wird erfj.n>dungsgemäss vorzugsweise aus den Sequenzen 14 - I9 und 20 24 oder 14 - 20 und 21 - -24 aufgebaut. Das Hexapeptid 14 19 oder das Heptapeptid 14 - 20 werden zweckmässig nach der Azidmethode mit der Restsequenz bis zur 24. Aminosäure ver- . knüpft. Fig. 15, 16 und I7 illustrieren die Synthese des Hexapeptidhydrazids 14 - 19 und des Heptapeptidhydrazids 14 - 20. Das in.Fig. I7 A genannte Aminosäurederivat H-HiS-N₃H₂-BOC •erhält man durch Kondensation von Z-His~0H mit BOC-NHrNH₂ mittels Dlcyclohexylcarbodilmid in Essigester und hydrogenoly*... tische Abspaltung der Carbobensoxygruppe. In analoger Weise

wird das geschützte Phenylalaninhydrazld in Fig. 15 A und ΐβ Α hergestellt. Vom Hydrazinrest wird, die BOC-Gruppe mit Triflupressigsäure, die Carbobsnzoxygruppe durch Hydrogenolyse abgespalten. Statt der BOG- und Carbobenzoxygruppe können äquivalente Schutzgruppe!! verwendet worden. Fig. 18 --20.illu*

909829/1544·. .

0AO ORIGINAL

strieren die Synthese der Sequenzen 20 - 24 bzw. 21 - 24, die mit der Sequenz 14 - 19 (in Fig. 16 Stufe J, nach hydrogenolytischer Abspaltung der Z-Gruppe vom Hydrazinrest) bzw. 14 20 zum Undecapeptid 14 - 24 verbunden werden können.

Man kann aber auch die Sequenz 14 - 19 bzw. 14 20 der Fig. 16 K oder der Figuren 15 J oder 17' L nach Abspaltung der α-Aminoschutzgruppe durch Hydrogenolyse bzw. mit Trifluoressigsäure mit der Sequenz 10 - 13 nach der Azidmethode zur Sequenz 10 - 19 bzw. 10 - 20 verknüpfen, dann aus dem geschützten Hydrazid die BOC- bzw. Carbobenzoxy-Schutzgruppe wie oben abspalten und die Sequenz 10 - 19 bzw. 10-20 nach der Azidmethode mit der Sequenz 20 - 24 bzw. 21 zum Pentadecapeptid 10 - 24 verbinden.

Die Sequenz des Pentadecapeptids 10 - 24, wie sie sich z.B. durch Zusammenfügen der in den Figuren 13 dargestellten Bruchstücke ergibt, kann beispielsweise nach der Methode von Wünsch mit dem Octapeptidamid 25 - 32, wie es in Fig. 11 oder 12 dargestellt ist, zum geschützten Tricosapeptidamid 10 - 32 kondensiert werden.

Man kann aber auch das Pentadecapeptid 10 - 24 zunächst mit der N-terminalen Sequenz 1-9 kondensieren,

zweckmässig in gleicher Weise wie unten für das Tricosapeptidamid 10 - 32 angegeben, und das Tetracosapeptid beispielsweise .nach Wünsch mit dem Octapeptidamid 25 - 32 verknüpfen.

Eine weitere erindungsgemässe Möglichkeit, das

geschützte Tricosapeptidamid der Aminosäuren 10 - 32 auf- ' '■

909829/15*4

zubauen, besteht darin, dass man die Sequenz 10-16, vorzugsweise nach der Azidmethode,¹ mit der Sequenz 17-32 verknüpft. Die Sequenz 10-16 kann man z.B. durch Kondensation· der in Fig. 13 oder 14 angegebenen Derivate der Sequenz 10-13 mit dem Tripeptid l4-l6 (H-Arg-Asn-Leu-OH, z.B. aus Z-Arg-Asn-Leu-OBzl durch Hydrogenolyse erhalten,) nach der Azidmethode herstellen. Die Sequenz 17-32 wird vorzugsweise aus den Sequenzen 17-24 und 25-32 (Octapeptidamid) aufgebaut, beispielsweise durch Kondensation nach der Methode von Wünsch. Man kann das Octapeptidderivat Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-OH mit geschützter a-Aminogruppe und gegebenenfalls geschützter Hydroxylgruppe des Serinrestes beispielsweise durch Kondensation von Z-Asn-Asn-Phe-His-NpH, (aus Fig. 17 F mit Trifluoressigsäure) mit H-Arg-Phe-Ser(tBu)-GIy-OH (Fig. 20 H) nach der Azidmethode erhalten.

Aus dem Tricosapeptidamid 10-32 mit geschützter a-Aminogruppe wird diese Schutzgruppe in geeigneter Weise entfernt (BOG mit Trifluoressigsäure, womit auch eine tert.-Butylestergruppe an der 7-Carboxylgruppe von Glutaminsäure'' und gegebenenfalls vorhandene tert.-Butyläthergruppen hydrolysiert werden; DPC mit Eisessig-Ameisensäure-Wasser, wobei tert.-Butylester- und -äthergruppen nicht angegriffen werden).

Die Verknüpfung der Sequenz 1-9* welche die Disulfidbrücke enthält und in welcher mindestens die a-Aminogruppe geschützt ist, mit der Sequenz 10-32, erfolgt, wie bereits erwähnt, vorzugsweise nach der Azidmethode.

•Man erhält so das Dotriacontapeptidamid mit geschützter a-Aminogruppe und gegebenenfalls geschützten Seitenketten-hydroxyl- und/oder -carboxylgruppen. Diese Schutz-

909829/1544

gruppen werden wie bereits erwähnt abgespalten.

Das für das Verfahren gemäss Variante 2) zu verwendende Dotriaoontapeptid mit freien SH-Gruppen kann in analoger Weise wie das oben beschriebene geschützte Dotriaconfca^· peptid hergestellt werden, mit dem Unterschied, dass die'-geschützten SH-Gruppen bis zum Schluss der Synthese, beibehalten werden. Erst nachdem alle übrigen Schutzgruppen aus dem geschützten Dotriacontapeptid entfernt worden sind,. spaltet . man die SH-Schutζgruppen wie oben erwähnt ab. ·

Die Synthese gemäss Variante 4) des Verfahrens eignet sich besonders für die Herstellung von Endprodukten der Formel I mit acylierter oder abgewandelter Aminogruppen vor allem der N^a-acetyllerten Verbindung. Das Bruchstück der Formel III, vgl. z.B. Fig. 9 K, kann nach den oben für die •Sequenz 1-9 illustrierten Verfahren hergestellt werden; man kann jedoch auch als a-Aminoschutzgruppe von Anfang an die beizubehaltende Acylgruppe wählen. Die Synthesemethoden entsprechen den oben beschriebenen.

.Je nach der Arbeitswelse erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung .mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer SaI- . ze geeignet sind, Salze gewinnen, v/ie z.B. solche mit anor- ' ganischen Säuren, wie Ilalogenwasserstoffsäuren, beispiels-

90 9-8 29/1544

8AO ORIGINAL

weise Salasäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure*. ' · "Salpetersäure oder Tiiiooyansäure^ Schwefel- oder Phosphor- ,_ säuren, oder organischen Säuren^ wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure_# Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, . Fumarsäure, Aepfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure,, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4~Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, K-Amino·

salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Aethansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder SuIfanilsäure.

Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für •dasselbe kommen solche Stoffe:.in Frage, die mit den Polypeptiden nicht reagieren, wie z.B. Gelatine, Milchzucker, Glukose, Kochsalz, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche · OeIe, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylen-glykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die·· pharmazeutischen Präparate können z.3. als Lyophllisat oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw..

909829 / 1-544 ,·· ■

ORIGINAL

oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabil!sierunge-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. - ■ · ' Die Erfindung" wird in den folgenden Beispielen ."■. ; beschrieben. Die.Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet.

System 43A : tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (100:40:10) : tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (51:21:28) : see. Butanol-3 #iges wässriges Ammoniak (70:30) : n-Butanol-Eisessig-Wasser (75:7,5:21) : n-Butanol-Eisessig-Wasser (67:10:23) : n-Butanol -Ameisensäure-Wasser (60:0,7509)

■Monochloressig-

System 43C System 45 System 52 System 52A System 53 System 54

.see, Butanol-Isopropanol 9 säure (58:8:34)

: Aethanol-8 J&Lges wässriges Natriumchlorid (75:25) : Methyläthylketon-Pyridin-Wasser (60:15:25) : .Aethylacetat-Pyridln-Wasser (40:20:40) : Essigester-Aceton-Wasser (72:24:4) : see. Butanol-Eisessig-Wasser (67:10:23) ' ·. :.Aethylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser (62:21:6:11) : n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (38:24:8:30)-System 101A : n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (42*24:4:30) ' System 101B : n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (40:24:6:30) .System 102E : Essigester-Methyläthylketon-Eisessig-Wasser ^: · (50:30:10:10) . ■ .·

909829/154A

System 55 System 59 System 70 System 89 •System .96 System 100 System 101

QA'-i

System 104

Chloroform-Methanol-17 ^lges wässeriges Ammoniak (4l:4k:l8)

System HlA : η-Butanol-Pyridin-Ammoniak (26 $E»ig)-Wasser (42:24:4:30)

System 121 : Isopropanol-Ammoniak (26 #ig)-Wasser (70:10s20) System 121A : I sopropanol-Ammoniak (26 #ig)-Wasser (85:5:10) System 87 : Isopropanol-Eisessig-Wasser (77s4:19)

System 110 : "Essigester-n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (42:21:21:6:10)

Benzol-Aethanol (8θ:2θ)
Benzol-Aethanol (90:10)
Benzol-Aethanol (95: 5)

n-Amylalkohol-Ameisensäure-Wasser (70:20:10) n-Butanol-Essigsäure-Wasser (66,6:16*7:16*7)

n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (66,6:12,5:4,2:16,7)

: n-Amylalkohol-Pyridin-Wasser (50:30:20) : Chloroform-Methanol-Eisessig (87,4:9,7:2,9).

System	1
11	2
ti	3
Il	4
Il	5
ti	6
ti	7
It	8

909829/1544

12 3456 789

Oys Ser Asn Leu Ser Tbr Cyg VaI Leu

TRI tBu tBu tBu TRI

A BOC-J-OH Z-L-OH Z—ONP Z—OH Z-J-CH H-¹OMe DPC-¹OH Z—OH H-OMe

B Z-llidiJioiia Z—ilz§i_0Me

tBu tBu

tBu tBu C H-¹ —¹OMe H OMe

tBu tBu TRI D Z LOzlUoMe BPOJ _0Me

tBu tBu E H ' ¹OMe H OMe

tBu tBu Z ^i ! LoMe

tBu tBu

H 1 1 OMe

tBu tBu tBu

H Z — —I———

tBu tBu tBu I _H ^J 1 !-0Me

TRI tBu tBu tBu J BOC^ 1 51^LJ '

TRI tBu · tBu tBu K BOC- ' 1 '

TRI tBu tBu tBu TRI L BOC-' 1 3J 1 ! 1 OMe

TRI tBu tBu tBu TRI

I I 1 I 1 _m

SH tBu tBu tBu SH BOC J ! i ! 1 NH-NH₀

tBu tBu tBu

boo —L 1 1 1 ' NH-NH₂

1?3 45 6 7 89

. 1

909829/1544

oo co ρ»

U
LP, CU

pq

O PP

H O

O O

ϋ O pq

to ι OJ

CM

i-rl

ΐ·

pq

pq-

- 28 --

ffl O

PQ O

pq

pq ο

IA

ο ο pq

pq—

pq-ISl

pq-

ϋ ο

pq

pq

!25

pq

|zi

CNJ
i

LPi

pq

ISl	ISJ	to
I	I	W
OJ	OJ	OJ
Xj	W
OJ	OJ
te	!25

LTV I

O O

LO

O	O	O
O	O	O
pq	pq	pq

H tSI

pq-

co

co—

cn

oo

in cm ti

OJ

pq

pq

O O

pq

ο pq

O O

909829/1544

Mg. 3

■ >s O

LTv Φ CO

CO QJ

O O pq

HO

O O pq

pq ο

O O

HO "t O O

O O

pq

pq ο

in I

O O

pq

pq

- 29 -

m ο

H ΡΟ

pq ο

pq

pq

in ι

O O

pq

Η Es)

pq-

H CSJ

pq ο

pq

Pl· pq
ο

pq-

pq ο

in

pq-i

tq
pq-

w ο

tr} O

CO"

pq

ο ο pq

rfr

909829/1544

1806435

3 er» ω Hl

ω co ρ·

ω i>» ο

O

in

O O

pq

HCO ft'PH Ei

O O

pq

Es)

CM

PP

H EH-

J5 O

ί5 O

LTi

H P=! EH-

H CO

rt pm

EH Sz;

i; ο

c\j

Ü3

W •H

LH

H EH-

(ti

EH-

CM

CM CM

O O

pq

ο ο pq

Pi EH

EH-

W-

O	ο
O	O
pq	pq

cn

909829/1544

PQ

H

FQ

PQ PQ

H

H

—

EH-

Η

]

•

H

W

31 -

in

co

i

r

H

CNJ CVJ

ω

i

•

co—

1

\

N^ C—

ί

in

i

hn

I

j

CO-

1

-

■ ^i"

CM

O Ο

Sz;

Ph

Ρί"

Pc!

P

Ρί EH-

O

W

I

Pi EH-

Ln ·_Η

O O

O

EH-

O

3

ΕΠ

PQ

,j -ι

•Η

FQ

CM

I

FQ PQ

O Ö

EH

ρ»;

I

ht-i ι ι h-M Γι

O

O

I

cn φ

H

•Η

{

M

P=!

j

EH

Φ

ί j

W

γΗ

•Η

O

N

■i H

O

H

PP

O

O

j

■

OO CO

O

PQ

t>

ι

H

I

i

EH-

O

-

" j

O

O

t

CQ

O

PQ

C- !>>

FQ

O

W

O

i

O

O

Η"}

I

PQ

Ϊ

O P

M -

PS

H ;

EH-

ft!

O

H

EH-

O

in

PQ

V£> Xi

W

EH

O

O

O

j

PQ

I

Ph

O

O

in φ

PQ

CQ

O

j

^t- φ

H

O

i

O

i

PQ

i

W

ί

O

*

ί

£j

ΚΛ CQ

N

W HO

Pi ι H

O

O

CM Φ

PQ

CO

CQ

O

O

O

PQ

FQ

909829/1544

P

Φ

1

ω

O

tu

^.

H

O

H

W

P

32 -

H

O

P

O

W

i

P

P

HH

H

P

ta

Hj-t

ρ

ta

P

P

\

O

ω

VO

φ

S

Ix! P O

j§d

in

pci

P=!

Ph -P-

Pi

Ph

O

O

pq

pq -P-

O

pq

O

pq

O

pq

pq I1^ M|

O

W]

Hi

ο

pq ι H

O

ο

EH

EH-

R

pq

pq

-P-

EH-

-P-

pq

•H

I

O

j

O

φ

P

cn

j

Ph

H

H

pq 43—

W

R

O

H

P=! EH-

S-

CO-

H

φ

in I

·>"

P4

CO

ο

P ϊ

P :

O

P

pq -P-)

P

pq :

H

W

pq

O

-P-

OO

Pi

-P-

O

«

J-J

W

M

J3

pq

s ■ -P-'

Ph

W^

FP -P-

ta

ra

O

Φ

φ

OJ

i

O

Cs]

)>]

S

t

O

l-i—I

c·

O

O

•j

O.

VO

.

KM

]

pq

t-

H O

q

tu

H

in

pci I H

W

N

in

m

I

H

P O

I

1

O

j ·

F=!

pq ι H

■""

ί

O

I

m

EH

H 1

pq

Xl EH

Φ

FM

pci

CiJ

H O

P

Fh φ Uj

P O

g-j

pq -P-

EH-

"*■

VO

pq

O

i

i j

-P — ti

O

ίΐΓ

in

pq

Φ

CVl

P (Sj

pq

ΐ3Ο

pq

Ί

P

pq

tBu

φ

4-3 —

P

pq -P-

OJ

pq ■P —

ö

CsI

CQ

O

O

FM

Fh φ co

Ph

R

R

φ

Φ

R

OvI

cn

.S

O

ϋ

O

Cv

V-;

W

j

ϋ

pq

909829/1544

cn ω Hl

H ω co

CQ >> O

EH

in ω

α>

ISJ

M H

Pi ι

"i

pq ι PQ , -P-J -Ρ-«

I ir

3

pq -ρ

tSJ

CU

3

⁵M

ES)

pq

- 33 -

Qi	Φ	V
O	Q	O

EU O

pc!

ε-Η

EH-

O)

O)

+³H

PQ -p-

pq

■PH

pq ■pH

-P-

H)

Pi

Bi

pq

■P-

-P-

CJ

bO •H

pq

EhH eh-

ο ο

ο ο

pq pq

KiJ

W-

■P-i

3

pq

-P-

3 !

P=I :

coH O O

pq

O pq

909829/1

909829/1544

φ χι ffl

*

;

ί

H EH--

1

PS O SS

•P-

O " ϋ!

I

N tsj Hj

-P-

-P-

ISJ ISJ il

|3

j3

H

O O

pq

i

, +*-

f

tr!

cn

•H

i

CM

:

χ

S οο ο

Jx! τ-

PQ I ΓΟ CQ

Ph

t-r-t

pq -P-

-P-,

P=!

O

NI

cn φ

I

Ο fr

_υ I Jj I .Ο—

R

M

I I

EH-

I

•

j -τ-

ηΊ

ι

Ι-τΗ

φ Φ Φ φ φ φ M

3 O S

HO H

Ο

»-Μ ;

SSSSSS cm

pq ι pq -P— -P-

O O O O O O !ζ;

EH—j EH-

H

P=!

OO

M

ι-Ι

φ

3 O S

EH-

OO CO

•Η

Ph I Ph -P— -P-

O O O O

ϊ>

IS) £

Ph ^

O O O O

H O

O

pq pq pq pq

Pl I H ΕΗ-4 g_ I εγί I ι

"^3I Fq O R P^ fxj (^ hu

CQ O

FcJ

EH

Φ

S

■P— .

ί \

ί

v£)

\Ο χΐ

EH

j

\ \

I

U LTv Φ CO

O M

O

pq

H »-a

■vt- Φ

Hl

d

ΚΛ CQ

CM Φ CC

CQ

909329/1544

OJ CvI CM

cn	.·' ■	co.1··	P	* * - t.	•
CM·	CVl ·'	H
		Fig.
	<\t

9 8 2 9/154 A

CM O KNfc Ph

kn (4 χ!

O 3

KNH CiJ

σ\ο

CMH CJj

CMXl

CMH

LfN-P CM (U

LTi

CM

Ν Cs!

3

pq

-P

pq

-P

W O

LT

CM

IS] CSJ

tsj

CO

CM

LfN

CM

-ρ ο-!

3 PQ ■Ρ

ο-

pq -ρ ο

-ρ ο

-ρ ο

ιη ι

CM

ISJ

- 37 -

pq -ρ ο

LfN

•—
CM

CM CM

CM CM

m j pq pq

O-j O-l O-

CSJ ISJ tSl

-P O-

CTv CM

LfN CM

909829/15 4-4

XO

A BOO—OH

B ■.■;.■·;■ ■■ ; ■"··■

BOO-

10

•11 Ala

13 Try

BOO OH

H QMe

BOO-

2Hl)

-OMe.

H-

-OMe

-OMe -OMe -OMe

13.

ng·

909829/15AA

INSPECTED

: . 160613$

10 11 . 12 13 ^:

Bor ■ Αία " Ty» ffiry

·' ■ '.tBu '."■'■' ■■'■'. tBu ■ ■-. . .". .;.'.' '■■;·'

A DPG-J-OH, -Z—K)H . Z-J-OH · . · H OMe ·..; \ ·' ".

B ." ■■'■; ';■ .V- . Z-U ^⁵^ ΟΜθ. ■-■■. · : :"

.■'■'■■-'■ ·■■"■"■■.· tBu"- . .--.·

σ · . . '·■ · -. H-L—— ■·—'—OMe./. ;,-·.'

"■■■'■■■■ tBu ' ^:. ::■■■"

D ζ—^^ L — ^:

9G9Ö29/1

. .· '. tBu

B . H- : ; : 1 ^: : K)Me

tBu tBu ' J £t5l . 1—r

tBu · "■■ ·■■■■■'■; · tBu

JJ

I· Dpo-J £t5l . 1—r :—-r OMe

•13V ■■.■'·.-";;·"■:■ -. ;

I· '

14

" I Il I

14

.15

16

4)

16

Fig

π

5)

18

18

3)

1806135

Arg

LJ

Asn

Leu

τχ

Asn

19

17,. ΠΤΤ C —

ty

ONP

Z ONP

■ 40 -

Phe

A

L Uli ύ

ύ

OSU

17

3)

— N2H2-BOC

■R

Asn

17

_ "M H —ΤίΠΠ

C

η ONP

·. 14

η ONP ' Z"~~0SU Η~

3)

1W ττ —"πηρ

T)

OSU

<7

V

rf

TT .

"M TT —ΏΩΠ

T?

η

3)

TJ TT —"RDH

J? ■ G

N H -BOG

U

7. -

I

H-

J

TT T-T -"ROP

K

H TT ΤϊΠΡ

—Μ TT —ΤΙΠΡ

im ρ Hp —UWO

15

.— W TT

JN 2 H ·ζ

19

909829/1544

■"■! ί:¹¹¹'⁷"¹""" !'''1!'"!1!11!!'1!11!1111IiIBIfUIII

BOC

14

15

BOC

I

—

16

41 -

17

17

15

BOC BOC

18

1806135

Arg

Asn

leu

.Asn

TT

Asn

OH

BOC- OH

OH

BOG—OH

Xi

OH

19

Phe

A B

BOG TJ

"nnr1

TT »T TT TJ Xl Xi ρ rip — Ii

η

Xl

2 2"

Kj D

TJ

■»τ TT η

H

I CJ c! & CJ

Έ η

BOG H

TlDO

JJ V-/Vy

H

H

I

3 t CvJ CJ

J K

14

Xtnlln — it

15

TT TT .„„ 7

16

"" lip XIp — Z/

Pi .

N2H2-Z

18

N2H2-Z ., , . M TT „7

19

909829/1544

14	15	16	17	18	19
Arg	Asn	Leu	Asn	Asn	Phe

20 His

A Z-OH Ζ—ONP Z—OH Ζ—ONP Ζ—ONP Z-OH H NH-NH-BOC

B C D B

1 Z-M Z

14

H-

15

H-

H-

H-

17

Pig. 16

3)

3)

2)-5)

3)

4) 5)

■ NH-NH-BOC 'NH-NH-BOC

■ NH-NH-BOC -NH-NH-BOC -NH-NH-BOC

NH-NH-BOC NH-NH-BOC

■ NH-NH-BOC

NH-NH-BOC

—— NH-NH-BOC NH-NH-BOC

NH-NH,

19

909829/1544

.' ·,·; .;'■;■■' 1B06135

. 21 22 23 '· '24

■ His Arg ϊϊιβ " Ser · G-Iy

Ά . Z-—OH Ζ— OH Tr—OH ". Z-^—OH Η—rOMe

' ' ' ' -·■'-■ I o Wr \

909829/154A

■■; · -■ · . \- ) Ί ■ -tBu ^; ■' '

• ' · ·'.·'.■ tBu ·■;■■■

. ' · :tBu .■■■·

H - I ' OMe

' ' · .-tBu
. , L· —1-0ΜΘ

' · tBu ·■ "

H . .' Me

· EH

tBu : ".·.

'■ OH

; '"; -21 .22 . ." '" 23 /^; . ^: 24;

ORIGINAL 1NSPECTÖI

20

His

- .44 -

21 Arg

Phe

23

Ser

24

B .

• σ ·

φ' -

H Z-

. .H-

20

NO.

A Z-—OH. ,Bp:0-J~0H ■ BOCJ—:0Η· · · BOO—OH H—K)BzI-

2)~5)

Βοσ

fa ■

NO

K-

NO,

21.

BOO-

H-

BOO^-

H-

g.

9 09.829/154

-OBzI

2)-5)

-OBzI

-OBaI

-OBzI

-OBzI -OBaI

ommHM, inspected

9098 2 9/15A4

21 22 .23

Arg Phe 3er GIy

₂ · tBu

A Z-L-OH Z—OH 2-L-OH H-OMe

¹ tBu' B " ' ^; . * Z^ ZhOl

• ' tBu 0 . H-J r—ΟΜθ

■ : .±Bu

D- Zr 1 2h5}

tBu

E ■·' H '■ 1 Tr OKe

■ · NO₂ tBu

ρ ν ζ-· ——* = 1- ^^ OMe

• ' .tBu ■'■-■■

G ■ η : 1 r- -¹

oh

21 22 . 23 ' ■.

;.i9 '

OFSGtNAL JNSPECTEO

.18p6135

Beispiel Χι " .

H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-'Tyr-Try-Arg- '., Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHp(l, Thyrocalcitonin).· ·

480 mg BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-VaI-Leu-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)»Try-Arg(Hg )-Asn-LeurAsn-Asn-Phe-His«-Arg(H₂ ⁺)-Phe-Ser(tBu)-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(0tBu)-Thr(tBu)-Pro-NH₂ werden unter Eiskühlung In 20 ml 90 #iger Trifluoressigsäure gelöst und die Lösung tinter Stickstoff 30 Minuten bei 0° belassen. Hierauf wird sie in 3OO ml eiskalten, peroxydfreien Aether eingegossen. Der dabei entstehende Niederschlag wird abgenutscht, mehrmals mit peroxydfreien Aether gewaschen und im Vakuum über Aetznatron getrocknet. Hierauf wird das Pulver wiederum in 20 ml eiskaltexv. 90 #iger Trifluoressigsäure gelöst, auf 25° erwärmt und,.ι Stickstoff I, Stunde bei 25° belassen. Sodann wird die Lösung wiederum in 300 ml eiskalten, peroxydfreien Aether, gegossen, und der entstehende Niederschlag abgenutscht, mit Aether gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur über Aetznatron getrocknet· Die nachfolgenden Operationen werden unter Stickstoff und unter Verwendung von Peroxyd- und Sauerstoff-freien Lösungsmitteln ausgeführt.

Zur Ueberführung in das essigsaure Salz wird das oben erhaltene Trifluoracetat von I, in 20 #. Essigsäure

90982971544 .

SADORKSiNAt

- 47 - ■■■■. ; .:

gelöst und über eine .Säure (ly.2 χ 15 cm) eines schwach basischen Ionenaustauscherharzes (Merck Nr. II, Acetatform) filtriert. Die Säule wird solange mit 20 #iger Essigsäure nachgewaschen, bis die U.V.-Kontrolle des Eluats keine Anwesenheit von I mehr zeigt. Hierauf wird das Eluat unter Zusatz . ·. "von n-t)ctanol im Vakuum bei 40° Badtemperatur eingedampft, der Rückstand durch Waschen mit Petroläther von Octanol be- · freit und getrocknet. Dabei wird das essigsäure Salz des Dotriacontapeptids als schwach gelbliches Harz erhalten. Zur Reinigung wird das Produkt einer Gegenstromverteilung .im System n-Butanol G- Liter)-l-n. Essigsäure (l Liter)-Ammonacetat (500 mg) unterworfen. Zu diesem Zweck löst man es In je 30 ml Ober- und Unterphase dieses Systems und füllt die Lösung in die ersten.drei Rohre der Verteilungsapparatur eih_T· .Nach 250 Verteilungsschritten werden die einzelnen Fraktionen mittels Dünnschichtohromatographie .(auf Aluminiumoxydplatt.e, System 104, Rf«Ö*,50) auf ihre Reinheit geprüft. Das reine Dotriacontapeptid befindet sich in den Fraktionen 140 - 165 (Maximum der Gewichtskurve in Fraktion 156, K = 1,65). Diese Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum bei 40° Badtemperatur eingedampft und der Rückstand zur Entfernung von Ammonium-. acetat bei 40° und 0,01 mm Hg getrocknet. Das dabei erhaltene Dotriacontapeptid erweist sich bei DünnschichtChromatographie an Aluminiumoxid als einheitlich (Nachweis mit Reindel-Hoppe-Reagens); es zeigt die folgenden Rf-Werte: Rf₄₅ » 0,33; Rf₅₂-" °'⁵⁹' ^Rfio4 ^a °'^5β· ■■"■■ '

909829/1544

. jAl*s^.>-;■-·■' BAD ORIGINAL

Das Sulfoxid von I weist folgende Rf-Werte auf«■ . . Rf₄₅ - 0,30; Rf₅₂ =0,5^; Rf₁₀₄ - 0,50.

Bei der Elektrophorese auf Celluloseacetat-Folie. ("Cellogel") in Essigsäure-Ameisensäurepuffer, pH = 1,9, 90. Minuten Laufzeit, 8 Volt/cm, zeigen I und sein Sulfoxid eine .Laufstrecke von 1,1 cm gegen die Kathode.

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
1) H-Thr(tBu)-0Me

12,92 g (40 mMol) Z~Thr(tBu)~OMe werden In 200 ml Eisessig • und 3 g Pd-Kohle (10 %) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Aufnahme von Wasserstoff ist nach einer Stunde beendet. ,. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und am Wasserstrahlvakuum bei 35° eingedampft. Nach dem Trocknen am Hoq'h-. vakuum bei 35° resultieren 7,3 g eines OeIs, das gemäss Dijnnschichtchroraatbgranim einheitlich ist und direkt weiter verwendet wird.
2) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-OMe ' -

3*9*3 S (38*6 mMol) DPC-Sor(tBu)-OH-, Cyclohexylaminaalz werden in 500.ml Chloroform aufgenommen, und bei 0° dreimal

cd mit 25 ml 1-n. Zitronensäure und fünfmal mit 40 rnl.halbgeo

^ sättJgter Kochsalzlösung ausgeschüttelt..Nach dem Trocknen cd. der Lösung über Natriumsulfat wird eingedampft und der er- ■ ^ haltene Schaum In 250 ml Essigest'er aufgenommen. Man gibt *- 5*36 .ml (38.,6 mMol) Triäthylamin au, kühlt die Lösung .auf -10° ab und versetzt unter Rühren mit 5.-13 rol (38,6 mMol)

at. Er₃ wird .10 Minuten boi -10° _ge„ BAD ORlOINAL

rührt und dann die auf -12° gekühlte Lösung von 7,3 g;(38,6 mMol) H-Thr(tBu)-OMö in 100 ml Essigester so zugetropft, dass die Reaktionstemperatur -10° 2 ..3 übersteigt. Nach beendetem Eintragen wird noch eine Stunde bei -10° gerührt und dann Über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die Lösung wird vorn ausgeschiedenen Triäthylamin-Hydrochlorid abfi.ltriert und bei 0° dreimal mit je 20 ml 1-n. Zitronensäure und fünfmal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Rohprodukt (OeI)ί 22,07 Z.· Zur Reinigung wird. 1 g an einer Silicagelsäule (2,5 cm, 30 cm) chi*omatogra-phiert. Mit Petroläther-Essigester (l:l) werden nach einem Vorlauf von 110 ml 787 mg reines Produkt eluiert. Im Dünnschichtchromatografie an Silicagel in Toluol-Aceton (7:3) ist Rf = 0,51. ' ■ · 3) Z-VaI-Leu-OMe

Man löst 19,9 S (HO mMol) H-Leu-OMe* HCl; in. 12CLmX · Di-.. methylformamid und gibt bei 0° .14.,6 ml (105 mMol) Triäthyl-

amin zu. Das ausgeschiedene.Triäthylamin-Hydrochlorid'wird abfiltriert, das Filtrat zu einer Lösung von 25,1 g (100 mMol} Z-VaI-OH in 200 ml Dimethylformamid (0°) gegeben und dann 22,6 g (110 raMol) Dicyolohexylcarbodlimid trocken zugefügt« Nach einer Stunde Rühren bei 0° und über Nacht im Kühlschrank, wird filtriert und die Lösung am Hochvakuum bei 40° eingedampft. Der ölige Rückstand wird in 30 ml Essigester aufgenommen, die Lösung auf 0° abgekühlt und vom ausgeschiedenen

,. 909829/1544

8AD ORlGWAL

Dicyclohexylharnstoff befreit..Nach Zugabe von η-Hexan kristallisiert das Produkt aus dem Plltrat über Nacht aus. P. 102 - 105°; Ca]₀: -41° (c = 2,88 in Methanol). Im Dünnschichtchromatogramm an Sillcagel in Chloroform-Methanol (98:2) ist Rf = 0,55 und in Toluol-Aceton (7:3) ist Rf - 0,60.

4) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBuJ-NH-NH₂ -■

4,253 g (7»^ mMol) DPC-Ser(tBu)~Thr(tBu)-OMe in l8 ml Methanol werden mit 5,55 ml (ca. 110 mMol) Hydazinhydrat versetzt und 10 Stunden bei Zimmertemperatur und 2 Stunden bei 40° stehen gelassen. Die Reaktionslösung wird in 450 ml Essigester aufgenommen und viermal mit halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung über Natrium- · sulfat wird auf ca. 15 nil eingeengt und mit ca. 5 ml Petroläther versetzt. Ueber Nacht kristallisieren '3,17 g des Hydra.« ■-zlds vom P. 132 - 134⁰ aus. .

Im DUnnschichtchromatogramin an ßllieagel in Toluol-Aceton (713) ist Hf * 0,40. .

5) H-VaI-Leu-OMe,HCl

5,66 g (15 mMol) Z-VaI-Leu-OMe werden in 75.ml Methanol.in Gegenwart von 15 mMol Salzsäure und 850 mg Pd~Kohle.(10 %) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Aufnahme:, von Wasserstoff ist nach 3 Stunden beendet. Es wird vom Katalysator abfiltriert und die Lösung auf ca. 15 ml eingeengt. Bei Zugabe von Aether kristallisiert das Produkt aus* P.I36 - 139··

909829/1544

¹ ' · 1

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol (9:1) ist Rf <= 0,45; in Toluol-Aceton (lil) ist Rf -

^Γ ι

6) TRI-CyS(TRI)-VaI-Leu-OMe .

7,13 g (10 mMol) TRI-Cys(THIJ-OHi-Diäthylamlnsalz werden in Chloroform bei 0° mit 1-n. Zitronensäure und halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen, die Lösung getrocknet, eingedampft und der erhaltene Schaum in 50 ml Essigester aufgenommen. Dazu gibt man eine mit 1,4 ml (10 mMol) Triäthylamin versetzte Lösung von 3,22 g (10 mMol) H-VaI-Leu-OMe-, Hy-.drochlorid in 40 ml Essigester von 0°$ aus der man .das ausgefallene Triäthylamin-iljdrochlorid abfiltriert hat. Dann versetzt man bei 0° mit 2,26 g (11 mMol) trockenem Dicyclo-.hexylcarbodilmid, rührt 2 1/2 Stunden bei 0° und lässt über Nacht im Kühlschrank stehen. Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und die Lösung bei 0° mit 1-n. Zitronensäure, 1-n. Natriumbicarbonat und halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die·· Lösung wird auf ca. 20 ml eingeengt, auf 0° gekühlt und von ■ weiterem Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Eindampfen zur ' Trockne ergibt 8,53 S Ester. Zur Reinigung wird das Rohprodukt an einer Silicagelsäule (5 cm; 55 cm) chromatographiert. Nach einem Voilauf von 400 ml wird das Hauptprodukt mit 300 ml Petroläther-Ecsigester (l:l) in reiner Form eluiert.

909829/1544

Im Dünnschichtchromatogramm an Silioagel in Chloroform-Methanol (99:1) ist Rf « 0,43.· .

7) H-Cys(TRI)-VaI-Leu-OMe ·

11,08 g (13,3 mMol) TRI-Cys(TRl)-VaI-Leu-OMe werden in 75 ml Essigsäure gelöst und 12,3 ml Wasser-tropfenweise zugegeben, so dass stets eine klare Lösung bleibt. Nach einer Stunde Rühren bei Zimmertemperatur gibt man zur klaren Lösung 64 ml Wasser, filtriert, den Niederschlag ab und wäscht mit kal-.ter 50 #iger Essigsäure. Das Filtrat wird am Hochvakuum bei · 40° zu einem OeI eingedampft, dieses in 250 ml Essigester aufgenommen und bei 0° mit 1-n. Natriumbicarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft, wobei 7*07 g eines weissen Produk-: · · tes erhalten werdan» Das Dünnschichtchromatogramm an Silicage,! im ^System Chloroform-Methanol' (98s2) zeigt beim Besprühen mit; .Reindel-Hoppe-Reagenz einen Fleck vom Rf-Wert 0,30.. ·.

8) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-VaI-LeU-OMe

Zu 13,6 g (23,8 mMol) DPC-Ser(tBu)-Thr<tBuJ-NH-NH₂ In 220 ml Dimethylformamid·werden bei -12° 32,26 ml Salzsäure in'Essigester (1,84-n.; 59*25 mMol) und 3,26 ml (28^55 mMol) tert.-Butylnitrit gegeben. Nach I5 Minuten.bei -10°.lässt man dann die auf -10° gekühlte'Lösung von 14,03 g (23,8 mMol) H-Cys-(TRI)-VaI-Leu-OMe und 8,315 ml (59*25 mMol) Triethylamin in' 100 ml Dimethylformamid derart zutropfen, dass die Reaktionsteraperatur -9° ⁿ^6 überschreitet. Es wird noch eine Stunde

909829/15U

·- 53 -

bei -10° gerührt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Es wird vom ausgeschiedenen Triäthy1amiη-Hy-,äJOchlorid abfiltriert, das Pil trat am Hochvakuum bei 4O° ein-· gedampft, der ölige Rückstand in 500 ml Essigester aufgenommen, mit 1-n. Zitronensäure, l~n. Natriumbicarbonät und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet, auf ca. 40 ml eingeengt und mit ca. 10 ml Petroläther versetzt. Ueber Nacht kristallisiert.der geschützte Pentapeptidester vom P. 177 178° aus. ' . .

Im Dünnschichtehromatogramm an Sillcagel in Chloroform-Methanol (98:2) ist Rf = 0,45; in Toluol-Aceton (7O) 1st Rf .'»

9) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-YaI-Leu-OH 2,830 g (2 mMoi) DPC-SeritBuJ-ThritBuJ-CysiTRlJ-Val-Leu-OMe werden in 60 ml 75 tigern Dioxan gelöst und mit 3 ml 2-n. Natronlauge (6 mMol) versetzt. Nach 1 1/2 Stunden bei Zimmertemperatur wird das Dioxan am Wasserstrahlvakuum bei 40·° abgedampft, Essigester und Wasser zugegeben und bei. 0° mit 1-n. Zitronensäure auf pH 3 gestellt. Die Essigester-Phase wird mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Es resultiert ein Produkt, das gema'ss Dünnschichtchromatogramm an Sillcagel einheitlich ist. Rf in Chloroform-Methanol (7i3). - 0,40; Rf₄₅ «0,55.

909829/1544

8/U5

10) H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-VaI-LeU-OH

2,22 g (2 mMol)

werden in 20 ml 'Methylenchlorid gelöst und 12 ml Chloressigsäure in Wasser (aus 75 g Chloressigsäure und 2$ ml Wasser), zugegeben. Die klare Lösung wird 15 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt, auf 0° gekühlt und dann werden JO ml Wasser zugegeben» Mit konzentriertem Ammoniak wird auf pH 6,5 eingestellt, wobei das Produkt ausfällt. Die wässrige Lösung wird abdekantiert und der Rückstand noch dreimal mit Wasser verrieben und dann lyophillstert. Dreimaliges Verreiben des Produktes mit Aether liefert ein weisses Pulver, welches laut Dünnschichtehromatogramm einheitlich ist. Es wird in dieser Form weiter verwendet.

Im Dünnschichtehromatogramm an Silicagel ist RiVr ^β 0,48j Rf₁₀₁ - 0,65; Rf₅₂* 0,75.
11) Z-Asn-Leu-OMe

l6,7 g H-Leu-OMe und 46,0 g Z-Äsn-ONP werden in 100 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird 19 Stunden bei 25° stehen gelassen. Hierauf gibt man 1,2 Liter Wasser zu und nutscht die kristalline Fällung ab« Das Dipep» tldderivat wird bei 4o° Im Vakuum getrocknet und dann zweimal aus Methanol-Wasser umkristallisiert· P₉ l80-- l8l?; ⁰-« +9° (o * 2/05 in Chloroform).

^f4 ti 9 § / 1 % L L

¹Ii¹"¹"¹!! ;'!Ϊ':^!ΙΙ!Γ ■ ;■ ■■' ■" ijjlli

12) H-Asn-Leu-OMe . " ..

15*0 g Z~Asn-Leu-OMe worden in 400 ml t-Butanol-Wasser gelöst und in Gegenwart von:.2 g Palladium-Kohle (10 # Pd) hydriert. Nach Beendigung der Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht und bei 40° eingedampft. Der Rückstand wird direkt weiter verwendet. ' . . . Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe . .

. 8,90 g H-Asn~Leu~OMe und 11,0 g Z-Ser(tBu)-OH werden in 100 ml frisch destilliertem Dimethylformamid' gelöst. Die Lösung wird auf 0° gekühlt und mit 3/90 g N-Hydroxysucc'inlmid • und dann mit 8,70 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 30 Minuten Stehen bei 0° und 18 Stunden bei 25° wird'vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abgenutscht und das Filtrat in 8OO ml Eiswasser gegossen. Der dabei ausfallende,, kristalline Niederschlag wird im Vakuum bei 40° getrocknet und dann aus Methanol-Wasser umkristallisiert. Das dabei in analysenreiner Form erhaltene Z-Ser(tBu)-Asn-Leu~OMe schmilzt bei F. 202 - 205°; [cc3^° - -l8° (0 « 1,05 in Eisessig). 14) H~Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe

6*3 g Z~Ser(t3u)-Asn-Leu~QMe werden in 6OO ml Methanol ge-Q löst und in Gegenwart von 1,2 g Palladium-Kohle-(10 % Pd) hydriert. Nach 1,25 Stunden wird vom Katalysator abgenutscht

ί^ und im Vakuum bei JtO Bad temperatur zur Trockne eingedampft. αϊ Das dabei erhaltene kristalline Tripeptidderivat zeigt bei **" DUnnschichfcchromatographie auf Sillc&eelplafcten im System Chloroforin~K.jtht.nol (90 s 10) nf « 0,11.

ÖA0 ÖSJOWÄL

15) BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn»Leu-OMe ^; ' ..."

5,0 β H-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe und 6,7 S BOC-Cys(TRI)-ONP werden in 30 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst. Die gelbe Lösung wird 42 Stunden bei 26° stehen gelassen. Hierauf wird durch Zugabe von 500 ml Eiswasser gefällt und das ausgefallene Produkt abgenutscht« Es wird in Essigester gelöst und.die Lösung mit 5 % Zltronensäurelösuhg, und dann mit Wasser gewaschen. Hierauf wird unter Eiskühlung zur Entfernuhg von p-Nitrophenol 5 χ mit einem Gemisch von je 1 Volumteil 5 $iger Kaliumcarbonat- und 5 $iger Kaliumbicarbonatlösung und dann mit V/asser gewaschen. Die Essigesterlösung hinterlässt nach Trocknen und .Eindampfen ein harzartiges Produkt. Dieses wird viermal aus Aceton und Petroläther umgefällt. Das-dabei als festes Pulver erhaltene Tetrapeptid-. derivat zeigt P. I8l-l82°; [α3^° « -11° (c = 2,09 in Methanol).

Bei Dünnschichtchromatographie auf 'Sllieagelplatten 1st RfjtV_A -0,57; Rf in Essigester = 0,10; Rf .in Toluol-Aoefcon (7θ)'^β ' 0_#05i Rf in Chloroform-Methanol (9:1).= 0,45·

16) BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-ABn-Leu-NH-NH2

es 7,0 g BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe werden in 70 ml Meuo.

J2 thanol gelöst und die auf 0° gekühlte Lösung mit 7 ml Hydraco . . -

zinhydrat versetzt. Wach ΐβ Stunden bei 2 wird eine eiskal- ' •te Lösung von 600 ml S-n. Essigsäure zugegeben, die gallertige ' Füllung gut serrieta* abgenutsoht und mit viel Wasser.neutral gewaschen. Daß erhaltene Pulver "wird. bei.-ΛΟ.⁰ im-Vakuum getrödcnet

• - 57 -

und dann in 100 ml Acetonitril suspendiert. Nach Zerreiben wird abgenutsoht und bei 40° im Vakuum getrocknet. Das erhaltene BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Hydrazid zeigt P. 216 - .· . . 218°. ' . ■ . .

Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten weist es.

die folgendenRf-Werte auf: Rf - 0,55 in Dioxan-Wasser (98:2); · Rf m 0,52 in Chloroform-Methanol (8:2); Ri*₁₀2E " °'^⁰' 17) BOC-CysiTRlJ-SeritBuJ-Asn-Leu-SeritBuJ-ThritBuJ-Cys(TRI)-:. Val-Leu-OH

Bei -15° werden zu 1,075 g (1,26 mMol) BOC-Cys(TRl)-Ser(tBu)-Asn-Leu-NH-NH₂ in 15 ml Dimethylformamid 1,71 ml Salzsäure in Essigester 0-,84-n. /,3,15 mMol) und 0,174 ml (1,51 mMol) tert.-Butylnitrit (1,74 ml aus einer Lösung von 1 ml tert.-Butylnitrit mit Dimethylformamid auf 10 ml aufgefüllt) gegeben. Die Lösung wird 15 Minuten bei -10° gerührt und dann die auf -12° gekühlte Lösung von 1,104 g (1,26 mMol) H-Ser(tBu)-Thr (tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OH und 0,$l ml (4,41 mMol) Triäthylamin in 15 ml Dimethylformamid zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde bei -10° und vier Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Eindampfen am Hochvakuum auf ein kleines Volumen und Zugabe von Wasser erhält man ein pulveriges Produkt, welches zweimal mit Wasser verrieben und dann am Hoch-; vakuum über Kalilauge getrocknet wird. Dieses Rohprodukt wird . durch limlösen aus Methanol gereinigt. Aus einer bei 50° gesättigten methanolisehen Lösung scheidet sich über Nacht ·

: 909829/1544. . . .

BADORIG)NAL

bei 0° ein weisses Pulver aus, welches sich im Dünnschicht*.

chromatogramm als einheitlich'erweist.

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf^v₀ ■ 0*54; R^f121A « 0,65; Ri¹J^₅ « 0,50; Rf₇₀ « 0,75; R* in Chloroform-' ■ Methanol (8;2).» 0,40. . . . ■

18) BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Scr(tBu)-Thr(tBu)-Cys-ValrLeu-OH ;

a) 846 mg (0,5 mMol) B0C-Cy8(TIll)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr. ■ (tBu)-VaI-Leu-OH werden in 8 ml Dimethylformamid gelöst und-

350 mg (1,1 mMol) Quecksilber(II)acetat in 4 ml Methanol . . .

zugegeben· Aus der klaren Lösung beginnt sich nach ca« 5 ' Minuten ein gallertiges Produkt auszuscheiden. Man rührt das Reaktionsgemisch 60 Minuten bei Zimmertemperatur, verdünnt mit 50 ml Dimethylformamid und.leitet dann 20 Minuten Schwefelwasserstoff und 15 Minuten Stickstoff hindurch. Der schwarze Niederschlag wird durch"Celite^Babfiltriert und mit Dimethylformamid gewaschen. Das Filtrat engt man auf 40 ml ein und leitet 15 Minuten Stickstoff hinduroh. Diese Lösung wird gleichzeitig mit einer Lösung von 17O mg (0,6 mMol) Dijodäthan in 40 ml Methanol bei Zimmertemperatur zu 20 .ml Dirnethylforinamid .und 20 ml Methanol innerhalb einer Stunde unter Rühren sin- . •getropft. Nach 10 Stunden bei Zimntertemperatur wird das Lo-' sungsmlttol am Hochvakuum bei 4ö° abgedampft und der Ölige · . · Rückstand zunächst dreimal mit' Pe tr öl either, d.ann zweimal mit Wasser verrieben und lyophilleiort· Die Reinigung dos bräunlichen Rohproduktes golingt durch Gegonstromvei'toilung Im

909 8 29/1544 . ,\

j^m'iQ OAiS

System: Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:4). Der Puffer wird aus 28,6 ml Eisessig und 19,25 g Ammoniumacetat, mit Wasser auf 1 Liter aufgefüllt, erhalten. Nach 135 Verteilungsschritten befindet sich das Produkt in den Elementen 49-63 (r = 53; K = 0,65). Der Inhalt dieser EIe-

max

mente wird zur Trockne eingedampft und über Nacht am Hochvakuum bei 40° vom Ammoniumacetat befreit. Es resultieren 254 mg eines chromatographisch einheitlichen Produktes. Im Dünnschichtchromatogramm an Sillcagel ist Rf^c = 0,42;

^Rf121A ^{= Oi7O; Rf}70 ⁼ °'^{75; Rf}53 ⁼ °>^ky' ^Rf43A ⁼ °'²²· b) Zu einer gerührten Lösung von 3,73 g (l4,78 mMol) Jod in 500 ml Methanol werden bei Zimmertemperatur 2,50 g (l4,78 mMol) BOC-Cys(TRI)-Ser-(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-VaI-Leu-OH in 500 ml Methanol innert 45 Minuten zugetropft. Nach beendetem Eintragen rührt man 1 Stunde weiter und entfärbt dann die Lösung bei 0° mit 1,0-n. wässeriger Thiosulfatlösung (26,05 ml 1-n. Thiosulfat). Die klare Lösung wird am Wasserstrahlvakuum bei 30° auf ca. 100 ml eingeengt. Dann gibt man 1,5 Lt Wasser zu, filtriert das ausgefallene Produkt und wäscht es mit Wasser. Nach dem Trocknen über Kaliumhydroxyd wiegt das Rohprodukt 2,3 g. Es wird zweimal mit Petroläther verrieben und zur Reinigung einer Gegenstromverteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:4) entworfen. [Puffer: 28,6 ml Eisessig; 19*25 g Ammoniumacetat, mit Wasser auf 1 Liter aufgefüllt]. Nach 135 Schritten befindet sich das Hauptprodukt

909829/1544

in den Elementen 50-79 (r· = 64} K = O,96). Der Inhalt

max

dieser Elemente wird zusammen am Hochvakuum (40 ) zur Trockne eingedampft und das Ammoniumacetat absublimiert. Das erhaltene BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val Leu-OH (1,49 g = 83$ der Theorie) erweist sich im Dünnschi chtchromatogramm (Silicagel) als einheitlich. Es zeigt die gleichen Rf-Werte wie das unter a) beschriebene Produkt.

19) Z-Tyr(tBu)-Try-OMe

Man gibt zu einer Lösung von 29,8 g Z-Tyr(tBu)-OH in 190 ml Chloroform 11,1 ml Triäthylamin und 20,5 g H-Try-OMe-Chlorhydrat, rührt 30 Minuten bei Raumtemperatur und kühlt dann auf 0°. Bei dieser Temperatur tropft man eine Lösung von 29,9 S Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml Chloroform zu. Man rührt 1 Stunde bei 0 und die ganze Nacht bei Raumtemperatur. Nach Abfiltrieren des Dicyclo-. hexylharnstoffes wird die Lösung im Vakuum eingeengt, der Rückstand in Essigester aufgenommen und diese Lösung bei 0 mit 5 $iger Zitronensäurelösung und 2-n. Natriumcarbonat ausgeschüttelt. Das nach Verdampfen des Essigesters erhaltene OeI wird an 1 kg Kieselgel chromatographiert. Das Rohprodukt wird in 25O ml Toluol auf die Säule gebracht, mit 9 Liter Toluol, 6,5 Liter Toluol-Chloroform (9:1) und 15 Liter Toluol-Chloroform (l:l) eluiert

»mm ^s

909829/1544

^BAD

Die nach Dünnschichtchromatogramm reinen Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft; Man erhält · 27,9 g Z-Tyr(tBu)-Try-OMe/Rf « 0,65 in Chloroform-Aceton (l:l) auf Silicag'el.

20) H-Tyr(tBu)-Try-OMe

26,2 g Z-Tyr(-tBu)-Try-OMe werden in 520 ml Methanol gelöst in Gegenwart von 4 g 10 #iger Palladium-Kohle und 21,b ml 2,1-n. Salzsäure bei Raumtemperatur hydriert. Nach beendigter Hydrierung wird vom Katalysator abfiltriert und das. Piltrat im Vakuum bei 30⁰ zur Trockne eingedampft. Man erhält 22,0 g H-Tyr(tBu)~Try«OMe-aflprhydrat Rf » 0,45 in Chloroform-Aceton

21) Z-Ala-Tyr(tBu)-Try-OMe

20,8 g H-Tyr(tBu)-Try-OMe,-HCl werden in. 4θ:ηιΓ Dimethylformamid gelöst, mit 16,7 g Z-AIa-ONP und 6,1 ml Triäthylamin versetzt und gerührt, bis die Mischung durchkristallisiert· Nach Stehenlassen über Nacht werden 300ml Essigester zugegeben, das unlösliche Material wird abfiltriert und das Piltrat bei 0° mit verdünnter Kaliumcarbonatlösung Nitrophenol-frei gewaschen, dann mit 0,1-m Zitronensäure und Wasser ausgeschüttelt. Nach Trocknen der Lösung und Verdampfen des Essigesters wird der Rückstand in 25 ml Chloroform gelöst, auf eine Säule aus 200 g Kieselgel aufgezogen und mit Chloroform eluiertt

. ■ ■ ■ ·

Das erhaltene Produkt wird aus Essigester-Hexan umkristallisiert· Das Z-Ala-Tyi'(tBu)-Try-OMe schmilzt ab 1θ8^α unter " · langsamor Zercataungi Rf » 0^5-in Chloroforrii-Acötcn (IjI).

22) H-Ala-Tyr(tBu)-Try-OMe '

10,3 g .Carbob'enzoxyverbindung von 21) werden in 200 ml Methanol in Gegenwart von 0,5 g 10 #iger Palladium-Kohle wie vorher gezeigt hydriert. .Das decarbobenzoxylierte Produkt zeigt Rf β 0,3 im System' Chloroform-Methanol (9si).

23) DPC-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-OMe '

8,3 g DPC-Ser(tBu)-OH (aus dem Cyolohexylammoniumsalz mit Zitronensäure freigesetzt) in 25 ml Essigester werden bei -10° mit 2,7 ml Triäthylamin und 2,7 ml Chloramelsensäureisobutylester versetzt. Nach 5 Minuten bei. -10°'wird zum gemischten Anhydrid die Lösung von 8,1 g H-Ala-Tyr(tBu)-Try-OMe in 20 ml Dimethylformamid gegeben und 10 Minuten bei -10 , • 2 Stunden bei 0° und 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wird mit Essigester verdünnt, bei 0° mit 0,1-m Zitronensäure und gesättigter Kaliumcarbonatlösung ausgeschüttelt, dann ,bei Raumtemperatur mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand .wird aus Essigester-Hexan umkristallisiert. Man erhält 10,5 S .DPC-SerftBuJ-Ala-TyritBu^Try-OMe vom F. 148 - 149° ·. (Zersetzung). Rf = 0,7 im System Chloroform-Methanoi (9^1)· 24) DPC-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-NH-NH₂ 1,34 g des Tetrapeptidderlvats von 23) werden in J,5 ml Methanol gelöst, mit 0,75 ml Hydrazlnhydrat versetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Durch Zugabe von 7,5 ml Methanol'und 15 ml Wasser kriotallislert das DPC-Ser

909829/1544

(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-NH-NH₂ -aus. Das Produkt wir1 abgenutscht, gut mit 50 #igem Methanol und Wasser gewaschen und im .Hochvakuum über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Das Produkt schmilzt ab 136° unter langsamem Zersetzen. Rf = 0,35 im System Chloroform-Methanol (9«'l)·

25) Z-Asn-Phe-NHNH-BOC

1,4 g H-Phe-WHNH-BOC, 1,94 g Z-Asn-ONP und 3 ml Dimethylformamid werden bei Raumtemperatur gerührt, bis die Mischung erstarrt. Nach Stehenlassen über Nacht wird mit Aether verrieben, das Dipeptidderivat abfiltriert und mit·Aether Nitrophenol-frei gewaschen. Daa Produkt, beginnt bei 211° unter Zersetzung zu schmelzen. Rf « 0,55 in Chloroform-Methanol (8:2) auf Silicagel. . . '.

26) H-Asn-Phe-NH-NH-BOC " . ·

28,75 g der Carbobenzoxyverbindung von 25) werden, in 1 Liter Methanol gelösfy-in Gegenwart von 2,9 g 10 #iger Palladi.um-Kohle bei Raumtemperatur hydriert. Nach vollständiger Decarbobenzoxylierung wird der Katalysator abfiltriert und das FiItrat zur Trockne eingedampft. Das Produkt schmilzt bei ΙβΟ - 161°. Rf = 0,15 in Chloroform-Methanol (8:2). .

27) Z-Asn-Asn-Phe-NH-NH-BOC

20,93 S H-Asn-Phe-NH-NH-BOC werden in 45 ml Dimethylformamid unter Erwärmen gelöst, bei Raumtemperatur mit 22,7 g Z-Asn-ONP vorsetzt und gerührt, bis die Mischung erstarrte Nach Stehenlassen über Nacht wird die fasfce Masse in ΙβΟ ml

909829ΪΜ5Α4'¹"

Dimethylformamid unter Erwärmen gelöst, durch Eintropfen in 1 Liter Aether gefällt, das Produkt abfiltriert und mit Αοθ-ton Nitrophenol-frei gewaschen-. Rf ·» 0,24 in Chloroform-. Methanol (8:2).

28) H-Asn-Asn-Phe-NHNH-BOC "

35*8 g der unter 27) beschriebenen Carbobenzoxyverbindung werden.in 5βΟ ml Dimethylformamid unter Erwärmen gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur gibt man $,6 g 10 # Palladium-Kohle zu und hydriert. Nach vollständiger Decarbobenzoxyllerung wird der Katalysator abfiltriert, die Dimethylformamid-Lösung auf ca. 100 ml eingeengt und das H-Asn-Asn-Phe-NHNH-BOC durch Eintropfen ih 1 Liter Aether gefällt. Rf₁Q₀'¹* °j,35 auf Silicagel. . '

29) Z-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-BOC ■■ ' ■'

2β,5 g H-Asn-Asn-Phe-NHNH-BOC werden in 58 ml warmen Dirne -> thylformamid gelöst, bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 24,2 g Z-Leu-ONP in 16 ml Dimethylformamid versetzt und gerührt, bis die Mischung erstarrt..Nach Stehenlassen über Nacht wird mit Aether verrieben, abfiltriert, in I90 ml Dimethylformamid gelöst und das Produkt durch Eintropfen in 1,5 Liter Aether wieder gefällt. Man filtriert ab und wäscht mit Aether Nitrophenol-frei. Rf = 0,45 im System Chloroform-Methanol (7; 3) auf Silicagel.

30) H-Leu-Asn-Asn-Phe"NHNH-BOC ·.' · .

.•36,0 ß des unter 29) erhaltenen Carbobenzoxyderivats werden ■ ■ 909829/1544. ■

SAD ORIGINAL

in 8OO ml Dimethylformamid wie unter 28) beschrieben hydriert und aufgearbeitet. Man erhält 27*9 g H-Leu-Asn-Asn-Phe- ' NHNH-BOC. Rf₁₀₀ =0,35. '

31) Z-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-M-BOC

27,9 g H-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-BOC werden in 145 ml Dimethylformamid warm gelöst, bei Raumtemperatur mit einer..'Lösung • von 21,6 g Z-Asn-ONP in 20 ml Dimethylformamid versetzt-und gerührt, bis die Mischung erstarrt. Nach Stehenlassen über Nacht wird wie bei 29) beschrieben.aufgearbeitet. Man erhält 3^,2 g .= 88 % d.Th. des Pentapeptidderivats. Rf_10Q..■ 0,5. .

32) H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-BOC

34,2 g des unter 31) beschriebenen Pentapeptidderivats werden wie unter 30) beschrieben hydriert und aufgearbeitet. '· Das H-Asn-Leu-Asn-Asn-PheτΝΗ-NH-BOC zeigt Rf₁₀₀ ⁰ 0,2.

33) Z-Arg-Asn-Leu-Z'sn-Asn-Phe-NHrNH-BOC-Hydrochlorid

23,6 g Z-Arg-OH werden in 87 ml Dimethylformamid suspendiert und unter Kühlung mit kaltem Wasser mit 21,2 ml 3#6-n. Salzsäure in Dioxan versetzt, wobei Lösung eintritt. 28,2 g des unter 32) genannten Pentapeptidderivats werden in 44O.ml Dimethylformamid warm gelöst, auf Raumtemperatur gekühlt und zu der Lösung von Z-Arg-OH* HCl. gegeben,-, dann noch 17#4.g Dicyclohexylcarbodiimid. Man lässt 24.Stunden rühren, filtriert vom auskristallisierten Dicyclohexylharnstoff ab und engt das Filtrat auf oa. 250 ml ein. Durch Eintropfen dieser Lö-■ sung in 2 Liter Aether wird das Rohprodukt gefällt. Dieses

. 909829/1544

_eA0

• . - 66 -

wird durch Eintragen unter Rühren in 280 ml heisses Dimethylformamid gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Produkt mit 870 ml gesättigter Kochsalzlösung und 1740 ml '" Wasser ausgefällt. Das ausgefallene Produkt wird abgenutscht und gut mit halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Das ■ feuchte Nutschgut wird in 1 Liter warmem Dimethylformamid gelöst und durch zweimaliges Einengen der Lösung azeotrop entwässert. Das ausgefallene Kochsalz filtriert man ab, das Plltrat wird in 2,4 Liter Acetonitril eingetropft, die entstandene Fällung nach einigen Stunden abfiltriert, mit Acetonitril und Aether gewaschen und im Vakuum bei 40 getrocknet. Das Z-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-BOC-Hydr.ochlorid weist Rf₁₀₀ - 0,25 auf. .
34) Z-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NMHg.-Hydrochlorid 10,6 g des unter 33) beschriebenen Hexapeptldderivats wer-« den unter Rühren und Eiskühlung in 50.ml $0 #Lger Trifluoijessigsäure gelöst* auf Raumtemperatur erwärmt und 20 Minuten bei dieser Temperatur belassen» Darauf-wird die Lösung unter Rühren und Eiskühlung in 500 ml Aether» eingetropft, die Fällung abfiltriert und mit Aether säurefrei gewaschen. Das Produkt wird in 90 ml warmes Dimethylformamid eingetragen, einige Zeit gerührt und darauf mit 1 Liter Aether in pulvriger Form ausgefällt. Dieses Rohprodukt wird mit 170 ml Iaopropanol 1 Stunde bei Raumtemperatur verrührt, abfiltriert, mit Isopropanol und Aether gewaschen .und im Vakuum bei

9098 29./ 1 544
^ 8ADOfMaINAL

40° getrocknet. Man erhält das Z-Arg-Äsn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH₂-Hydrochloric, das Rf_Qg « 0,38 auf Silicagel aufweist.·

35) Z-Phe-Ser(tBu)~OCH,

27,0 g (90 mMol) Z-Phe-OH werden in 250 ml absolutem Tetra- · hydrofuran zusammen mit 12,5 ml (90 mMol) Triäthylamin ge- ■ · löst und gekühlt. Bei -l8° werden 14,7 ml (112 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester. zugetropft und eine halbe Stunde bei< -10° gerührt. Zu der weissen Suspension (Triäthylamin- · hydrochlorid) gibt man nun 18,1 g H-Ser(tBu)-OCH,THydroohlorid (85,5 mMol)!in feingepulverter Form, verdünnt mit 350 ml Tetrahydrofuran und lässt dann 15,0 ml (IO8 mMol) Triäthyl-

amin in 100 ml Tetrahydrofuran zutropfen. Man rührt noch 3 Stunden bei ca. -10° und dann über Nacht bei Zimmertemperatur. Die Suspension wird.dann am Vakuum auf etwa 250 ml eingeengt, in viel Essigsäureäthylester aufgenommen und mit verdünnter Zitronensäurelösung (3 x 200 ml), verdünn- ' · · ter Natriumcarbonatlösung (3 χ 200 ml) und gesättigter Koch- .■ Salzlösung (5 x 200 ml) ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das Rohprodukt wird in 200 ml Essigsäureäthylestor-Hexan (lsi) gelöst. Aus der Lösung kristallisieren beim Abkühlen weisse Drusen aus, die isoliert und getrocknet werden. Das Produkt schmilzt bei 92,5 - 94°; [α]q° = +3° ±0,5° (c - 2,2 % in Methanol). Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten weist das Produkt folgende Rf-Worte auf; In Chloroform-Äceton (1:1)

Rf * 0,70; in Chloroform-Mofchanol (95:5) ^f *-. 0,70; Rf₂,,. » 0,65; ₀ o₆ 909829/ 154A

J^p_n Fi U, ÖD»

e OAä SAD OWOWAL

Z-Phe-Ser(tBu)-hydrazid·

25,4 g Z-Phe-Ser(tBu)~OCH, (55,7 mMol) werden in 250 ml Methanol gelöst und unter Eiskühlung mit 28 ml (575 mMol) Hydrazinhydrat versetzt. Die Lösung wird 6j Stunden im Kühlschrank belassen, wobei sich ein dicker Kristallkuchen bildet«. Das Produkt wird Isoliert und getrocknet. Es schmilzt bei 158,5 - 159/5°. [a]p⁰= +16° + 0,5° (c = 2,3 $> in Eisessig). Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagelschichten ist Rf s 0,27 in Chloroform-Methanol (95 :'5); Rf ^-_A « 0/57;'· ' · Rf₈₉= 0,65. _t ·

37) Z-Phe-Ser(tBu)-Gly-OCH . · ^; "

18,4 g .Z-Phe-Ser(tBu)-hydrazid (40,4 mMol) werden,in 100.ml Dimethylformamid gelöst und bei -20° mit 41,6 ml Chlorwasserstoff in Aether (2,43-η.,ΙΟΙ mMol) versetzt.· Zu der klaren Lösung gibt man 7,15 ml t-Butylnitrit (59 mMol) in 4.0 ml Dimethylformamid und spült mit 20 ml Dimethylformamid. Nach 10 Minuten bei Temperaturen-unter ~9° gibt man l4,0 ml (101 mMol) Triethylamin in βθ ml Dimethylformamid zu .und trägt 8,85 g H-GIy-OCH,-Hjtirochlorid (70 mMol) ein. In Intervallen von 10 Minuten gibt man drei Portionen von je 5,6 ml Triethylamin zu (insgesamt ISl mMol). Das pH beträgt dann oa« 8,5· Die Kühlnuschung wird dann entfernt und drei Stunden * bei 0 ,, dann über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Nach •Einengen der Reaktionsmisohung im .Vakuum zu einer dicken Paste nimmt man diese.in viel Essigsäureäthylester auf und ' ^f

90982.9/ 1 5 44 «

wäscht die Lösung nacheinander mit 3 Portionen verdünnter Zitronensäurelösung, 3 Portionen verdünnter Natriumcarbonat-•lösung und 5 Portionen gesättigter Kochsalzlösung. Das:., nach dem Trocknen und Eindampfen der Lösung erhaltene Rohprodukt wird in Essigsäureäthylester gelöst, durch eine Glasfritte filtriert und mit ca. 800 ml Aether versetzt. Der geschützte' .Tripeptidester kristallisiert sehr langsam aus, P. l40 - 141· Ca]^⁰ »■+ 13° + 0,5° (c = 2,3 % in Eisessig), Im Dünnschichtchromatografie auf ßilicagelschichten ist in Chloroform-Methanol (95:5) Ri" « 0,6l; in Chloroform-Ace.tpn (9:1) Rf = 0,28; Rf_102E - 0,82; Rf₄₃₀ - 0,72, 38) H-Phe-Ser(tBu) -GIyOCH,

7,4 g Z-Phe-Ser(tBu)-GIy-OCH, werden in Methanol mit Wasserstoff in Gegenwart von 1,0 g Palladiumkohle (10 # Pd") decarbobenzoxyliert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahmt wird filtriert, eingedampft und das entstandene Rohprodukt direkt weiter verarbeitet. Das Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm auf Sllicagelschichten folgende Rf-Werte auf: in Chloroform-Methanol (95:5) j Rf ■ 0,26; R^,_A = Ο,βΟ; Rf₅₂ - 0,51.
39) Z-Arg-Phe-Ser(tBii)rGly-OCH,-.:Hydrobconiid.

5,3 g Z-Arg-OH (17,3 mMol) werden in 15 ml Dimethylformamid aufgeschlämmt und nach Kühlung mib Eis-Kochsalzgemisch mit 5,9 ml Bromwasserstoffsäure in Methanol (3,06-n.,l8 mMol) versetzt. Nach kurzem Rühren entsteht eine klare, farblose

' ' 90982 9/1-54.4

Lösung. Dazu lässt man bei -18° eine Lösung von 5*6 .g H-Phe-Ser(tBu)-GIy-OCH, (14,4 mMol) in·15 ml Dimethylformamid zutropfen und gibt noch 7 ml Dimethylformamid zu. Dann fügt. · · man eine Lösung von 3,85 g. Dicyclohexylcarbodlimid in 5 ml

Methylenchlorid zu, ersetzt nach 1 Stunde die Kühlmischung durch Eiswasser., und lässt nach weiteren drei Stunden über Nacht bei Zimmertemperatur rühren. Der ausgefallene Nieder-: schlag von Dicyolohexylharnstoff wird dann abfiltriert, das Piltrat im Vakuum auf die Hälfte eingeengt, auf 0° gekühlt und in 600 ml Aether eingerührt. Von der resultierenden Fällung wird abdekantiertji der Niederschlag mit Aether gewaschen, in ca. 50 ml Methanol gelöst und wieder mit βΟΟ ml Aether ausgefällt. Nach nochmaligem Lösen in Methanol wird eingeh, dampft und am Hochvakuum getrocknet. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatografie auf Silicagelschichten; Rf^ = 0 = 0,54; auf Cellulose Selekta Rf.. _κ = 0,8l«

40) H-Arg-Phe'-Ser(tBu)-GIy-OCH,-Hydrochloria-Hydrobromid

6,3 g Z-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly~OCH₃-:Hydrobromid (.8,5 mMol) werden in 350 ml Methanol gelöst und mit 2,9 ml Chlorwasserstoff in Dloxan (3,09-11., 8,9 mMol) versetzt. Man hydriert in Gegenwart von 1,2 g lO.f&Lger Palladium-Kohle bei Zimmertemperatur, und Atmosphärendruck. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnähme wird filtriert, eingedampft, der erhaltene Rückstand in 30 ml Methanol gelöst und die Lösung in 700 ml Aether eingerührt. Dadurch entsteht eine gelbliche Paste, die nochmals in gleicher Weico gelöst und gefällt wird.

909829/1544

8AO ORIGINAL

Schliesslieh wird das Produkt nochmals in Methanol gelöst, filtriert und eingedampft. Das Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagelschichten folgende Werte auf: Rf₅₉ = 0,12; Rf₉₆ = 0,38; Rf₁₀₀ = 0,13. 41) Z-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-GIy-OCH^ Man schlämmt 7,6 g .Z-HiS-NH-NH₀ £5 mMol) in 60 ml Dimethyl-

C.

formamid auf, versetzt bei -l6° mit 3I ml Chlorwasserstoff·. in Aether (2,43-n., 75,3 mMol) und vermischt die dadurch erhaltene klare, gelbliche Lösung bei -18° mit 3,2 ml t-Bu-. tylnitrit (95 #ig, 26,5 mMol) in 10 ml Dimethylformamid. Nach 10 Minuten werden 10,4 ml Triäthylamin (75 mMol) in 25'ml vorgekühltem Dimethylformamid und 8,5 g H-Arg-Phe-Ser (tBu)-GIy-OCH , 2HCl (14'mMol) in 50 ml vorgekühltem Dimethylformamid zugefügt. Es wird mit 40 ml Dimethylformamid verdünnt und in Intervallen von .5 Minuten 4 Portionen von je 1,0 ml Triäthylamin (insgesamt 28,7 mMol) zugegeben. Man. lässt noch drei Stunden bei 0° und 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, filtriert dann von den ausgefallenen Salzen ab und engt die Reaktionslösung am Vakuum auf etwa 3/4 ■ des Volumens ein. Durch wiederholtes Einrühren des Produkts in viel Essigester gewinnt man ein Rohprodukt, das durch Gegenstromverteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (9s3*5J8:2) über I30 Stufen gereinigt wird ,(Puffer wie unter .18); r _v .« 54; K « 0,7). Die reinen

lila. Ji.

Fraktionen werden zusammengefasst, eingodampft, bei 40° a;n Hochvakuum vom /uiimoniumaco.üit bofrsJ'j und nach Lösung

909829/154Λ

in Wasser lyophilisiert. . .

Im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagelschichten ist Ri\r_2A ^β 0,34; Rf₁₀₁A - 0,71; Rf₁₂₁ = 0,76; Rf_niA = 0,40. . 42) H-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-GIy-OCH,,-2 CH₃-COOH . , · 2,9 g Z-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-GIy-OCH, (3,3 mMol) werden in 300 ml Methanol-Eisessig (9:1) unter Zusatz, von 500 mg Palladium-Kohle (10 % Pd) bei Zimmertemperatur und Atmosphären.-. ■ druck hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnähme wird filtriert'und am Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man über dem Rückstand zweimal je 50 ml Toluol eindampft. Das ' , Produkt, ein weisses Pulver, zeigt in Dünnschichtehromatogrammen auf Silicagelplatten folgende Rf-Werte:,Rf₁₀₁W = 0,51* RfQg = 0,10; ^Rf _111A ~ 0,28; auf Cellulose Selekta Rf^₅ = 0,55;

. 43) H-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-GIy-OH^CH -COOH ' · "■ ·

2,84 g H-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-GIy-OCH,,·2 CH,-COOH werden in 40 ml Wasser gelöst mit 15^mI 2-n^Plperidinlösung in Wasser 14 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Die klare, leicht gelbe Lösung wird dann mit 15 ml 2-n. wässriger Essigsäure. neutralisiert, filtriert und lyophilisiert. Aus dem Lyophilisat, einer leicht gelben zerfliesslichen Masse, wird am Hochvakuum .im Wasserbad von 6o° Piperidinacetat abgetrieben. Nun wird in 10 .ml Methanol gelöst und in 400 ml Essigsäure- · äthylester eingerührt. Die weisse, flockige Fällung wird

· filtriert, mit Essigester gev/aschen und getrocknet. Man

erhält 2,0 g reines Produkt in Form eines weissen Pulvers, ZiSO 'Φ*$ SAO ORIÖINAI,

.'■■' Im Dünnschlchtchromatogramm auf" Sillcagelschichten ist R ' 0,45; ^Ri"₁₂i ^β °^7* auf Cellulose Selekta: Rf₂^ - 0,48; Rf₅₅ = 0,38; Rf₉₆ - 0,36.

In der Papierelektrophorese (Papier S +.S 2043 6; 5 Stunden; 2000 Volt; pH 6,3) wandert die Substanz 6,5 cm. zur Kathode. In der Elektrophorese auf Selekta-Cellulose-Platten (pH 6,3; : 3 Stunden; 1000 Volt) wandert die Substanz 8,5 cm zur Ka- · thode. " .

.44) Z-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-OH,-CH,-COOH

3*77 g Z-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH₂ werden in 100 ml Dimethylformamid aufgeschlämmt und nach Kühlung mit einem Eiskochsalzbad mit 3,0 ml Chlorwasserstoff in Dloxan (3>O9-n., 9,27 mMol) versetzt. Ei:»;..: Teil der Suspension "geht in Lö·» sung. Nun gibt man bei -10° .0,5 ml t-Butylnltrit (95 #ig, 4,14 mMol) zu. Nach 5 Minuten bei -10 bis -12° gibt man nochmals Q08ml t-Butylnitrit zu. Nach insgesamt 11 Minuten Reaktionsdauer gibt man 1,29 ^ml Triethylamin (9,26 mMol) zu und gleich darauf die vorgekühlte Lösung von.2,40 g H-Hie-Arg-Phe-Ser(tBu)-Oly-0H-,CH₃-C00H (3,6 mMol) in 30 ml Dimethylformamid, dann noch 20 ml kaltes Dimethylformamid. In vier Portionen gibt man nun innerhalb 2,5 Stunden 1,08 ml Triäthylamln (7,8 mMol) zu, das pH bewegt sich zwischen 7 und 8, Man belässt den Ansatz Über Nacht bei 0°.und gibt am Morgen die Lösung des auf gleiche Art w,i<3 oben beschrieben aus 1,81 g Z-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phö-NH-NH₂ hergestellten

90982.9/1544

Azids zu, dann noch 0,62 ml (4,47 mMol) TriEthylamine Wiederum belässt man den Ansatz über Nacht bei 0⁰^ engt am Morgen am Vakuum bei einer Badtemperatur von 45° auf ca. • 15 nil Volumen ein und rührt den Ansatz in 800 ml Essigester..' ein. Das abfiltrierte Rohprodukt wird mit Essigester gewä- .·■ sehen und getrocknet. Es wird einer Gegenstromverteilung Im ,· System n-Butanol-Eisessig-V/asser (4:1:5) über 300 Stufen unterworfen; T_max. ** 94; K = 0,46. Die durch Dünnschichtchromatographie ermittelten reinen Fraktionen werden kombiniert^ eingedampft, in V/asser gelöst, filtriert und lyophilisjLert,? Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf SillcageX-schichten: Rf_101B = 0,56; Rf₁Qh = 0,07; auf Cellulose Seielitas Rf₂₁₅ = 0,37. ■ .

45) H-Arg-Asn~Leu~Asn-Asn~Phe-His-Arg«-Phe-Ser(tBu)-GIy-OH,- · 2 CH₃-COOH

1,48 g Z-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-GIy-OH werden in 350 ml Dimethylformamid-Wasser (4:1) unter Zusatz von 700 mg 10 ^iger Palladium-Kohle bei Zimmertemperatur und Atmosphärendruck hydriert. Nach 15 Stunden Schütteln unter Wasserstoffatmosphäre wird filtriert, am Vakuum eingedampft, in Wasser gelöst und lyophlllsiert. Das reine Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagelplatten folgende Rf-Werte: Rf₁Q₁₃ ^β 0,42; Rf₁₀₁^ ^a 0,34; auf CeIIu--, lose .Selekta: Rf^₅-* 0,27; auf Alox-Camag: R

^RflllA ^β °'^{28; Rf}121 ^a °'²⁷· -

9 09829/1544

SAD ORIGINAL

46) DPC-SerttBuJ-Ala-TyritBuJ-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-GIy-OH

75β mg DPC-Ser(tBu)-AXa-Tyr(tBu)-Try-NHNH₂ in 15 ml entgastem Dimethylformamid werden bei -30° mit 0,6 ml 3,6-n. Chlorwasserstoff in Dloxan und anschliessend mit 0,124 ml t-Butylnitrit versetzt. Nach 15 Minuten bei -15° werden 1,7 ml 2-n« Natriumcarbonatlösung zugetropft (pH 7-8) und das Azid mit eiskaltem Wasser ausgefällt. Die Fällung wird abgenutscht und mit eiskaltem Wasser gewaschen. Man löst 272 mg H-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-GIy-OH,-Acetat durch lelch-' , tes Erwärmen in 5,5 ml Dimethylformamid, gibt bei Raumtemperatur 0,51 ml 1-m. Triäthylamin in Dimethylformamid zu und versetzt die Lösung bei 0° mit dem oben hergestelltön festen Azid. Die Nutsche wird.noch mit 4 ml kaltem Dimethylformamid und 2 ml kaltem 3?sßigester ausgewaschen. Die Lösung wird nun bei 0° gerührt, wobei nach 20 Minuten 0,5 ml Wasser und nach 2 Stunden 0,05 ml 1-m. Triäthylamin in Dimethylformamid zugegeben werden. Nach 4 Stunden wird das Reaktionsgemischmit viel Aether gefallt, Datei erhält man das zuerst Ölig ausfallende Produkt naeh mehrmaligem Verreiben mit Aether und Umfallen aus Methanol-Aether als flockiges Produkt. Das erhaltene Rohprodukt wird durch Craig-Verteilung über 150 Stufen im Gemisch Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (100*7:4) (Puffer wie unter 18)) gereinigt. Die reine Substanz bedindet sich in den Verteilungselementen 75 - 112»

-909829/1544

' «AD ©BIOtti*L

Diese werden vereinigt, die organischen-Lösungsmittel im Vakuum entfernt und die wässrige Lösung lyophilisiert. Man erhält das geschützte Pentadecapeptid, das bei Chromatographie an Silicagel im System Essigester-Pyridin-Wasser (49:24:27). ·

Rf ο 0,4 zeigt. ■ ·

47) Z-Gly-Phe-Gly-Pro-OtBu.

Man löst 15,5 g Z-Gly-Phe-GIy-OH [dargestellt nach J.R. Vaughan & J.A. Eichler, J.Am.Chem.Soc. JS, 5556 (1953)3 in .100 ml absolutem Tetrahydrofuran und 5*3 ^ml absolutem Triäthylamln und lässt zu der auf -20° gekühlten Lösung unter Rühren 4,64 ml Isobutylchlorocarbonat so zutropfen, dass die Innentemperatur -15° nicht übersteigt* Hierauf wird 10 Minuten bei -10 reagieren gelassen, dann wieder auf -20° gekühlt und eine Lösung von 7,6 g H-Pro-OtBu in 30 ml Dimethylformr amid unter Rühren derart zugetropft, dass die Innentemperatur 0° nicht übersteigt. Man lässt 18 Stunden bei 0° stehen, ' saugt dann vom Triäthylamln-hydrochlorid ab und dampft das Filtrat bei 4o° Badtemperatur ein. Der Rückstand wird in 200 ml Essigester gelöst und die Lösung mit Natriumbicar-• bonatlösung, Wasser, 10 #ige:, Weinsäurelösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrooknet und eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigester-Petroläther kristallisiert, P. 66 - 71°; [a]p° = -45° (c « 1 % in Chloroform). 48) Z-Gly-Phe-Oly-Pro-OH.·

Man löst 25/6 g· Z-Giy~Phe-Gly-Pro-OtBu in 260 ml 90 #

90982 9/15k

.Trifluoressigsäure und lässt die Lösung 20 Minuten bei 22° stehen. Hierauf wird am Rotationsverdampfer bei 25° Badtemperatur bis zur öligen Konsistenz eingeengt, dann gibt man 250 ml Wasser zu und knetet die zähe Masse bei 0° durch. Die wässrige Phase wird abdekantiert und der Rückstand noch zweimal mit je 100 ml Wasser in gleicher Weise gewaschen« Hierauf wird er im Hochvakuum bei 30° Badtemperatur getrock;-net. Der dabei erhaltene Rückstand wird mit βΟΟ ml Aether-Fetroläther (lsi) versetzt, zerrieben, abgenutscht und getrocknet. Das Produkt wird direkt weiter verarbeitet". : 49) Z

Man löst 5,27 g Z-Thr(tBu)-OH und 1,56 g H-PrO-NH₂ in 60 ml Acetonitril, kühlt die Lösung auf 0° und versetzt mit 3,11 g ,Dicyclohexylcarbodlimld, Nach 1 Stunde bei 0° und .20 Stunden bei Raumtemperatur wird vom Dicyclohexylharnstoff abgenutsöht, das Piltrat eingedampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen. Die Essigesterlösung wird mit verdünnter Zitronen-

. säurelösung, Sodalösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der farblose Rückstand zeigt bei Dünnschichtchromatographie an.Si^L'ioAgeiplatten Rf »_ΓΚ

• 0,76; Rf^₃₀ = 0,70; Rf^₂ «0,62,

■ 50) H-Thr(tBu)-PrO-NH₂-hydrochlorid,

5,88 g Z-Thr(tBu)-PrO-NH₂ werden in 200 ml Methanol und 13,7 nil 1-n. HCl gelöst und in Gegenwart von 66Ο mg Palladiumkohle (lO % Pd) hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoff auf nähme wird bei 33° Badtemperatur zur Trockne einge*

909829/1544

dampft und getrocknet. Der Rückstand wird aus Aethanol->Aether kristallisiert; F. I70 - 173°. .

51) Z-Glu(0tBu)-Thr(tBu)-Pro-NH_o. :

Man suspendiert 3,0 g H-Thr(tBu)~Pro-NH₂~hydrochlorid und •4,92 g Z-GIu(OtBu)-ONP in einem Gemisch von 10 ml Dimethyl» formamid und 1,64 ml Triethylamin. Das Reaktionsgemisch wird 20 Stunden bei 30⁰ gerührt, hierauf mit I50 ml Essigester . verdünnt und die Essigesterlösung bei 0° viermal .mit. ^e. 50 ml gesättigter Kaliumcanbonatlösung, 50 ^l Wasser, 2 χ 5ß- ml 5 $ige Zitronensäurelösung und 2 χ 50 ml V/asser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Eindampfrückstand wird aus Esslgeste>Hexan kristallisiert, P, I59 161°.
52) H-GIu(OtBu)»Thr(tBu)-Pro-

4,4 g Z-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro~NH_s v/erden in 120 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,2 g Palladiumkohle (10 % Pd) hydriert, Nach Beendigung der Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht und das Piltrat eingedampft, wobei das Tripeptidderivat als kristalline Kruste anfällt. Es zeigt bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten d.en jfif-Wert « 0,50 im System Chloroform-Methanol (9il)« 53) Z-Gly-Phe-01y-Pro-Glu(0tBu)-Thr?tBu)-PrO-NH₉.

__- .-. -- . .- . -^ . _ ---,.Hr₁ IM,! I Mill IMWIIHW nMllllMll« M MB

Man löst 4,47 g Z-Gly-Phe-Gly-Pro-OH und 3,00 g H-GIu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-.NHg in 40 ml Acetonitril und versetzt die Lösung'

909829/1544

0A0 ORiGiNAL

mit 1,76 g Dieyclohexylcarbodiimld. Nach 12 Stunden bei wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abgenutscht und ' das Piltrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen und die Lösung mit Weinsäurelösung, Wasser, Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird zur Reinigung zweimal aus Essigester-Lösung₍ durch Zugabe von Petroläther umgefällt. Bei Dünnschichtchromatographie auf.Silicaselplatten ist Rf^- « 0,52 ; Rf₅₂ ^a °'57· 5²O H>Gly-Phe~Gly-Pro-Glu(0tBu)-Thr(tBu)-Pro-NH₂. Man löst 3,95 g Z-Gly-Phe-Gly-Pro~Glu(OtBu)-Thr(tBu)-PrO-NIi₃ in 80 ml Methanol und hydriert die Lösung in Gegenwart von 600 mg Palladiumkohle (10 % Pd). :Nach Beendigung, der Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht, das FiItrat auf ein Volumen von 10 ml eingedampft, 20 ml Benaol zugegeben, nochmals auf 10 ml eingeengt und das.Produkt imit 70 ml Petroläther ausger' fällt. Die schmierige Fällung wird zu einem Pulver zerrieben, '

abgenutscht und getrocknet; Ausbeute 3,3 g. Bei Dünnschicht-· .Chromatographie auf Sillcagelplatten 1st Rf^,_c «■ 0,27;

-Rf_. = 0,24; Rf: in Chloroform-Mothanol (8:2) « 0,10. 55) DPC-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-GIu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NH

Man suspendiert 3,72 g DPC-Methionin (G.Xr. 17108/67, Case 6IO6/I-3) und 5#21 s K-01y-Plie-Gly-Pro«Glu(qtBu)-Thr(tBu)-Pro-NHp in 30 tnl Acetonitril und gibt' dann 1,98 g Dicyclohexyl-

t *

carbodiimld zu. Nachdem die Luft im Reaktionsgefäss durch ·

909829/1544

8AO ORIGINAL

VordrHngU woinian AM?, w;U'd 530 Stunden bei 30° ge«·

rührt. Sodann wird mit 45 ml Methanol verdünnt, leicht erwärmt und dann vom noch ungelösten Dicy.clohexylharnstoff abgenutscht und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Essigester, gelöst und bei 0° wie unter 52) beschrieben, neutral gewaschen. Die Essigesterlösung hinterlässt beim Trocknen und Eindampfen 9,12 g farbloses Produkt, das aus Essigester-Hexan kristallisiert; P. l82°\ Bei Dünn-, Schichtchromatographie an Sillcagelplatten ist Rfii-xß .«■ 0,64, Rf in Chloroform-Methanol (9:1) ■ 0,30. 56) H-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-

3,0 g des unter 55) erhaltenen Octapeptidderivates werden in 35 ml Methylenchlorid gelöst und bei Raumtemperatur mit 28 ml eines Gemisches von Monochloressigsäure und Wasser (3:1) versetzti Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wird in 170 ml eiskalte, 2-n. Sodalösung eingegossen. Das sich dabei· abscheidende Octapeptidderivat wird mit 200 ml. n-Butanol— Essigester (1:1) extrahiert und die organische Phase mit . ■' Wasser neutral gewaschen. Sodann wird zur Trockne eingedampft, wobei das Octapeptidde,rlvat mit freier Aminogruppe . als.farbloser Rückstand erhalten wird, der bei Dünnschicht-Chromatographie an SUicagelplatten Rf₁₀₀ ^m °'²3 0,51 zeigt. · '

909829/1544

8AD ORIGINAL

• · 180613S

. 57) DPC-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-GIy-OH, Ditosylat ■

258 mg des unter 46) beschriebenen Pentadecapeptid-diacetates werden bei 40° in 4 ml absolutem Pyridin gelöst und dann bei 0° mit 1,025 ml einer 4 #igen Lösung von Toluolsulfosäure-monohydrat (2 Aequivalente).. versetzt. Die Lösung . wird im Hochvakuum bei 35° Badtemperatur zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Aether zerrieben. Hierauf wird abgenutscht und getrocknet (bei 30⁰) wobei das Ditosylat als . festes Pulver, erhalten wird. Rf₁₀IA ^β °*58; ^hq " 0*°9i Rf₈₇ =0,48. _f

58) DPC-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-SerCtBuJ-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-GluCOtBu)-Thr(tBu)-PrO-NH₂

254 mg des unter 57) erhaltenen Ditosylates, I38 mg H-Met* Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-PrO-NH₂ und 22,3 mg N-Hy-" droxysuccinimid werden in 1 ml Dimethylformamid unter Erwärmen auf 60° gelöst und die auf. 25° gekühlte Lösung mit 0,3 ml einer Dimethylformamidlosung versetzt, die 30 mg Dicyclohexylcarbodiimid enthält. Das Reaktionsgemisch wird unter Stickstoff- Stunden bei 25° und 12 Stunden bei 45° ^ belassen, der abgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert

und das Filtrat mit einem Gemisch von 15 ml Benzol und 40 ml ·" ^iCD Petroläther gefällt. Der entstehende Niederschlag wird abcn zentrifugiert, getrocknet und nach Lösen in 2,5 ml Dirnethyl- **· . formamid nochmals durch Zugabe von 30 ml Benzol-Petroläther (1ί2) gefällt, Nach Abdekantieren der Lösung wird der Nie- '

derschlag getrocknet. Ausbeute 390 mg Rohprodukt. Zur Reinigung wird multiplikativ verteilt über 200 Stufen im System . Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (lQJ3:6:5j .Puffer wie unter 18). Das reine Produkt wird aus' den Elementen 1OJ - 132 gewonnen, das Maximum befindet sich im Element 122 (K w 1j5)· Die Ausbeute beträgt 213 η>β; ^Rfno ^m °*3<>; ^Rf52A * 0,25; Rf₉₆ m 0,42. ■ ■

59) H-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn~Leu»Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro~Glu(OfcBu)-Thr (tBu)~Pro-NH₀~tritosylat.

Man löst 210 mg des unter 58) erhaltenen geschützten Tri° Gosapeptidamids in 10 ml Eisessig-Ameisensäure (83 %)-Wasser-(7ί1ί2) und lässt die Lösung 1 Stunde bei 30⁰ stehen. Dann wird das Produkt mit freier a»Aminogruppe durch Zugabe von 100 ml Aether ausgefällt und abzentrifugiert» Der Ueberstand wird mit 25 ml Petroläther versetzt, auf ein Volumen von 3Ö ml eingeengt und die dabei entstehende Fällung abzentrifugiert. Beide Niederschläge werden vereinigt und in 5 ml Methanol-0,1-m Essigsäure (2:1) gelöst. Die Lösung wird über eine Säule von Merck-Ionenaustauscher Nr. II in der Acetatform filtriert (Säule 9 mm; 125 nun). Das Eluat wird auf 2 ml eingeengt und dann lyophilisiert. Hierauf trocknet man im Hochvakuum bei 45 bis zur Gewichtskonstanz und löst den Rückstand in 10 ml 90 ^igem Pyridin. Dann gibt man 27 mg Toluolsulfosäuremonohydrat zu und dampft die Lösung .im Hochvakuum zur Trockne

909829/1544

8AD ORKsWNAl

ein. Der Rückstand wird in 2 ml Wasser gelöst, die Lösung lyophilisiert und hierauf im Hochvakuum bei ^getrocknet. Dabei werden Ιβγ mg Tritosylat des geschützten Trlcosapeptidamids mit freier a-Aminogruppe erhalten. Rfng " 0,27s

^Rf87 ^{= 0}^

60) BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Ser (tBu) -Ala-Tyr (tBu) -Try-Arg-Asn-Leu-Asn-^Asn-Phe-His Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr (tBu)-Pro-NH₂

675 mg BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-VaI-Leu-OH, 1,30 g des unter 59) erhaltenen Tritosylats der Sequenz 10 - 32, 38 mg N-Methylmorpholin und 86 mg N-Hydro^y,-succinimid werden in 7 ml frisch destilliertem Dimethylformamid unter Erwärmen auf 70° gelöst. Sodann kühlt man die · Lösung auf 25° ab und gibt 115 mg Dicyclohexyloarbodlimid zu. Die Reaktionsmischung wird unter Stickstoff 9 Stunden bei 25° und 8 Stunden bei 45° stehen gelassen. Hierauf wird vom Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat mit 80 ml Benzol und 400 ml Petroläther versetzt. Das dabei ausfallende rohe geschützte Dotriacontapeptidamid wird in 25 ml Methanol gelöst und durch Zugabe von 100 ml Benzol und 250 ml Petroläther ausgefällt. Hierauf wird der Nied-erschlag · abgenutscht und getrocknet.

Zur Reinigung wird einer multiplikativen Verteilung im System Methanol-Puffer (wie unter l8) - Chloroform-Tetrachlor-. kohlenstoff (10:3:6:5) über 300 Stufen unterworfen (Phasen-

909829/1544

volumen: 25 ml). Dünnschichtchromatographische Kontrolle (Systeme wie unten) ergibt, dass die Fraktionen 101 - 130 die reine, geschützte Sequenz 1-32 enthalten (Maximum Element 116, K = 0,63). Bei Dünnschichtchromatographie an Silicagel ist Rf₅₂ = 0,20; Rf₉₆ = 0,44; Rf₁₀₀ = 0,23; Rf₈₇ - 0,69;

auf Aluminiumoxyd ist Rfh,- =0,67.

61. BOC-Cys-Ser(tEu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-VaI-Leu-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-GIy-OH

145 mg BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-VaI-Leu-OH in 0,7 ml entgastem Dimethylformamid und 0,Ho ml einer 1-m. Lösung von N-Methylmorpholin in Dimethylformamid werden bei -15 mit 0,Ho ml einer 1-m. Lösung von Pivaloylchlorid in Dimethylformamid versetzt. Nach 3 Minuten bei -10° bis -15° wird eine Lösung von I72 mg H-Ser(tBu)-AIa-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-ÖfLdiacetat in 0,4 ml Dirnethylf ormam d und 0,04 ml einer 1-m. Lösung von N-Methylmorpholin in Dimethylformamid züge- * tropft. Nach 30 Minuten bei -5° bis -10° wird mit Aether gefällt und das feste Produkt isoliert. Dieses Rohprodukt wird durch Craigverteilung über 53O Stufen gereinigt; System: Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:7:4) (Puffer wie unter l8). Die reinen Fraktionen (Verteilungskoeffizient: O,9-»O,95) werden vereinigt, das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und die verbleibende wässrige Lösung lyophilisiert. Man erhält I55 mg eines weissen Pulvers.

909829/15U

Rf_g6 = 0,4 ; R^₃C = 0,18.

62. BOC-Cys-SeritBuJ-Asn-Leu-SeritBuJ-ThritBuJ-Cys-Val-Leu-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe -Sfcr (tBu) -GIy -Me t -GIy -Phe -GIy -Pro -GIu (OtBu) -Thr (tBu)-PrO-NH₂

99 mg BOC-Cys-Ser(tBuJ-Asn-^eu-SerftBu)-Thr(tBu)-Cys-VaI-Leu-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His r Arg-Phe~Ser(tBu)-GIy-OH, 2 HCl und 85 mg des unter 56) erhaltenen Peptids der Sequenz 25 - 32 werden unter Ueberleiten von Stickstoff mit 10 mg N-Hydroxy-succinimid, gelöst in 0,4 ml Dimethylformamid, versetzt und bei 40°gerührt bis alles gelöst ist. Nach Zugabe von 12,5 mg Dicyclohexylcabrodiimid, gelöst in 0,1 ml Dimethylformamid, wird noch 12 Stunden bei 40° gerührt. Mit 8 ml peroxidfreiem Aether wird das Rohprodukt ausgefällt und abzentrifugiert. Zur Reinigung wird, wie unter 6o) beschrieben, verteilt. Das erhaltene Produkt ist mit dem unter 6o) beschriebenen vollständig identisch.

Beispiel 2:

H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-VaI-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-GIy-Pro-GIu-Thr-Pro-NH₂ (Thyrocalcitonin).

300 mg BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser('tBu)-AIa-

909829/1544

BAD

Tyr(tBu)-Try-Arg(H_o+)-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg(H_i:)+)-Phe-Ser(tBu)-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-PrO-GIu(QtBu)-Thr-(tBu)-Pro-NHp werden wie in Beispiel 1 beschrieben mit Trifiuoressigsäure zur Abspaltung der Schutzgruppen hydrolysiert, in das Acetat überführt und durch Gegenstromverteilung gereinigt. Das Produkt erweist sich nach Dünnschichtchromatographie und Elektrophorese auf Cellulose-Acetatfolie als mit dem in Beispiel 1 erhaltenen Dotriacontapeptidamid identisch. Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:

1. BOC-VaI-Leu-OBzl

19*9 S (92 mMol) BOC-VaI-OH werden in 200 ml frisch destilliertem Dimethylformamid unter Erwärmen gelöst, nach Abkühlen auf 0° 25,9 rol absolutes Triäthylamin zugegeben, und die auf -10 gekühlte Lösung mit 8,64 ml Chlorkohlensäure-äthylester versetzt. Nach 10 Minuten bei -10 wird eine Lösung von 23,2 g (90 mMol) H-Leu-OBzl. HCL in 90 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten bei -10 , 3 Stunden bei 0° und 16 Stunden bei 20° belassen. Dann wird vorn Ungelösten abfiltriert und das Filtrat am Hochvakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in Essigester gelöst und die Lösung mit verdünnter Zitronensäurelösung, Wasser, Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Nach Zugabe von Petroläther kristallisiert das Produkt über Nacht aus. P. 88,5 - 89,5° [a]^¹ -22° (c = 2 in Dimethylformamid); Rf₂ = 0,73

909829/1544

SAD ORIGINAL

2. H-VaI-Leu-OBzI-HCl

22,8 g (54 mMol) BOC-VaI-Leu-OBzl werden in 228 ml Methylenchlorid gelöst. Durch diese Lösung wird während 1V2 Stunden gasförmiger Chlorwasserstoff geleitet. Nach Eindampfen zur Trockne wird der Rückstand dreimal mit Aether verrieben.

p. 192-195⁰.

Rf₂ = 0,27.

3. BOC-Cys(BzI)-VaI-LeU-OBzI

l4,2 g (32,8 mMol) BOC-Cys(BzI)-ONP und 11,7 g (32,8 mMol) H-Val-Leu-OBzl.HCl werden in I37 ml Dimethylformamid gelöst und zu der auf 0° gekühlten Lösung werden 4,7 ml Triäthylamin und 0,5 ml Eisessig zugegeben. Die gelbe Suspension wird 3 Stunden bei 0 und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nun wird vom ausgefallenen' Triäthylamin-Hydrochlorid abfiltriert, und das Filtrat am Hochvakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester gelöst und ausgeschüttelt und zwar zweimal mit Wasser, zweimal mit 0,1-n Salzsäure, zweimal mit 1Obiger Kochsalzlösung, sechsmal mit 10$ Sodalösung und zweimal mit gesättigter Kochsalzlösung. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft zur Trockne. Aus Essigester/Petroläther kristallisiert das geschützte Tripeptid vom F. 113-115°; [a]^⁰ -33° (c = 1 in Dimethylformamid) ;
Rf =0,30.

909829/1544

4. H-Cys(BzI)-VaI-Leu-OBz1,TFA .

10 g (ΐβ,3 mMol) BOC-Cys(BzI)-VaI-Leu-OBzl werden in 20 ml 90#iger Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen. Hierauf wird 200 ml peroxydfreier Aether zugegeben und 2 Stunden unter Eis/Kochsalz Kühlung gerührt. Die Fällung wird abgenutscht und zweimal mit peroxydfreiem Aether gewaschen und im Vakuum über Aetznatron getrocknet. F. 168-173°
Rf₄ = 0,77-

5· BOC-Ser-Thr-OBzI

Man gibt zu einer Lösung von l4,7 g (38,2 mMol) BOC-Ser-OH, Dicyclohexylammoniumsalz in 100 ml Methylenchlorid 9*4 g (38,2 mMol) H-Thr-OBzl,HCl und 60 ml Methylenchlorid, rührt 10 Minuten bei Raumtemperatur und kühlt dann auf -5°. Bei dieser Temperatur tropft man eine Lösung von 8,0 g (38,6 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in l8 ml Methylenchlorid zu. Man rührt 3 Stunden bei -5 und die ganze Nacht bei Raumtemperatur. Nach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffes und Dicyclohexylamin-Hydrochloridswird die Lösung ausgeschüttelt und zwar dreimal mit 0,1-n Salzsäure, zweimal mit 20$iger Kochsalzlösung, einmal mit lO^iger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit 20^iger Kochsalzlösung und über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird auf ca. 100 ml eingeengt, auf 5° gekühlt und von weiterem Dicyclohexylkernstoff abfiltriert. Eindampfen zur Trockne ergibt 15*8 g Ester. Zur Reinigung wird das Produkt aus Essigester-Hexan kristallisiert.

F. 110-111 ; [cc]_D -8,5° (c = 2 in Dimethylformamid) ; Rf₂ = °*33- 909829/ 1 5AA

■6. H-Ser-Thr-OBzl,TFA

9,3 g (23,5 mMol) BOC-Ser-Thr-OBzl werden gelöst in 13,8 ml 90#iger Trifluoressigsäure und die Lösung 20 Minuten bei 22° belassen. Hierauf wird sie unter Rühren in I38 ml trockenen Aether eingetropft, eine Stunde gerührt, und 2 Tage bei -10° stehen gelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und dreimal mit trockenem Aether gewaschen und im Vakuum über Aetznatron getrocknet.
F. 128-I29⁰;
Rf₂ = 0,65 ; Rf₄ = 0,50.

7. BOC-ASn-LeU-N₃H₂-Z

34,8 g (150 mMol) BOC-Asn-OH werden in 3OO ml Acetonitril aufgeschlämmt und mit 38 g (15O mMol) Woodward's Reagenz K versetzt, Dann lässt man unter Rühren und Kühlen 21 ml (150 mMol) Triäthylamin so zutropfen, dass die Innentemperatur +30° nicht übersteigt. Nach beendetem Eintragen wird noch 45 Minuten bei 25° gerührt. Zu der fast klaren Lösung gibt man 52,2 g (165 mMol) H-LeU-N₂H₂-Z,HCl und 23 ml (165 mMol) Triäthylamin in 185 ml Acetonitril, rührt das bald erstarrende Reaktionsgemisch über Nacht bei Zimmertemperatur, kühlt auf -10 ab und rührt noch 2 Stunden bei -10°. Hierauf nutscht man die kristalline Fällung ab und wäscht das Dipeptidderivat einmal mit kaltem Acetonitril, einmal mit Essigester und achtmal mit Wasser bis Chlorid-frei. Das erhaltene Produkt wird bei 40° in Vakuum getrocknet.
.F. 194-196⁰; [a]_D -39° (c = 2 in Dimethylformamid); Rf₁ - 0,45. 90982-9/1 54

8. H-ASn-LeU-N₂H₂-ZjTFA

46,3 S (9²^ mMol) BOC-Asn-Leu-N₂H₂-Z werden in 92,6 ml 90#iger Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei 20° belassen. Darauf wird die Lösung unter Rühren in 975 ml Aether eingetropft und 15 Minuten gerührt. Man dekantiert den Aether von der Fällung, gibt aufs neue 210 ml Aether zu und rührt 1 Stunde bei 35° unter Rückfluss, kühlt auf -10° ab, und filtriert das Produkt nach einigen Stunden ab. Es wird in Vakuum über Aetznatron getrocknet.

F. 175-179°j
Rf^ = 0,46.

9. B0C-Ser-Asn-Leu-N₂H₂-Z

16 g (78 mMol) BOC-Ser-OH werden in 200 ml Acetonitril gelöst, die Lösung gekühlt auf 0° und mit 20 g (78 mMol) Woodward's Reagenz K und 11 ml Triäthylamin versetzt. Nach 1 /2 Stunden Rühren bei 0° wird zu der klaren Lösung 39-·6 g (78 mMol) H-ASn-LeU-N₂H₂-Z,TFA und 11 ml Triäthylamin in 200 ml Dimethylformamid zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wird die Lösung am Hochvakuum bei 50 eingedampft, der ölige Rückstand in 500 ml Essigester aufgenommen, zweimal mit 0,2-n Salzsäure, zweimal mit lO^iger Kochsalzlösung, zweimal mit 10#iger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit lO^iger Kochsalzlösung ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet, und auf 100 ml eingeengt. Nach Zugabe von 20 ml Hexan kristallisiert

909829/15U

das Tripeptidderivat aus. Zweimaliges Kristallisieren aus Essigester-10# Wasser ergibt einheitliches BOC-Ser-Asn-Leu-

F. 149-151°; [α]η° -^l8*5° (c = 2 in Dimethylformamid); Rf-, = 0,33.

10. BOC-Ser-Asn-Leu-lOi

15.3 g (26,7 mMol) BOC-Ser-Asn-Leu-NgHg-Z werden in 456 ml Dimethylformamid in Gegenwart von 2,4 g Pd-Kohle (10$) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Reduktion ist nach 5 Stunden vollendet. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und am Hochvakuum eingeengt. Dreimaliges Verreiben mit Aether liefert ein weisses Pulver.

20
F. 179-I8I⁰; [<x]_D -14° (c = 2 in Dimethylformamid) ;

Rf₆ = 0,73-

11. BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl

8,4 g (l8,7 mMol) B0C-Ser-Asn-Leu-N₂H_ in 49 ml Dimethylformamid werden bei -20° mit 19,1 ml Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran (l,97-n; 37,6 mMol) und 2,53 ml iso-Amylnitrit versetzt. Nach 8 Minuten bei -20° wird eine vorgekühlte Lösung von 8 g (18,7 mMol) H-Ser-Thr-OBz1.1,13TFA und 8,3 ml Triäthylamin in 49 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 3 Tage bei 0° belassen. Dann wird vom ausgeschiedenen

909829/1544

Triäthylamin-Hydrochlorid abfiltriert, das Filtrat im Hochvakuum bei 40° auf 40 ml eingeengt» unter Rühren mit 400 ml Essigester versetzt, und über Nacht bei -10° belassen. Die Fällung wird abgenutscht und zweimal mit Essigester gewaschen. Das noch feuchte Rohprodukt wird mit einer Mischung von 60 ml 0,03-n.Salzsäure und 40 ml Essigester verrührt, und über Nacht bei -10° belassen. Am folgenden Morgen wird von der Fällung abdekantiert, der Rückstand gelöst in Aceton-Wasser, am Wasserstrahlvakuum das Aceton abgedampft, wobei das in Wasser unlösliche Pentapeptidderivat ausfällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet, und aus Dimethylformamid-Essigester kristallisiert. F. 207-208°; [a]p° -19,5° (c = 2 in Dimethylformamid) ; Rf₆ = 0,88.

12. BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OH

10 g (l4,l mMol) BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-CBzl werden in 300 ml Dimethylformamid unter Zusatz von 1,25 g Pd-Kohle (10$) bei Zimmertemperatur und Atmosphärendruck hydriert. Die Reduktion ist nach 2,5 Stunden vollendet. Die Lösung wird über Asbest vom Katalysator abfiltriert und am Hochvakuum eingeengt. Dreimaliges Verreiben des Rückstandes mit Aether liefert ein laut Dünnschichtchromatogramm einheitliches Pentapeptid. F. I4l-l44°; [ct]p° -13° (c = 2 in Dimethylformamid); Rf₆ =0,34.

909829/1544

■13· .H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OH,TFA

8,5 g (I3i7 mMol) BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OH werden in 85 mi 9O#iger Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei 20° belassen. Darauf wird die Lösung auf ca. 25 ml eingeengt, unter Rühren mit 200 ml Aether versetzt und über Nacht bei -10 stehen gelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und aufs neue mit 100 ml Aether während 5 Stunden verrührt, abfiltriert, zweimal mit Aether gewaschen und im Vakuum über Aetznatron getrocknet.

F. 161-168°; [a]_D -11° (c = 2 in Dimethylformamid) ; Rf : 0,09.

14. BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OH

5,3g (13 mMol) BOC-Cys(BzI)-OSU und 7,4 g (lO mMol) H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OH, 1,93TFA werden in 75 ml Dimethylformamid gelöst. Aus einer Lösung von 15O mMol Triäthylamin in 100 ml Dimethylformamid wird unter Rühren 18,1 ml (27,2 mMol) zugetropft, bis das Reaktionsgemisch auf feuchtem Indikatorpapier ein pH von 6,4 zeigt. Die Lösung wird 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt, darauf am Hochvakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird zweimal mit 250 ml Essigester verrührt, anschliessend dreimal-mit einer Mischung von 100 ml Essigester und 20 ml 5/^iger Zitronensäurelösung, abfiltriert und im Vakuum bei 40 getrocknet.
F. 184-185°; [a]p° -13° (c = 2 in Dimethylformamid);

Rf₆ = 0,45.

909829/1544

. - 94 τ

j|£, BOC-Cys(BzI)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(BzI)-VaI-Leu-OH 3,90 g (6 mMol) H-Cys(BzI)-VaI-Leu-OH." 1,15TFA werden in 50 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst, mit 4,48 g (5,5 mMol) BOC-Cys(BzI)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OH versetzt und und bei Raumtemperatur bis zur Lösung gerührt» Sodann kühlt" man die Lösung auf 0° ab, gibt 1,26 g (11 mMol) N-Hydroxysuccinimid und 0,98 ml Triäthylamin in 45 ml Dimethylformamid zu, kühlt weiter auf -22° ab und gibt 1,13 g (5,5 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Dimethylformamid zu. Man rührt 1 Stunde bei -22° und alsdann 3 Tage bei Zimmertemperatur, filtriert von ausgefallenem Dicyclohexylharnstoff ab und dämpft am Hochvakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird zweimal verrührt mit einer Mischung von 200 ml Essigester und 20 ml 5#iger Zitronensäurelösung, anschliessend einmal mit einer Mischung von 200 ml Essigester und 20 ml 5#iger Matriumbicarbonatlösung, das erhaltene Produkt abfiltriert und im Hochvakuum bei 40 getrocknet. F. 218-221°; [a]j:⁰ -28,5° (c = 2 in Dimethylformamid); Rfg = 0,43.

16. BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH 2,5 g (1,9 mMol) BOC-Cys(BzI)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(BzI)-VaI-Leu-OH werden bei -40° in 25O ml trockenem flüssigem Ammoniak suspendiert. Unter Rühren wird, beim Siedepunkt des Ammoniaks, Natrium in solcher Weise zugegeben,dass die Farbe

909829/1544

des Reaktionsgemisches nur hellblau wird. Nach 50 Minuten hat sich das Nonapeptidderivat ganz gelöst. Man rührt noch 10 Minuten unter Beil«aalten Φ-^ Blaufärbung, gibt alsdann 1 g Ammoniumchlorid zu ivid dampft im Hochvakuum (ca. 1 mm) zur Trockne ein. Der Rückstand wird,mit 30 ml ö,l-n.Salzsäure verrührt, die Fällung abfiltriert, sechsmal mit Wasser gewaschen und getrocknet, Ausbeute 1,38 g. Das wässerige
Filtrat wird dreimal mit Essigester extrahiert. Der Essigester-Auszug wird zweimal mit 10#iger und einmal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat
getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das Produkt ist im Dünnschichtchromatogramm einheitlich.

Rf₁- = 0,86; Rf^- = 0,76; Rf„ = 0,8l.
5 ο γ

i7· BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH

234 mg (0,225 mMol) BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH werden in 100 ml entgastem Dimethylformamid gelöst und mit 1 ml einer Triäthylaminlösung in Dimethylformamid versetzt (0,95 ml Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid, also

0,675 mMol). Diese Lösung wird gleichzeitig mit einer Lösung von 69,8 mg (0,248 mMol) Dijodäthan in 100 ml entgastem

Methanol bei Zimmertemperatur zu einer entgasten Mischung von 150 ml Dimethylformamid und 15Ο ml Methanol innerhalb 90 Minuten unter Rühren eingetropft. Man gibt 1 ml Cyclohexan zu und dampft am Hochvakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird zweimal

909829/1544

verrührt mit einer Mischung von 10 ml 2$igem Natriumbicarbonat und 20 ml Chloroform» Das schwach gelb gefärbte Pulver wird im Hochvakuum getrocknet und erweist sich im Dünnschichtchromatogramm als einheitlich.

Rf₅ = 0,82s Rf₆ = 0,75; Rf₇ = 0,78.

\8. BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-SerCtBu)-Ala-TyrCtBu)-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-SerCtBu)-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-GIu(OtBu)-Thr(tBu)-PrO-NH₀

412 rag BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH, 360 mg des unter 59) erhaltenen Tritosylats der Sequenz 10-32, 15 mg N-Methylmorpholin, 50 mg N-Hydroxysuccinimid und 15 ml Dimethylformamid werden unter Stickstoff 2 Stunden bei 45 gerührt. Dann kühlt man auf 0 ab, fügt 8 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt 2 Stunden bei 0° unter Stickstoff, gibt dann weitere 50 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt unter Stickstoff 8 Stunden bei 45°. Dann giesst man in 100 ml peroxydfreien Aether ein, nutscht den Niederschlag ab, wäscht ihn mit Aether und trocknet ihn im Vakuum bei 35°. Das Rohprodukt wird durch Gegenstromverteilung wie unter 60) beschrieben, gereinigt.

90982971544

Beispiel 3 i

N'^-Acetyl-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHg (i^-Acetyl-Thyrocalcitonin).

1,2 g (1,2 mMol) N^a-Acetyl-*C^s-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH werden In 30 ml frisch destilliertem Dimethylformamid .und 123 mg N-Methylmorpholin gelöst. Hierauf kühlt man die

Lösung auf -15°, gibt unter Rühren 15O mg Pivaloylchlorid hin; "■/zu, und hält das Reaktionsgemisch 5 Minuten auf -15°. Dann tropft man eine auf -15° gekühlte Lösung von 2,4 g (0,9 mMol) H-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-Hls-Arg-Phe-Ser- ' ■ Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHg-dlacetat in 50 ml Dimethylformamid, 100 mg N-Methylmorpholln, und Wasser hinzu. (Die TriacosapeptidlÖsung erhält man am besten, indem man das Peptid in dem Gemisch von Dimethylformamid und N-Methylmorpholin unter Stickstoff auf 50° erwärmt und unter Rühren sowie Wasser zutropft, bis das Peptid in Lösung geht). Nach beendeter Zugabe wird über Nacht unter Stickstoff bei 0° belassen und hierauf im Hochvakuum bei 40° Badtemperatur"' auf ein Volumen "von ca. 30 ml eingeengt. Mari gi es st- das-Konzentrat in 500 ml peroxydfreien Aether und saugt den . entstehenden Niederschlag ab. Das so erhaltene rohe - N -Acetyldotriacontapeptid wird zur Reinigung eine Gegenstromverteilung über 100 Stufen im System n-Butanol-Eisessig-Wasser

9 09.829/ 1 5-4

BAD ORK3INAL

(5s1:4) unterworfen. Aus den Verteilungselementen isoliert man beim Einengen reines N -Acetyl-Thyrocalcitonin.

Hf₅₂ =0,55 und Rf₁₀₄ = 0,69.

Das als Ausgangsmaterial verwendete Nonapeptidderivat kann wie folgt hergestellt Werdens

50 ml konzentrierte Salzsäure werden auf -10° gekühlt, hierauf 3*0 g fein gepulvertes BOC--Cys-Ser(tBu) -Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-OH unter Rühren eingetragen, die Luft durch Stickstoff verdrängt^ auf 0° erwärmt und 10 Minuten bei 0 belassen. Dann gibt man 250 ml Eiswasser und 20 ml Eisessig zu und filtriert über eine Säule von Merck-Jonenaustauscher Nr. 1I₅ schwach basisch, Acetatform.' Das Eluat wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Wasser gelöst und lyophilisiert. Das Lyophilisat löst man in 30 ml Wasser, stellt das pH der Lösung durch Zugabe von Pyridin auf 6,8 und versetzt mit dem dreifachen Volumen Dimethylformamid. Hierauf fügt man eine Lösung von βΟΟ mg p-Nitrophenylacetat in 5 ml Dimethylformamid zu und lässt 5 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Dann dampft man bei 35 Badtemperatur und 0,01 mm Hg zur Trockne ein und gibt 100 ml l#ige Lösung von Pyridin in Aether zu. Man zerreibt das ausgefallene Nonpaptidderivat gut, nutseht es ab, wäscht es mit Aether nach und trocknet es im Vakuumexsikkator über

909829/1544

konz. Schwefelsäure. Zur Reinigung wird das Produkt in Butanol-Wasser (3:1) gelöst und über eiiio im gleichen Lösungsmittel bereitete Säure (3,8 cm; 95 cm) "Sephadex" LH-20 chromatographiert. Man fän^t Fraktionen ä 10 ml auf, kontrolliert ihre Reinheit dünnschichtchromatographisch auf Silicagelplatten (System 121A), vereinigt die reinen Fraktionen dampft zur Trockne ein und trocknet bei 35° Badtemperatur und 0,01 mm Hg.

Das als Ausgangsmaterial verwendete H-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-GIy-Met-GIy-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHp-diacetat wird wie folgt bereitet: 3,4 g DPC-SeritBuJ-Ala-TyrftBuJ-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-SerCtBu)-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-GIu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NHp werden in 60 ml 80#iger Essigsäure gelöst und die Lösung wird 6 Stunden bei 35 stehen gelassen. Hierauf dampft man sie zur Trockne ein, zerreibt den Rückstand mit peroxydfreiem Aether, nutscht das erhaltene Pulver ab, trocknet es und löst es in 50 ml 95$iger Trifluoressigsäure. Man lässt 1,5 Stunden unter Stickstoff bei 25° stehen, dampft dann auf ein Volumen von ca. 5 ml ein und giesst in 300 ml peroxydfreien Aether ein. Man nutscht den Niederschlag ab, wäscht ihn mit Aether und trocknet über Natriumhydroxyd im Exsikkator. Hierauf löst man in 1Obiger Essigsäure und filtriert über eine Säule von Merck-Ionenaustauscher

909829/1544

SAOOBiGiNAL

- loo - ' 18CJ6135

Nr. II (schwach basisch, Acetatform). Man wäscht die Säule solange mit lO^iger Essigsäure nach₃ bis das Eluat im W bei 280 mfj, keine Absorbtion mehr zeigt, dampft das Eluat zur Trockne ein, löst den Rückstand in Wasser und lyophilisiert.

Beispiel 4

k H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met(θ)-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHp (Thyrocalcitoninsulfoxid).

25 mg Thyrocaleitonin werden in 5 ml 0,05-n. Essigsäure gelöst. Dazu gibt man 0,5 ml 5$ige wässerige Wasserstoffsuperoxidlösung und lässt 90 Minuten bei Zimmertemperatur stehen. Dann setzt man eine Spur Platinmohr zu und rührt, bis die Sauerstoffentwicklung aufhört. Man zentrifugiert das Platin ab und lyophilisiert die überstehende Lösung. Das so erhaltene Thyrocalcitonin-Sulfoxid weist bei der Dünnschichtchromatographie auf Aluminiumoxid Rfp-o ~ 0*51 und Rf₁Qh ~ 0,48 auf. Bei der Elektrophorese auf Celluloseacetat (pH = I*9; 90 Minuten; 9 Volt/cm) wandert es 1,5 cm gegen die Kathode, auf Avicel-cellulose 2,9 cm.

909829/1544

am

Beispiel 5 ι ' . " ■

N^Acetyi-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-'Ala-Tyr- .· Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-Hls-Arg-Phe-Ser-Gly-MetioO-Gly- ^: : Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH₂ (N^a-Acetyl-Thyrocalcitoninsulf-,' oxid)). '

Man löst 15 mg Thyrocalcitonlnsulfoxid in 10 ml- Wasser und stellt das pH durch Zugabe von Pyridin auf 6,5. Zur Lösung gibt man 4 ml einer frisch hergestellten 0,5 #igen Lösung von p-Nitrophenylacetat in Dimethylformamid-Wasser (l : 3) und lässt während 3 Stunden bei 45° stehen. Dann fügt man 1,2 ml 5-n. Essigsäure zu und extrahiert das gebildete p— Nitrophenol und das überschüssige p-Nitrophenylacetat mit Essigester. Die wässrige Phase wird zur Trockne eingeengt, in 3 ml Wasser gelöst und lyophilisiert. Das so erhaltene Rohprodukt wird in einer Craig-Verteilung im System n-Butanol-

*■■&
Eisessig-Wasser (5*1ι4·/ VoL) mit Phasenvolumina von je y.iml' ■

über I8l Stufen verteilt. Aus den Verteilungselementen Nr. 108 - 127 W_max - 117; K - 1,82) isoliert man beim Ein- "^:

.engen zur Trockne insgesamt 11,5 mg reines N^a-Acetyl-Thyro- "·.

calcitoninsulfoxid. Die Substanz weist im Dünnachichtchromatogramm auf Aluminiumoxid ("Camag") folgende Rf-Werte auf ι .· · Rfc₂ ■ 0,51 und Rf₁₀^ ⁰^* ,' . · · Auf Cellulose-Dünnschlchtplatten '("'-ÄYlcel.'")« ^54» Ο,βΐ*

. ' 90982 9/15UU

BAD

- 102 - · · ■ "M

Sie' 1st, im Gegensatz zu Thyroaaleitonlnsulfoxid, Nlnhydrinnegatlv« - .

Bei der Elektrophorese auf Celluloseacetat »Streifen ("Cellogel".) wandert sie (bei pH 1,9 und 9 Volt/cm)in 90 Minuten} 0,5 ®ro zur Kathode« ' ' . ' · . · ·''.··■ . .' ·■·'·.. .·

. · · ' . Beispiel 6s. ·· '■ '

j—— — —)■ .

N »Phenylthiocarbamoyl-H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-VaI-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-HIs-Ärg-Phe- · " ' '

. ■■Ser-01y-Met(0)-Gly-Phe-01y-Pro-Glu-aSir-Pro-NH₂ (N^a-Phenyl«r.

. thiocarbamyl-Thyrocalcitoninsulfoxld)»

' 10 -rag ThyrocalcitonlnsuKoxidi'weidaa'Jin' 2-raL Pyridin-Waiäsei)* (lsi) gelöst und mit 15 ml Phenyllsothiocyanat unter Stickstoff 1 1/2 Stunden bei 20° reagieren gelassen. Man=extrahiert .

ι _φ

das Gemisch 4 mal.mit 3 rol Benzol und bringt die wässrig©·. Lösung im Vakuumexslccator zur Trockene« Man'löst den Rück-■ stand in je 3 ml Unter-.und Oberphase des Systems n-Butanol-■ Eisessig-Wasser (5ί1ί4) und reinigt ihn durch multiplikati» ' ve Verteilung .in dem genannten System (Je 3 Wl Ober- und .Unterphase) über 177 Stufen. Fraktionen zu Jo 10 Elementen werden vereinigt, eingeengt und lyophillslert. Man er« hält β mg reines N^a~Phenylthiocarbamyl-Thyrocaloitoninsulfoxid das mit Chlor-Tolidin-Reagens, Barton's Reagens und

• I

. ' "■ . 909 82 9/ 154A.'

Pauly's. Reagens positiv, mit Ninhydron negativ reagiert. Inder Elektrophorese auf kristalliner Cellulose ("Avicel") zeigt das Produkt bei pH 1,9 eine kautodische Wanderstrecke von 2,7 cm (Ausgangsprodi^'; j>, f> am); Rf-Wert-auf Alox im System n-Butanol-Eisessig-Wasser- (75ί7/5·*2ΐ) 0,55 (Ausgangsmaterial. (0,45), auf Cellulose im gleichen System 0,29 (Ausgangsmaterial 0,20) « Spezifische Aktivität: ¹IO MRC-Einheiten/mg.

Beispiel 7;

N -Pyroglutamyl-Cys-Ser-

Acn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met(0)-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHp(N^-Pyrogiutamyl-Thyvocalcitononsulfoxyd).

Man löst 15 mg Thyrocalcitoninsulfoxid in 1 ml Dimethylformamid, 1 ml 0, Ij&igera Triäthylamin in Dimethylformamid (pH 6,7) und 0,3 rnl Wasser, fügt 0,2 ml l#igen Pyroglutamyl-2,4,5-trichlorphenylester.hinzu und lässt 72 Stunden bei 20 stehen. Dann gibt man wonig Wasser hinzu.» dampft unter vermindertem Druck ein und lyophilisiert. Der Rückstand wird einer multiplikativeri Verteilung im System n-ßutariol-Eisessig-Wasser (4:1:5; obere und untere Phase je jj ml) über 397 Stufen unterworfen. N -Pyroglutamyl-Thyrocalci-iüninsulfoxid befindet sich in den Stufen 270-345 Ofaxiniuni in Element 3-1-0) · Biese Fraktionen werden vereinigt, die Lösung «ingeongt und lyophillsiert.

909829/15AA

8AOOR>G»1AL

Das erhaltene Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm die folgenden Rf-Werte bezogen auf Thyrocalcitoninsulfoxid = 1,0 auf:

aus Aluminiumoxid (Alox) : ^Rfcp ^{= 1}^^{0 : Rf}io4 ^{= 1>0} * auf Cellulose : Rf_{n ΑΊ} = 1,05 : Rf₁.,. = 1,01.

In der Elektrophorese wandert es bezogen auf Thyrocalcitoninsulfoxid = 1,0 gegen die Kathode: auf Cellogel, pH 1,9, l40 Volt: 0,39, auf Cellulose Selecta, pH 1,9, l40 Volt: 0,8l.

Beispiel 8

H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro- Glu-Thr-Pro-0H

25 mg BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His~Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro- OtBu werden in 2 ml 95$iger Trifluoressigsäure 1 Stunde bei Zimmertemperatur belassen. Anschliessend giesst man den Ansatz in 20 ml tiefgekühlten, peroxidfreien Aether, filtriert und wäscht mit etwas Aether und lässt die Lösung des Filträtionsrückstandes in wenig Wasser über eine kleine Säule Amberlite CG-45 in Acetatform laufen. Das Eluat wird mittels einer

909829/15U

BAD

UV-Zelle verfolgt und die Fraktionen mit der Substanz werden lyophilisiert.

Dünnschichtchromatogramm an Aluminiumoxid; Rf₄₅ = 0,36, Rf₅₂ = 0,39, Rf₇₉ = 0,42 .

Elektrophorese: Auf Selektaplatten (pH =1,9, 1,5 Stunden 280 V) Wanderungsstrecke gegen die Kathode 6,3 cm

Auf Cellogel (pH = 1,9, 1,5 Stunden 280 V) Wanderungsstrecke gegen die Kathode: 4,3 cm.

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:

1. Z-Thr(tBu)-Pro-OtBu

6,3 g Z-Thr(tBu)-OH und 2,34 ml N-Methylmorpholin werden in 100 ml Tetrahydrofuran gelöst und bei -17° mit 3,0 ml Chlorameisensäure-isobutylester versetzt und nach 20 Minuten Rühren bei derselben Temperatur mit 6,7 g H-Pro-OtBu in 100 ml Tetrahydrofuran umgesetzt. Nach Stehenlassen bei Zimmertemperatur über Nacht wird filtriert und das am Vakuum zur Trockne verdampfte Filtrat in Essigester mehrmals mit verdünnter wässeriger Zitronensäurelösung, verdünnter wässeriger Sodalösung und gesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Die erhaltene ölige Verbindung gibt im Dünn-

schichtchromatogramm an Silicagel: Rf η™ = 0*89, Rflic = 0*75.» Rf₅₂ = 0,6^ [α]β° =' -44° + 1° (c = 1,0 in Aethanol).

909829/1544

2. H-Thr(tBu)-Pro-OtBu,HCl

2,7 g Z-Thr(tBu)-Pro-OtBu werden in 200 ml Methanol unter Zusatz von 2,9 ml wässeriger 2-n.Salzsäure und 500 mg Palladiumauf-Kohle Katalysator (l0$ig) mit Wasserstoff in der Schüttelente bei Atmosphärendruck und Raumtemperatur deearbobenzoxyliert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnähme, Filtration und Eindampfen zur Trockne wird das Produkt aus Hexan kristallisiert. F. 142-145° (Zersetzung).

Dünnschi cn tchromatogramm an Silicagel; ^Rfj.-z_C = 0,45, ^R^iic = ®>Ί®> Rf ₂ = 0,55; [α]ρ° = 66° + 0,5° [2,2$ in Aethanol]

3. Z-GIu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu

7,79 g H-Thr(tBu)-Pro-0tBu,HCl und 9,79 g Z-GIu(OtBu)-ONP werden zusammen in 15 ml Dimethylformamid gelöst ,mit 3,2 ml Triäthylamin versetzt und über Nacht bei 27-30 gerührt. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Essigester und Chloroform aufgenommen und mit Zitronensäure, Sodalösung und Kochsalzlösung wie bei 1. ausgeschüttelt und das erhaltene Rohprodukt an Gilicagel chromatographiert. Die Substanz lässt sich mit Hexan/Aether 1:1 und Aether eluieren und kristallisiert anschliessend aus Aether/Hexan.
F. 135-137°.
Dünnschichtchromatogramm an Silicagel: Rf_CHC1 MeOH

= 0,53, Rf₀Hc₁ __Aceton 1:1 ⁼ °'⁷²> ^Rf4₅ ⁼ °'^ [a]p° = -44° + 0,5° (c - 2 in Aethanol)

909829/1544

8AD OR)QfNAL

fii ρ:|!Ρ| »rim

4. H-GIu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu

777 mg der unter 3 beschriebenen Verbindung werden in 250 ml Methanol mit 300 mg 10#igem Palladiumkatalysator auf Kohle hydriert. Man erhält ein dickes OeI, das ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe eingesetzt wird.

Dünnschi chtchromatogramm an Silicagel: Rf™» mpOH fo-Ή 0,48, Rf_43A = 0,50 .

5. Z-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)~Thr(tBu)-Pro-OtBu 667 mg Z-Gly-Phe-Gly-Pro-OH werden mit den unter 4. erhaltenen 608 mg H-GIu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro(OtBu) in 20 ml Acetonitril gelöst und unter Zusatz von 222 mg N-Hydroxysuccinimid mit 269 mg Dicyclohexylcarbodiimid l6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man filtriert vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff ab, dampft im Vakuum ein, löst den Rückstand in viel Essigester und schüttelt die Lösung wie bei 1. beschrieben aus. Nach dem Trocknen und Eindampfen am Vakuum wird das Rohprodukt durch Säulenchromatographie an Silicagel gereinigt. Es lässt sich mit Essigester und Essigester/Aethanol (4:1) eluieren. Anschliessend wird aus Aether umgefällt.

F. 96-99°.

Dünnschichtchromatogramm an Silicagel: Rfr-urn MeOH (9'·ΐ) = 0,40, Rf_102A = 0,75, Rf₅₂ = 0,80.

909829/1544

6. H-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu

858 mg Z-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu werden in 150 ml Methanol in Gegenwart von 200 mg Palladiumkatalysator (l0$ Pd auf Kohle) hydriert. Das Produkt, das man nach Verreiben mit Aether-Hexan (l:l) als amorphes Pulver erhält, zeigt im Dünnschichtchromatogramm an. Silicagel folgende Werte:

UnUl-j-MeUn. IUdHi i)d

7. DPC-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-GIu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu ·

4"10 mg DPC-Met-OH werden mit 750 mg H-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu in 15 ml Acetonitril unter Stickstoff und unter Zusatz von I52 mg N-Hydroxysuccinimid mit 271 mg Dicyclohexylcarbodiimid 19 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffes wird das Filtrat im Vakuum eingedampft, der Rückstand in viel Essigester aufgenommen und wie bei 1. ausgeschüttelt und eingedampft. Das Rohprodukt wird durch Säulechromatographie an Silicagel gereinigt. Es lässt sich mit Essigester/Aethanol (4:1) eluieren.

Dünnschichtchromatogramm an Silicagel: Rfpurn μ au (9^1) = 0,42, Rf_102E = 0,39, Rf₅₃ = 0,29.

909829/15U

8. H-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu 190 mg der unter 7«erhaltenen DPC-Verbindung werden in 3 nil Methylenchlorid unter Stickstoff gelöst und mit 2,9 ^l des Gemisches Monoehloressigsäure/Wasser (3:1) versetzt. Nach 12 Minuten Reaktion bei Zimmertemperatur giesst man den Ansatz in 20 ml eiskalte 2-n.Sodalösung in Wasser und extrahiert diese mit drei Portionen ä 30 ml n-Butanol/Essigester (l:l). Nach Neutralwaschen mit gesättigter wässeriger Kochsalzlösung wird getrocknet und eingedampft und der Rückstand mit Aether mehrmals extrahiert. Dieser Extraktionsrückstand, ein amorphes Pulver, hat folgende Rf-Werte im Dünnschiehtchromatogramm an Silicagel: Rfhv_C = 0,31, Rf^₂ = 0,30, Rf₁₀₀ =0,27.

9. BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-VaI-Leu-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg~ Phe-Ser(tBu)-GIy-Met-GIy-Phe-GIy-Fro-GIu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu

55 mg BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Ser (tBu) -Ala-Tyr (tBu) -Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-.His-Arg-Phe-Ser(tBu)-GIy-OH-ditosylat wird mit 8l mg H-Met-Gly-Phe-

Gly-Pro-GIu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu in 0,2 ml Dimethylformamid unter Einleiten von Stickstoff nach Zugabe von 9 mg N-Hydroxy-•succinimid bei 40 gerührt. Nachdem sich alles gelöst hat

■ 909829/1544

gibt man 7*3 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml Dimethylformamid zu und rührt 22 Stunden bei 40°. Nach dem Erkalten fällt man das Produkt mit 8 ml peroxydfreiem Aether und zentrifugiert ab. Das Rohprodukt wird im System Methanol/ Puffer/Chloroform/Tetrachlorkohlenstoff (10:3:6:5) über 100 Stufen multiplikativ verteilt (K = 0,4). (Puffer wie in Beispiel 1, unter 18). Die das Produkt enthaltenden Röhrchen werden zusammengegossen, eingedampft und am Hochvakuum bei 40 das Ammoniumacetat abgetrieben.

^Rf52A ⁼ °'²ⁱ*' ^Rfi00 ⁼ °>²5' ^Rfno ⁼ °'^ ^{auf Silica}S^elP^lafcten· Beispiel 9

Man stellt eine 5 ml Trockenampulle her, aus synthetischem Thyrocalcitonin, 0,5 mg

lyophilisiert

Mannit 20 mg.

Zwecks subcutaner Injektion wird der Inhalt in 0,1-m. Acetatpuffer vom pH 4,6 aufgelöst.

Der Ampulleninhalt wird beispielsweise 1 Mal pro Tag angewendet.

909829/15U

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Dotriacontapeptid der Formel I

   ( 1

   H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-A sn-Leu-A sn-A sn-Phe-Hi s-Arg-Phe-Ser-GIy-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-OH

   oder entsprechende Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginreste durch den Asparaginsäurerest und/oder der Glutaminsäurerest durch den Glutaminrest und/oder der Methioninrest durch den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin- oder Norleucinrest ersetzt sind, oder ihre Säureadditionssalze, Derivate oder Komplexe nach an sich bekannten Methoden herstellt.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verbindungen der Formel I dadurch herstellt, dass man

   1. aus Verbindungen der Formel I oder den genannten Analogen oder Derivaten dieser Verbindungen, worin mindestens die a-Aminogruppe und die terminale und Seitenketten-Carboxylgruppen geschützt sind, die Schutzgruppen abspaltet oder

   2. Verbindungen der Formel II

   909829/15A4

   H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-OH ^

   oder die genannten Analogen oder Derivate zu Disulfiden oxydiert oder

   3. Verbindungen der Formel II oder die genannten Analogen oder Derivate, worin die Mercaptogruppen durch die Tritylgruppe geschützt sind, direkt zu Disulfiden oxydiert oder

   4. Verbindungen der Formel III oder IV

   CH

   R-CH-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-OH R-CH-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-A III IV

   7
   worin A 1 bis 21 der auf Cystein¹ folgenden Aminosäurereste und R Wasserstoff oder eine acylierte Aminogruppe darstellt, mit der restlichen C-terminalen Sequenz des Peptids nach in der Peptidsynthese bekannten Methoden kondensiert mit der Massgabe, dass die Azidmethode, die Anhydridmethode oder ■die Methode der aktivierten Ester angewendet werden, wenn die C-terminale Sequenz eine freie Carboxylgruppe aufweist, und wenn erwünscht, die a-Acylgruppe abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Säureadditionssalze, Derivate oder Komplexe überführt.

   909829/1544

   3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man von dem terminalen Amid der geschützten Verbindung der Formel I ausgeht.

   4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-J>, dadurch gekennzeichnet, dass man von Verbindungen ausgeht, in welchen gegebenenfalls vorhandene Carboxylgruppen durch die tert.-Buty!estergruppe geschützt sind.

   5· Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man von Verbindungen ausgeht, in welchen die a-Aminogruppe durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe geschützt ist.

   6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass man von Verbindungen ausgeht, in welchen die Hydroxylgruppen in den Seitenketten durch die tert.-Butyläthergruppe geschützt sind.

   7. Verfahren nach den Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass man aus

   BOC-—Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-

   Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH₂ ,
   worin die a-Aminogruppe durch die tert. Butyloxycarbonylgrupp'e,

   909829/1544

   die 7-Carboxylgruppe durch die tert.· Butylestergruppe und, wenn erwünscht, die Hydroxylgruppen der Seitenketten durch tert. Butyläthergpuppen geschützt sind, die Schutzgruppen durch saure Hydrolyse abspaltet.

   8» Verfahren zur Herstellung neuer Peptide wie in den schematischen Darstellung gezeigt· oder in den Beispielen beschrieben.

   9. Peptide der Formel I

   H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn~Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly~Met-Gly-Phe- Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-OH

   ■^; I

   und entsprechende Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginreste durch den Asparaginsäurerest und/oder der Glutaminsäurerest durch den Glutaminrest und/oder der Methioninrest durch den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin- oder Norleucinrest ersetzt sind, ihre Säureadditionssalze, Derivate und Komplexe mit Ausnahme der in den Ansprüchen und 15 genannten Peptide.

   10. Das synthetische Dotriacontapeptidamid der Formel

   H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe- Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH₂

   11. Säureadditionssalze des Dotriacontapeptidamids

   der Formel ' 909829/1544

   I I

   H-Cys-Ser-Asn-L'eu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH₂ .

   12. Komplexe des Dotriaeontapeptidamids der Formel

   H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-yal-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe- Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHg.

   13. Das Dotriacontapeptid der EOrmel

   H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-yal-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-OH
   und seine Säureadditionssalze und Komplexe.

   ί S

   14. N -Acetyl-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-

   Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH₂ und dessen Met²⁵-sulfoxid und ihre Säureadditionssalze und Komplexe.

   15· Das synthetische H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly- Met(0)-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH₂ und seine Säureadditionssalze und Komplexe.

   909829/1544

   l6. N -Acyl-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-

   25 Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NEL und dessen Met -sulfoxid und Ihre Säureadditionssalze und Komplexe.

   17. N^Phenylthiocarbamoyl-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHg und dessen Met²⁵-sulfoxid und ihre Sä'ureadditionssalze und Komplexe.

   18. ^-Pyroglutamyl-Cys-Ser-Asii-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser» Gly™Met»Gly~Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH₂ und dessen Met sulfoxid und ihre Säureadditionssalae und Komplexe.

   19. Komplexe von Peptiden gemäss den Ansprüchen 9-I8 mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat -und/oder Zinkhydroxyd.

   20. Komplexe von Peptiden gemäss den Ansprüchen 9-I8 mit Gelatine, Polyphoretinphosphat oder Polyglutarnlnsäure.

   21. Die in den Beispielen beschriebenen Peptide.

   22. Pharmazeutische Präparate enthaltend Verbindungen gemäss den Ansprüchen 9-21.

   909829/1544

   SAO ORtQINAt

   ι 1

   23. H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH und seine Derivate, in welchen die Amino- und/oder Carboxylgruppe und/oder Hydroxylgruppen, geschützt sind.

   24. BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-A sn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-VaI-Leu-OH.

   25. BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-VaI-Leu-OH. . ·

   26. BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH.

   27. BOC-Cys(TRI)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(TRI)-VaI-Leu-OH.

   28. H-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHg und seine Derivate, in welchen die Carboxylgruppe und/oder die Hydroxylgruppen geschützt sind.

   29. Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass man das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Dotriacontapeptid oder Dotriacontapeptidamid durch Kondensation des geschützten N-terminalen Nonapeptids und des C-terminalen Tricosapeptids oder eines Derivates davon herstellt.

   90 9 82 9/ 1