DE1794156A1

DE1794156A1 - Verfahren zur Aufloesung unloeslichen Kollagens

Info

Publication number: DE1794156A1
Application number: DE19681794156
Authority: DE
Inventors: Tadahiko Fujii
Original assignee: Nihon Hikaku KK
Current assignee: Nihon Hikaku KK
Priority date: 1967-09-16
Filing date: 1968-09-16
Publication date: 1971-10-07
Also published as: DE1794156B2; GB1192314A; JPS4615033B1; US3637642A

Description

1794156 Patentanwalt DipL-Phys. Gerhard Lied! 8 München 22 Steinsdorfstr. 21-22 Tel. 29 84

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Nihon Hikaku Kabushiki Kaisha 1-1, Senjumidori-cho, Adaehi-ku, T oky o/JAPAN

Verfahren zur Auflösung unlöslichen Kollage ns -

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auflösung von unlöslichem KoI · lagen« Dabei soll im Sinne der vorliegenden Beschreibung sowie der Patentansprüche unter unlöslichem Kollagen ein Kollagen verstanden werden, das üblicherweise nicht in einer wässrigen alkalischen Lösung oder in einer anorganischen Salzlösung aufgelöst werden kann,

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Es siRd bereits viele Verfahren für die Auflösung unlöslichen Kollagens in wässrigen Lösungen vorgeschlagen worden, in denen das Kollagen in den nionömolekularen Zustand überführt wird. Die bekannten Verfahren befassen sich mit solchen Methoden für die Behandlung unlöslichen KoI-lagens_? bei denen eine wässrige Säurelösung mit verschiedenen Enzymen benutzt wird, um die Kollagenlösung zu erhalten. Im einzelnen befassen sich die USA-Patentschriften 3 034 852 und 3 121 049 mit dem Gebrauch von eiweißlösenden (proteolytischen) Enzymen, die aus den Eingeweiden von Tieren gewonnen werden; die britische Patentschrift 1 090 967 befaßt sich mit dem Gebrauch von Enzymen, die aus Aspergillen gewonnen werden und gemäß der britischen Patentschrift 1 119 342 wird ein Enzym benutzt, dessen Basis das Penicillin ist. Weiterhin ist durch die USA-Patentschrift 3 314 861 ein Verfahren zur Auflösung unlöslichen Kollagens bekannt, bei dem die Behandlung mit einem Enzym erfolgt, dessen optimaler pH-Wert für Milchkasein zwischen 2 und 10 liegt, wobei ein kationischer, oberflächenaktiver Stoff oder ein wasserlösliches Salz eines zweiwertigen Metalls vorhanden ist.

Bei den Kollagen/wird entsprechend ihrer Löslichkeit eine Einteilung in drei Gruppen vorgenommen:

1, In neutralen Salzen lösliche Kollageiie> die in einer wässrigen Lösung neutraler Salze, wie z.B. einer wässrigen Lösung von 0, 5 M Natriumchlorid aufgelöst werden können;

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2. säure lösliche'Kollägene, die in einer Säureiösung, wie bsvspielsiweise einer Zitratpufferlösusng" (Zitronensäure + Nafriuniziirat) und verdünnter Essigsäurelösung aufgelöst werden könneifuna

3 unlösliche Kollagene, die in solchen Lösungen nicht aufgelöst werden können.

Ein Koliagenmolekiii ist aus drei PoLypeptidketten aufgebaut, Diese Ket^n aus in neutralem Salz löslichem Kollagen weisen im wesentlichen keine φ

Querverbindungen auf, Mit der Zeit, cLli, bei weiterem biologiscnem Beifen von löslichem Kollagen entstehen zwischen zwei oder drei diese? Kelten intramolekulare und kovalente Querverbindungen, wie im Falle des säurelöslichem Kollagens. Die Moleküle dieses löslichen Koilageiis haben spezielle Teile, sogenannte Teiopeptide, an den Enden der Moleküle, Die Struktur der Teiopeptide unterscheidet sich deutlich von der des Bestes der Pülypeptidketten. Die Teiopeptide werden durch Enzyme verhältnismäßig leicht angegriffen. Dagegen bleibt das Mittelstück der Polypeplidketten unversehrt. Bei dem unlöslichen Kollagen sind noch weitere Querverbindungen aufgebaut. Im Falle von Kalbfell bauen sich zwei oder mehr Querverbindungen auf _} die auch Macromoleküle intermolekular und kova-Ient im Bereich der Teiopeptide verbinden. Hierdurch wird das zunächst lösliche Kollagen, das nur intramolekulare Querverbindungen aufweist, unlöslich Bei weiterem biologischem Altern, d*h. wenn das Kalbsfell zu

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BAD ORIGINAL

einer Stierhaut wird, bauen sich weitere Querverbindungen auf, und zwar sowohl intra- als auch inter-molekulare Querverbindungen, Die Telopeptidteile des unlöslichen Kollagens werden durch ein eiweißlösendes, d.h, proteolytisches, Enzym angegriffen und hierdurch ist es möglich, die Auflösung von unlöslichem Kollagen durchzuführen. Die Zerstörung der Telopeptidbereiche des unlöslichen Kollagens einer Stierhaut durch die Enzyme geht jedoch sehr langsam voran, wenn man sie mit den entsprechenden Vorgängen bei der Zersetzung eines Kalbfelles vergleicht. Dies beruht auf den zugfc sätzlichen Querverbindungen.

N. T, Crosby und G, Stainsby berichteten in der Zeitschrift '!Research" Ij) p,p, 427 (1962), daß das unlösliche Kollagen des Kalbfelles teilweise durch eine Behandlung mit einer 5%igen wässrigen Natriumhydroxydlösung, die mit Natriumsulfat gesättigt ist, bei einer Temperatur von 20 C innerhalb von 5 Tagen gelingt. K. Kühn, E. Zimmer, P. WaykileundP. Fietzek haben ebenfalls in der Zeitschrift "Physiol. Chem." 333, 209 (1963) berichtet, daß mit dem gleichen Verfahren das unlösliche Kollagen des Kalbfelles

völlig aufgelöst wird,

Wenn das oben beschriebene Verfahren auf das unlösliche Kollagen einer Stierhaut, d,h_; auf das Fell eines erwachsenen Tieres, angewendet wird, ist die Ausbeute an gelöstem Kollagen sehr gering. Dies beruht auf der im Vergleich zum Kalbfell übermäßig großen Anzahl von Querverbindungen.

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Die Erfindung zeigt nun einen Weg, wie auch unlösliche Kollagene, die eine große Zahl von Querverbindungen aufweisen, in verhältnismäßig geringer Zeit aufgelöst werden können. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die unlöslichen Kollagenfasern in einer wässrigen Lösung von Alkali-Metall-Hydroxyd, Alkali-Metall-Sulfat und einer geringen Menge primärer oder sekundärer verzweigter, unverzweigter oder cyclischer Amine mit 0 bis 5 Kohlenstoffatomen eingeweicht werden, daß der Faserbrei entsalzt und daß die Kollagenfasern mit einer Säurelösung, deren

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pH-Wert kleiner als 4 ist, behandelt werden.

Es hat sich nämlich herausgestellt, daß das unlösliche Kollagen ausgewachsener Tiere in seine lösliche Form umgesetzt werden kann, wenn es mit einer wässrigen Lösung von Alkali-Metall-Hydroxyd und Alkali-Metall-Sulfat behandelt wird, die eine kleine Menge einer organischen Base, wie beispielsweise eines Amins, enthält. Die Wirkung des Alkali auf die Telopep tidteüe wird dadurch stark beschleunigt. Wenn anschließend die Behandlung mit einer Säurelösung fortgesetzt wird, wird das Kollagen aufgelöst und man erhält eine Kollagenlösung,

Im allgemeinen schwillt Kollagen in einer wässrigen Ätzalkalilösung an. Das in der Lösung gleichfalls vorhandene Nat riumsulfat verhindert jedoch ein derartiges Anschwellen des Kollagens. Auf diese Weise wird verhindert, daß infolge des Alkalizusatzes die Denaturierungstemperatur des Kollagens

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herabgesetzt wird, Folglich kann das erfindungsgemäße Verfahren bei relativ hohen Temperaturen durchgeführt werden.

Jedes primäre oder sekundäre Amin, das 0 bis 5 Kohlenstoffatome enthält, kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Anwendung finden. Das Amin kann dabei jede Form haben, Es kann unverzweigt, verzweigt oder cyclisch sein. Typische Amine sind: Monomethylamin, Dimethylamin, Hydrazin, Äthylendiamin , Hydroxylamin, Piperidin und Piperazin. Andere brauchbare Amine können von jedem Fachmann ausgewählt werden.

Die Aminkonzentration liegt zwischen 0, 05 und 0, 3 M. Die Konzentration des Alkali-Metall-Hydroxyds, beispielsweise des Natrium- oder Kaliumhydroxyds, liegt zwischen 0,3 und 1, 0 N. Die Konzentration des Alkali-Metall-Sulfats, beispielsweise Natriumsulfat und Kaliumsulfat, liegt zwischen 10 und 20% (Gewicht/Volumen). Die Arbeitstemperatur liegt zwischen 15 und 25 C und die Behandlungszeit schwankt zwischen 5 und 14 Tagen. Im allgemeinen sollte die Behandlungstemperatur herabgesetzt werden, wenn die Konzentration des Natrium sulfat s abgesenkt oder die Konzentration des Alkali erhöht wird.

τ-

Das Amin beschleunigt die Hydrolyse, die durch den Alkali hervorgerufen wird, nur bei den Telopeptiden des Kollagens. Das Reststück des Kollagens wird nicht hydrolysiert und behält seine ursprüngliche Struktur. Damit

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unterscheidet sich das vorliegende Verfahren von den bisher bekannten, wie sie beispielsweise in der USA-Patentschrift 2 184 494 beschrieben werden, wo Kollagen mit einer wässrigen Lösung von Kalziumhydroxyd behandelt wird- die Amine enthält, die denen ähnlich sind, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden, da diese Kombination eine Hydrolyse nicht nur der Telopeptide, sondern auch des Restes der Kollagenfasern hervorruft, wodurch dieses in Teile niedrigeren Molekulargewichtes aufgespalten wird. Demgemäß ist ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung darin zu sehen, daß das Amin nur in der Weise φ

wirkt, daß sichergestellt ist, daß nur die Telopeptidteile und nicht der Rest der unlöslichen Kollagenfasern durch das Alkali angegriffen werden.

Nach der Alkalibehandlung wird der KoUagenfaserbrei mit einer beliebigen Säure, wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Zitronensäure oder Milchsäure neutralisiert. Anschließend wird der Faserbrei sorgfältig mit Wasser gewaschen, um das Salz zu entfernen. Die

Telopeptidteile des so behandelten Kollagens sind aufgelöst, und die Faser m

wesentlich schwillt· an, ohne jedoch ihr Aussehen/zu verändern.

Folglich kann die Kollagenfaser leicht in eine Kollagenlösung umgewandelt werden, ,wenn eine Säurelösung beigegeben wird, Zu den üblicherweise verwendeten Säuren zählen Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Zitronensäure und Milchsäure. Der pH-Wert wird so eingestellt, daß er unter

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4, O liegt. Die Menge der beigefügten Säure wird so eingestellt, daß sich der gewünschte pH-Wert und die gewünschte Konzentration der Kollagenlösung ergeben, Die Konzentration der entstehenden Lösung liegt im allgemeinen bei etwa 8 Gew. -%,

Die Kollagenmoleküle in der gemäß der Erfindung hergestellten Kollagenlösung wurden bezüglich ihrer Eigenviskosität, ihrer Doppelbrechung und ihrer Sedimentation durch Ultrazentrifugalanalyse und optischer Rotation W untersucht und es stellte sich heraus, daß die Kollagenmoleküle in der Lösung monomolekular gelöst sind und ihre ursprüngliche Struktur beibehalten haben« Die Lösung kann durch Auspressen in regenerierte Kollagenartikel, wie Fasern, Filme und Röhren, mittels konventioneller Verfahren umgewandelt werden.

Ein weiteres wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist darin zu sehen, daß die Kollagenfaser, die Kollagenlösung oder die regenerierte nt Kollagenfaser, die gemäß der Erfindung erhalten wird, in Gelatine umgewandelt werden kann, was durch Erhitzen der Kollagenlösung geschieht oder durch Erhitzen der Kollagenfasern in Wasser bei einer Temperatur, die über der Denaturierungstemperatur des Kollagereliegt. Die entstehende Gelatine besitzt einen isoionischen Punkt von etwa 4,9, was der gleiche Wert ist wie derjenige der Gelatine, die durch das Kälkverfahren erzeugt wird und sie unterscheidet sich von der Gelatine, die aus unlöslichem Kollagen mit Hilfe von Enzymen erzeugt wurde nur im Hinblick auf den isoionischen Punkt.

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ORIGINAL INSPECTED

Die auf dem Markt befindlichen Gelatineprodukte werden üblicherweise so hergestellt, daß die enthaarten Rohhäute für eine lange Zeit, beispielsweise für 60 oder 90 Tage, gekalkt werden und daß dann die Gelatine aus der gekalkten Haut in mehreren Extraktionsschritten unter Anwendung von warmem Wasser gewonnen wird. Die Qualität der so erhaltenen Gelatine verringert sich mit jedem Extraktionsschritt. Im Gegensatz dazu weist die Gelatine, die nach dem erfindungsgemaßen Verfahren hergestellt ist, eine hohe Qualität und ein einheitliches Molekulargewicht auf und kann in einem einzigen Extraktionsschritt nach der Alkalivorbehandlung von weniger als 2 Wochen erfolgen.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Beispiel 1

Unlösliche Kollagenfasern wurden aus Häuten folgendermaßen gewonnen:

Die Stierhaut wurde enthaart und mit Wasser gewaschen. Anschließend

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wurde sie gespalten, um Fett und Fleisch zu entfernen. Die verbleibende Zwischenschicht (Corium), die einen größeren Anteil von Kollagen als die anderen Teile aufweist, wurde mit Wasser gewaschen und in einer 10%igen wässrigen Salzlösung eingeweicht. Die Haut wurde anschließend durch einen Fleischwolf gedreht, um einen Brei zu erhalten und dabei gekühlt. Zur Entfernung der in neutralen Salzen löslichen Kollagene und der säurelöslichen Kollagene, die in einem geringen Umfang vorhanden sind, wurde der Brei in einer 10%igen wässrigen Salzlösung eingeweicht, der eine 0,15 M Zitrat-

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pufferlösung zugesetzt war und zwar für die Dauer von 2 Tagen, ■ An- ' schließend wurde der Brei erneut mit Wasser gewaschen. Nach der Einstellung des pH-Wertes des Breies auf 7, 0 unter Verwendung von Natriumhydroxyd wurde der Brei mit Wasser gewaschen und die Fasern wurden unter Verwendung von Äthylalkohol dehydriert. Anschließend wurden die Kollagenfasern mit einer Mischung von Äthylalkohol und Äthyläther im Verhältnis von 1:1 entfettet und getrocknet, um auf diese Weise unlösliche Kollagenfasern zu erhalten.

Die Fasern wurden wie folgt behandelt-;

Kollagenfasern	100 g
NaOH	20 g
Na₂SO₄	160 g
Monomethylamin	6,21g
Volumen der Lösung	1 g
Behandlungstemperatur	20⁰C
Dauer der Behandlung	2 Wochen

Während der Behandlung wurden die Kollagenfasern täglich wenige Male für eine kurze Zeit durchgerührt. Anschließend wurde der Brei unter Zuhilfenahme von Säure, wie beispielsweise Schwefelsäure, Salzsäure, Essigsäure, Zitronensäure oder Milchsäure neutralisiert. Dann wurde

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der Brei gewaschen, um alle Salze daraus zu entfernen. Schließlich würde die Kollagenfaser mit Hilfe einer Säurelösung, beispielsweise einer Essigsäurelösung mit einem pH-Wert, der unter 4 lag, einen Tag lang unter Rühren ausgezogen und der Betrag der Säure wurde so eingeregelt, daß die entstehende. Kollagenlösung eine Konzentration von etwa 8% aufwies. Nach dem Ausziehen wurde die Lösung gefiltert, um eine kleine Menge nicht kollagenen Materials, das in der Lösung verblieben war, zu entfernen. Es stellte sich heraus, daß das Molekulargewicht des Kollagens in der Lösung bei etwa 300 000 lag, Die Länge des Moleküls betrug 2800 AE, der Durchmesser 15 AE und das Molekül hatte die Form eines starren Stabes, der aus drei Polypeptidketten zusammengesetzt war und war monomolekular in dem wässrigen Medium gelöst. Als die Kallagenlösung durch eine Düse in ein Koagulationsbad entsprechend den üblichen Verfahren versponnen wurde, wurde die Faserstruktur des Kollagens restlos wieder hergestellt.

Wenn der neutralisierte und gewaschene Kollagenfaserbrei oder die '

Kollagenlösung oder die regenerierten Kollagenfasern in Wasser eingestreut wurden, das über die Denaturierungstemperatur des Kollagens, beispielsweise auf 50 bis 60 C erhitzt wurde, wurden die drei Polypeptidketten in einzelne Ketten aufgebrochen und bildeten eine Gelatine mit einem einheitlichen Molekulargewicht und einem isoionischen Punkt von etwa pH 4,9.

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ORJGWALINSPECTED

Beispiel 2

Stierknochen wurden 7 Tage lang mit einer 1, 2 N Salzsäurelösung behandelt. Die Säure wurde jeden Tag durch eine frische Lösung ersetzt, um Ossein zu erhalten, das eine große Menge von Kollagen enthielt. Um unlösliches Kollagen zu erhalten, wurde das Ossein zunächst wie in Beispiel 1 behandelt, die Alkalibehandlung wurde jedoch wie folgt vorgenommen:

Kollagenfasern

NaOH

Na₃SO₄

Dimethylamin

Volumen der Lösung

Temperatur

Dauer

Dann wurde der Kollagenfaserbrei neutralisiert, gewaschen und mit Säure ausgezogen, wie in Beispiel 1.

Die entstehende Kollagenlösung hatte die gleichen Eigenschaften wie das Erzeugnis gemäß Beispiel 1 und konnte in regenerierte Fasern und Gelatine umgewandelt werden.

JOO	g
20	g
100	g
4₅	,5 g
1	Liter
15⁽	³C
2	Wochen

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ORIGINAL INSPECTED

Beispiel 3 bis 6

Kollagenfasern wurden entsprechend dem Beispiel 1 behandelt, die Alkalibehandlung wurde jedoch wie folgt durchgeführt:

	Beispiel 3	Beispiel 4	Beispiel 5	Beispiel 6
Verhältnis von Flüssig keit zu Fasern	10	10	10	10
Kollagenfasern (g)	100	100	100	100
NaOH (g)	32	32	28	40
Na₂SO₄ (g)	250	160	160	160
Hydrazin (g) (H₂N-NH₂, H₂O)	15	-	-	—
Äthylendiamin (g)	-	12	-	-
Hydroxylamin- Sulfat (g)	-	-	16,4	-
Piperazin (g)	- "	-	-	4.3
Temperatur (° C)	2.5	20	20	20
Dauer (Wochen)	1	1	1	1

.1 09 8/1 / 1 Λ Γ 5 7

Beispiel 7

Die Verfahren gemäß Beispiel 2 wurden durchgeführt, aber die Bedingungen bei der Alkalibehandlung waren wie folgt:

Verhältnis von Flüssigkeit zu Fasern 10

Kollagenfasern 100 g

NaOH 20 g

Na₉SO 100 g

Piperidin 17 g

Die Eigenschaften der auf diese Weise erhaltenen Kollagenlösungen gemäß Beispiel 3 bis 7 waren dieselben wie die Eigenschaften der Lösungen gemäß Beispiel 1 und 2. Die Kollagene konnten in regenerierte Fasern und in Gelatine umgewandelt werden,

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Claims

Patentansprüche

1, Verfahren zur Auflösung unlöslichen Kollagens, dadurch gekennzeichnet, daß die unlöslichen KoUagenfasern in einer wässrigen Lösung von Alkali-Metall-Hydroxyd, Alkali-Metall-Sulfat und einer geringen Menge primärer oder sekundärer verzweigter, unverzweigter oder cyclischer Amine mit 0 bis 5 Kohlenstoffatomen eingeweicht werden, daß der Faserbrei entsalzt und daß die Kollagenfasern mit einer Säurelösung, deren pH-Wert kleiner als 4 ist, behandelt werden,

2, Verfahren zur Herstellung regenerierter Kollagenartikel, dadurch gekennzeichnet, daß die unlöslichen KoUagenfasern in einer wässrigen Lösung von Alkali-Metall-Hy dr oxy d, Alkali-Metall-Sulfat und einer geringen Menge primärer oder sekundärer verzweigter, unverzweigter oder cyclischer Amine mit 0 bis 5 Kohlenstoffatomen eingeweicht werden, daß der Faserbrei entsalzt und daß die KoUagenfasern mit einer Säurelösung, deren pH-Wert kleiner als 4 ist, behandelt werden und daß die Kollagenlösung in regenerierte Kollagenartikel umgewandelt wird-

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3. Verfahren zur Erzeugung von Gelatine, dadurch gekennzeichnet, daß die unlöslichen Kollagenfasern in einer wässrigen Lösung von Alkali-Metall-Hydroxyd, Alkali-Metall-Sulfat und einer geringen Menge primärer oder sekundärer verzweigter, unverzweigter oder cyclischer Amine mit 0 bis 5 Kohlenstoffatomen eingeweicht werden, daß der Faserbrei entsalzt wird und daß der Faserbrei auf eine Temperatur, die über der Denaturierungstemperatur des Kollagerßliegt, W erhitzt wird.

4.-. Verfahren zur Herstellung von Gelatine, dadurch gekennzeichnet, daß die unlöslichen Kollagenfasern in einer wässrigen Lösung von Alkali-Metall-Hydroxyd, Alkali-Metall-Sulfat und einer geringen Menge primärer oder sekundärer verzweigter, unverzweigter oder cyclischer Amine mit 0 bis 5 Kohlenstoffatomen eingeweicht werden, daß der Faserbrei entsalzt und daß die Kollagenfasern mit einer Säure- m. lösung, deren pH-Wert kleiner als 4 ist, behandelt werden und daß

die Kollagenlösung auf eine Temperatur oberhalb der Denaturierungstemperatur des Kollagerserhitzt wird.

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5. Verfahren zur Herstellung von Gelatine, dadurch gekennzeichnet, daß die unlöslichen Kollagenfasern in einer wässrigen Lösung von Alkali-Metall-Hydroxyd, Alkali-Metall-Sulfat und einer geringen Menge primärer oder sekundärer verzweigter, unverzweigter öder cyclischer Amine mit 0 bis 5 Kohlenstoffatomen eingeweicht werden, daß der Faserbrei entsalzt und daß die Kollagenfasern mit einer Säurelösung, deren pH-Wert kleiner als 4 ist, behandelt werden und daß die KoUagenlösung in regenerierte Fasern umgewandelt wird und daß die Fasern in Wasser bei einer Temperatur oberhalb der Denaturierungstemperatur des Kollagerserhitzt werden.

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