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DE1768841B2 - Kovalent gebundene Konjugate von sauren Polysacchariden und komplexen organischen Stoffen - Google Patents

Kovalent gebundene Konjugate von sauren Polysacchariden und komplexen organischen Stoffen

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DE1768841B2
DE1768841B2 DE1768841A DE1768841A DE1768841B2 DE 1768841 B2 DE1768841 B2 DE 1768841B2 DE 1768841 A DE1768841 A DE 1768841A DE 1768841 A DE1768841 A DE 1768841A DE 1768841 B2 DE1768841 B2 DE 1768841B2
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Michael Alan High Wycombe Cresswell
Joseph George London Feinberg
Patrick James Beaconsfield Mill
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Bayer Corp
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Miles Laboratories Inc
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Description

besteht, wobei das Polysaccharid und die biologisch aktive Substanz durch Amid- und/oder Esterbindungen kovalent miteinander verbunden sind und das Konjugat Säuregruppen besitzt und lösliche Natrium- und unlösliche Calciumsalze bilden kann.
2. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das saure Polysaccharid, vorzugsweise im Überschuß, und die biologisch aktive Substanz in wäßriger Lösung unter Verwendung eines Kupplungsmittels unter Ausbildung von Amidbindungen, Esterbindungen oder einer Kombination von Amid- und Esterverbindungen zwischen den Reaktionsteilnehmern umsetzt und das Konjugat als wasserlösliches Calciumsalz oder als wasserlösliches Natriumsalz isoliert und das letztere gegebenenfalls in das wasserunlösliche Calciumsalz überführt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kupplungsmittel ein wasserlösliches Diimid, sin Mischanhydrid, N-Hydroxy- js piperidin oder ein Azid verwendet
Es ist bekannt, daß biologisch wirksame Substanzen, wie Enzyme mit anderen chemischen Substanzen gekuppelt werden können, ohne daß sie dadurch ihre biologische Wirksamkeit verlieren. So ist in Nature, Bd. 120, Seiten 367 bis 369 (1966) angegeben, daß Enzyme an ein vernetztes Dextrangel gebunden und dadurch unlöslich gemacht werden können. Während es für viele Verfahren, bei denen Enzyme als Katalysatoren eingesetzt werden vorteilhaft ist, diese in unlöslicher Form vorliegen zu haben, ist es für viele andere Fälle günstiger, wenn die Enzyme oder andere biologisch wirksame Substanzen in löslicher Form vorliegen. In diesem Falle ist es jedoch häufig schwierig, diese Substanzen wieder aus dem Reaktionsgemisch abzutrennen und insbesondere diese biologisch wirksamen wertvollen Substanzen so zurückzugewinnen, daß ihre biologische Wirksamkeit erhalten bleibt.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mittel zur Verfügung zu stellen, mit dessen Hilfe es möglich ist, eine biologisch wirksame eiweißhaltige Substanz von der löslichen in die unlösliche Form zu umwandeln, ohne daß die dabei ihre biologische Wirksamkeit einbüßt.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, durch ein immunologisches aktives Säuregruppen enthaltendes Konjugat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es
a) aus einem sauren Polysaccharid aus der Gruppe Pectin, Pectinsäure, Alginsäure, Celluronsäure und Carrageenan und
b) einer biologisch aktiven eiweißhaltigen Substanz aus der Gruppe der Antigene, Allergene, Mikroorganismen, Toxine, Toxoide, Hormone, Enzyme oder Haptene,
besteht, wobei das Polysaccharid und die biologisch ίο aktive Substanz durch Amid- und/oder Esterverbindungen kovalent miteinander verbunden sind und das Konjugat Säuregruppen besitzt und lösliche Natrium- und unlösliche Calciumsalze bilden kann.
Die Bildung der kovalenten Amid- und/oder Esterbildüngen erfolgt im allgemeinen über basische Aminogruppen oder phenolische Hydroxylgruppen der aktiven Komponente an die Säuregruppen des Polysaccharids. Unter »basische Aminogruppe« wird iiu vorliegenden Fall jede — NH-Gruppe verstanden, die mit einer Säure ein Additionssalz bilden kann.
Die verwendeten sauren Polysaccharide bilden wasserlösliche Natriumsalze und wasserunlösliche Calciumsalze und die Konjugatbildung erfolgt in solcher Weise, daß diese Eigenschaften urd die biochemische Aktivität der aktiven Komponente in dem Endprodukt erhalten bleiben.
Pectin ist ein hochmolekularer natürlich vorkommender Stoff, der z. B. aus Äpfeln und Citrusfrüchten isoliert wird und überwiegend aus Galacturonsäuregliedern besteht, deren Carboxylgruppen zum Teil verestert sind. Pectinsäure ist die freie Säure, die durch Verseifen von Pectin erhalten wird. Alginsäure ist ein natürlich vorkommendes hochmolekulares Produkt, das aus Algen isoliert wird und überwiegend aus Mannuronsäu-JS regliedern und gegebenenfalls einigen Glucuronsäuregliedern besteht. Celluronsäure ist ein Polymer von Glucuronsäure ' id Glucose, das durch gesteuerte partielle Oxydation von Cellulose mit Stickstoffdioxid erhalten wird. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird das Oxidationsprodukt in wäßrigem Alkali gelöst, neutralisiert und als Calciumsalz ausgefällt Das Calcium wird dann durch Behandlung mit dem Dinatriumsalz der Äthylendiaminotetraessigsäure und Dialyse gegen Wasser entfernt und dabei das lösliche
Natriumsalz der Celluronsäure zurückgebildet.
Diese sauren Polysaccharide werden entweder in Form der Natriumsalze verwendet, die durch Gefriertrocknen ihrer Lösungen in Vakuum erhalten werden, oder in Form der freien Säuren, die durch wiederholtes
■so Behandeln der getrockneten Natriumsalze mit überschüssiger äthanolischer HCI, Waschen mit Äthanol und Trocknen im Vakuum erhalten werden.
Carrageenan ist ein natürlich vorkommendes Produkt, das aus bestimmten Algen erhalten wird und
V) besteht aus einem sulfaiierten Polymeren von Galactose und Anhydrogalaciose. Geeignetes Material für die Konjugatbildung kann erhalten werden, indem eine Lösung des Carrageenan mit einem Calciumsalz versetzt, das ausgefällte Calciumsalz gesammelt, durch
M) Zugabe von Dinatriumsalz der Äthylendiaminotetraessigsäure gelöst und die Lösung gegen Wasser dialysiert wird. Die erhaltene Lösung wird durch eine mit einem starken Kationenaustauscherharz in der Wasserstoffform gefüllte Säule geschickt und die ausfließende
h', Lösung der freien Säure Carrageenan wird mit genügend Natriumhydroxydlösung behandelt, um die Säuregruppen zur Hälfte zu neutralisieren. Schließlich wird diese Lösung im Vakuum gefriergetrocknet.
Beispiele für aktive Komponenten gemäß der vorliegenden Erfindung sind Extrakte von Allergen- oder Antigenstoffen, Extrakte von Mikroorganismen, Toxine, Toxiode, Hormone und Enzyme. Einzelne Beispiele für Allergene sind Pollenextrakte z.B. von Bäumen und Sumpfholunder, Extrakte von Proteinen von Lebensmitteln, Pilzen, von tierischer Epidermis oder Schuppen, von Insekten und von Haushaltsstaub. Die aktive Komponente kann auch ein kleines Molekül sein, das als solches kein Antigen ist, aber als Teil der großen Konjugatmolekel ein solches wird, z.B. ein Hapten.
Die neuen !Conjugate werden mit Hilfe von Verfahren für die lcovalente Bindung von komplexen organischen Verbindungen, die basische Aminogruppen oder phenolische Hydroxylgruppen enthalten, an Säuren hergestellt und in diesem Zusammenhang ist es wichtig, eine Arbeitsweise zu wählen, bei weicher weder die biochemische Aktivität der Komponenten zerstört noch unerwünschte Gruppen in das Konjugat eingeführt werden Bei diesen Arbeitsweisen wird im allgemeinen ein Kupplungsmittel verwendet
Gemäß einem Verfahren wird ein wasserlösliches Diimid, z. B. das Metho-p-toluolsulfonat von 1-CyclohexyI-3-morpholinyläthyIcarbodiimid als Kupplungsmittel verwendet Bei diesem Verfahren werden das saure Polysaccharid und das Antigen in wäßriger Lösung mit dem genannten Reagens vermischt Das letztere wird in den entsprechenden Harnstoff überführt und die Säuregruppen des Polysaccharide reagieren mit den jo basischen Aminogruppen oder phenolischen Hydroxylgruppen der aktiven Komponente unter Ausbildung von Amidbindungen bzw. Esteriiindun^.-n. Gemäß einem weiteren zweckmäßigen Verfahren w:rd das saure Polysaccharid zunächst mit Äthyi hloroformat in r, Gegenwart von Triäthylamin zu einem Mischanhydrid und dieses dann mit der aktiven Komponente unter Ausbildung von Amid-, oder Esterbindungen zwischen den Komponenten des Konjugats umgesetzt Gemäß einem dritten Verfahren wird das saure Polysaccharid mit N-Hydroxypiperidin in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zu dem N-Hydroxypiperidinester des sauren Polysaccharids umgesetzt Dieser Ester wird dann mit der aktiven Komponente zur Umsetzung gebracht, die an das saure Polysaccharid über Amidbindungen oder gegebenenfalls Esterbindungen unter Freisetzung von N-Hydroxypiperidin gebunden wird. Bei dem vierten Verfahren wird ein partiell verestertes saures Polysaccharid mit Hydrazinhydrat unter Bildung des entsprechenden Hydrazids umgesetzt. w Dieses Hydrazid wird dann mit salpetriger Säure behandelt, um das entsprechende Azid zu erhalten, das dann mit der aktiven Komponente zur Umsetzung gebracht wird, die über Amid- oder Esterbindungen an das saure Polysaccharid gebunden wird. Gemäß einem v, fünften Verfahren wird ein Amin- oder Metallsalz des Polysaccharids zunächst mit einem SOj-N.N'-Dimethylformamidkomplex zu einem Mischanhydrid umgesetzt, das darauf mit der aktiven Komponente unter Ausbildung von Amid- oder Esterbrücken zur Reaktion mi gebracht wird. Alle diese Verfahren zeichnen sich dadurch aus, daß sie in wäßriger Lösung bei relativ niederen Temperaturen durchgeführt werden können. Die Anwendung dieser Verfahren auf die Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate wird weiter unten in μ den Beispielen beschrieben. Es sei aber darauf hingewiesen, daß ebensogut auch andere Kupplungsmittel Anwendung finden können.
Das gewünschte Konjugat wird im allgemeinen als wäßrige Lösung erhalten, unabhängig davon, welches der genannten Verfahren angewendet wird. Aus der wäßrigen Lösung wird das Konjugat vorzugsweise durch Ausfällen des Calciumsalzes isoliert; das Salz wird abfiltriert und gründlich mit Wasser gewaschen, um etwa noch vorhandenes nichtumgesetztes Antigen zu entfernen. Das gewaschene Cakiumsalz wird dann in einer wäßrigen Lösung von Natriumithylendiamijotetraacetat und Natriumcarbonat gelöst und diese Lösung dialysiert Die dialysierte Lösung wird schließlich getrocknet und das Konjugat in Form seines Natriumsalzes erhalten.
Um sicher zu gehen, daß das Konjugat freie Sänregruppen enthält, wird im allgemeinen das saure Polysaccharid im Überschuß eingesetzt, so daß das als Endprodukt erhaltene Konjugat freie Säuregruppen enthält und ein wasserlösliches Natriumsalz und ein unlösliches Calciumsalz bilden kann. Der Anteil des in ein Konjugat eingebrachten Stickstoffs kann mit Hilfe von Methoden der Proteinanalyse, z. B. der Stickstoffbestimmung nach Kjeldahl ermittelt werden.
Die erfindungsgemäßen Konjugate haben sich als brauchbar in Reagenssystemen erwiesen, in denen eine lösliche Form einer biochemisch aktiven Substanz verwendet wird, die in situ ausgefällt werden kann oder wird, wobei das Konjugat seine Aktivität während des ganzen Verfahrens beibehält Es kann aber auch die unlösliche Form des Konjugats hergestellt werden und als solche Anwendung rinden. Ein Beispiel für in situ Ausfällen ist die Verwendung eines löslichen Konjugats eines Enzyms oder einer anderen eiweißartigen Substanz wie Albumin, um Obstsäfte zu klaren und dann das Konjugat durch Zugabe von Calciumionen zu entfernen. Eine andere Anwendungsmöglichkeit ist die Verwendung eines unlöslichen Antigenkonjugats, um eine langsame Antigenabgabe im Gewebe zu bewirken. Eine solche langsame Abgabe im Gewebe wird häufig als auch Depotwirkung bezeichnet Die erfindungsgemäßen Konjugate können auch bei der herstellung von Antisera in Tieren gegenüber Toxinen Anwendung finden, z. B. bei der Schlange Naja Naja (Cobragift).
Im trockenen Zustand weisen die erfindungsgemäßen neuen Konjugate eine gute Lagerbeständigkeit auf.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Alginsäure (10 g, 0,046 Äquivalente) und 1-Cyclohexyl-S-morpholinyläthyl-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (10 g, 0,024 Mol) wurden mit Triäthylamin (3,05 cm3, 0,022 Mol) und dem Natriumsalz von Eialbumin (1 g) in Wasser (200 cm3) sieben Tage lang gerührt. Nach dieser Zeit wurde eine Calciumacetatlösung (10%, 100 cm-1) zugegeben und das ausfällende Gel abfiltriert und 1 h lang mit 11 destilliertem Wasser gewaschen und dann zentrifugiert Dieser Waschvorgang wurde siebenmal wiederholt, wobei einmal 21 Wasser verwendet und über Nacht gerührt wurde. Das schließlich erhaltene gewaschene Gel wurde dann in einer wäßrigen Lösung von Natriumäthylendiaminotetraacetat und Natriumcarbonat gelöst und diese Lösung gegen destilliertes Wasser dialysiert Die dialysierte Lösung wurde gefriergetrocknet und dabei 9 g Produkt erhalten. Das Produkt enthielt 5-6% Protein (Kjeldahl) und eignete sich als langsam abgebende Antigensubstanz zur Untersuchung des Antigen-Antikörperansprechens in Mäusen während einer längeren Zeitspanne.
Beispiel 2
Pectinsäure (10 g, 0,046 Äquivalente) und 1-Cyclo-hexyl-i-morpholinyHthylcarbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (10 g, 0,024 Mol) wurden mit Triäthylamin (3,05 cm3, 0,022 Mol) und dem Natriumsalz von Eialbumin (1 g) in Wasser (200 cm3) sieben Tage lang gerührt Die erhaltene Lösung wurde gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet und 10 g Konjugat erhalten, das 3-4% Eiweiß enthielt Dieses Produkt Heß sich in derselben Weise verwenden, wie das von Beispiel 1.
Beispiel 3
Celluronsiure (3 g, 0,005 Äquivalente), das Natriumsalz von Eialbumin (0,3 g), Triäthylamin (033 cm3,0,0024 Mol) und l-Cydohexyl-a-ntorpholinyläthylcarbodiimidmetbo-p-toluolsulfonat (3 g, 0,0072 Mol) wurden in Wasser (50 cm3) eine Woche lang gerührt Eine Calciumacetatlösung (10%, 50 cm3) wurde zugegeben und das erhaltene Gel, wie in Beispiel 1 beschrieben, aiitigenfrei gewaschen. Darauf wurde es in einer wäßrigen Lösung von NatriumäthylendVaninotetraacetat und Natriumcarbonat gelöst, und die Lösung gemäß Beispiel 1 dialysiert und gefriergetrocknet Es wurde das gewünschte Konjugat in einer Ausbeute von 1,2 g erhalten; die Analyse ergab einen Proteingehalt von 1,8%.
Die nach dem Ausfällen des Konjugats in Form seines Calciumsalzes abgetrennte Mutterlauge wurde mit weiteren 20 cm3 10%iger Calciumacetatlösung behandelt und der gebildete Niederschlag abgetrennt mehrere Male mit verdünnter Calciumacetatlösung gewaschen und dann wie bereits für die Hauptfällung beschrieben, gelöst und dialysiert Es wurde eine zweite Ausbeute von 1,0 g des gewünschten Konjugats mit 3s einem Eiweißgehalt von 2,8% erhalten. Dieses Konjugat war in derselben Weise wie das von Beispiel 1 brauchbar.
Beispiel 4
Feinzerteilte Alginsäure (2 g) wurde mit Triäthylamin (132 cm3,0,0095 Mol) und Äthylchlorameisensäureester (0,44 cm3, 0,0046 Mol) in Dioxan bei 5° C 1 h lang gerührt Das Produkt wurde abfiltriert und zu einer Lösung des Natriumsalzes von Eialbumin (100 mg in 25 or,3 Wasser) gegeben. Das Gemisch wurde mehrere Tage gerührt und dann das Konjugat durch Zugabe von überschüssiger Calciumacetatlösung (10%, 20 cm3) ausgefällt der Niederschlag abgetrennt und gründlich mit Wasser gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wurde in einer wäßrigen Lösung von NatriumäthylendianvQotetraacetat und Natriumcarbonat gelöst die Lösung wie in Beispiel 1 beschrieben gegen Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet; das gewünschte Konjugat wurde in einer Ausbeute von 1,2 g erhalten; die Analyse ergab einen Proteingehalt von 2,5%. Das Konjugat ließ sich gemäß Beispiel 1 verwenden.
Beispiel 5
Alginsäure (1,76 g 0,008 Äquivalente) wurde, suspen- eo diert in Tetrahydrofuran (50 cm3), mit Ν,Ν'-dicyclohe· xylcarbodümid (1,03 g, 0,005 Mol) und M-Hydroxypiperidin (1,5 g, 0,015 Mol) zwei Tage lang gerührt Das Produkt wurde abfiltriert und mit Methanol gewaschen um den gebildeten N.N'-Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Der N-Hydroxypiperidinester der Alginsäure wurde in einer Ausbeute von 1,9 g erhalten. Pollenextrakt von Wiesenlieschengras (Phleum pratense, 25 mg) wurde in etwas Wasser gelöst und die Lösung durch Zugabe von 0,01n NaOH Lösung auf pH-Wert 7-8 gebracht Hierauf wurden die Suspension von 500 mg Alginsäure-N-hydroxypiperidinester in 20 cm3 Wasser und 0,15 cm3 Triäthylamin (0,0011 MoI) zugegeben. Das Gemisch wurde 3 Tage lang gerührt und dann das Konjugat durch Ansäuern mit verdünnter HCl auf pH-Wert 4 ausgefällt Das ausgefällte Konjugat wurde in Natriumcarbonatlösung gelöst und diese Lösung gegen Wasser dialysiert Durch Lyophilisieren der dialysierten Lösung wurden 200 mg gewünschtes Konjugat erhalten; die Analyse ergab einen Proteingehalt von 6—7%. Das Konjugat eignet sich als Depotantigen, um eine verlängerte Desensibilisierung bei Säugetieren zu bewirken.
Beispiel 6
Pectinhydrazid wurde hergestellt, indem 1 Äquivalent Natriumpectinat mit 2 Äquivalenten Hydrazidhydrat in Methanol 2 h unter Rückfluß gekocht wurde. Das Hydrazid wurde abfiltriert, mn. Methanol gewaschen und getrocknet Gemäß einer anderen Herstellungsweise für das Hydrazid wurden 1 Äquivalent Natriumpectinat mit 5 Äquivalenten Hydrazidhydrat in Methanol gemischt das Gemisch 2 Tage bei Raumtemperatur stcnengelassen, der Niederschalg abfiltriert, gewaschen und getrocknet In beiden Fällen glich das Pectinhydrazid dem ursprünglichen Pectin.
Pectinhydrazidnatriumsalz (1 g) wurde in Wasser (50 cm3) bei 00C gelöst und mit Natriumnitrit (0,117 g, 0,0017 Mol) und In HCI (6 cm3, 0,006 Mol) versetzt Während dieser Zugabe wurde das Pectin teilweise ausgefällt Man ließ die Reaktion bei 0°C 30 min andauern. Dann wurde genügend Natriumbicarbonat zugegeben, um das Produkt aufzulösen und den pH-Wert auf 7—8 zu bringen. Dann wurde eine neutrale Lösung von gefriergetrocknetem Pollenextrakt von Wiesenlieschengras (50 mg in Wasser (10 cm3) zugesetzt und 3 weitere Tage gerührt Das Produkt wurde durch Zugabe von Calcium^cetatlösung (10%, 10 cm3) ausgefällt und das erhaltene Gel gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen und abzentrifugiert. Das Waschen und Zentrifugieren wurde zehnmal wiederholt Hierauf wurde das gewaschene Gel in einer wäßrigen Lösung von Natriumäthylendiaminotetraacetat und Natriumcarbonat gelöst, die Lösung gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Es wurden 0,52 g Konjugat mit einem Proteingehalt von 63% erhalten. Dieses Konjugat ließ sich gemäß Beispiel 5 verwenden.
Beispiel 7
Carrageenan (2 g, 0,01 Äquivalente) wurde in tetrahydrofuran (50 cm3) bei 0°C suspendiert und dann mit Triäthylamin (1,17 cm3,0,0085 MoI) und Ä'hylchlorameisensäureester (0,82 cm3, 0,086 Moi) versetzt. Das Gemisch wurde 21A h gerührt, darauf das gebildete Mischanhydrid abfiltriert und zu einer Lösung von Eialbumin (200 mg) in Wasser (60 cm3) gegeben.
Das Gemisch wurde 2 Tage bei 0°C stehengelassen und dann das Produkt durch Zugabe von Calciumacetatlösung (10%, 20 cm3) ausgefällt Der Niederschlag wurde gründlich mit verdünnter Calciumacetatlösung (0,01 m) gewaschen, um freies Protein zu entfernen. Hierauf wurde das Gel durch Zugabe von Natriumcarbonat bis zu einem pH-Wert 9-10 und durch Zugabe von Dinatriumsalz der Äthylcndiaminotetraessigsäure in leichtem Überschuß gelöst Die Lösung wurde gegen
Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet Es wurden 300 mg Produkt mit 3-4% Protein erhalten. Dieses Produkt fand gemäß Beispiel 1 Anwendung.
Beispiel 8
Alginsäuretriäthylaminsalz (0,7 g, 0,0025 Äquivalente) wurde in trockenem Dimethylformamid (15 cm3) suspendiert und auf -5° C gekühlt. Äthylchlorameisensäureester (1 cm3, 0,0104 Mol) wurde zugegeben und die Lösung bei 0 bis 10° C gerührt, bis das suspendierte ι ο Triäthylaminsalz in Lösung ging. Diese Lösung wurde zu einer zuvor bereiteten Lösung von 200 mg Knäuelgraspollenextrakt in 35 cm3 eiskaltem Wasser gegeben. Der pH-Wert der gekühlten Lösung wurde auf 8 eingestellt und während der Anfangsperiode der η Reaktion konstant gehalten. Hierauf wurde das Gemisch über Nacht in einem kalten Zimmer gerührt, bevor das Konjugat durch Zugabe von Calciumacetatlösung (!0%, 20 cm3) ausgefällt τηιτάζ. Das Frödüki wurde gemäß Beispiel 2 aufgearbeitet. Es wurden 450 mg Konjugat erhalten; die Analyse ergab einen Proteingehalt von 4%. Das Konjugat ließ sich gemäß Beispiel 5 verwenden.
Beispiel 9
Trockenes Natriumpectat, (0,5 g, 0,0025 Äquivalente) wurde in 20 cm3 trockenen Dimethylformamid suspendiert und mit 0,4 cm3 Dimethylformamid enthaltend 0,0014 Mol SO3-DimethyIformamidkomplex versetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 3 Wochen stehengelassen und dann der Pectatkomplex abfiltriert und zu einer Lösung von 280 mg Hollunderpollenextrakt in eiskaltem Wasser gegeben. Das Gemisch wurde 2 Tage bei 2"C gerührt und dann das Konjugat wie in dem vorangegangenen Beispielen als Calciumsalz y, ausgefällt und aufgearbeitet. Es wurde 0,5 g Komjugat mit einem Proteingehalt von 3,5% erhalten, das gemäß Beispiel 5 Anwendung fand.
Beispiel 10
Alginsäuretriäthylaminsalz (120 mg, 0,004 Äquivalente) wurden in 15 cm3 trockenem Dimethylformamid suspendiert und auf -50C gekühlt. Äthylchlorameisensäureester (0,25 cm3,0,0026 Mol) wurde zugegeben und weitere 2 h bei -5° C gerührt Die erhaltene Lösung des Mischanhydrids wurde dann in Tetrahydrofuran (25 cm3) ausgegossen und dann ein paar Minuten lang gerührt. Das ausgefällte Mischanhydrid wurde abfiltriert und zu einer Lösung von Diphterie-Toxin (1250Lf.) in 20 cm3 eiskaltem Wasser gegeben. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 8 eingestellt und die Lösung über Nacht weitergerührt. Das Konjugat wurde als Calciumsalz gefällt und wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, aufgearbeitet.
Es wurden 90 mg Produkt erhalten. Das Konjugat eignete sich zum Immunisieren von Säugetieren.
Beispiele 11 -61
Es wurden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Konjugate hergestellt; es sind jeweils die Polysaccharid-Komponente, die Antigen- oder Proteinkomponente, und das Kupplungsverfahren angegeben (MA. — Mischanhydri,vMethode unter Verwendung von Äthylchlorameisensäureester; W.S.D. — wasserlösliches Diimid-Methode; SO3 = SO3-Komplexanhydrid-Methoden; N.H.P. - N-Hydroxypiperidinester-Methode; A.CHI Säurechloridmethode; Azid - Aztdmethode unter Verwendung von Pectinhydrazid). Die Konjugate waren in derselben Weise brauchbar, wie die Produkte der vorangegangenen Beispiele.
Beispiel Polysaccharide Aktive Komponente Melhode
11. Alginsäure Wiesenlieschengras-Pollenextrakt N.H.P.
12. desgl. desgl. M.A.
13. desgl. desgl. W.S.D.
14. desgl. desgl. SO.,
15. Pectinsäure desgl. M.A.
16. desgl. desgl. W.S.D.
17. Pectin desgl. Azid
18. Celluronsäure desgl. M.A.
19. desgl. desgl. W.S.D.
20. Carrageenan desgl. W.S.D.
21. Alginsäure Knäuelgras-Pollenextrakt M.A.
22. desgl. desgl. SO3
23. desgl. desgl. M.A.
24. desgl. desgl. SO3
25. desgl. desgl. M.A.
26. desgl. desgl. SO3
27. Pectinsäure desgl. SO3
28. desgl. desgl. SO3
29. desgl. desgl. SO3
30. desgl. Holunder-Pollenextrakt SO3
31- Alginsäure Birken-Pollenextrakt M.A.
32. desgl. Pferdeschuppenextrakt M.A.
Fortsetzung
IO
Beispiel Polysaccharide Aktive Komponente
Methode
33. Alginsäure Katzenepithelextrakt M.A.
34. desgl. Eialbumin N. H. P.
35. desgl. desgl. M.A.
36. desgl. desgl. W.S.D
37. desgl. desgl. SO,
38. desgl. desgl. ACHI
39. Pectinsäure desgl. M.A.
40. desgl. desgl. W.S.D
41. desgl. desgl. SO3
42. Pectin desgl. Azid
43 CsMurofi säure A~ 1 W.S.D
44. Carrageenan desgl. M.A.
45. desgl. desgl. W.S.D
46. Licheninuronsäure desgl. W.S.D
47. Alginsäure Milchalbumin M.A.
48. desgl. desgl. SOj
49. Alginsäure Schellfischextrakt M.A.
50. desgl. Extrakt eines Trockenfäule erregenden MA.
Pilzes
51. desgl. Bäckerhefeextrakt SO,
52. desgl. Maja naja Gift SO,
53. desgl. Bienengift SOj
54. desgl. Insulin W.S.D.
55. desgl. Tetanus-Toxoid SO,
56. desgl. Diphterie-Toxin M.A.
57. desgl. Trypsin M.A.
58. Pectin desgl. Azid
59. Alginsäure Chymotrypsin M.A.
60. Pectin desgl. Azid
61. Alginsäure Ficin M.A.

Claims (1)

Patentansprüche;
1. Immunologisch aktives Säuregruppen enthaltendes Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß es
a) aus einem sauren Polysaccharid aus der Gruppe Pectin, Pectinsäure, Alginsäure, Celluronsäure und Carrageenan und
b) einer biologisch aktiven eiweißhaltigen Substanz aus der Gruppe der Antigene, Allergene, Mikroorganismen, Toxine, Toxoide, Hormone, Enzyme oder Haptene
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