DE1692668A1 - Verfahren zur Herstellung einer gereinigten Agar-Fraktion - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung einer gereinigten Agar-Praktion

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer gereinigten Agär-Fraktion.

Agar ist die getrocknete hydrophile colloidale Substanz, die aus Gelidium cartilogineum (Linne) Gaillon (Pan. Gelidiaceae), Grracilaria confervoides (Linne)_i Greville (Pan, Sphaerococcaceae) und verwandten Rotalgenarten (Klasse; Rhodobhyceae) extrahiert wird. Die purpurroten Meeresalyen, aus denen Agar gewonnen wird, wachsen in fast allen Meeren der Welt, Ein Verfahren zur Herstellung von Agar besteht darin, dass die-Meeresalgen geerntet und gewaschen werden, worauf das Agar bed hohen Temperaturen und Drucken aus den Algen extrahiert wird. Verunreinigungen v/erden ausgefällt und durch Filtration entfernt und die Flüssigkeit geliereri gelassen. Nach/ffelierung wird

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das Agar einige Tage lang gefroren. Das Agar ist in Eis unlöslich, während bestimmte Verunreinigungen in das Eis übergehen, das später geschmolzen und weggewaschen wird. Das Agar wird gewaschen, entfärbt, sterilisiert, zur Entfernung von geringen Mengen noch verbliebener Verunreinigungen behandelt und ,erneut gewaschen. Nach der Entwässerung ist das Agar verpackungs- und verkaufsfertig. Das auf diese Weise gewonnene Produkt ist ein handelsübliches herkömmliches Agar, das für fe die verschiedensten Zwecke verwendet wird, beispielsweise in · der Zahnheilkunde, in der Kriminalistik, in der plastischen Chirurgie, für die Präparierung von Museumsgegenständen, zur Anfertigung von Skulpturen, zur Verarbeitung von Nahrungsmitteln, in der medizinischen Forschung, in tier Mikrobiologie, in der Fotografie, in der Chemie und ganz allgemein in der Wissenschaft.

Agar besteht aus zwei Fraktionen, und zwar einem neutralen Galaktosepolymerisat und einem sulfatierten Polysaccharid (Agaropectin). Die Agaropectin-Fraktion verleiht dem neutralen Galaktosepolymerisat Eigenschaften _t die für bestimmte Zwecke und bei bestimmten Anwendungsgebieten unerwünscht sind. Das neutrale Galaktosepolysaccharid enthält keine Gruppen, die eine Ladung tragen, so dass ein Gel dieses Polysaccharide sehr geeignet als Stabilisierungsmittel für Elektrophoresen und Immunodiffusionen ist. Agar, das von der Agaropectin-Fraktion befreit worden,ist, besitzt andere Vorteile. Wird es in mikrobiologischen Medien verwendet, so liefert es ein Gel mit einer

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überraschend hohen Gelfestigkeit, sogar dann, wenn "beträchtlich kleinere Mengen verwendet werden, als dies normalerweise "bei der Verwendung eines herkömmlichen Agar für derartige Zwecke der Pail ist. Die aus dieser gereinigten Agar-Fraktion gebildeten Gele scheiden im Vergleich zu herkömmlichen Agar-Gelen sehr geringe Mengen an Synärese-Wasser aus.

Die Erkenntnis der "besonderen- Vorteile der Verwendung eines neutralen Galaktosepolymerisats als■GeIierungsmaterial, hat ä viele Forscher zur Entwicklung von Methoden für eine wirksame, schnelle und billige Abtrennung dieser Fraktion von Agar angeregt. Dass diesen Versuchen jedoch bisher kein besonderer Erfolg beschieden war, geht aus der Tatsache hervor, dass das zur Zeit im Handel erhältliche neutrale Galaktosepolymerisat ungefähr um das 5Ofache teurer ist als das handelsübliche Agar. Ein Acetylierungsverfahren zur Herstellung des neutralen Galaktosepolymerisats wurde von Araki (J.Chem. Soc, Japan, Pure Chem. Sogt. 58 (1937), 1338) vorgeschlagen. Dieses Acety-. lierungsverfahren wurde von Hjerten als sehr langwierig und teuer besehrieben. Zur Verbesserung des AeetyIierungsverfahrens schlug Hjerten eine Cetylpyridiniumchlorid-Methode vor (.vergl. Biochem. Biophys. Acta, 62 (1962), 445)· Bei diesem Cetylpyridiniumchlorid-Verfahren von Hgerten auftretende Uachteile regten andere Forscher zu einem Verfahren an, das sich der fraktionierten Ausfällung mit Eolyäthylenglykol bediente (vergl. Rüssel et al, Biochem. Biophys, Acta, 86 (1964)-» 169-174). Es wurden auch Versuche .unternommen, um Agar durch Behandlung mit

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trockener Chlorwasserstoffsäure zu desulfatisieren; diese Behandlung hatte jedoch einen Abbau des Agars" zur Folge. Die Agaropektin-JFraktion des Agar kann durch Extraktion aus einer warmen Agarlösung unter Verwendung von Harzen erfolgen. Jedoch machte die geringe Kapazität der für diesen Zweck verwendeten Harz-Säulen dieses Verfahren ungeeignet. Ein Hauptnachteil aller bisher bekannten Verfahren liegt darin, dass die Reinigung des Agar mit einer Agar-Lösung durchgeführt werden muss. Dies ™ erfordert das Arbeiten mit einer heissen geschmolzenen Substanz, ein Umstand, der die Schwierigkeiten und Kosten der Verarbeitung erhöht.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Schaffung einer Methode zur schnellen, wirksamen und billigen Herstellung des neutralen Cralaktosepolymerisats aus Agar.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist in der Ent- k wicklung eines Verfahrens zu sehen, das die Herstellung des neutralen Galaktosepolymerisats aus Agar in der Kälte bei einer Temperatur von ungefähr 15 bis 70⁰O ermöglicht.

Weiterhin hat sich die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des neutralen Galaktosepolymerisats aus Agar zum Ziel gesetzt, wobei billige und leicht erhältliche Chemikalien verwendet werden.

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Weitere Ziele und vorteilhafte Merkmale der vorliegenden Erfindung gehen aus der nachstehenden Beschreibung hervor.

Die vorliegende Erfindung beruht auf ein««»Verfahren, bei dem der Agaropektin-Anteil des Agar durch die Verwendung von irgendwelchen Materialien gelöst wird, die das Agaropektin abbauen (beispielsweise durch Pektinase, die zur Familie der Enzyme gehört) oder die Calcium abtrennen und damit die Lösung des Agaropektins ermöglichen (zu derartigen Abtrennmitteln gehören A'thylendiamintetraessigsäure und bestimmte Phosphate). Das gelöste Agaropektin wird dann in einfacher Weise von dem neutralen Galaktosepolymerisat durch Waschen mit Wasser, vorzugsweise destilliertem oder entionisiertem Wasser, entfernt. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird dem Agar Pektinase zugesetzt. Pektinasen sind im Handel aus einer Vielzahl von Quellen erhältlich. Sie werden hauptsächlich bei der Verarbeitung von Prüchten verwendet. Pektinase baut unter, wäßrigen Bedingungen den Agaropektinanteil des Agar zu kleineren Einheiten ab, die wasserlöslich sind. Diese wasserlösliehen Abbauprodukte können dann durch Waschen des unlöslichen neutralen Galaktosepolymerisats mit entweder kaltem oder warmem Wasser entfernt werden.

Gemäss einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Agaropektin durch die Entfernung von Oalciumionen unter zur Hilfenahme von Abtrennraitteln in kaltem Wasser löslich gemacht. Beispiele für derartige Abtrennmittel sind

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zweibasisch.es llatriumphosphat, dreibasisch.es Uatriumphosphat, Hatrimapyroph.osph.ate, Natriumtriph.osph.at, Natriumhexametaphosphat, Hatriumtripolyph.osph.at und Äthylendiamintetraessigsäure. Uachdem die Calciumionen abgetrennt sind und damit nicht mehr für eine Vereinigung mit den Agaropektinen zur Verfügung stehen, werden diese wasserlöslich und können durch Waschen des unlöslichen neutralen Galaktosepolymerisats mit kaltem oder warmem λ Wasser entfernt werden. Es ist natürlich klar, dass das CaI-ciumabtrennmittel nicht den neutralen Galaktosepolymerisatanteil abbauen darf.

Mir die Auflösung der Agaropektinkomponente des Agar werden pro 0,454- kg (pound) Agar ungefähr 5 bis 50 g Pektinase in Form einer Pektinase-Enzympräparation mit einer "Quittensaftaktivität" von 200 Einheiten pro Gramm verwendet. Vorzugsweise werden ungefähr 25 g einer derartigen Enzympräparation pro 0,454 kg (pound) Agar verwendet. Die Auflösung des Agaropektins erfolgt bei Temperaturen, die für die enzymatisch« Aktivität der Pektinase geeignet sind, und zwar im allgemeinen bei einer Temperatur von ungefähr 38 bis 6O⁰O und vorzugsweise bei ungefähr 4O⁰O. Nachdem die Auflösung nach ungefähr 1 bis 20 Stunden und vorzugsweise nach ungefähr 4 Stunden bis zu einem zufriedenstellenden Ausmaß fortgeschritten ist, wird das neutrale Galaktosepolymerisat mit Wasser, vorzugsweise mit destilliertem oder entionisiertem Wasser, von den Agaropektinen freigewasohen. Das Galaktosepolymerisat kann dann zur Verbesserung

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der Farbe und Klarheit unter Verwendung einer herkömmlichen Bleiche, wie beispielsweise einer Fatriumhypochlorit-LÖsung, gebleicht werden. Anschliessend an die· Bleichung wird das ■ Polymerisat von zurückgebliebenen Bleichkomponenten oder Reaktionsprodukten freigewaschen« Es wird dann nach einem Verfahren getrocknet, welches zwar das Wasser entfernt, ohne jedoch dabei das neutrale, Galaktosepolymerisat zu zerstören oder abzubauen. Zu derartigen Trocknungsverfahren sind die Trocknung unter Vakuum, die Trocknung mittels organischer Lösungsmittel, <| wie beispielsweise Aceton, Alkohol oder Äther, oder andere geeignete Verfahren zu zählen. - -

In dem vorstehenden Absatz wurde die Pektinase-Enzymaktivität in "Quittensafteinheiten" der Aktivität ausgedrückt. Dies ist ein übliches Maß für die Wiedergabe der Aktivität von Pektinase* Diese Aktivitätsängabe beruht auf dem Grad, bis zu dem das Enzym ein Quittensaftsubstrat zu klären vermag. Eine erfindungsgemäss verwendbare'Pektinase-Enzympräparation sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus Aspergillus niger-Produkten, wird in der südafrikanischen Patentschrift Nr. 63/5936 beschrieben. In dem weiter unten folgenden Beispiel 1 wird eine derartige Pektinase-Präparation verwendet.

Die Auflösung der Agaropektine unter Verwendung von Calcium-, abtrennmitteln erfolgt nach derselben Methode, die bei dem Pektinase-Verfahren angewendet wird. Wird ein GaIciumabtrennmittel vom Phosphat-Typ verwendet, dann wird das entsprechende

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Phosphat dem Agar in Wasser zugesetzt· Pro 0,454 kg (pound) Agar werden ungefähr 100 bis 1000 g Phosphat verwendetφ Die Abtrennung des Calciums wird vorzugsweise in destilliertem oder entionisiertem Wasser bei lemperaturen zwischen ungefähr 38 und 70⁰O, vorzugsweise 40⁰O, während einer Zeitspanne von ungefähr 1 bis 24 Stunden, vorzugsweise ungefähr 12 Stunden, durchgeführt. Das neutrale Galaktosepolymerisat wird dann mit Wasser, vorzugsweise mit destilliertem oder entionisiertem Wasser > von den Agaropektinen freigewaschen. Das Galaktosepolymerisat kann dann zur Verbesserung der Farbe und Klarheit unter Verwendung einer herkömmlichen Bleiche, wie beispielsweise einer ITatriurahypochlorit-Lösung» gebleicht werden. Anschliessend an die Bleichung wird das Polymerisat in der vorstehend für das Pektinaee-Verfahren angegebenen Weise gewaschen und getrocknet. Bei der Verwendung anderer Arten von Calciumabtrennmitteln, wie beispielsweise Äthylen&iamintetraessigsäuren sowie deren Salzen, wird das Verfahren praktisch in derselben Weise wie bei der Verwendung von Phosphaten durchgeführt. Pur die Auflösung der Agaropektine in 0,454 kg (pound) Agar werden ungefähr 1 bis 100 g Al)IA oder deren Alkalisalze verwendet.

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte neutrale Galaktosepolymerisat ist als Gel-bildendes Material und als Stabilisierungsmittel für Elektrophoresen und Immunodiffusion geeignet. Für derartige Verfahren let es erwünscht, dass ein Gel eine ausgezeichnete Durcheichtigköit besitzt und eine Diffusion von Stoffen, beispielsweise von Antigenen und Antikörpern

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mit einem möglichst kleinen Widerstand, entweder durch Adsorption oder durch andere Mechanismen ermöglicht« Enthält ein Agar grössere Mengen an geladenen Teilchen, die sich mit den untersuchten Materialien vereinigen können, so dass sie die * Diffusion dieser Stoffe wegen der Übertragung einer elektrischen ladung erschweren, so ist ein derartiges Agar nicht für Geldiffusions- und Immunoelektrophoreseverfahren geeignet. Das nach dem erfindungsgemässen-Verfahren hergestellte neutrale | Galaktosepolymerisat liefert extrem klare und durchsichtige Gelstrukturen. VjTeiterhin ermöglicht dieses neutrale Galaktosepolymerisat die ungehinderte Diffusion geladener Stoffe, beispielsweise von Antigenen und Antikörpern, sowohl bei Geldiffusionsals auch bei Immunoelektrophoreseverfahren·

Ss hat sich auch herausgestellt, dass das erfindungsgemäss hergestellte neutrale Galaktosepolymerisat für die Herstellung verbesserter mikrobiologischer halbfester Kulturen geeignet ist. Bisher war es bei der Herstellung mikrobiologischer halbfester Kulturen üblich, ungefähr 2 i<> herkömmliches Agar zu verv/enden. V/erden weniger als 2 # verwendet» dann besitzen die erhaltenen halbfesten Medien keine ausreichende strukturelle Festigkeit, die erforderlich ist, damit sie den Bedingungen widerstehen, denen sie laufend ausgesetzt sind. Es wurde gefunden, dass 1 fo des erfindungsgemässen neutralen Galaktosepolymerisats die Her-βteilung eines halbfesten Mediums ermöglicht, das die gleiche Gelfestigkeit wie ein Gel besitzt, welches unter Very/endung von 2 i» eines Üblichen Agare hergestellt wurde. Weiterhin unter-

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bleibt bei Verwendung des erfindungsgemässen neutralen Galaktosepolymerisats praktisch jede Abscheidung von Synärese-Y/asser.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1 -

25 g einer flüssigen Pektinase-Enzympräparation mit einer Quit tens aft aktivität von 200 Einheiten pro Gram wurden bei Zimmertemperatur 8 Liter destilliertes Wasser zugegeben. Das destillierte Wasser wurde dann auf 40⁰C erwärmt. Daraufhin wurden 0,4-54 kg (pound) Agar in die Enzym-Wasserlösung eingebracht und 4 Stunden lang in Kontakt mit dem Pektinase-Enzym belassen. Anschliessend wurde das restliche nicht gelöste neutrale Galaktosepolymerisat von dem zugesetzten Enzym und den gelösten Agaropektinen unter Verwendung von destilliertem Wasser freigewaschen. Zu 8 liter destilliertem Wasser wurden dann 100 ml W einer 5,25/^igen Natriumhypochloritlösung zugefügt. Das neutrale Galaktosepolymerisat wurde in diese Bleichlöaung eingebracht und 4 Stunden lang in dieser Lösung belassen. Fach der Entfernung der Bleichlösung wurde das Polymerisat in destilliertem Wasser von zurückgebliebenem freien Chlor freigewaschen. Das Polymerisat wurde dann in einer Vakuumkammer getrocknet.

Das nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellte neutrale Galaktosepolymerisat konnte sowohl für eine G-eldiffusion als auoh für eine Immunoelektrophorese verwendet werden·

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Wurden 2 ?S dieses Polymerisats zu 100 ml eines Veronal-Puffers mit einem pH-Wert von 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 gegeben und die Mischung auf 93⁰C erwärmt, dann wurde eine klare wasserähnliche lösung erhalten. Wird eine entsprechende Menge dieser Lösung in eine Elektrophoreseplatte gegossen und gelieren gelassen, dann wird ein sehr klares und durchsichtiges Medium erhalten. Nach, der Zugabe einer Analysenprobe und der in üblicher Weise erfolgenden Anlegung einer elektrischen Spannung an das System, können ungewöhnlich klar gezeichnete Korn- ™ ponenten-Banden sichtbar gemacht werden.

Beispiel 2

Zu 0,4-54 kg O pound) Agar in β Üitera Wasser werden bei Zimmertemperatur 1000 g ]Jatriumhypophosphat zugesetzt» worauf die Mischung in destilliertem Wasser von 2iiamertemperatur auf 45⁰O erwärmt wurde. Bach 12 Stunden wurde die Ägar-Fraktion, die das neutrale Galaktosepolymerisat enthielt, unter Verwendung von destilliertem "Wasser von dem zugesetzten Hypophosphat und der ^ Agaropektin-Praktion freigewaschen. Sas gewaschene neutrale Galaktosepolymerisat wurde dann 1 Stunde lang mit einer Bleichlösung kontaktiert· Diese Bleichlösung wurde durch Zugabe von .100 ml einer 5,25?£igen ITatriumhypochlorit-Üösung zu 8 latern destilliertem Wasser hergestellt. Das neutrale Galaktosepolymerisat wurde dann aus der Bleichlösung entfernt und solange Mt destilliertem Waeser g^imsoiien, bis es frei von zurüpkgebliebenen^^ freiem Chlor war« Das Polymerisat wurde dann auf einem Trockenblech im Vakuum getrocknet.

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Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei jedoch Natriumtripolyphosphat anstelle von Uatriumhypophosphat als Caloiumabtrennjüittel verwendet wurde«

Beispiel 4

50 g iDetranatriumäthylendiamintetraacetat· wurden bei Zimmer--.

^ temperatur zu 8 Litern destilliertem Wasser gegeben, worauf das Y/asser auf 60⁰C erwärmt wurde. Dann wurden 0,454 kg (1 pound) Agar in diese Wasserlösung eingebracht und 4 Stunden lang in der Lösung belassen. Das Tetranatriumäthylendiamintetraacetatchelierte während dieser Zeitspanne die in der Lösung vorhandenen Calciumionen und machte auf diese Weise die Agaropektine wasserlöslich. Das unlösliche neutrale Galaktosepolymerisat wurde aus der Chelierungslösung entfernt und unter Verwendung von destilliertem Wasser von allen Agaropektinen und dem zugesetzten !etranatriumäthylendiamintetraaeetat frei-

" gewaschen. Das Polymerisat wurde in eine Bleichlösung eingebracht und darin 1 Stunde lang belassen. Diese Bleichlösung wurde nach der in Beispiel 2 beschriebenen Weise hergestellt. An die Bleichung schlossen sich dann die in Beispiel 2 beschriebenen Wasch- und Trocknungsstuf en an.

Das nach einem der vorstehend beschriebenen Verfahren herge- stellte neutrale Galaktosepolymerisat ermöglicht bei einem Zu-. satz von 1 i» die für mikrobiologische Gelmedien, wie beispielsweise das nachstehend angegeben® Reagenzglas- und Platten-

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medium, erforderliche strukturelle Pestigkeitt

Reagenzglas-Uedium

1. Pepton 1,0 g

2. Natriumchlorid 5,0 g

3. Dextrose 1,0 g

4. Mononatriumphosphat 2,0 g ' 5. Harnstoff ' 20,0 g

6. Phenolrot 0,012 g

7. neutrales Galaktosepolymerisat 11,0 g

8. destilliertes Wasser q.s. Tola 1000,0 ml

Plattenmedium

1» Proteasepepton 10,0 g

2, Dextrose 20,0 g

5· neutrales Galaktosepolymerisat 13,0 g

4* destilliertes Wasser q.s. bis 1000,0 ml

Das erfindungsgemäeee neutrale Galaktosepolymerisat muss natürlich nicht die gesamte Gel-erzeugende Komponente eines mikrobiologischen Reagenzglas- und Plattenmediums ausmachen. Werden beispielsweise 1,5 ⁶/<> eines herkömmlichen handelsüblichen Agar und 0,5 $> des erfindungsgemässen neutralen Galaktosepolymerisats vermischt und zusammen als Gel-bildende Komponente für ein Reagenzglas- und Plattenmedium verwendet, dann zeigt die Mischung Eigenschaften, die ein derartiges Medium, in dem kein neutrales Galaktosepolymerisat verwendet wird wd in dem

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2 fo eines herkömmlichen im Handel erhältlichen Agar die gesamte Gel-bildende Kompoente ausmachen, nicht besitzt. Derartig vermischte Medien scheiden weniger Synärese-Wasser aus als ein aus einer Komponente bestehendes Medium. Die durch die geringere Menge des neutralen GalaktosepolymerisatbeStandteils bewirkte Strukturverbesserung ermöglicht ie% es, dass aus einer Mischung bestehende Medien in viel grösserem Maße einem physikalischen Schock widerstehen können als dies ein Medium in der Lage ist, das eine einzelne Komponente aus 2 $> eines herkömmlichen Agars enthält. Die Schockbeständigkeit kann dann ausserst wichtig sein, wenn Heagenzmedien über weite Entfernungen hinweg transportiert werden.

Patentansprüche

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Claims (1)

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   Patentansprüche

   1« Verfahren zur Herstellung eines gereinigten, in kaltem Wasser unlöslichen neutralen Agar-Salaktosepolymerisat- · Bestandteiles aus einem Agar, das einen derartigen Polymerisatbestandteil und zusätzlich Calcium und ein in kaltem Y/asser unlösliches sulfatiertes Polysaecharid enthält, dadurch ge- ™ kennzeichnet, dass das sulfatierte Polysaceh©y?id durch Zugabe eines aus einem Pektinase-Enzym oder einem Galeiumabtrennmittel bestehenden Lösungsmittel unter wäßrigen Bedingungen zu dem Agar in kaltem Wasser löslich gemacht wird, worauf der in kaltem Wasser unlösliche Bestandteil von dem in kaltem Wasser gelösten sulfatierten Polysaeeharifl. abgetrennt wird«

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Calciumabtrennmittel Äthylendiamintetraessigsäure, ein Alkalisalz dieser Säure, ein Phosphat, zweibasisches Uatriumtriphosphat, dreibasisches Hatriumphosphat, ITatriumpyrophosphat, Uatriumtriphosphat, ffatriumhexametaphosphat oder Natriumtripolyphosphat verwendet wird»

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung des Calciums vorzugsweise in destilliertem oder entionisiertem Wasser bei einer Temperatur von ungefähr

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   38 bis 7O⁰O, vorzugsweise 41⁰C, während einer Zeitspanne von ungefähr 1 "bis 24 Stunden, vorzugsweise ungefähr 12 Stunden, durchgeführt wird.

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