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Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit ACTH-Aktivität Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung adrenocorticotrop wirksamer Peptide
der allgemeinen Formel I a-e ßAla-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Iys-Lys-Arg-Arg-Pro-X-NH2,
(I) a-e worin X a) Val b) Val-Lys c) Val-Lys-Val Q) Val-Lys-Val-Tyr e) Val-Lys-Val-Tyr-Pro
bedeutot, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Peptid der Formel II OtBu
Boc-Bala-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH (II) worin Boc den tert.-Butyloxycarbonylrest
und tBu den tert.-
Butylrest bedeutet, mit einem Peptid der allgemeinen
Formel III a-e
worin Y a) Val b) Val-Lys(R) c) Val-Lys(R)-Val d) Val-Lys(R)-Val-Tyr e) Val-Lys(R)-Val-Tyr-Pro
und R den tert -Butyloxycarbonyl- oder den Formyl-rest bedeutet, mittels eines Carbodiimids
in Gegenwart einer aktive Ester bildenden Verbindung kondensiert und aus dem erhaltenen
Peptid der allgemeinen Formel IV a-e
worin Boc, R4tBu und Y die oben angegebene Bedeutung besitzen, die Schutzgruppen
durch Behandeln mit Triflubressigsäure oder Ameisensäure abspaltet und, falls R
den Formylrest bedeutet die Formylgruppen durch Behandeln mit Ilydrazinacetat entfernt.
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Überraschenderweise wurde gefunden, da# synthetische Peptide mit der
Aminosäuresequenz des adrenocorticotropen Hormons, die mindestens die ersten 20
Aminosäuren, von er N-terminalen Aminosäure an gerechnet, umfassen, und in denen
das Serin gegen #-Alanin ausgetauscht ist, gegenüber den Peptiden mit natürlicher
Sequenz eine erheblich gesteigerte und verlängerte +) vorher oder anschließend
biologische
Wirkung besitzen.
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ACTE-Peptide mit einer gegenüber dem natürlichen Hormon erhöhten Wirkung
sind schon aus Experientia 22 (1966)-, Seite 526 und aus dem Belgischen Patent 668
250 bekannt, Hier ist die N-terminale Aminosäure L-Serin gegen ihr Enantiomeres,
das D-Serin, ausgetauscht, Es wurde beobachtet, daß die Verfahrensprodukte, z,B.
die Verbindung I d, gegenüber einem analog dem Belgischen Patent 668 250 hergestellten
D-Ser ACTH-( 1-23)-trikosipeptid-amid im Sayers-Test bei subcutaner Applikation
nach U.S.
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Pharmakopöe 17 eine äquivalente biologische Aktivität besitzen. Die
erfindungsgemäßen Peptide dind jedoch gegenüber den vorbekannten Verbindungen dadurch
besonders vorteilhaft, daß anstelle des schwer zugänglichen D-Serins das sehr leicht
zugängliche #-Alanin eingesetzt wird, das außerdem eine natürliche, in körpereigenen
Verbindungen vorkommende Aminosäure ist.
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Die Kondensation der beiden BruchstUcke wird so ausgeführt, daß man
die Verbindung der Formel II zusammen mit einer Verbindung der Formel III in einem
Lösungsmitten wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Phosphorsäure-tris-dimethylamid,
Pyridin oder in einem Gemisch von zwei oder mehr dieser Lösungsmittel löst, mindestens
ein Equivalent, bevo#zugt 2-4 Äquivalente einer aktive Ester bildenen Verbindung
zugibt und dann als Kondensationsmitel ein Carbodiimid, bevorzugt die Cyclohexylcarbodiimid
in 2-5 molarer Menge einträgt. Als Verbindung zur Bildung aktiver Ester kommen TIydroxy-,
Mer-capto-oder Imidoverbindungen mit einem pK-Wert zwischen 4. 0 und 8.0 infrage.
Insbesondere werden die in der Peptidchemie üblichen Verbindungen wie 4-Nitrophenol,
2,4-Dinitrophenol, 2,4,5-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, Pentafluorphenol2 Hydroxysuccinimid,
HydroxyphthalimidJ Thiophenol, 4-Chlorthiophenol, 4-Nitrothiopheno1 oder Saccharin
verwendet. Das-Peptid der Formel III muß bei
dieser Kondensation
als Salz einer starken Säure, beispielsweise als Benzolsulfonat, Toluolsulfonat
oder Chlorid vorliegen.
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Man rührt 1-5 Tage, bevorzugt bei Raumtemperatur. Es kann auch bei
etwas niedrigerer Temperatur, a.B. bei 0° oder bei mä#ig erhöhter Temperatur, bis
etwa 60°, gearbeitet werden, wobei sich die Reaktionszeit entsprechend verlängert
bzw. verkürzt.
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Nach beendeter Kondensation filtriert man gegebenenfalls vom ausgeschiedenen
Harnstoff, z. B. Dicyclohexylharnstoff, ab und fällt die rohen Reaktionsprodukte
durch Zugabe eines Lösungsmittels, in dem die Peptide praktisch unlöslich sind,
wie z. B. Äther oder Essigester aus. Die Verbindungen der allgemeinen Formel IV
werden dann zur Abspaltung der Schutzgruppen für etwa 1 Stunde in Trifluoressigsäure,
die vorteilhaft etwas Wasser und Thioglycolsäure enthält, oder für etwa 3 Stunden
in Ameisensäure gelöst. Nach beendeter Reaktion fällt man die von Schutzgruppen
befreiten Peptide der allgemeinen Formel I durch Zugabe von Äther aus. Die weitere
Reinigung kann dann in bekannter Weise durch Chromatographie an Carboxymethylcellulose
erreicht werden. Vorteilhaft kombiniert man die Abspaltung der Schutzgruppen mit
der Reinigung der Peptide nach dem Verfahren der deutschen Patentanmeldung F 45
044 IVb/12 qu (Fw 4694).
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Falls in den Verbindungen der Formel IV die Schutzgruppe R die Formylgruppe
bedeutet, werden die VerbindungenIV vor oder nach dieser Behandlung zur Abspaltung
der Formylgruppen mit Hydrazin oder einem geeigneten Hydrazinderivat oder mit Anilin
bzw. einem geeigneten Anilinderivat nach dem Verfahren der deutschen Patentanmeldungen
F 50 057 IVbX12 qu (Fw 5170) oder
F 51 486 IVb/12 qu (Fw 5318) behandelt.
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Bevorzugt läßt man überschüssiges 2m Hydrazinacetat in Methanol 15
Stunden bei 550 oder 4 Stunden bei 650 einwirken. Die Peptide werden nach Abdestillieren
des Methanols im Vakuum durch Lösen in ca. 50 Tln. Aceton und Fällen mit etwa 100
Tln. Äther und Waschen des Niederschlags mit Aceton und Äther isoliert.
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Die Ausgangsprodukte der allgemeinen Formel IIIa-e sind aus Chem.Ber.
Bd. 94 (1964), S. 1197 und Bd. 96 (1963), S. 609 bekannt, wenn R den tert.-Butyloxycarbonylrest
bedeutet. Die Verbindungen der allgemeinen Formel IIIa-e in der R den Formelrest
bedeutet, sind aus J. Am. Chem. Soc.
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83 (1961), S. 2294 und Bd. 84 (1962), S. 4481 bekannt oder können
analog den dort beschriebenen Verbindungen hergestellt werden.
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Das als Ausgangsstoff verwendete neue Peptid der Formel II kana auf
mehreren Wegen nach bekannten methoden der Peptidclsemie hergestellt werden. So
kann man z. B. das aus Chem.
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Ber. 96 (1963), S. 1080 bekannte Hexapeptid H-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH
nld t Z-Tyr-Ser-Met-N3 zum Nonapeptid Z-Tyr-Ser-Met-Glu (OtBu) - Hls-Phe- Arg- Try-
Gly- OH umsetzen, analog Acta Chim. Hung. 44 (1965), S. 15 die Carbobenzoxygruppe
hydrogenolytisch abspalten und die freie Aminogruppe mit einem aktivierten Ester
des B0C-ß-Alanins, z.B. dem Nitrophenyl-, Trichlorphenyl- oder Thiophenylester,
zur Reaktion bringen, wobei das Dekapeptid der Formel II entstellt.
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Die neuen Verbindungen besitzen das Wirkungsspektrum-des natürlichen
ACTH, wobei Jedoch wegen der bedeutend erhöhten Aktivität nur ein Bruchteil an Verbindung
der allgemeinen Formel I, verglichen mit natürlichem Hormon, eingesetzt zu werden
braucht.
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Beispiele Abkürzungen: DCC bedeutet im folgenden Dicyclohexylcarbodiimid.
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Rf(A) = Rf-Wert im Laufmittel a (n-Butanol-/Essigsäure/pyridin/Wasser
: 30:6:20:24) Rf(E) = Rf im Laufmittel E (n-Butanol/Esessigsäure/Wasser = 40:10.50)
Beispiel 1 a) H-Ser-Met-OMe,HCl 350 g Boc-Ser-Met-OMe, hergestellt nach DBP 1 212
981, werden in 1,5 Ltr. frisch bereiteter in HC1 in Methanol 1 Std. stehen gelassen.
Dann wird i.Vak. zur Trockene eingedampft. Man digeriert den öligen Rückstand mehrmals
mit trockenem Äther und erhält nach dem Trocknen i. Vak. über H2SO4 und KOH das
H-Ser-Met-OMe,HCl als schaumiges Harz. Es wird ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet.
b) Z-Tyr-Ser-Met-OMe Das nach a) gewonnene Harz wird mit 4,5 Ltr. trockenem Methylenchlorid
übergossen. Man gibt 322 g Z-Tyr-OH und langsam 140 ccm Triäthylamin zu und rührt,
bis Lösung eingetreten ist. Dann kühlt man auf -10° ud gibt die Lösung von 220 Dicyclohexylcarbodiimid
in 500 ccm Methylenchlorid zu und lü#t unter weiterem Rühren langsam auf Raumtemperatur
kommen. Nach 15 Stunden saugt man vom gallertigen Niederschlag ab, destilliert aus
dem Filtrat das Methylenchlorid ab und verrührt Niederschlag und Rückstand zusammen
mit 1.5 Ltr. warmem Methanol. Nach Abkühlen auf 0° werden 210 g Harnstoff erhalten.
Man bringt das Filtrat i.Vak. zur Trockene und erhält 470 g
Z-Tyr-Ser-Met-OMe
(86 %), Schmp. 160-164°, nach Umkristallisieren aus 50-proz. Äthanol 166-168°. Das
Rohprodukt ist jedoch zur weiteren Umsetzung genügend rein. c) Z-Tyr-Ser-Met-N2H3
Der rohe Tripeptidester wird in 5 Ltr. Methanol gelöst.
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Man gibt 156 ccm 80-proz. Hydrazinhydrat zu und läßt über Nacht bei
Raumtemperatur stehen. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit Methanol und Äther gewaschen
und aus 4.5 Ltr. 50-proz. Dimethylacetamid umkristallisiert.
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Ausb. nach Trocknen i.Hochvak. bei 600 über P205 und KOH 348 g (74
%), [α]D = -15.5° (c=2 in 90-proz.
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Essigsäure). Schmp. 212-214° (Zers.) d) Z-Tyr-Ser-Met-Glu (OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH,
31120 82 g ZTyr-Ser-Met-N2H3 werden in 330 rom Dimethylformamid gelöst. Man kühlt
auf-10°, gibt 60 ccm 5n HCl zu und läßt bei derselben Temperatur unter starkem Rühren
die Lösung von 10.8 g NaN02 in wenig Wasser zutropfen. Man rührt noch 10 Min. bei
dieser Temperatur, gibt etwas Harnstoff zu und rührt nochmals 2 Min. bei -10°. Nun
versetzt man mit 450 ccm Essigester(-200) und 14 com Triäthylamin, gibt etwas NaCl
zu und trennt die untere Phase im vorgekühlten Scheidetrichter ab. Die untere Phase
wird noch zweimal mit kaltem Essigester extrahicrt, die vereinigte Essigesterlösung
wäscht man mit 10-proz. NaCl-Lösung und trocknet über vorgekühltem Na2SO4. Dann
wird i. Vak. bei tie=fer Temperatur auf ca. 400 ccm eingengt. Zu diescr Lösung gibt
man die Lösung von 9(3.4 g g II;Glu (OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH, CH3COOH, und
14 com zu ccm Triäthylamin in 700 ccm Dimethylformamid, Nach Stehen über Nacht im
Kühlschrank versetzt man mit 14 Ltr.
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Essigester. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Essigester
gewaschen
und durch Auskochen mit 1 Ltr. 90-proz.
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Methanol gereinigt. Ausb. 112 g (76 %) R(E): 0.68 [α]D = 16.
8 (c=2 in Dimethylformamid) e) H-Tyr-Ser-Met-Glu (OtBu) IIis-Phe-Arg-Try-Gly-OII,
4 H2O 14.6 g der nach d) hergestellten Verbindung werden in 200 ccm Dimethylformamid
gelöst und nach Zusatz von 8 ccm Cyclohexylamin und 15 g Pd in der Schüttelente
bei Raum, temperatur hydriert. Nach beendeter Reaktion filtriert man vom Katalysator
ab und fällt aus des Filtrat das Nonapeptid durch Zugabe von 2 Ltr. Essigester/Äther
(1:1) aus. Ausbeute 11.7 g (87.3 %) [α]D= -22,1° (c=2 in Dime"thylformamid).
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Rf(E) : 0.34 f) Boc-#-Alanin Die Verbindung wird analog der im DBP
1 212 553 beschriebenen Herstellung von Boc-Cys(Bzl)-OH erhalten. Sie wird aus Diisopropyläther
umkristallisiert. Schmp. 78-79° g) Boc- ß-Alanin-thiophenylester 18.9 g Boc-#-Alanin
und 12.5 g Thiopheol werden in 100 ccm Essigester gelöst. Man versetzt mit 22 g
DCC, rührt 4 Stdn. bei Raumtemperatur, saugt vom ausgeschiedenen Harnstoff ab und
destilliert aus dem Filtrat das Lösungsmittel i.Vak. ab.
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Die rohe Verbindung wird zweimal mit Petroläther verrieben und aus
n-Heptan umkristaliisiert. Ausb. 16.8 g, Schmp. 61-63°. h) Boc- #Ala-Tyr-#er-Met-Glu(OtBu)
-HI s- Phe- Arg Try-Gly-OH, 4 H2O (II) 5.6 g des nach e) hergestellten Nonapeptids
werden in 50 ccm Dimethylformamid unter leichtem Erwärmen gelöst. Man gibt 1.7 g
Boc-#-Alanin-thiophenylester zu und rührt über Nacht
bei 300. Das
gallertige Reaktionsprodukt wird mit Ätherausgefällt und zur Reinigung aus 250 ccta
60-proz. ethanol umkristallisiert. Ausb. 4.1 g [α]D= 16.40 (c=l in Dimethylformamid).
Nach Abspaltung der Schutzgruppen mittels Trifluoressigsäure R (A) : 0.53 i) #Ala-Tyr-Ser-Met-Glu
-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys -Pro- Val- Gly- Lys - Lys - Arg- Arg- Pro-- Val- Lys -
Val-Tyr-NH2 (Id) 3.3 g des nach h) hergestellten Boc-Dekapeptids und 4.4 g Tridekapeptid-hydrocklorid
1 hergestellt nach Chem.
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Ber. 97 (1964), S. 1197, werden 2 Stdn. bei 600 i. Hochvak. über
P205 und KOH getrocknet. Dann löst man das Gemisch in 50 ccm Dimethylacetamid/Pyridin
1:1, fügt 0. 9 g 4- Nitrophenol und 1.7 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und rührt
5 Tage bei Raumtemperatur. Das Reaktionsprodukt wird durch Zugabe von Essigester/Äther
1:1 ausgefällt. Die Abspaltung der Schutzgruppen und die Reinigung wird z.B. nach
der deutschen Patentanmeldung F 45 044 IVb/12 qu vorgenommen.
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Ausb. 2,5 g; Rf(A): 0,33 Beispiel 2 #Ala-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro--
Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-NH2 (Id) 15 ar Boc-Dekapeptid II und
17 g Tridekapeptid-Tosylat IIId(R=For) hergestellt nach J.Amer.che. Soc. 83 (1961),
Seite 2294, werden nach Trocknen analog Beispiel 1 i) in 300.ccm Dimethylacetamid
gelöst.
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Man gibt 4.6 g N-Hydroxysuccinimid und 8.8 g Dicyclohexylcarbodiimid
zu, rührt 2 Tage bei Raumtemperatur und fällt das Reaktionsproduct mit Essigester
ther (1:1) aus. Ausb. 31.2 g. Zur Abspaltung der Fornylscin@@/gruppen lost man in
3 I,tr, 2n methanolische Hydrazinacetatlösung @ne crwärmt 4 Stdn. au:E 65°, Dann
wird das Methanol i.Vak. abdestilliert. Man nimmi den Rückstand in 1.5 Ltr.
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Aceton auf, wobei Erwärmung eintritt. Nach 2 Min. gibt man 3 Ltr.
Äther zu, filtriert das ausgefällte Peptid ab und wäscht es mit Aceton und Äther.
Ausb. 28.2 g. Die restlichen Schutzgruppen (Boc- und tert.-Butylrest) werden im
Zug der Reinigung analog Beispiel 1 i) abgespalten. Ausb. 16,3 g reine Verbindung;
Rf(A): 0,33 Beispiel 3 #Ala-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-NH2
(Ia) (R - Boc) 19. 8 g Dekapeptidusld-Togylat lila hergestellt nach Chem.
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Ber. 97 (1964), 8. 1197, werden zusammen mit 15 g Boc-Dekapeptid
II 2 Stdn. bei 600 i. Hochvak. über P2O5 und KÖH getrocknet. Dann löst man das Gemisch
in 300 ccm Dimethyl acetamid, gibt 7.3 g 2.4-Dinitrophenol und 8.8 Ig Dicyclohexylcarbodiiiid
zu und rührt das Genisch 2 Tage bei Raumtemperatur.
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Rohausb. nach Fällen mit Essigester/Äther (1:1) 35 g. Abspaltung
der Schutzgruppen und Reinigung analog Beispiel li.
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Ausb. 12,8 g ; Rf(A): 0,36 Beispiel 4 #Ala-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-NH2
(Ib).
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(R - Boc) 22. 1 g Undekapeptid-Tosylat III b, hergestellt nach Chem.
Ber.
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97 (1964), S. 1197, werden mit 15 g Boc-Dekapeptid II nach Beispiel
3 umgesetzt, jedoch werden anstelle von 2.4-Dinitrophenol 10.7 g Pentachlorphenol
verwendet. Ausbeute nach Reinigung analog Beispiel 1 i) 14,1 g; Rf(A): 0,32
Beispiel
5 ßAla-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys -Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-NR2
(Ic) (R-Boc) 23.1 g Dodekapeptid-Tosylat III Ic. hergestellt analog Chem.
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Ber. 97 (1964) S. 1197, werden mit 15 g Boc-Dekapeptid II nach Beispiel
3 umgesetzt, jedoch werden anstelle von- 2,4-Dinitrophenol 4.6 g N-Hydroxysuccinmid
verwendet.
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Ausbeute nach Reinigung 17,6; Rf(A): 0,33 Beispiel 6 #Ala-Tyr- Ser-Met-
Glu- His- Phe- Arg- Try- Gly-Lys- Pro- Val- Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-NH2
(Ie) 22.4 g Tetradekapeptid-hydrochlorid IIIe (R=Boc), hergestellt nach Chem. Ber.
96, (1963) S. 609, werden mit 15 g Boc-Dekapeptid II in der in Beispiel 5 beschriebenen
Weise umgesetzt. Ausbeute nach Reinigung 17,4 g; Rf(A): 0,34