DE1467742A1

DE1467742A1 - Verfahren zur Herstellung von Antibiotica

Info

Publication number: DE1467742A1
Application number: DE19621467742
Authority: DE
Inventors: Growich Jun John Andrew; Nicholas Deduck
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1962-03-29
Filing date: 1962-03-29
Publication date: 1968-11-28
Also published as: BE628963A; GB952820A

Description

Die vorlio^ojide Erfindung "betrifft die Herstellung von Setracyclin. durch Fermentation, insbesondere gewisse neue llutantenstämme von Streptoiayces aureofaciens, die die Eigenschaft haben, ^Tetracyclin unter Ausschluß von Chlortetracyclin unabhängig von Oiiloridionengehalt des Pernientationsaediuma zu eriiaugo-i. . -.

Es ist aeit einiger Zeit bekannt, daß Mikroorganismen der Species Streptoisyces aureofaciens, die Setracyclin erzeugen, gleichseitig auch Ghlortetracyclin ergeben. Die gleichzeitige Erzeugung von Chlortstracyclin iat nachteilig, wenn tetracyclin das herzustellende Ilauptprodukt sein soll» Während im allgemeinen nach deu Arzneimittelstandard die Anwesenheit kleiner !.!engen von ChI orte tr acy elin in arzneimittel— reinem 2etracyclin vorliegen kann, ist die Anwesenheit beträchtlicherer Kengen an Ohlortetracyclin von Nachteil. Überdies bedingt das Torliegen dieser zwei Antibiotica in irgend-

ORfGfNAt.

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Neu© Unterlaaen

welchen beträchtlichen Mengen in der Fermentationsmaische schwierige Probleme des Abtrennens bei den Reinigungs- oder Extraktionsverfahren. Es ist natürlich möglich, die Antibiotica aus der Fermentationsmaische zu extrahieren und durch selektive Reinigungsverfahren eine Trennung der Antibiotica zu bewirken. Jedoch sind die Reinigungsverfahren zur Durchführung der Trennung der Antibiotica nicht ohne Schwierigkeit und bedingen gewöhnlich einen Verlust an antlbiotischer Gesamtaktivität, überdies kann Chlortetracyclin in den Fällen, wo Tetracyclin das Hauptprodukt der Fermentation ist, als Verunreinigung betrachtet werden und wird gewöhnlich verworfen, da es normalerweise nicht in genügender Menge vorliegt, um die Kosten eines getrennten Reinigungsverfahrens,um es auf den Arzneimittelstandard zu bringen, zu rechtfertigen. Bisher waren die Entfernung von Chloridion und die Verwendung von Chlorierungsinhibitoren die verfügbaren Mittel zur Unterdrückung der Bildung von Chlortetracyclin.

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, daß gewisse neue Mutantenstämme von Streptomyces aureofaciens bei der Fermentation Tetracyclin unter völligem Ausschluß von Chlortetracyclin erzeugen« Diese neuen Mutantenstämme von Streptomyces aureofaciens sind somit Chloridionen ignorierende Stämme, da sie unabhängig von der Chloridionenkonzentration des Mediums ausschließlich Tetracyclin erzeugen.

Die neuen Mutantenstämme der vorliegenden Erfindung sind Stämme der Species S. aureofaciens. Die nachfolgend beschriebe- nen S. aureofaciens-Stamme sind alle direkte Abkömmlinge des

aus Erde isolierten, Chlortetracyclin erzeugenden S. aureofaciens A-377, der in der US-Patentschrift 2.482.055 beschrieben und bei den Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois deponiert und mit der Indexnummer NRRL-2209 versehen wurde. Diese neuen Mutantenstamme von S. aureofaciens wurden durch Behandlung des A-377-Stammes mit mutagenen Mitteln, wie Ultraviolettstrahlung, Nikotin und Stickstofflost erhalten. Typische Mutantenstamme von S. aureofaciens, die chlorionenunempfindlich sind, wurden als T-135, T-l4o, T-1^3, T-225, S-2308 und S-2589 bezeichnet. Lebendkulturen dieser neuen Mutanten- fl

stamme wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Washington, D.C, USA deponiert und erhielten die folgenden Nummern:

Stamm ATCC-Nr. ■

T-135 13,908

T-140 13,909

T-143 13,910

T-225 13,911.

Im allgemeinen sind die neuen Mutantenstämme der vor- . liegenden Erfindung charakteristisch für die Species S. aureofaciens, unterscheiden sich jedoch von früher beschriebenen Stämmen von S. aureofaciens nicht nur in der Pigmentation, sondern auch in den Farben der gesamten damit erhaltenen Erntemaischen. Die Farben der gesamten Erntemaischen, die durch Fermentation mit den neuen Mutantenstämmen nach der vprlie- ·

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genden Erfindung erhalten werden, zeigen alle einen Wert von ; ΔΕ "bei 420 πιμ, der größer ist als derjenige von AR "bei 430 mu. ' . Die "beigefügten Kurven Pig. 1 Ma Pig. 8 sind Reflexionaspektrogramme von 1cm Glaasel-l-esv die mit der ganzen mit den neuen Mutantenstämmen von S.aureofaciens, der vorliegenden Erfindung erhaltenen_ $rnt<»aiseien gemesien wurden. Die.Kurve · des Reflexspektrogramms eines Materials ist' eine bleibende ' Aufzeichnung, die das Aufbewahren einer Probe überflüssig .· ' macht* Außerdem werden die Einheiten, in welchen die Kurve ausgedrückt ist, in der gesamten Pachwelt verstanden und anerkannt.. In Pig. 1 bis 8 ist die Wellenlänge des lichtes in mp. als Absfiese gegen die Reflexion als Ordinate aufgetragen.. Die Wellenlänge des Lichtes ist international als ßrundlängeneinheit anerkannt, auf welche alle anderen Längeneinheiten bezogen werden. Diese Reflexspektrogramme wurden mit einem . } Standard-Spektralphotometer unter Verwendung von magnesium- « - carbonat als Bezugsmaterial aufgenommen. . _ '-; Der Buohstabe R bezeichnet den Reflexionewert bei einer ■'·, bestimmten Wellenlänge, so ist beispielsweise Rjjqq der Reflexions wert bei der Wellenlänge 500 mu. Das Zeichen AR bezeichnet den ' _; vertikalen Abstand zwischen der Seflexionskurve (wenn sowohl ? die Werte für ^-Reflexion als auch die Wellenlänge im linearen . Maßstab aufgetragen sind) und einer Geraden, die durch die ' . ■ Kurvenpunkt· bei 400 mu und 550 an gezogen let» Diese graphische Bestimmung der Werte'für AR bei. 420 mu und 430 au kann leicht durohgtftüirt werden/ Weiter verleihen in jedem Pail ■ die neuen Mutintenatämme der vorliegendes Erfindung der ge-

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samten Ernteniaiaelie eine solche Farbe, daß AR bei 420 mu größer ist ala ΔΒ. bei 430 mu,.

Die mathematische Bestimmung der Vierte von ΔΚ. bei 420 mu und 430 ημ kann auch, mittels der folgenden Gleichung durchgeführt werden: . · "

ΔΗ bei 420 icfi=20 (R₅₅₀J + 130 (R₄₀₀) -150 ΔΕ bei 420 Hu=30(

. worin R₄₀₀* ^420» ^£4"0 ¹^ ^Γι550
V/ellenlängen 4OO εμ, 420 ηιμ,- 450 nu und 550 mu darstellen. Diese mathematisclis Eostimxauns hängt nicht von der Skala ab, die für die ^-Reflexion oder die Wellenlänge verwendet wurde.

Eine "gesaiite Erntemaiache" ist die unbehandelte Maische» die man erhält, wenn die !Fermentation zu dem Punkt fortgeschritten ist, wo die Biosynthese eines Bauptprodükts prak-. tisch beendet ist. In allgemeinen steigt die antibiotisehe Aktivität der Permentationasiaiselie nicht mehr beträchtlich, wenn-die Fermentation etwa 140 bis 160 Stunden lang angedauert hat. -

Om die visuellen Sarbunterschiede zwischen den neuen Mutantenstämmen von S.aureofaciens, die ausschließlich Tetracyclin produzieren, zu zeigen, wurden diese Stämme auf Maisquellagar gezüchtet und die folgenden Beobachtungen, durchgeführt.

BAD

3098 10/13 19

■1)

Farbbeobachtu ο ^c>·> r^ B. ρ.υ re of aci ens i

AP4

6 !age Inkubation bei 26.5°C

Stamm Einzel-Eolor-ioii

Hass enwaclistuni

ΐ-135 Dunkel lcaiarbsn (Dark luggage tan) Ahornfarben (Maple) !-140 Orange rostfarben (Orange rust) Ahornfarben (Kaple) 1-143 Eichenbrarai (θεώ brown) Hellbraun(Light brcwa !-225 Dunkel lohfarben (Dark luggage tan) GeIb ahornfarben

(Yellow maple)

1) 3?arben nach "Color Harmony 3£anuc£}.ⁿ, dritte Auflage, Container Corporation of iliaerica.

Parbbeob&chtunken '% S, aureofaeienst

AP6-I,iaiquolla.c;ar: 6 Tage Inkubation bei 26_%5°C

Stamm Einzel-Kolonien

Kaa s enwachstum

2-135 Lohfarben (Luggage tan)

I-HO Orange rostfarben (Orange rust)

!-143 Dunkel lohfarben(Dark luggage tan)

!-225 Lohfarben (Luggage tan) ^

Hell gewürzbraun (Light spice brown)

Ahorn (Maple) Ahorn (Maple) Ahorn (Maple)

1) Farben nach "Color Harmony XfanuGpL", dritte Auflage, ■ Container Corporation of America.

BAD ORIGINAL

809810/1319

für

Saccharose	10	_g .
	0	»25 g
KH^PO₄	2	β
	" ■ .£
Maiaquell\rasaer ν	4	&
Agar nach Bacto (·ϋ<*·^ aV	20
mit Wasser auffüllen auf	1000	a!

wie für AP4-Afar,>

β g pro XiterKaisgueliwasser.

Die aeueu Mutantenstäaaae von S_fsar©oXacieas der-Tor- . Erfindiing, die ausscliließllcii Ietracyolia produ- ;

ziere»* weisen äie gleiclis allgemeine Charakteristik auiy- '

-· ■ ■ ■■ ■ ' ^: ■ - - . ' . . . ■ v diöjenigen Stämme, die sowohl Chlörtetracyclin als auch

y proäuzieren xuid tuitersoheidea sich untereinander auf die gleiche allgomcine Weise, wie sieh die Tetracyclin produzierenden und Chlortetracyclin produaierenden Stämme voneinander unterscheiden und vrie dies in einer Anzahl του wissenschaftlichen ?erö£fentlichungen beschrieben wurde. Hie nachfolgenden Daten dienen sur weiteren Unterecheidung ϋίΰτ neuen Hutantenstäiame τοη S.aureofaoiena der vorliegenden Erfindung τοη den vorher bekannten Stäaaaetn τοη fl.aureofacienn, wie dem Originaletaimii A-377» 4er al» SSBIr-2209 erhftltUch let. . . ,·. '"

ly

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1487942

Die neuen StrtptomfCtS aureofaciena .Mutantenstämme ■wurden von S.AKr#ofacie»S A-377 (HRRIr-2209) durch Beobachtung von Wachstumseharakteristiea an verschiedenen Medien beim Inkubier en bei 26,5⁰C dif- / ferenziert* ' · ."·'-"'■'·''■"-

1« 'Slyeerin-Asparagin-Pleiaohextrakt-Agar

Glycerin — — -—«———— i_to

1-A8paragin —·—-—- 0,0!

Jleiachextrakt —-^-^~....... o,2

Agar nach Baeto ————...-.,- ,, -j_t5

mit dsatilliertem Wasser auffüllen auf —-—100,0

pH-Wert eingestellt mit 50$ KOH auf ~ ■■ -7,0

pH-Wert nach Sterilisieren —~~~~~-.._r ..■■ 7,2.

♦ ':- V·"; ■

ft-o.Aaiu7ia.i-fl.

aureofaciena

Wachst»»

Sporula» tion

!Piffundierbares
Pigment ;

Rückseite

' O

ί-135 gut, hyallnj apigmentiert-bis !P (topaz)*·*

J -HO gut, hyalin; apig mentiort M S (topaa)'

"*43 gut, liyallRi

l0ilfS3?T3 (

luggage

auageseie&aet

/."■•377 gut·

j weiß

sohwaoh,

; weiß

p "bis aiem«

Iicli gut, weiß_t il"b d

"bia

sehr

biherfarbea VrQ₁ de^a. (light fawa "bis Ί)

saJxwaßh Ida i gut, weiß Tais (light

kslae

keine

keineg

ehiibrauÄ werdend (2opaz*oak brown werdend)

Hyalin, Sopaa, eiohenbraua werdend (ajopaz/oak brown werdend)

gut

sehr reioh-Hell

hell bernstein- Hyalin, dunkelbraun (light

ziemlich gut

hellgelb

dunkelbraun Mahagoni A

gelb bis
gelb

Farben nach Color Sarraany lamual,
Container Corporation of Amerioa.

β*

"'Jf

2. Jtxtritt

Dextrin ~—■

BTaITO₃

MgSO..

PeSO^.7H₂O ■

Agar nach. Bacto

destillierte^ Wagper, pH-Wert nach. Sterilisieren

t_r0 Ji 0,2 Si 0,1 * 0,05 ft 0,05 5t 0,001g 1,5 ft, 100,0 # 7»2

Streptomycea aureofaciena

Staina

Wachstum .

Iiufthyphen

Sporulation

Diffundierbarea
Pigment

Rückseite

ί-135 schwach, dünn» halb durchscheinend!

schwach» weiß

keine

keines

weiß, durchscheinend.

t-140

I-U3

schwach, dünn» halb durchscheinendj weiß»

achwach,dünn» halb

durchscheinend;

weiß¹

schwach, dünn, halb dttwitstsfretoteiea ©■ pec Iv «eifl.1 '

A-377 gut

keines

schwach» weiß

keine

reichlich» maus- * sehr reichgrau (mouse gray) lieh bis bleigrattj
wasaerhellö Obear«
flächenkügelchen
(water-white surface .■ [ _s globules)

keines

Spuren; blaßgelb

weiß, durchscheinend

weiß» durch* scheinend

weiß, durchscheinend«

apigmentiert» rosa Spuren.

farben nach Color Harmony Manual, 3. Auf lage, Container Corporation of America.

3. Αϊ.

1*67*42

Maisquellwasser — : 0,4- f»

Saccharose ———-■_ 1,0 $

MgSO₄-TH₂O . · 0,025 $

^KH2^P04 """■""*' ~" ~ '— °»² St

(M₄)₂HP0₄ ~- _: r 0,2 j

Agar nach Bacto. — ~ 2,0 #

mit. Leitungswasser, auffüllen auf --——100,0. #

pH-Wert nach Sterilisieren —— . ·. 6,5

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Streptonyoes aureofaoiena

	Stamm	77achatum	3iufthyplien ν*	Sporula- tion	Lösliches Pigment	Rückseite
	T-135	mäßig '	spärlich, reichlich werdend; biber- farben (beaver)¹	mäßig bia reichlich	orange-braun	hellbraun bis schoko ladenbraun
OO ■ ' O co	Ϊ-UO	näßig	mäßig; biberfarben bia schokoladen- farben (beaver· bia chocolate)	mäßig	orange-braun	Kastanienbraun bis tiefbraun .
ε i/o 18	!P-U 3	reichlich.	reichlich; blaß- gräulich-braun (fawn¹)bia biber- farben	mäßig bis reichlich	hell orange- braun	tiefbraun bis dunkel braun
—» IO		reichlich	sehr reichlich, * schokoladenfarben	sehr reich lich	hell orange- braun	dunkelrosabraun bia Sbenholzbraun·
	A-377	ausgezeichnet	reichlich; blaß gräulich-braun (fawn)¹	sehr reich lich	hellgelb bia bernstein farben	hell lohfarben

Farben nach Color Harmony Manual, 3«Auflage, Container Oorporation of America.

ι σ»

AP6 :.:_ir v^--..ll-Agar

Iiaisquellwa3ser .__....___._-_, 6 g

Saccharose 10 g

MgSO₄.7H₂O 0,25 g

•irpr -pn ___ _, ,. -■„.,«,..-„.■.„„ 9 o·

"i PT^fI ___— ., ,, ■ , ι., ■ - . η. ι»-.»·.. .η.r.. 9 C

/2^ο"¹* 4 ——~ *"" " *■ e>

Agar nach Baato ^— 20 g.

mit Ieitungsraaaer auffüllen auf 1000 ml.

pH-Wert nach. Sterilisieren 6,5»

80 98J0 /13J 9

StreptoEiycea atireofaoiens

Stamm

Waohaturn

Iiufthyphen Sporulation

Lösliches Pigment

Hückseite

•Ε« 155 reichlich

mäßig bis reichlich} blaßgräulich-braun (fawn)' bis graubraun (mist brown!) mäßig bis.
reichlich

orange bis orange-braun

'. kastanienbraun bis dunkelbraun

3M4O reichlich

OO O CO

2-143 reichlich ■

T-225 reichlich

A-37? ausgezeichnet

mäßig bis reichlich: sehr reichbiberfarben (bearer¹) lieh bis blaßgräulichbraun (fawn) - ·

schwach bia mäßig; beige¹ bis graubraun (mist brown)

reichlich; schokoladenfarben Λ (chocolate )

mäßig bia reichlich;

blaßgräulichbraun

(fawn¹) ziemlich
gut

orange bis orange-braun

orange-braun

sehr reich- orange-braun lieh

kastanienbraun bis dunkelbraun

schokoladenbraun

ebeiihoi ■; λ ' (Ebony ν: ο....)

orange bis orange· gelb.

** farben nach Color Harmony Manual, 3.Auflage, . Container Corporation of America. _f

5. Q* Maisquell-Agar

Maiaquellw&seer Saccharose -—«—

mit Wasser auffüllen auf

pH-Wert nach Sterilisieren —

■ ¹O V\ - 0,25 g^f ν ² '■«.· ·■ 30 g 1000 ^: ml.

6,5.

ρ-." -	Wachstum	Str.eptoHaßje's, aureofaeiena	Sporula- tion	• . ·■	Lösliches Pigment	•	■^»»-
. Stamm	reichlich	Lufthyphen	reichlich	tieforange- braun	Pdickaeite
·'' 2-135 ■	sehr reichlieh	reichlich; blaß gräulich-braun (fawn¹) bia biber- farben ·	reichlich	tief-orange braun	kupferbraun bia tiefbraun	Φ
ί j T-HO'	sehr reichlich	sehr reichlich, blaß-gräulich-braun (fawn') bis biber- farben	sehr reich lich	tief-orange braun	kupferbraun bis tiefbraun
α?-Η3		sehr reichlichι beige' bis grau braun (mist brown)			tiefbraun bia schokoladenbraun

Ϊ-225 sehr reichlich

sehr reichlich, * schokoladenfarben

sehr reich- bernsteinlich farben

A-377 ausgezeichnet! blaßgelb
(pale yellow¹)

sehr reichlich; dunkelbraun

sehr reich- orange-braun
lieh

orange bis orange-gelb

!»ärben nach Color Harmony Manual» 3«Auflage Container Corporation of America.

/t

β. r

Medium

Streptorayces rmroofaciens ^s ·

Stamm Ϊ-135 Stamm 1-140

Nähragar schlechtes Ms ziemlich gutes Wachstum; weiß bis blaßgelb (pale yellow^). Keine lufthyphsn. Rückseite; weiß bis blaS

Glucose/ gutes Y,'£ch3tu::i; hyalin; Asparagin- apigiaenticrt bis olaß-J¹MsChorange (p:il£.oran%;o '). extrakt- Keine LuIthyphen. Sück-Agar saiteί apigmentiert bis blaß-orange.

Waksman's
Agar

Purpur«
milch
(Purple
Milk) ^l

Xartoffelachräg~

agar

gutes Wachstum, halb undurchsichtig (semi-opaque)j weiß bis blaß-orange (pale orange'). lufthyphen: spärlich, reichlich werdend; weiß bis blaß-gräulichbraun(fawn). Sporulation: spärlich, reichlich werdend. Rückseite! dunkel lohfarben bis dunkel gewürzbraun. (dark luggage tan bis dark spice brown).Hell "bernsteinfarbenes, lösliches Pigment.

"blaßgelber (pale yellow ) Wachstumsrand. teilweise Peptonisierung_tpH 7,1 schlechtes Wachstum; ^ bis blaßgelb (pale yellow }. Keine lufthyphen. Rückseite: weiß bis blaßgelb.

gutes Wachstum; .hyalin, apigmentiert bis blaß~ orange (pale orange'). Schwache Lufthyphenbildung; weiß. Rückseites apigmentiert bis blaßorange.

gutes Wachstum» halb undurchsichtig; weiß bis * blaß-orange (pale orange )_t mit zunehmendem Alter orange werdend. Lufthyphens spärlich,reiehlich werdend^ weiß bis biberfarben. Sporulation: spärlich, sehr reichlich werdend. Rückseite; beige bis kupfer braun. Spuren von hell ". bernsteinfarbenem löslichen Pigment. '

blaßgelber Wachstumsrand teilweise Peptoniaierung, pH 7,0.

sehr reichlich, feucht, sehr reichlich, feucht, knb" tchenförmige s Wachstum; knötchenförmiges Wachstum j kastanienbraun' "bis dunkel- hell-gewürzbraun ·. Barngawürzbraun, rostbraunes ·, rotes (Barn red) lösliches lösliches Pigment, Pigment.Schwache weiße

Iiufthyphenbildung.

1 .» Farben nach Color Harmony Manual, 3.Auflage, Container Corporation of America,

BAD ORIGINAL

8 0 9 8 10/1 3.1

/f

! ntorryn r> ^ r.-.ir eo'.V. e

Medium

Stamm T-H3

Stamm 2-225

Hähragar

schlechtes Wachstum: woiß schwaches "bis ziemlich,
"bis hell-orangegelb (light gutes Wachstums weiß biö v orange-yellow^). Keine Luft-goldbraun· (golden brown')« hyphen. Rückseite: weiß Ms Keine Lufthyphen. ■> hellorange-gerb. Rückseites durchscheinend +'·

weiß Ma luftziegelbraun ■',

(adobe brown). Kein, lös- ^

. lichee Pigment. .:.',·

Glucose
Asparagin
fleisch- .
extrakt-Agar

Gutes T/achatu:*

reichliches Wacheturn.

tfuxes r/acns/cu:*: ^j^x&n, rexcnxienes wacneiium.

blaßgelb bis orange"¹. Luft- Sehr reichliche Lufthyphen} hyphen:''.schwach, v/eiß. biberfarben (beaver·)* '■.■■■:.

Riickseitej hvalin: "blaß— Sr>orulations äsehr reicli—' ·

Eüekseite: hyalin; blaß gelb bis kupferbraun bis tiefbraun.

Waksman*s gutes Wachstumi hell-loh-Agar farben bis Topas (topaz¹). Lufthyphen: ziemlich gut Ms reichlich * beigebraun bis blaßgräulich-'braun (fawn). Sporulation: schlecht, sehr reichlich werdend. Rückseite: Dunkel lohfarben (dark luggage •tan) bis tief braun. HeIlbrnieinfarbenes bis bern-Bteinfarbenes, lösliches Pigment.

Kartoffelschräg-

Agar

sehr reichliches, feuchtes, knötchenförmiges Wachstum; biberfarben' bis hellgewürzbraun. Dichte weiße Lufthyphen an isolierten Herden. Rostbraunes, lösliches Pigment.

Purpur- "' blaßgelber (Pale yellow ) milch Wachstumsrand._φWenig kenn-(Purple zeichnende pH-lnderung Milk) · ■ oder sichtliche Peptoni- ■ sierung· pH 6,7.

Sporulation: sehr reichlich. Hückseite;. dunkel * auberginenfarbig (dark eggplant). Sehr hell bernsteinfarbenes lösliches Pigment. \

reichliches Wachstum. Reichliche Lufthyphen! taupebraun· bis schoko- ·'■' ladenfarben. Rückseite» ·· ebenholzfarben. Hell bern-, steinfarbenes, lösliches ;;_; Pigment» ." ' ·.-.·· -<^:-*%

ruisu

sehr reichliches, feuchtes, gl^t^r- knötchenförmiges · >. Wachstum; orange-rostfar-;, ι ben (orange rust¹) bis ,-Vl eiohbraun, mit zunehmen- .| dem Alter schokoladen- .-.; j farben werdend. Orange- r | braunes, lösliches■Pigment *

schwer blaßgelbe3(heavy '^ pale yellow·) Wachstums-■'■'.;.? rand. Seilweise Peptoni*' ' sierung, pH 6,78. Kein ;;.; lösliches Pigment·", ^: ν

farben nach Color Harmony Manual, 3.Auflage Container Corporation of America.

809810/1319 * ■ -^i

146774

StTeρtomyces anreofacicns

Kedium

St*TTiTn A-377

Nähragar gutes Wachstus- Keine Lufthyphen. Blaßgel"be3' lösliches Pirinont. Iiüekai t e: öl au j el ο.

Glucose Gutes 7/aehstua. Lufthyphen weiß, Asparagin mit zunehmender Sporenbildung Fleisch- zunehmend grau werdend (gray'), extrakt- Spuren: gelb-oranges lösliches Agar Pigment. Hückseite: hellgelb bis rosa-orange.

Y/aksman's Gutes Wachatura. lufthyphen aieni-Ägar: lieh gut, reichlicla werdend: weiß bis taupebraun (taupe— brown'). Hellgelbes, lösliches Pignent. Küekoeite: Kamel- bis luftziegelbraun (camel bis adobe brown).

Kartoffel- sehr r^eIiIi .;h.:s, fsuchtes,

Q λΙι Τ*ϊ3 IT« "1 ίί *ί~ "frs * - \^Γ "· ■ f'\ ί" / "*~ "· ■"· *Ήΐ*",' "ί TOC»

agar Waahatuia, holl-braungelb (light brovm-yellow') bis beige bis cedernfarben,- Kein lösliches Tiginent.

Purpur- Schwach gelber (slight yellow ) milch bis blaßgelber Wucharand. (Purple v'/enig kennzeichnende pH-Änderung MIk) oder sichtliche Peptonisierung in 14 Tagen. pH 6,45.

Parten nach Color Harmony Manual, 3.Auflage, Container Corporation of America.

9 8 JJ0Ü3J 9

BAD ORiGfNAL

ti

7« MiTkroalcopl sehe Beobachtungen

Sjre ptomj ce S autreο fa -,1.ona

Sbamm 'U-135 Bbamiii T-HO

!»Tedium

My eel

Üporen Liyoel

Sporen

AP₄ Mais

q.uell-

gewunden, fortlaufenä, verzweigt. 0 0,3-1,0 a steroidal gewunden, bis eifornig»furtlaufend, # 0,8-1,5 μ vcrav/eigt. 0 0,3-1,0 μ

spheroidal bia eiförmig. 0 0,8-1,5 u

gewunden, fortlaufend, verzweigt. 0 0,3-1,0 μ

spheroidal gewunden,

bis eifor- fortlaufend,

ctig. ve x'zweigt

0 1,0-1,2 μ 0 0,8-1,0 μ

spheroidal bis eiförmig. 0 1,0-1,2 ρ

./akaiaan'a
Agar

gewunden, fortlaufend, verswoi^u» 0 0,8-1,0 u gewunden, bia eiför- fortlaufend, :.iiC· verzweigt. 0 1,2-1,5 u 0 0,8-1,0 μ

spheroidal bis eiförmig. 0 1,0-1,2 u.

'..'•sdiuift

llillj" " ■ ■„' "·*'*^'» γ* i.t:.-u Q-Teicχ ο? -i-.,..ri μ ■).- -.-

My c el

Sporen Stamm ΐ-225 Myeel Sporen

Asparagin

Fleisoh-

extrakt-

gev/unden, fortlaufen:!, verzweigt. 0 0,8-1,0 u

3ph.eroidal gewunden, steroidal

bia elfor- fortlaufend bia eiförmig.

TTiIz* "verzvreigt. 0 1,2-1,5». 0 1,0-1,2 μ. 0 0,8-1,0 μ.

AP, LIaisl

, LIa
'lll-

gev/unden, fortlaufend, verzweigt, 0 0,8-1,2 μ

apiieroidal

bi3 öifor-

aig.

^ 0,8-1,5 gev/unden, spheroidal fortlaufend bis eiförmig verzweigt. 0 1,0-1,2 u. L. 0 0,8-1,0 Ji,

ii 0 VJ 3 1 ü / 13

Medium

Streptomyoea aureofaciena Stamm A-377 ■

liycel Sporen

Glycerin/
Asparagin
I¹Ie is chexfcraktagar

gewunden

i'orilauf end v/aigt d~1_r0 μ

^Λ Ρ "L

fiai a quell- gey/mid ^a

.Spheroidal his ei förmig.
0 1,0-1,5 u.

bis ei-

>' 1,2-1,5 p.

Die Bodiiigiin^on der fermentation aind im ali_d';e*- nieinen die gleichen -..'ic i"ür die gegeiiviärtig bökannfcen Verfahren aur Herstellung von Chlortetracyclin durch Jermenbabion. "Dan-hei!.·t₃ "iaa "IPernontationsmedLim enthalt die üblichen tiährstox'fe mid !.liner al sub a tanken. Zu geeigneten ifährsubstanzen gehören Stärke, Dextrose, Rohrzucker, Glucose, uölacii-jo, Ga.jubohneniielil, läilchfeststoffe, RsLa₁ ?leiach.e:cbrakte, Peptone, Harnstoff, liaiaq,uellflüasigkeit, ipestillatio-naniaischen·', fischmehl und andere herkömmlicho Substanzen. Zu nnorgraiisohÄ Salaen gehören beispielweise Calciumcarbons-t, Anaionsulfat, ^.nonchlorid, und die Salze der verschiedenen Spurenelemente v.'is luangan, Kobalt, Sin!c, Kupfer, Eisen und dev^ic-ic-han.

Die anderen allgeineinsn Bedingungen, für die P:3r~ mentation wie J

BAD

8 0 9 3 1 0 / S -v; il

Zeit, Geschwindigkeit der BeiüΓlung, Herstellung dea Inoculuma, Sterilisierur-, Inoculierung und dergleichen sind herkömmlich und JcÖiwen ähnlich ^u den für die Herateilung von Chlortetracyclin benutzten aein, wie sie in der US- ^atentschrift 2.482.055 beschrieben werden.

Die Gewinnung der Tetracycline aua den Permentationaflilssigkeiten i-at hcrlcörr-lich und bedarf keiner Erläuterung, da zahlreiche Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin aua FermentationsflüasxgKeiten schon veröffentlicht sind .

Die nachfolgenden !Beispiele dienen zum besseren Verständnis der Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1 Herstellung eines Inoculums von S.aureofaciena Stamm S-2308

Sparen von S.aureofaeiens Stamm S-2308 wurden von Schrägagar mit sterilem destillierten Wasser gewaschen, was eine Suspension mit 60-80 χ 10 Sporen/ml ergab« Ein Teil von 0,33 ffil dieser Suspension wurde verwendet, um einen <| 20,3 cm (8") Schüttelzylinder zu inoculiscen, der 8 ml eines Mediums enthielt, das nach folgendem Rezept hergestellt wart

Saccharose 30 g

Ammonsulfat 2 g

Oalciumcarbonat 7 g

Maisquellwasaer .................. , 16,5 ml.

Leitungswasser, auffüllen auf .... 1000 ml.

8 0 9 810 /131 9

' . Tor dez¹ Irtoculierur*; wurde däa Medium im Autoklaven. 20 Minuten uniac einem Druck von 1,05 lcg/ca (15 pai) eteriliaiert» wobei sich, der pH-Wert von 6,3 auf 6,9 Haderte. Der inooulierte Schüttelzylinder wurde dann 24 Stunden bei 2S⁰C auf einer hin- und hergehenden Schüttelmaachine mit 116 Schwingungen pro ί;_.-Γ- ±j\ceuliert. Die Inocula der andern neuen Mutantenstäiame der vorliegenden Erfindung werden auf'identische Weise hergestellt« . \". :· -V^::'""·.-.

- " "- ■-·-'■■ · Beispiel 2 : .'"■." ^: - ' . ^; ' ■· ■-'"■

. '* '■- . ·· '■-■- · X ' '■■■'·.·" ■·' • Chloragtin-I-geat zur Differenzierung von getraoyolin .

; · . "· ν und Chlortetraoyclin ' ■·' " - -' ■';

Die Stanmlösung A wurde hergestellt durch Auflösen von 100 g Chloramin T in 900 ml 0,1tfv£a~P0, (38 g Ηβ^ΡΟ^· 12H₂O/1.000 ml destillierteS Wasser). Eine Arbeitslösung B wurde hergestellt durch Mischen von 180 ml der Stammlösung A mit 820 ml einer wäßrigen lösung von Xthylendiamintetraessigsaurem Uatriumaai«· (5 g pro 1.000 ml destilliertem Wasser). Zur Durchführung des eigentlichen Seats wurden 0,5 ml der zu untersuchenden Permentationsmaische in einem Reagenzglas mit 20 ml der Arbeitslösung B gemischt» Das wird dann intermittierend 30 bis 60 Minuten lang geschüttelt Am Ende dieser Schüttelzeit wird das Reagenzglas auf seine* farbe untersucht. Maischen mit. hohen Konzentrationen an Tetracyclin färben sich weinrot (positive Reaktion), während Maischen mit hohen Konzentrationen an Chlortetraoyclin eine

BAOORfOfNAL < 809810/1319 ,- . ^Jk

tiefe Berasteinfarbe ergeljsn. Dieser Chloramin-T-iEest ist ein weiteres Mittel, um die neuen Mutantenstämme der vor- , liegenden Erfindung von äen bisher bekannten Stämmen von S.aureofaciens zu differenzieren. .

'". Beispiel ^ . . . ^: ·

Sirbernitrat-Test- auf CMLoriaion .1

■ . f . .· ■

Zu einem 10 lal-Anteil aer gesamten Peraentationsmaische werden 10 ml 0,2i:\.KlIö, tmd 0,5 g chloridfreie DiatomSnerde-Pilterliilfe zugesetzt. Die vereinigten Materialien werden gründlich gemischt und dann filtriert. Bas so erhaltene Mltrat wird nochmals so oft filtriert als notwendig ist, um ein klares Piltrat zu erhalten. Dann werden 2 ml 0,01KW AgSO, zu einem 2 ml-Teil des klaren Piltrata in einem Eeagenzglas zugesetzt. Die Mischung wird eine Minute lang "beobachtet. Die Bildung von AgCl, die entweder als Trübung oder als weißer Niederschlag zu "beobachten ist, zeigt das Vorliegen von freiem, ungebundenen Chloridion in der gesamten. Maischeprobe .an. . . >

Beispiel 4

getracyclinherstellung durch Fermentation in Schüttelflaechen A. Voli—chlt>ridIia3rtlgea-^/Iedium · ■' ,/

Bin Permentatioiismedium mit VOÜem Chldridjjehalt zur Herstellung von Tetracyclin wurde' wie folgt hergestellt;

809810/1310

(BH₄)₂S0₄.. 5 S

CaCO₃.... 7-9 g

1,5 g

0,4-0,6 g

MaSO₄.4H₂O 0,05 g

- ZnSO₄.7H₂O 0,1 g

Maisquellwasser 20-30 g

Baumwollsamenmehl 0-2 . g

_Ä Stärke ., ............, 55 g

P ' c · ^; ·■■■!"

Sehweiaae-aehmalzöl- 20 ml

■ - J

ait Leitungswasser auffüllen auf 1000 ml·

B. Medium mit "begrenztem Chloridgehalt

Ein Permentationsmedium mit begrenztem Chloridgehall; zur Herstellung von Tetracyclin wurde wie folgt hergestellt ι

(HH₄)₂SO₄ 6,83 s

CaCO^ 7-9 g

MnS0₄.4H₂0 .......... 0,05 g

ZnSO₄-TH₂O 0,1 g

liaiaquellwasser 20-20 - g

Baumwollaamenmehl 0—2 g

Stärke .; ... 55 g

' BcwaillohmalzoT 20 ml

mit leitungswasaer auffüllen auf ......... 1000 ml·

80 98 10/1319

Itinf 25 ^l l-:xic.i.l.t3 beider Medien wurden in. zelin ' *' 250 ml Erlemneyerkorben gegeben, in jedem PaLl jsit einem , Baumwollstöpsel verschlossen und in einem Autoklaven 20 Minuten "bei einem Druck von 1,05 kg/cm (15 pei) sterili- . siert. Nach dem Steriliaicron wurde ^edea ?aar der 25 ml— . Anteile auf verschiedene Weise mit 1,0 ml eines .wie im "' '

Beispiel 1 hergestellten Inokuluma -inokuliert. Die !Fermentation wurde in den ersten 18 Stunden "bei 28⁰C und dann vom Ende der 18. Ms zu.· 142 Stunden oei 24⁰C fcei pH-Wert 6~?
auf einer rotierenden SchüttelmascMne mit -180 UpM durchgeführt. Unter diesen Bedingungen wurden die in
angegebenen Ergebnisse erhalten. . ' -.:.:' -

809810/1319

! 9 I

Prüfung .

Stamm Me- Chlortetra- !Tetracyclin Chloramin- Silber-Uo. dium cyclin _t J ₅ meg'./ml. . Test· ... ;■ nitratlest²

2-135;	A	<5O⁵	2460	+	''■■'.. ■ + ' ■ .'·
	B	<50	2510	+
f-HO	A	<50	2210	+	; '■'.-■ + -
' -·■ "	B	<50	2200		+ '-■
1-143 «	A	<50	, 3820	- +	- ·■■".'■+·
	B	<50	3470	+
1-225	A"	^5O	3890	■. +	■■."■' ^;- ■■-+"' :
	B	<50	3990		.·'■ ^: '".+ ■·-:
S-2308	A'.	<^0"	6580	+	• ■'"'"+'
	B-	. -C50	6520

-\ .* Chloramin-T-Oiest,nach Beispiel 2. ' ;

2 » Silbern!trat-Sest nach Beispiel 3«- '

· Kulturen zeigten jedoch bei der Chromatographie

"■· ""·.. an Papierstreifen kein Chlortetracyclin.» ■ ? Γ

809810/1319

Tetraoyciinherstellur · "hoi der Fermentation in Schüttel- ' ■

■ Wirkang der Auraonehlpriflkonzentration

Das Permentationsmedium A des Beispiels 4 wurde ^:. mit einem Gehalt an UH₄Cl von 0,0, 0,1, 0,2, 0,5 und 1,5 g/l und einem konstanten Gehalt von 5,0. g/1 (HH^gSO, hergestellt« Die Fermentation wurde wie in Beispiel 4 "beschrieben durch geführt, wobei sich die in der Tabelle 2 angegebenen Ergeb-' ■ nisse zeigten. . · ^; · ■" . ·

	BH₄Cl	Tabelle II	¹ -	Prüfung	3430	Silber-
I	Stamm Ge— No. - halt g/l	Chlortetra- [!tetracyclin cyclin mcg/ml mcg/ml	2770	, ■ nitrat- " . ' 3?est¹
T-225 0,0	<50²	2900 ;	+ ·■-.-'· '■''_'■
0,1	<50	2940	... ₊ , .- ;.,
V 0,2	<50	3390 -— "3390—~Τ"~
. 0,5"	<50	5760	:■·"■ + ..:■>.-."
■1,5 ;	<50	' 4580 .	"T-... -·-+
S-2308 0,0	<50	5080	■■'■+-. . ■:.■■ ■■
··■'. 0,1 .	<50	5440 .	: -+ '"■ ■·-.
0,2	<50	6080'
0,5	<50
1,5	<50	♦ ■

Silbernitrattest nach Beispiel 3·

Das Prüfverfahren auf^ü^äffcetracyolin ist nur bis her unter auf 50 mcg/ml empfindlich. Die Kulturen zeigten je doch bei der Chromatographie an Papierstreifen, kein

9810/1319 " :-.:, ·

• ' . · ■ · Beispiel 6 · , . _'·'■■

Eeaktion der tetracyclin produzierenden Stämme
■ auf ultraviolettes Sicht -

. Die neuen Mutantenstämme der vorliegenden Erfindung können leicht von bisher bekannten Chlortetracyclin erzeugenden Stämmen von S.aureofaciens (sowie von festgelegten Stämmen, die vor allem andere bekannte !Tetracycline wie s beispielsweise 6-Desmethyltetracyclin, 7-Chlor-6-desmethyl- ·» tetracyclin und 7-ChlQr-5$"(11;^)-dehydrotetraeyolin. erzeugen) '·. durch Vergleich der unter Ultraviolettlicht größerer Wellen-

i O

.; länge, vor allem bei 3660 A,erzeugten,Pluoreszenz differenziert werden. Ein besonders geeignetes Medium für Wachstums*- und Fluoreszenz-Beobachtungen ist Qq Sporulationsagar, das wie folgt hergestellt wird:

; ,. .MgSO₄'.7H₂O .0,25 g

KH₂PO₄ 0,4 g

; " (M₄)₂HP0₄ ' 0,4 g

Saccharose ......."... 15 . g

' Nährmedium nach Staley Fr.22 9 g

mit Leitungswasser auffüllen auf 1000 mT.

Der pH-Wert dieses Mediums wurde auf 6,6 mittels einear [ SO^igen KOH-Lösung gebracht und dannYi7,5 ml Anteile des Mediums in.25 x 150 mm Kulturröhren aus Glaä gebracht und - · die Röhren mit Baumwollstopfen verschlossen. Die das Medium • enthaltenden Kulturröhren wurden bei 120⁰C 20 Minuten, lang

809810/1319

sterilisiert, in geneigter Lage stehen gelassen, um eine möglichst große Oberfläche zu ergeben und bis zum Gebrauch im Eisschrank gekühlt. Sporen von S. aureofaciens Stamm A-377 wurden mit sterilem, destilliertem Wasser von einem Schrägagar gewaschen, was eine Suspension mit 60-80 χ 10 Sporen/ml ergab. 0,1 ml-Anteile dieser Suspension wurden zum Inokulieren der wie oben beschrieben vorbereiteten Gläser mit Qg Sporulationsagar eingesetzt. Nach dem Inokulieren wurden die Qg-AgapSchrägpräparate bei 26,5 - 27,5⁰C inkubiert. Nach I²J Tagen war die Sporen-

bildung im allgemeinen beendet. Das gleiche Verfahren wurde im ν Falle aller anderen untersuchten Mikroorganismen angewandt, die in der nachfolgenden Tabelle III aufgeführt sind.

Beim Beobachten unter Ultraviolettlicht (3660 8) während der Inkubationszeit von ο - 14 Tagen wurde das vegetative Wachstum der Tetracyclin erzeugenden Stämme brlllant-goldorange, während der Agarkörper immer stärker brillant-orangegelb bis gelb wurde. Während dieser Wachstumsphase können auch Chlor-

η tetracyclin erzeugende Stämme eine schwache Fluoreszenz ählicher Art zeigen. Gleichzeitig fluoresziert der obere Teil des Schrägagar s, wo die Dicke des Mediums am geringsten ist, grüngelb bei f Tetracyclin produzierenden Stämmen und goldgelb bei Chlortetracyclin produzierenden Stämmen. Wenn die Schrägkulturen.reif werden, bleibt bei den Tetracyclin produzierenden Stämme die gelbe Fluoreszenz des Agarkörpers bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht von 3660 S bestehen, während sie bei den Chlortetra-

809810/1319

cyelijBr-produzierenden Stämme blafiblau w^rdear.

Ein Permentationsmedium zur Tetracyclinerzeugung wurde nach folgendem Rezept hergestellt:

' . (M₄)₂SO₄ .............. 5,58/ g

CaCO, 7-10 g

₄^ ₁ techii.rein) 0,08'. g / -

' HaiacLUellv/asser .,.».. 20-30 " g

Stärke-. 47,5 ^: g. -'.

■ MaiBEiehl 14,5 g . ..

'-'··· Schweineschmalzöl .20-32 bQ.

mit Leitungswasser auffüllen auf '1000 ml.

, Das PermentationsTerfahren wurde nach den Anweisungen dea Beispiels 4 durchgeführt, wobei die in labeile III unten

aufgeführten Mikroorganismen verwendet und die in Tabelle ■..-. an- III unten/gegebenen Ergebnisse erhalten wurden«

8 0 9810/1319

1*67742

III

	■Cklortetra- cyclin mcg/ml	ig	l'etracyciin . mcg/ml	Q Agar-Scnrägfeultur
S.aureo-	-,50		bei 3660 $:
faciens Stamm Mo·	<5O¹	620
A-377	'.'·■ <5ö	BO
Ϊ-135	<5O	5670 ■ .	" m
	'00 .	4140-	' .#
	<50	664Ö	■■■·■■■■
Φ-225	<50	S770
S-230S		■ ■ ■ : _ . 1 « Die ifritfiisg se^f Cnlortetraö^alin ist ' - zu. 5® w&s/^k* öEtpiiiiiäXi.ßl£» Sie Κβ^ΐβο?
		niar liia iterunter zeigt - ieäach, tea.

der

ais fafiers-teeifβ» keim

ä^reii

von. S.aureofsciena Stamm 2-135 wurden von einer Agarseciiräglcultur mit sterilem, deetilliertem Wasser unter Bildung einer. Suspension von 60-80 χ 10 Sporen/ml gewascnen» Ein 0,33 ml Anteil dieser Suspension wurde zur Inokulation einea 20 cm (8") Schüttelzylinders verwendet,

309810/1319

■ •".· ' ■ ·■"

der 8 ml eines Iladiuss eiotMelfe, daa nach dem. in Beispiel 1 angegebenen Rezept hergestellt war. Sie nachfolgende Zubereitung von InocuXa der verwendeten neuen liutantenstämme von S.aureofaciens geschah »ach dem Verfahren des Beispiels 1. Es wurde ein Permentationsiaedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

t ζ -, ? £i i?

KhSO« ilQ^t techniseä Eeitt) ....... G,0ä-G_r15 g

..... ..—».- 20-30 g

Maismehl ......... „...„...■.....« 14-_e"5 S

mit ieitttitgsweejssr auffüllen auf 1000 ml.

ileaea Eeäitsm. in eiaea AutoklaTea 20 BS»s.tea
' - ■■ ■ 2 ■.

eiaem Ssiicfe tcsl T_rQ5 feg/eas (15 psi)

aligaate Seil^foa 25 ml in. 25ö eü. i£L SeilsEi des wie oben beschrieben, hergestellten. Inakulums inolculiert. Sie Perraentation wurde in den ernten 18 Stunden bei 23°C und dann -i.^oh-4e-bis s* 142 Stunden bei 24°C auf einer rotierenden SciiüttelEiaachine mit 180 Umdrehungen pro Kinttte durolijofuhrt. I3oi den anderen verwendeten riikroorganisnen, die in '!^sIIe IY .aufgeführt "aind, wurdr_; claa gleiche Yerxahr&n banutst,.

BAD ORIGINAL

8098Ί0/1319 - . —

,Me Prüfung auf Tetracyclin wurde nach dem Standard-Hiscox-Verfahre:a durchgeführt, während Chlortetracyclin-Prüfungen nach einem fluoriiaetrisehen Verfahren durchgeführt wurden. Die Ergebnisse werden in der Tabelle IV aufgeführt. Die Reflexionskurven, für die geearote Erntemaische wurden mittels eines General Electric CD.Spektrophotometera erhalten, und sind in den fig. 1 bis Fig. € der Zeichnungen wieder- gegeben. Die Proben wurden in einer 1 cm-Glasküvette gemessen, die in Reflexionslage auf der Rückseite der Kugel angebracht war, wobei Magnesiumcerbonat als Bezugssubstanz verwendet wurde. Die Eigen-(Spiegel)reflexion der Zelle wurde mit berücksichtigt und ein Bereich von 400 ιψ bis 700 .τψ untersucht. Die Werte für AR bei 420 mu und bei 430 ιημ wurden bestimmt ' und werden in der nachfolgenden Tabelle IV angegeben. .

	Tabelle	IV	AR** bei	430 ma
			420 ΐημ	18
S. aureo—	Prüfung		27 ;.·■.".	18
faciens Stamm Ko.	Chlortetracyclin Gew.#	Tetracyclin Gew. #	32	-9
T-135	keines*	100 .	59	3
T-140	Il ■*	100	72	12
2-143	keines*	100 ,	63	36
1-225-	keines*	100	94
S-2308	keines*	100
S-2589 -	keines*	100

* Die Kulturen zeigten beim Chromatograph!eren an Papier- ' streifen kein Chlortetracyclin.

** Die Skalen der Reflexion und Wellenlänge in Pig.1 bis Pig.8 verlaufen nicht linear mit den aufgetragenen Mengen. Dies ist auf die besondere Anzeigeart des Spektralphotometers zurückzuführen und beeinflußt in keiner Weise die Berech nung der AR-Werte.

80 98 10/1319

1:^1 spiel 8 · ...· y

Charakterisierung »inea Tetracyelin-ergeugenden Stammeg von S.aureo£aciews durch RgfleKiongspelctrographie der .·;. gesamten Ern.temai»ohe im synthetischen Medium

Sporen von S«aureofaciens Staera S-2589 wurden mit

sterilem destillierten Vfaaser unter Bildung einer Suspension mit 60-80 χ 10 {Sporen pro ml von einer Agarachrägkultur

^. abgewaschen. Ein 0,33 «nl Anteil dieser Suspension wurde ver-

W ' · ■·■ ·.. ■ ■· ·

^ wendet, um einen 20 cm (8")-Schütteleylinder eu inokulieren,

der 1^i8 ml eines nach dem Rezept des Beispiels 1 \ berge-» ■

stellten Mediums enthielt.' ' \

Es wurde ein Pernientationsmedium der Zusammensetzung'hergestellt j - .;' : " · ■

(JIH₄J₂SO₄ ,., 8,0 . g

,., Maisstärke. ;.". 55»O ' g;"' .

l5gCl₂.6H₂0 2^0 g. ,

. . ' feS0₄.7H₂Q 0,06 g.\

ZnSO₄.7H₂O ο.............. ' 0,10 g;

■ .' mso₄.H₂o .......... —.......w....Cv o»o5 ^g ^v.

' . CoCl₂UH₂P '^:\ 0^005 g ζ .".:.-

!»Methionin ....«« 0,UO · g

, ;. ir-Hiatidin 0*80 ' g

.mit destilliertem H₂O auffüllen auf «·· 1000 ml«

8098143/1319

Zu diesem Medium wurde e;Lne Schweineachmalzöl-Mineralölkombination (aus Schweineschmalziöl lsi Mineralöl U-.S.P.Qualität 5s1) zugegeben und zwar 0,63 ml pro 25 ml des Mediums. Nach. 20 Minuten langem Sterilisieren dieses Mediums . im Autoklaven "bei einem Druck von 1,05 kg/cm (15 psi) wurden aliquote Teile von 25 ml in 250 ml' Erlenmeyerkolben mit 1,0 ml !eilen des wie oben beschrieben hergestellten Inoculums beimpft. Die !Fermentation wurde 18 Stunden lang* la ei 28⁰C und dann von der 19. "bis zur 142j Stunde, bei-24⁰C auf einer ro- X tierenden Schüttelmaechine mit 180 TJpKT durchgeführt.

'-"" Die gesarate Erntemai solle zeigte bei der Prüfung einen Gehalt von 8060 Hikrogramm Tetracyclin pro ml nach dem Standard Hiscox-Prüfverfahren, wobei die Kultur kein Chlortetracyclin bei der Papierchromatographie zeigte. Unter Yorwendung eines General Electric Co.-Spektralphotometers wurde eine Heflexionskurve für die gesamte Erntemaische erhalten, die in Fig.? wiedergegeben'iat. Die Probe befand sichln einer 1 cm-Glasküvette, die sieh in Reflexionsstellung an der Eückseite der Kugel befand und Magnesiumcarbonat wurde g

ala Bezugsmaterial verwendet. Die Eigenreflexion der. Zelle wurde berücksichtigt und ein Bereich von 400 mu bis 700 au untersucht* Der Viert für AR bei 420 mu betrug 118 und für ΔΕ bei 430 mp betrug 87. ' ₍

809810/131S

ϊ **■'■""

frt is »ic 1 &^?

Charakterisierung »ino Τ*ΪΥ*&γ&1η*~$Υζβυ.ββηα6Ώ. Stammes von S.aureofaciens flurch 1t»f t«jct onsgpektrographie der gesamten Ej-nteraaiach.e in j&tTOCkn§tem. Molkenroaaium.

Sporen von 3.8-urtofaeiena Stamm S-2589 wurden mit sterilem destillierten Wasser unter Bildung einer Suspension mit 60-80 χ 10, Sporen pro ml von einer Agarschrägkultür '■'-

abgewaschen. χ»· 0,33 ml ieil dieser Suspension wurde zum
WL Beimpfen einea 20 cn (8") -Zylinders mit 8 ml eines naon
Beispiel 1 hergestellten Mediums verwendet.

Eb wurde ein Peraontationamedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt? ■ - ^:

Getrocknete Molke ·. 15*5 g

Maismehl .' 42,7 g

Maisstärke 30,8 g

CaCO₅ 11,5 g

• (M₄)₂S0₄ 8,5 g

HH₄Cl' 2,0 g

. MnSO. (70 jS, technisch rein) O₉HOg

CoOl₂.6H₂O ο 0,005 g

Milchsäure 0,650 g .

mit IeitungS7iasaer auffüllen auf ......... 1000 ml.

Zu diesen Hedium wurden 0,75 ml Schweineschmalzöl pro 25 ml des Mediums zugesetzt, ilach 20 Minuten langem Sterilisieren des llediuras in einem Autoklaven bei einem Druck von 1,05 kg/cm (15 psi) wurden aliquote leile von 25 ml

BAD ORIGINAL 809 8 10/1319 .

in 250 al Erlenimeyericolöen mit 1_}0 «al Teilen des wie oben hergestellten Xnokulums beimpft. Die Fermentation wurde ' ^! 18 Stunden lang* bei 28^eÖ und dann von der 19. bis zur 142» Stunde bei 24⁰C auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit

180 UpM durchgeführt. ' .

Die gesamte Exatemal-sche zeigte bei der Prüfung 6070 Mikrogramm Tetraeylin pro nil nach atm Standard Hiscox-Prüfverfahren, wobei die Kultur kein Chlortetracyclin bei der Papierchromatographie zeigte. Mittels eines Genera! Electric Co, Spektralphotometers wurde die Reflexionskurve der gesamten Erntemaische erhalten, die in Pig.8 wiedergegeben ist. Die Probe befand sich in einer 1 cm G-lasküvette in Reflexionsstellung auf der Rückseite der Kugel, es wurde Magnesium- · carbonat als Btsugssubftanz verwendet. Die Eigenreflexion der Zelle, wurde berücksichtigt und der Bereich von. 400 mu bis 700 mu untersucht. 5er Wert für ΔΕ bei 420 mu betrug 129, der für ΔΗ bei 430 mu betrug 66.

8098 10/1319

Claims

« ver-vi«iiule t.. der eich durch- die Ffihlg·* iceit, der gaßßnieu Erntemoinchc eine Farbe au verleihen, ,ttti* wil^Ur bei der lineal¹ aufgetragenen Reficuciou8kv.rve dor vertikale Abstand zvrißohen der Iteflexionskurvt-' und fcinnr Geraden, dio die Beflexions· kurve bei ^00 tnjuvna ί>30 nyt eohneidet, bei ^120 ψ( größer ist als bei H$Q m^ und durch die frei tore Fähigkeit, in Qg Spor-ulatione&gar nach l4-t8giger Incubation bei &6,5 bie S?_#5°C bei Einwirkung von Ultravicilett-Lifehi· von .5660 A oine golbe Pluoreβztmz VAx ergeben,

BADORJGINAL

809810/1319 . _

Unterlagen (Art.7S1Abs.2Nr.1Satz3de8Anderungsgeä.v.4.9.t967i