DE1442304A1

DE1442304A1 - Verfahren zur Herstellung von Purinderivaten

Info

Publication number: DE1442304A1
Application number: DE19631442304
Authority: DE
Inventors: Isao Banno; Takezi Hasegawa; Seizi Igarasi; Teiji Iijima; Akira Imada; Ikuo Nogami; Einosuke Ohmura; Ikuo Suhara; Masahiko Yoneda
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1962-08-08
Filing date: 1963-08-06
Publication date: 1970-01-15
Also published as: US3298923A; GB1005892A; MY6900173A

Description

PATENTANWÄLTE DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖN WALD DR.-1 NG. TH. METER DR. FUES DlPL.-CHEM. ALEK VOM KREISLER DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLUPSCH

KÖLN T, DEfCHMANNHAUS

Köln, den j. Mai 1969 Kl/En.

P 14 42 50fr.2

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27* Doshomaehi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan)

Verfa&ren_zur_Herstellung von Purinderivaten

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Furinderivaten der allgemeinen Formel

in der X = -H, -OH oder Y= -OH oder -KH₂, jedoch für den Fall, daß X für

-OH oder -NH₂ steht, nicht -NHg bedeutet; R= -H> -CH-CcHOH)₂-CH-CH₂-OH oder

LI

-CH- CCHOH)^-CH-CH₀-C-O-P- )~CM. ι c; 1 ei in

i O OH

η = eine ganze Zahl von 1 bis j5>

durch VerwendiMg von Mikroorganismen mit den nachstehend beschriebenen Eigenschaften*

{Art. ? ä l Abs, 2 Nr, I Sate 3 des Anderunasges» v* 4. S* ü*<* ?i

H42304

Zu den gemäß der Erfindung hergestellten Purinderivaten gehören beispielsweise Hypoxanthin, Xanthin,, Adenin, Guanin, Inosin, Xanthosin, Adenosin, Guanosin und davon abgeleitete 5^r-Nucleotide, wie 5'-Inosinsäure (IMP), ^^Xanthylsäure (XMP), 5'-Adenylsäure (AMP), 5'-Guanylsäure (GMP), Ädenosin-5^r-di-. phosphat (ADP) und Adenös±n-5^l-triphosphat (ATP), Die genannten Pur inderivate stellen bekanntlich wertvolle Arzneimittel, Chemikalien und Zusatzstoffe für Nahrungsmittel dar»

Die Purinderivate werden in vivo, z.Bv in Zellen von Mikroorganismen, synthetisiert und darin als Komponenten von Nucleinsäuren zurückgehalten. Es wird angenommen, daß der biochemische Weg dieser Purinderivate zu den Nucleinsäuren darin besteht, daö 5-Aminoimidazolribotid über S-Aminoimidazol-^-carboxamidribotid in 5 ^r-Inosinsäure und die letztere in 5 *-Adenylsäure und 5^f-Gu2u^ylsäure umgewandelt wird und schließlich die beiden letztgenannten 5'-MUcIeOtide zusammen mit 5^l-Pyrimidinnucleotiden, wie 5^f-Uridylsäure und 5'-Cytidylsaure, zu Nucleinsäuren -vereinigt werden. Da die Nucleinsäuren für die Lebensvorgänge -wesentlich sind, und ständig in Zellen gebildet werden, müssen die Purinnucleotide darin als Zwischenverbindungen vorliegen« Es ist jedoch allgemein bekannt, daß die natürlichen Stämme von Mikroorganismen nur geringe Mengen dieser Purinderivate in. Form von Purinbasenv Nucleosides odeir Nucleotiden enthalten, und daß diese Purinderivate kaum aus den Zellen, austreten*

Andererseits ist bekannt, daß einige. "nutritionelXe^ Mutanten Hypoxanthinderivate extrazellular anreichern. Biese Mutanteneignen sich jedoch nicht für die industrielle Herstellung von Hypoxanthlnderivaten., da ihre Bebrütung umständliche Arbeitsgänge und genaue Einstellung der Bedingungen, z.B. den Zusatz der erforderlichen Nährstoffe, erfordert.

£09^83/04©?

In dem Bemühen, Mikroorganismen zu finden, die gewinnbare Mengen an Purinderivaten im Zuchtmedium unter einfachen Bebrütungsbedingungen anreichern, wurde durch die Anmelderin festgestellt, daß Mikroorganismen, die gegen Antimetaboliten im Purinstoffwechsel beständig sind, Purinderivate zu bilden vermögen und im großtechnischen Maßsta') zu diesem Zweck eingesetzt werden können, und daß diese Mikroorganismen als Mutanten durch künstliche oder spontane Mutation von natürlich vorkommenden Stämmen erhalten werden können, deren Wachstum durch die Anwesenheit von Antimetaboliten im Purinstoffwechsel gehemmt wird. -

Gegenstand der Erfindung ist somit ein neues Verfahren zur Herstellung von Purinderivaten der allgemeinen Formel (I) in einfacher Weise unter Verwendung von Mutanten, die gegen Antimetaboliten im Purinstoffwechsel beständig sind. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die großtechnische Herstellung dieser Purinderivate mit niedrigeren Kosten, als dies bisher möglich war.

Zur Herstellung der Purinderivate werden die genannten Mutanten in einem geeigneten Kulturmedium bebrütet. Die ursprünglichen Mikroorganismen, von denen die gewünschten Mutanten erhalten werden, sind die Stämme, deren Wachstum durch das Vorliegen von Antimetaboliten im Purinstoffwechsel gehemmt wird, und die nachstehend als "Stämme vom Wildtypus" im Gegensatz zu den für die Zwecke der Erfindung verwendeten "Mu-• tanten" bezeichnet werden. Zu den Stämmen vom Wildtypus gehören alle von unserer Umgebung isolierten Stämme und solche Mutanten, die gegen Substanzen außer den Antimetaboliten im Purinstoffwechsel beständig sind oder einen Nahrungsbedarf J)O zeigen. Die in Präge kommenden Stämme vom Wildtypus kommen sehr häufig unter Mikroorganismen vor, die zu den sog. Bak-

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terien, Actinomyceten und Hefen gehören. Die gewünschte Mutation läßt sich bei diesen Stämmen vom Wildtypus immer auslösen.

Zu den Antimetaboliten im Purinstoffwechsel, die das Wachs- -■ turn der Stämme--vom- Wildtypus- hemmeny gehören beispielsweise 8-Azaguanin, 6-Mercaptopurin, 2,6-Diamlnopurin, Benzimidazole. Soffein, Purin, Purinribosid, S-Azaguaninribosid-S¹-phosphat und 6-Mercaptopurinribosid-5'-phosphat. Die gegen diese Antimetaboliten resistenten Stämme können durch Behandlung eines Stammes vom Wildtypus mit einem Mutagen, z.B. durch Bestrahlung mit UV-Licht oder Röntgenstrahlen oder durch Kontakt mit salpetriger Säure oder durch Auswahl und Isolierung einer Kolonie eines natürlich und spontan vorkommenden Mutanten aus Kolonien des Stammes vom Wildtypus erhalten werden· Das Wachsturn der auf diese Weise erhaltenen Mutanten wird durch die Antimetaboliten im Purinstoffwechsel nicht mehr gehemmt. Die Auslösung der gewünschten Mutation an Stämmen vom Wildtypus kann in beliebiger bekannter Weise erfolgen. Die zu diesem Zweck anzuwendenden Methoden sind in zahlreichen veröffent-Hebungen beschrieben, z.B. in "Method in Medical Research"

2. von R.W. Gerard, herausgegeben von den Year Book Publishers, Inc., Chicago 1950, und "Nature".18^, 1829 (1959) in einem Artikel von P. Kaudewitz.

In Frage kommen zahlreiche Stämme vom Wildtypus, von denen nachstehend einige als Beispiel unabhängig von der Klassifizierung der Mikroorganismen aufgeführt sindi

Tabelle 1 _; Γ

Endomyces magnus!i Ludwig
Endomycopsis fibuliger (Lindner) Dekker Jo Endomycopsis soolyti Phaff und Yoneyama Schizosaccharomyces pombe Lindner

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H42304 - 5 -

serevisiae Hansen rouxii Boutroux Saoehar«yö©s delbrueckii Lindner Saocharoinyoes marxianus Hansen Torulaspora delbrueckii Lindner Törulasport, rosei Quilliermond &®ha£TG®&&&& hansenil (Zopf) Lodder et van Rij ©ebary©iayees kloeekeri öuiiliermond et ΡεJu |>iöhia ü'einbranaefaöiens Hansen PioMa laogii Ohara et Nonomura Piöhia sake (Naganishi) Öhara et Nonomura

ludwigii Hansen gossypii (Ashby et Nowel) öuillierinond fluorescens Soneda Petaaoäpora rhodaensis (Ramirez et Boidin) Boidin et Abadie

roseus Kluyver et van Nlel

salraonicolor (Fischer et Brebeok) Kluyver et

van Niel

luil©3C»a al£>a (Manna) Derx Öryptoeöcöüs albidias (Saito) Skinner

laurentii (Küfferath) Skinner B&ke (Saito et Oda) Lodder et van Rij glabrata (Anderson) Lodder et de Vries

anoßialus Güsters" . " ■ *

bruöellensis RUff

eutaneuni (de Beurm«, Gougerot et taucher) Sta pmliulans (Lindner) jDiddens et Lodder

Saito

(S^ess) Lodder et van Rij api'öUlata (Reess eiaend. Klööker) Junke

.) Harrison (lefnme) Lodder poiysporus v.di, Walt

Bacillus megaterium de Bary
Bacillus subtilis Conn emend. Prazmowski Bacillus cereus Frankland and Frankland Bacillus firmus Werner '
Bacillus polymixa (Prazmowski) Migula Sarcina lutea Schroeter
Eseherichia coil (Migula) Castellani et Chalmers

Diese Mikroorganismen haben die Fähigkeit^ die gewünschten Purinderivate in ihrer Umgebung anzureichern, wenn sie in ihre Mutanten, die gegen Antimetaboliten im Purinstoffwechsel resistent sind, umgewandelt werden.

Die Bebrütung des Mutanten erfolgt in einem geeigneten Kulturmedium. Das Kulturmedium kann flüssig oder fest sein, jedoch ist für die Produktion im technischen Maßstab ein flüssi ge s Kulturmedium vorzuziehen. Wenn das Kiilturmedium flüssig ist, wird die Bebrütung entweder stationär oder in submerser Kultur unter Belüftung und/oder Bewegung vorgenommen. Das Kulturmedium muß Kohlenstoff-Quellen und Stickstoff-Quellen enthalten und wird zweckmäßig durch anorganische Salze oder Spurenelemente ergänzt. In Frage kommen die Nährstoffe, die allgemein für die Bebrütung von Mikroorganismen verwendet werden» Öeeighete Kohlenstoff-Quellen sind beispielsweise Stärke, Dextrin, Saccharose* Laetose, Maltose, Glucose und Glycerin» Geeignete StiökstöfiN-Queilen sind beispielsweise ^le3S3he^trakt, Pepton^ Hefeextrakfe, Hefe, Sojabohnenmehl, Malstpellwässer» Melasse und örganlsehe oder anorganische

wie Haicaastöft*,

Äffimoiiiiumsulfafe» ftmmonJjümnitrat,.' lactat, Wiä Mtrafce* a»B» ilai^rlMnni^rait ©läer Als weitere anörganisisfee Salze tetammen phosphat*

In Frage. Als Spurenelemente können Borsäure, Kupfersulfat, Kaliumiodid, Perrichlorid, Mangansulfat, Natriummolybdat und Zinksulfat verwendet werden. Als weitere Spurenelemente werden vorzugsweise Vitamine dem Medium zugegeben, beispielsweise Biotin, Pantothensäure, Polsäure, Inosit, Nikotinsäure, p-Aminobenzoesäure, Pyridoxin, Riboflavin, Thiamin und Salze dieser Verbindungen, so weit sie existieren.

Die Bedingungen, unter denen der Mutant bebrütet wird, sind verschieden je nach dem verwendeten Stamm und/oder der Zusammensetzung des Kulturmediums, Der Anfangs-p„-Wert des Mediums liegt gewöhnlich im Bereich zwischen schwach sauer und schwach alkalisch, und die BebrUtungstemperatur wird gewöhnlich aus dem Bereich gewählt, in dem der Mutant gut wachsen bzw. sich vermehren kann. In den meisten Fällen liegt dieser Bereich zwischen 20 und 40°. Diese Bedingungen sind jedoch anderen Faktoren, die das Wachstum von Mikroorganismen bestimmen, so anzupassen, daß die Ausbeute an gewünschten Purinderivaten maximal ist.

Mit der Zeit werden im Kulturmedium die Purinderivate gebildet und angereichert. Diese extrazellular angereicherten Purinderivate können 5'-Purinnucleotide oder Purinnucleoside oder Purinbasen sein* Es kann natürlich vorkommen, daß mehr als eine Purinbase, ein Nucleosid und mehr als ein 5^f-Nucleotid im Kulturmedium angereichert werden. Beispielsweise ist es möglich, daß als Purinderivate nur die Hypoxanthinderivate gebildet werden, wie Hypoxanthin, Inosin und 5^f-Inosinsäure. Femer ist ihre gleichzeitige Anreicherung mit Adenin, Adenosin und 5'-Adenylsäure möglich. Eine Wechselbeziehung zwischen der Art der angereicherten Purinderivate einerseits und der Stellung des Stammes vom Wildtypus in der Klassifizierung der Mikroorganismen oder der Methode zur Auslösung

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der Mutation am Stamm vom Wildtypus andererseits ist nicht festgestellt worden. Zweckmäßig wird daher ein Mutant gewählt, der das gewünschte Purinderivat bzw. die gewünschten Purinderivate ausschließlich oder bevorzugt vor anderen Purinderivaten anzureichern vermag.

In der Praxis ist es zweckmäßig, während der Bebrütung die Anreicherung an Purinderivaten zu verfolgen. Die Zeit, nach der die gebildete Menge an Purinderivaten maximal ist, ist verschieden in Abhängigkeit von den Stämmen oder Spezies von resistenten Mutanten, der Art oder Zusammensetzung der Nährstoffe im Kulturmedium, der Bebrütungstemperatur, dem Grad der Belüftung und/oder Bewegung und der für die Bebrütung verwendeten Apparatur. In den meisten Fällen ist jedoch die maximale Anreicherung nach 1 bis 15 Tagen vom Beginn der Bebrütung erreicht. Abgesehen von Ausnahmen ist die Dauer bis zu maximaler Anreicherung bei Bakterien am kürzesten (etwa 1 bis 7 Tage), bei Actinomyceten etwas länger (etwa 3 bis 8 Tage) und bei Hefe am längsten (etwa 7 bis 12 Tage).

Die Verfolgung der Anreicherung an Purinderivaten im Medium 2o. kann nach bekannten Methoden zur Bestimmung dieser Verbindungen erfolgen. In Frage kommen für diesen Zweck beispielsweise Papierelektrophorese, Papierteilungschromatographie, Kolonnenehromatographie an Ionenaustäuschharzen, enzymatisehe Bestimmung oder Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 260 mu. Ein Test mit Mikroorganismen, bei dem eine Variante die Purinderivate als wesentlichen Faktor zum eigenen Wachstum braucht, kann zum gleichen Zweck angewendet werden. Diese Bestimmungsmethoden sind ausführlicher in vielen Veröffentlichungen beschrieben, z.B.. in "The Nucleic Acids", Band 1, von Chargaff und Davidson, herausgegeben durch Academic Press, Inc., New York 1955* "Journal of Biological Chemistry" 161,_ Seiten 429, 445 und 461 (1947) von Kaikar und

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ORIGINAL INSPECTED

in der gleichen Zeitschrift von R.B. Huribert im Jahrgang 209, Seite 23 (1954).

Einige der für die Zwecke der Erfindung verwendeten Mutanten bilden Phosphomonoesterase, die die Umwandlung von Nucleotiden in Nucleoside katalysiert. Wenn speziell Nucleotide gebildet werden sollen, hat die Verwendung solcher Mutanten niedrigere Ausbeuten an gewünschten Nucleotiden zur Folge. In solchen Fällen ist es zweckmäßig, einen geeigneten Phosphomonoesterase-Inhibitor dem Kulturmedium zuzusetzen. Zu diesem Zweck eignen sich beispielsweise Phosphate, wie Natrium- und Kaliumphosphat, Arsenate, wie Natrium- und Kaliumarsenate, Fluoride, wie Natrium- und Kaliumfluorid, Cystein, Glutaminsäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und zweiwertige Metallionen, wie Zink- und Gupriionen. Durch Zusatz

IS eines oder mehrerer der genannten Phosphomonoesterase-Inhibitoren in Mengen, die das Wachstum des Mutanten nicht stören, wird die Aktivität der Phosphomonoesterase genügend gehemmt, so daß höhere Ausbeuten an Nucleotiden erhalten werden, während die angereicherte Menge an Nucleosiden geringer wird*

Die .im Kulturmedium angereicherten Purinderivate werden als Gemisch abgetrennt oder als Einzelverbindungen isoliert. Die Abtrennung bzw. Isolierung der gewünschten Purinderivate erfolgt nach an sich bekannten Methoden zur Abtrennung von Gärungsprodukten aus der Nährflüssigkeit oder zur Trennung von Gemischen mehrerer ähnlicher chemischer verbindungen in die Einzelverbindungen. Die Trennung ist beispielsweise möglich durch Ausnutzung der unterschiedlichen Löslichkeit der gewünschten Verbindungen einerseits und der Verunreinigungen

ja andererseits in verschiedenen Lösungsmitteln* des Unterschiedes in ihren Verttilungskoeffizienten zwischen den beiden Lö-

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ΗΛ2304

- ίο - :

sungsmlttelschichten, des Unterschiedes in der Adsorbierbarkeit an einem Adsorptionsmittel, wie Aktivkohle und an Ionen-, austauschharzen, der unterschiedlichen Dialysierbarkeit durch eine halbdurchlässige Membran oder der unterschiedlichen Kristallisierbarkeit aus einem Lösungsmittel, ferner durch Filtration oder Zentrifugieren des Kulturmediums mit oder ohne Zusatz von Filterhilfsmitteln. In der Praxis werden diese Methoden zur Abtrennung oder Isolierung je nach der gewünschten Reinheit und dem Zustand der Produkte kombiniert oder wiederholt angewendet. Beispielsweise fallen die Purinderivate in Form der freien Base oder der freien Säure oder des Sates an. Vorzugsweise werden die gewünschten Verbindungen -■ insbesondere wenn es sich um Nucleotide handelt - in Form des Salzes mit einer anorganischen oder organischen Base isoliert, z.B. als Bariumsalz, Natriumsalz, Kaliumsalz, Ammoniumsalζ und als basisches Aminosäuresalz. Diese Trenn- oder Isolierungsmethoden wurden bereits ausführlicher in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben, z.B. in "The Nucleic Acids", Band 1, von Colowick und Kaplan in "Methods in Enzymology" Band 3, herausgegeben durch Academic Press, Inc., 1957, von Tsuboi und Price in "Archives of Biochemistry and Biophysics" 81, Seite 225 (I959), in "Journal of Biological Chemistry" 209 , Seite 23 (I954) und in den französischen Patentschriften I.303..206. und I.303..546.

Die Erfindung wird nachstehend in den Beispielen ausführlicher beschrieben. Die Mengenangaben in diesen Beispielen, soweit sie sich auf die Zusammensetzung der Medien beziehen, sind auf Gewicht/Volumen bezogen. Die verwendeten Mutanten wurden bei der American Type Culture Collection, Washington,

3ö D.C, U.S.A., hinterlegt» Sie erhielten die in Klammern angegebenen HinterlegMngsnummern. :

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U42304

Tabelle 2

Saccharomyces cerevisiae Hansen,

It ti

Saccharomyces oviformis Osterwalder

Rhodotorula rubra (Bemme) Lodder Rhodotorula glutinis (Fres.) Harrison

Torulopsis glabrata (Anderson) Lodder et de Vries

Bacillus megaterium de Bary dto.

Bacillus subtilis Conn emend Prazmowski

Eseherichia coil (Migula) Castellani et Chalmers

Streptomyces sp. Stamm Nr. I07

Mutant MAGR-16 (ATCC-Mutant MAGR-5397 (" Mutant MAGR-Jl18 (" Mutant MAGR-56 (ATCC-

Mutant MAGR-66 (ATCC-Mutant RMAGR-9 (ATCC-

Mutant RMAGR-2 (ATCC-

Mutant TMAGR-25(ATCC-Mutant KAG-72 (ATCC-Mutant KMP-221 (ATCC-

Mutant B-822-22(ATCC-

Mutant 6E-6 (ATCC-Mutant IO7-I5 (ATCC-

2o' Beispiel 1

Eine Agarplatte", die ΙΟΟγ/cnK 8-Azaguanin enthielt, wurde mit Zellen von Saccharomyces cerevisiae Hansen besät. Spontan auftretende Mutanten, die gegen 8-Azaguanin resistent waren, wurden isoliert. Mit einem Stamm (von den Erfindern als MAGR-16
25 bezeichnet) aus den isolierten Mutanten wurde 1 Liter eines

wäßrigen Kulturmediums geimpft, das die nachstehend angegebenen Nährstoffe enthielt. Die Bebrütung wurde 11 Tage bei 28°
unter Belüftung und Bewegung durchgeführt. Die KuIturflüssig-

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keit wurde filtriert und das Piltrat mit einer Aktivkohlesäule behandelt, wobei die gewünschten Purinderivate adsorbiert wurden. Durch-Elution der Säule mit ammoniakalischem Äthanol wurden Fraktionen erhalten, die die Purinderivate enthielten. Durch Behandlung der Fraktionen mit einem stark - basischen Anionenaustauschharz auf Basis von Polystyrol (Ionenkapazität 1,1 Äquivalente/Liter) wurden 285 mg Hypoxanthin, 168 mg Inosin und 4o mg S'-Inosinsäure erhalten.

Das Kulturmedium enthielt
Io

Glucose	5 %
Ammoniumeitrat	0,85^
Kaiiumdihydrogenpho sphat	0,1 %
Magnesiumsulfat
Natriumchlorid	0,01$
Calciumchlorid	0,01$
Biotin	20 «$
Thiaminhydrochlorid	4 7^
Pyridoxinhydrochlorid	4 70
Inosit	20 7^
Calciumpantothenat	4 -V^
Riboflavin	4 7^
Nikotinsäure	4 ΎΪ
p-Aminobenzoesäure	4 rf
Borsäure	Spur
Kupfersulfat	Spur
Kaliumiodid	Spur
Ferrichlorid	Spur
Zinksulfat	Spur

Die wäßrige Lösung dieser Nährstoffe hatte einen p_H-Wert von 5,5 und wurde verwendet, nachdem sie 15 Minuten unter einem Druck von 1,05 Ate. sterilisiert worden war.

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- 13 Beispiel 2

Eine Agarplatte, die 100 Ύ/απΡ 8-Azaguanin enthielt, wurde mit Zellen von Saccharomyces cerevisiae Hansen besät, nachdem diese mit Nitritionen in Berührung gebracht worden waren. Hierbei wurden einige Kolonien von Mutanten erhalten, die gegen S-Azaguanin resistent waren. Hiervon wurde ein Stamm (von den Erfindern als MAGR-3397 bezeichnet) isoliert und auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise gezüchtet. Hierbei wurden 230 mg Hypoxanthin, I85 mg Inosin und 22 mg 5^I-Inosinsäure pro Liter KuIturflüssigkeit erhalten,

Beispiel 3

Zellen von Saccharomyees oerevlsiae Hansen wurden mit Ultraviolettlicht bestrahlt, Mit den überlebenden Zellen wurde ©ine Agarplatte besät, die 100 γ/cnr 8-Äzaguanin enthielt, ■ Ton den erhaltenen Kolonien von gegen 8-Azaguanin resistenten Mutanten wurde ein (von den Erfindern als MMR-3II8 bezeichneter) Stamm isoliert und in einem wäßrigen Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 gezüchtet mit der Ausnahme, daß die Bebrütung zwei Tage durchgeführt wurde. Die Aufarbeitung der Kulturflüssigkeit auf die-in Beispiel 4 beschriebene Meise ergab 100 mg Hypoxantihin» 120 mg Inosin und 20 mg S'-Iftosinsäure pro Liter Kulburflüssiglceit»

Beispiel 4 ·

Mit dem in Beispiel 3 verwendeten Mutanfcen ÄGR-3II8 wurde ein wairiges Kulturmedium beimpft, das die ataefcusteilend genannten Mährstoffe enthielt. Öle BebrÜtiimg wurde 12 Tage bei 28° in einer rotierenden Schüttelvorrichtung vorgenommen, Die Aufarbeitung der Kulturflüssigkeit auf die im Beispiel 1

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beschriebene Weise ergab 148 mg Hypöxanthin und I5o mg Ino-rsin pro Liter Kulturflüssigkeit.

Zusammensetzung des Kulturmediums:

Pepton 0,5 %

Hefeextrakt 0,2 %

Glucose 5 %

Die wäßrige Lösung, die diese Nährstoffe enthielt, hatte ei.-nen p_H-Wert von 6,0. :

Beispiel 5

Auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise wurden einige Kolonien von gegen 8-Azaguanin resistenten Mutanten aus dem Stamm vom Wildtypus Saeeharomyees cerevisiae Hansen erhalten. Hiervon wurde ein Stamm (von den Erfindern als MAGR-56 bezeichnet) isoliert und zum Beimpfen eines wäßrigen Kulturmediums verwendet, das die gleiche Zusammensetzung wie das in Beispiel 1 verwendete Medium hatte. Nach der Bebrütung und Aufarbeitung auf die in. Beispiel 1 beschriebene Weise wurden 164 mg Hypöxanthin, 212 mg Inosin und 54 mg Adenin pro Liter Kulturflüssigkeit erhalten.

So Beispiel 6

Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurden einige Kolonien von gegen Ö-Azaguanin resistenten Mutanten vom Stamm vom Wildtypus Saecharomyees oviformis österwalder spontan erhalten. Hiervon wurde ein Stamm (von den Erfindern als !MÄiGR-66 bezeichnet) isoliert und zum Beimpfen eines wäßrigen Kulturmediums verwendet, das die gleiche Zusammensetzung wie das in Beispiel 1 verwendete Medium hatte. Die Bebriituiag

wurde 12 Tage unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Aufarbeitung der KuIturflüssigkeit auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise ergab 146 mg Hypoxanthin, 127 mg Inosin, 10 mg 5'-InOsInSaUrC, 55 mg Adenosin und 45 mg 5^f-Adenylsäure pro Liter Kulturflüssigkeit.

Beispiel 7

Auf die in Beispiel 3 beschriebene Weise wurden einige Kolonien von gegen 8-Azaguanin reslstenten Mutanten vom Stamm vom Wildtypus Rhodotorula rubra (Bemme) Lodder erhalten. Hiervon wurde ein Stamm (von den Erfindern als RMAGR-9 bezeichnet) isoliert und zum Beimpfen eines wäßrigen Kulturmediums verwendet, das die gleiche Zusammensetzung wie das in Beispiel 1 verwendete Medium hatte. Die Bebrütung wurde 10 Tage unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen durchgeführt. Die Aufarbeitung der Kulturflüssigkeit ergab 6 mg Hypoxanthln, 35 mg Inosin, 30 mg 5'-Inosinsäure und 40 mg Adenosin pro Liter Kulturflüssigkeit.

Beispiel 8

Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurden durch spontane Mutation einige gegen 8-Azaguanin resistente Kolonien von Rhodotorula glutinis (Pres.) Harrison erhalten. Hiervon wurde ein Stamm (von den Erfindern als RMAGR-2 bezeichnet) isoliert und zum Beimpfen eines wäßrigen Kulturmediums verwendet, das die gleiche Zusammensetzung wie das in Beispiel 1 verwendete Medium hatte. Die Bebrütung wurde 6 Tage unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen durchgeführt. Die Aufarbeitung der KuIturflüssigkeit ergab 8 mg Hypoxanthin, 14 mg Inosin, 12 mg 5^I-Inosinsäure und 32 mg 5'-Adenylsäure pro Liter Kulturflüssigkeit.

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Beispiel 9

Auf die in Beispiel j5 beschriebene Weise würde der Stamm vom Wildtypus Torulopsis glabrata (Anderson) Lodder et de Vrles mit Ultraviolettlicht bestrahlt, wobei einige gegen 8-Äzaguanin resistente Mutanten erhalten wurden. Hiervon wurde ein Stamm (von den Erfindern als TMAGR-25 bezeichnet) isoliert und zum Beimpfen eines "wäßrigen Kulturmediums verwendet, das die gleiche Zusammensetzung wie das gemäß Beispiel 1 verwendete Kulturmedium hatte. Die Bebrütung wurde 10 Tage unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, Die Aufarbeitung der KuIturflüssigkelt auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise ergab 250 mg Inosin, 62 mg 5^l-inosinsäure und 112 mg Adenosin pro Liter KuIturflüssigkeiti

Beispiel, 10

Eine Agarplatte, die pro crrr 50 γ 8-Azäguähin enthielt, wurde mit gewaschenen Zellen von Bacillus megäterium de Baty besät, die vorher mit UV-Licht bestrahlt worden waren. Hierbei wurden resistente Mutanten erhalten; die auf der Ägärplatte wüchsen* Hiervon wurde ein Stamm (von den Erfindern als KÄG-72 bezeichnet) isoliert und zum Beimpfen eines wäßrigen Kulturmediums verwendet, das die nachstehend genahnten Nährstoffe enthielt« Die Bebrütung wurde 5 Tage bei 28 unter Belüftung und Bewegung durchgeführt. Die KuItürflüssigkeit wurde zur Entfernung der Feststoffe zentrifugiert.

Der flüssige Anteil wurde mit Aktivkohle behandelt, wobei die Purinderivate adsorbiert wurden. Die durch Extraktion der Kohle mit ammoniakalisehern Äthanol erhaltenen Extrakte wurden eingeengt, wobei ein Gemisch von 5'-Nucleotiden erhalten wurde.Das Gemisch wurde unter Verwendung eines stark

j5° basischen Anionenaustauschharzes auf Basis von Polystyrol (Ionenkapazität 1_>1 Äquivalente pro Liter) chromatographiert,

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wobei 70 mg 5'-Inosinsäure, 23O mg 5'-Adenylsäure pro Liter Kulturflüssigkeit erhalten wurden.

Das Kulturmedium hatte folgende Zusammensetzung:

Mannit 2 #

Mononatriumglutamat 2 %

Dikaliumhydrogenphosphat 0,7 #

Kaliumdihydrogenphosphat 0,2 #

Magnesiumsulfat . 0,02 %

Ammoniumsulfat 0,1 #

Pulverförmiger Hefeextrakt 0,1 #

Beispiel 11

Gewaschene Zellen von Bacillus megaterium de Bary wurden nach Suspendierung in einer 0,2 #igen wäßrigen Natriumchloridlösung mit UV-Licht bestrahlt. Mit der auf diese Weise behandelten Zellsuspension wurde eine Agarplatte besät, die pro cnr 100 γ 6-Mercaptopurin enthielt, wobei einige resistente Mutanten erhalten wurden, die auf der Platte wuchsen. Hiervon wurde ein Stamm (von den Erfindern als KMP-221 bezeichnet) isoliert und zum Beimpfen eines wäßrigen KuIturmediums verwendet, das die gleiche Zusammensetzung wie das* in Beispiel 10 verwendete Kulturmedium hattea Die Bebrütung und Aufarbeitung auf die in Beispiel 10 beschriebene Weise ergaben 210 mg S'-Inosinsäure, 100 mg 5^I-Adenylsäure und 55 mg 5'-Guanylsäure pro Liter Kulturflüssigkeit..

Beispiel 12

Eine Suspension wachsender Zellen von Escherichia coil (Migula) Castellani et Chalmers wurde mit UV-Licht bestrahlt, wobei 99,9 % der Zellen getötet wurden. Mit den überleben-

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den Zellen wurde eine Agarplatte besät, die pro crn^ 400 γ 6-Mercaptopurin enthielt. Hierbei wurden einige resistente Mutanten erhalten, die auf der Platte wuchsen. Hiervon wurde ein Stamm (von den Erfindern als 6E-6 bezeichnet) isoliert und zum Beimpfen eines wäßrigen Kulturmediums verwendet, das die nachstehend genannten Nährstoffe enthielt. Die Bebrütungwurde 7 Tage bei 28° unter Schütteln durchgeführt. Die Aufarbeitung der Kulturflüssigkeit auf die in Beispiel 10 beschriebene Weise ergab 58,6 mg Hypoxanthin und'1170 mg Inosin pro Liter Kulturflüssigkeit. '

Das Kulturmedium hatte folgende Zusammensetzungϊ

Glucose . 1 %

Caseinhydrolysat I %

Dikaliumhydrogenphosphat 0,7 %

Kaliumdihydrogenphosphat 0,2 %

Magnesiumsulfat 0,02 %

Ammoniumsulfat 0,05 %

Natriumeitrat 0,05%

Thlaminhydrochlorid 2,0 7^

Riboflavin 2,0 7^

p-Aminobenzoesäure 0,1 7^

Nikotinsäure 4,0 7^

Calciumpantothenat 4,0 7^

Pyridoxinhydrochlorid 2,0 7^

Polsäure 0,1 y&

Inosit 2,0 7^

Biotin 0,1 ^ '

- Beispiel 13

Eine Suspension von Sporen von Stpeptomyces sp., Stamm Nr. Jo 107, wurde mit UV-Licht bestrahlt. Die überlebenden Sporen

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wurden auf eine Agarplatte gesät, die pro cnr 200 γ 8-Azaguanin enthielt. Hierbei wurden einige Kolonien von resistenten Mutanten erhalten, die auf der Platte wuchsen. Hiervon wurde ein Stamm (von den Erfindern als 107-15 bezeichnet) lsoliert und zum Beimpfen eines wäßrigen Kulturmediums verwendet, das die unten genannten Nährstoffe enthielt. Die Bebrütung wurde 5 Tage bei 28° unter Schütteln durchgeführt. Nach der Bebrütung wurde die Kulturflüssigkeit auf die in Beispiel 10 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 170 mg 5'-Adenylsäure, 1000 mg Adenosin-5'-diphosphat (ADP) und 90 mg Adenosin-5'-triphosphat (ATP) pro Liter Kulturmedium er-halten wurden. Das Kulturmedium enthielt folgende Nährstoffe:

Glucose 4 #

Asparagin 0,5 ^cfi>
Dlkaliumhydrogenphosphat 0,2 %
Magnesiumsulfat 0,05 %
Caseinhydrolysat 0,1 %

Beispiel 14

Ein Mutant (von den Erfindern als B-822 bezeichnet), der durch Bestrahlen des Stammes vom Wildtypus von Bacillus subtilis Cohn enend. Prazmowski mit UV-Licht erhalten wurde, reichert HjTpoxanthin und Inosin an, wenn er in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet wird.

Zellen des Mutanten B-622 wurden weiter mit UV-Licht bestrahlt.

Mit den überlebenden Zellen wurde eine Agarplatte besät, die pro cm-" 2000 y 8-Azaguanin und 10 y Adenin enthielt. Hierbei wurden einige Mutanten mit erhöhter Resistenz gegen 8-Azagusnin erhalten. Hiervon wurde ein Stamm (von den Erfindern als 3-822-22 bezeichnet) isoliert und zum,Beimpfen eines wäßrigen Kulturmediums verwendet, das die unten genannten Nährstoffe

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enthielt. Die Bebrütung wurde7 Tage bei 37° unter Schütteln durchgeführt. Nach der Bebrütung wurde die KulturflUssigkeit auf die in Beispiel 10 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 521 mg Hypoxanthin und I58O mg Inosin pro Liter Kulturflüssigkeit erhalten wurden. Es ist festzustellen, daß die
Ausbeute wesentlich höher ist als bei Verwendung des Stammes

Zusammensetzung des Kulturmediums:

	Lösliche Stärke	10%
Ip	Fleischextrakt	0,5 %
	Natriumeitrat	i*2 %
	Diammoniumhydrogenphosphat
	Natriumchlorid	1,2 g
	Magnesiumsulfat	0*05 :
15	Calciumchlorid	0,015
	Äthylalkohol

Die wäßrige Lösung dieser Nährstoffe hatte einen powert von 6,8. V .- ..'- , ■■...'■.".■ ^- ... : .ν:" ν ; T ■:

Beispiel 15 ^r

Gewaschene Zellen eines Wildtypus-Stammes von Bacillus pumilus Gottheil wurden der Einwirkung von ultraviolettem Licht ausgesetzt; danach wurden die Überlebenden Zellen auf eine Agarplatte, die 50 7/cm an 8-Azaguanin enthielt, bestreut, zwecks Gewinnung der auf der Agarplatte wachsenden resistenten Mutanten mit einem daraus isolierten Stamm (von den Erfindern als PAG-7 bezeichnet) wurde ein aus den gleichen Bestandteilen,
wie in Beispiel 10 beschrieben, bestehendes Kulturmedium beimpft. Die Bebrütung wurde 5 Tage lang bei 37°C unter Belüftung und Rühren durchgeführt* Nach der Bebrütung wurde die

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Kulturflüssigkeit zwecks Abtrennung der festen Bestandteile zentrifugiert. Das Piltrat wurde zwecks Absorption der Nucleotide mit Aktivkohle behandelt, die Aktivkohle wurde mit ammoniakalischem Äthanol extrahiert, und der Extrakt wurde anschließend konzentriert* Es fiel eine Mischung von 5'-Nucleotiden an. Diese Mischung wurde an einer mit einem quarternären stark basischen Anionenaustauscherharz vom Styroltyp gefüllten Säule adsorbiert (die lonenkapazität betrug 1,1 Äquivalente je Liter, die Teilchengröße entsprach einem Siebdurchmesser von ca. O,Oj58 mm, der Austauscher lag in der Essigsäureform vor, die Säule war 1,8 m hoch und zuvor mit einer 0,6 Mol Essigsäure enthaltenen Pufferlösung auf einen PjT-Wert von 4,4 abgepuffert). Aus der Säulenfüllung wurden Inosin und dergleichen mit einer 0,6 Mol Essigsäurepufferlösung (pH 4,4) eluiert, danach wurde mit einer 0,8 Mol Essigsäurepufferlösung (pH 4,4) Guanosin eluiert. Anschließend wurden mit einer 1,4 Mol Essigsäurepufferlösung die Verunreinigungen und danach mit einer 1,8 Mol'Essigsäurepufferlösung die 5'-Guanylsäure eluiert. Die so erhaltenen Guanosin- und 5*-Guänylsäure-Fraktionen wurden je mit Aktivkohle behandelt, wobei die jeweiligen Substanzen adsorbiert wurden, und danach wurde die Aktivkohle mit ammoniakalischem Äthanol extrahiert, und im Anschluß daran wurden die Extrakte konzentriert. Der«. Rückstand aus der das Guanosin enthaltenden Masse wurde aus heißem Wasser umkristallisiert, und man erhielt 36 mg je Liter Kulturflüssigkeit an Guanosin. Die konzentrierte Lösung des 5'-Guanylsäure-Anteils wurde erhitzt und nach Zugabe von Methanol zum Abkühlen stehengelassen, wobei 730 mg je Liter Kulturflüssigkeit an 5^I-Guanylsäure-Kristallen gewonnen wur-

3o' den.

Im Gegensatz dazu wurde Keine nennenswerte Anreicherung an Purinderivaten in der Kulturfiüssigkeit des Wildtypus-Stammes,

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wie er ursprünglich in diesem Beispiel eingesetzt worden war, bei in gleicher Weise durchgeführter Bebrütung gefunden.

Beispiel 16

Ein Mutanten-Stämm (von den Erfindern mit PAÄ-88 bezeichnet), der 8-Äzaguanin-resistent und Adenin-verbrauchend und aus Bacillus pumilus Gottheil erhalten worden war, wurde in einem wäßrigen, in gleicher Weise, wie in Beispiel 10 zusammengesetzten Kulturmedium, dem lOyUg/crrr Adenin zugegeben wor-Λ den waren, bebrütet. Die Bebrütung wurde 5 Tage bei 37°Cunter Belüften und Rühren durchgeführt. Die Kulturflüssigkeit wurde anschließend zur Entfernung der festen Bestandteile zentrifugiert« Das FiItrat wurde mit Aktivkohle behandelt, wobei die Purinderivate adsorbiert wurden, und die Kohle würde mit ammoniakalischem Äthanol extrahiert, anschließend die Extraktionslösung konzentriert, und man erhielt eine Mischung von 5'-Nucleotiden. Die Mischung wurde an einer mit einem ... y quarternären starkbasischen Anionenaustauscherharz vom Styrol typ (Ionenkapazität 1,1 Äquivalente je Liter, Ameisensäureform) gefüllten Säule chromatogräphiert, anschließend wurde mit Wasser gewaschen, Die Waschwässer wurden mit der Abflüssigkeit vereinigt, die Gesamtflüssigkeit wurde konzentriert und filtriert, und man erhielt Guanosin-Kristalie. Die Kristalle wurden ausheißem Wasser umkristallisiert, und es fielen 1^30 mg je Liter Kulturflüssigkeit an Guanosin-Krlstallen

Die Kolonne wurde mit einer Mischung aus; 0,01 η Ameisensäure und 0,05 η Natriumformiat ausgewaschen und danach mit einem Gemisch aus 0,1 η Ameisensäure und 0,1 η Natriumformla-t eluiert. Das Eluat wurde mit Aktivkohle behandelt und die 5^f-Guanylsäure absorbiert. Dann wurde die Aktivkohle mit arnmoniakälIsehern Ätna-

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nol extrahiert, und der Extrakt wurde konzentriert. Nach Erhitzen wurde Methanol zu dem Konzentrat hinzugegeben, und die Mischung wurde zwecks Abkühlung stehengelassenj es wurden 320 mg an S'-Guanylsäure-Kristallen je Liter Kulturflüssigkeit erhalten.

Im Gegensatz dazu wurde keine nennenswerte Anreicherung von Purinderivaten in der Kulturflüssigkeit von dem in der gleichen Art wie zuvor beschrieben bebrüteten anfänglich in diesem Beispiel eingesetzten Wildtypus-Stamm gefunden.

Beispiel 17

Zellen eines Wlldtypus-Stammes von Bacillus subtilis Cohn emend« Prazmowskl (von den Erfindern mit B-58 bezeichnet) wurden mit ultraviolettem Licht bestrahlt, wobei 99,9 Ji der Zellen abgetötet wurden. Mit den überlebenden Zellen wurde eine Agarplatte besät, die 2 mg/cnr an 8-Azaguanin enthielt. Hierbei wurden resistente Mutanten erhalten, die auf der Agarplatte wuchsen. Hiervon wurde ein Stamm (von den Erfindern als B-58-8R-38 bezeichnet) isoliert und zum Beimpfen eines wäßrigen Kulturmediums verwendet, das die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 14 beschrieben hatte. Die Bebrütung wurde 7 Tage bei 37°C unter Belüften und Rühren durchgeführt. Nach dem Bebrüten wurde die Kulturflüssigkeit wie in Beispiel 15 beschrieben behandelt und es fielen 2,2 g Inosin, 1,3 g Guanosin und 1*0 g Hypoxanthin je Liter Kulturflüssigkeit an,

Im Gegensatz dazu wurde keine nennenswerte Anreicherung an Purinderivaten in der Kulturflüssigkeit des Wildtypus-Stammes (B-58) beim Bebrüten des Stammes in der gleichen Weise, wie zuvor beschrieben, festgestellt.

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Beispiel 18 . . .

Ein Adenin-verbrauchender Mutanten-Stamm (von den Erfindern als B-58-388 bezeichnet)-, der aus dem gleichen Wildtypus-Stamm wie in Beispiel 17 und in der gleichen Weise, wie in Beispiel 17 beschrieben, isoliert worden war, wurde in einem wäßrigen Kulturmedium, das die gleiche Zusammensetzung, wie in Beispiel 14 beschrieben, hatte, bebrütet. Die Bebrütung wurde 7 Tage lang bei 37°C unter Belüften und Rühren durchgeführt. Nach der Bebrütung würde die Kulturflüssigkeit wie in Beispiel 15 behandelt, und es fielen 10,2 glnosin je Liter der KuI turf lüssiglceit an.

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Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung von Purinderivaten, dadurch gekennzeichnet, daß man Mutanten, die gegen Antimetaboliten im Purinstoffwechsel beständig sind, in einem Kulturmedium bebrütet, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, und anschließend die gebildeten Purinderivate aus dem Medium abtrennt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Kulturmedium Purinderivate der allgemeinen Formel

in der X Wasserstoff oder einen Hydroxyl- oder Aminorest, γ einen Hydroxyl- oder Aminorest und R Reste -CH-(CHOH)₂-CH-Ch₂-OH und

-CH-(CHOH)₀-CH-CH₀-(-0-P-) -OH

I 0- * ' OH

bedeuten, in denen η eine Zahl zwischen 1 und 3 bedeutet, wobei X Wasserstoff ist, wenn Y einen Aminorest bezeichnet,

3) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutanten Bakterien, Hefe oder Actinomyceten verwendet.

4) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Mutanten von Mikroorganismen folgender Gruppen verwen-

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Unibfiagan. m- 7 S I At«.2 Nr.-l Satz *ώ» Änderunaeapa. ν.4.&1&6Ώ.

det werden: Endomyces, Endomyoopsls, Schizosaecharomyces, Saccharomyces, Torulaspora, Debaryomyees, Pichia, Saccharomycodes, Ashbya, Wickerhamia, Petasospora, Sporobolomyces, Bullera, Cryptoeoccus, Torulopsis, Brettanomyees, Trichosporon, Mycoderma, Candida, Kloeckera, Rhodotorula, Kluyveromyces, Bacillus, Sarclna \ind Escherichia.

5) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von Adenin, Adenosin und Adenosin- ^'-phosphorsäureestern Mutanten der Gruppen Saecharomyces ecerevisiae Hansen, Saecharomyces oviformis Osterwalder, Rhodotorula rubra (Bemme) Lodder, Rhodotorula glutlnis (Pres.) Harrison, Torulopsis glabrata(Anderson) Lodder und de Vries, Bacillus megateritim de Bary und Streptomyces sp. strain Nr. I07 (ATCC- ) verwendet und das KuI-' turmedium bei Temperaturen zwischen 20 und 40° bebrütet.

6) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von Hypoxanthln Mutanten der Gruppen Saecharomyces cerevisiae Hansen, Saecharomyces oviformis Osterwalder, Rhodotorula rubra (Bemme) Lodder, Rhodo- torula glutinis (Pres.) Harrison^ Bacillus subtilis Cohn emend. Prazmowski und Eseheriehtä eoli (Migula) Castellani und Chalmers verwendet und-bei Temperaturen zwischen 20 und 40° bebrütet.

7) Verfahren nach An-sprüehen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von Inosin Mutanten der Gruppen Saecharomyces eerevisiae Hansen, Saecharomyces 'oviformis Osterwalder, Rhodotorula rubra (Bemme) Lodder, Rhodotorula glutinis (Presβ) Harrison, Torülopsis glabrata (Anderson) Lodder und de Vries, Bacillus subtilis Cohn

J5o emend» Prazmowski und Escherichia coil (Migula) Castellani

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und Chalmers verwendet und bei Temperaturen zwischen 20 und 40° bebrütet.

8) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von Inosin-5¹-phosphat Mutanten der Gruppe Saccharomyces cerevisiae Hansen, Saccharomyces oviformis Osterwalder, Rhodotorula rubra (Bemme) Lodder, Rhodotorula glutinis (Pres.) Harrison, Torulopsis glabrata (Anderson) Lodder und de Vries und Bacillus megaterium de Bary verwendet und bei Temperaturen zwischen 20 und 40° bebrütet.

9) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeiehnet, daß man zur Herstellung von 5^f-Guanylsäure Mutanten der Gruppe Bacillus megaterium de Bary verwendet und bei Temperaturen zwischen 20 und 40° bebrütet.

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