DE1442139A1 - Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiven,wasserunloeslichen Substanzen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiven,wasserunloeslichen SubstanzenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von enzymatisch aktiven, wasserunlöslichen, trägergebundenen Enzymen· Ferner betrifft die Erfindung die Herstellung enzymatisch aktiver Substanzen, die an Cellulose gebundene Enzyme aufweisen« Andere und weitere Ziele der Erfindung sind
weiter unten beschrieben·
sowie dem britischen Patent Nr.916
In den israelitischen Patenten Hr. 13950 und Hr. 15448/
sind enzymatisch aktive Substanzen beschrieben, in denen Enzyme aa polymere Träger gebunden sind. SrfindungsgemäS besteht ein sehr einfaches und zweckmäßiges Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiven, wasserunlSsliohen Substanzen,
bestehend aus EnzymmolekOlen, die über ihre für die enzymati
s ehe Aktivität nicht unbedingt notwendigen funktionellen
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Gruppen an Cellulose gebunden sind, darin, daß man zunächst
Bromacetylcellulose (BAC) herstellt und daran Enzymmoleküle
bindet, und zwar vorzugsweise über Schwefelwasserstoffgruppen oder über otoder £ -Aminogruppen der Enzymmoleküle oder über
die Imidazolgruppe von Histidin. Die Verbindungen nach der Erfindung können durch die allgemeine Formel
Cell -(-0-C-
O (I)
dargestellt werden, worin "Cell11 Cellulose bedeutet, X für
die -NH-, -S- oder Imidazolgruppe steht und Z ein Molekül des Enzyms bezeichnet, von welchem die -S-, -HH- oder Imidazolgruppen einen Seil darstellen.
Die Verbindungen gemäß der Formel I werden hergestellt durch umsetzen von Cellulose in beliebiger Form (Pulver-,
Blattform oder dergl.) mit Bromacetylbromid zu einer Verbindung
der allgemeinen Formel:
die dann mit einem geeigneten Enzym zur Reaktion gebracht wird,
welches funktioneile Gruppen aufweist, die geeignet sind zur covalenten Bindung der erwähnten Enzymmoleküle ohne Zerstörung
der enzymatisohen Aktivität, wobei sich Verbindungen der allgemeinen Formel (I) ergeben.
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Die Bindungsreaktion kann dargestellt werden durch
folgendes Reaktionsschema:
+ m HX-Z —^ Cell + m HBr
\ (-000CH2X-Z)n
wobei X und Z die gleiche Bedeutung wie oben haben.
Zum besseren Verständnis der Erfindung dienen die
folgenden. Beispiele: ..-.»*■
Beispiel It -.·-..·. , ■ - ■ ■- eis
Methode I. Eine Mischung aus 30 g Cellulose-Pulver
(Genuine Whatman Oellulosepulver, Standard Grade")» 300 g Broaeeeigaäure und 80 omr Dioxan wurden bei Raumtemperatur
über Facht gerührt; dann wurden 75 cnr Bromacetylbromid
zugefügt und 8,Stunden bei Raumtemperatur weitergerührt·
Es wurde eine viskose Lösung erhalten und Teile der Cellulose löstet sicsJr*u£. Dae Gemiich wurde dann in 2 1 einer Wasser-Eis-Miecäung gegossen und der sich bildende weiße Hiderschlag
oehraalsiait Vaseer>
mit 0,6 normaler Kaliumbicarbonat-Lösrnng «nd wltdenr mit Wasser gewaschen. Me Ausbeute betrug
33 g BAO-I mit einem Gehalt an 20,1 Gewichtsprozent Brom
(d.h. durchschnittlich 0,6 restliches Bromacetyl je Glucose
einheit).
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Methode II. Eine Mischung aus 5 g Cellulosepulver,
100 g Bromessigsäure, 100 g Bromacetylbromid und 40 cnr Dioxan wurde 130 Stunden bei 5O0C geschüttelt. Der frei werdende
Bromwasserstoff wurde mittels eines durch das Reaktionsgemisch
hindurchgeleiteten Stickstoffstromes kontinuierlich entfernt, so daß ein stärkerer Abbau der Cellulose vermieden
wurde. Die Ausbeute betrug 7»7 g BAC-II, enthaltend 32,5 $>
Brom, (d.h. im Durchschnitt 1,3 restliches Bromacetyl je Grlucoseeinheit).
Das Produkt erwies sich als leicht löslich in verschiedenen organischen Lösungsmitteln, wie u.a. Aceton, Dioxan,
Dimethylformamid und Dirnethylsulfoxyd.
Stufe B: Kupplung von Trypsin«
1 mg Trypsin (50 1° MgSO,, N.B.C. "Güteklasse für
chemische und Forschungszwecke" - "for chemical and investigational
use") wurden 3 Minuten gerührt mit 1 g BAC-I (vorher homogenisiert) in 50 cnr "Yeronal-Puffer" (veronal buffer)
(0,06-molar) mit einem pH-Wert von 8,6. Das Produkt (Tryp-BAC-I) wurde abzentrifugiert und siebenmal mit Wasser gewaschen,
rast alles Trypsin war an den Träger gebunden.
Ein weiterer Versuch zur Kupplung von Trypsin mit BAC-II wurde in 45 #iger Lösung von Aceton in Veronal-Puffer
(veronal buffer) mit einem pH-Wert von 8,6 durchgeführt. Die Analyse der wasserunlöslichen Derivate (Tryp-SAC-II) auf Gesamtetickstoff
zeigte, daß 100.mg BAC-Il 27 mg Trypsin binden·
809809/07U
Die Aktivität von Tryp-BAO-I gegenüber 5 mg L-lysinäthylester in 5 ca. Wasser bei pH 6 wurde geprüft durch
Titration mit einem pH-Wert-Titrationsgerät (pH-stat titrator)
mit automatischer Aufzeichnung, Modell TTT-1. Es wurde gefunden, daß 100 mg unlösliches Tryp-BAO-I in seiner Aktivität
60 bis 70 mg natürlichem Trypsin entsprachen (d.h. das gebundene Trypsin ist zu 60 - 70 # aktiv).
Analog wurde die Aktivität von Tryp-BAO-II gegenüber
5 mg Benzoyl-Ii-Argininäthylester, gelöst in 5 cur Wasser,
bei pH 6 geprüft. Es wurde gefunden, daß 100 mg Tryp-BAC-II
eine Aktivität besitzen, die 4,2 mg natürlichem Trypsin entspricht.
Die Aktivität von Tryp-BAO-I gegenüber Casein wurde
nach Koni te (M. Eunitz J. Gen. Hiysiol. ^O , 291 (1947) )
geprüft. Die Aktivität von 100 mg Tryps-SAC-I entsprach derjenigen von 23 mg natürlichem Trypsin.
Di· enzymatisch· Aktivität von Tryp-BAO-I verschlechterte sich nicht während 3-monatiger lagerung, vorausgesetzt,
daß das Kuppeln durch eine Nachbehandlung mit Merkaptoäthanol
ergänzt wurde, dessen Menge ausreichte, um mit den ungebundenen Bromgruppen zu reagieren.
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— & —
500 mg homogenisiertes BAC-I wurden 4 Minuten ge-
•z
rührt mit 10 mg Chymotrypsin, gelöst in 4-0 cnr Veronal-Puffer
(veronal buffer) ( 0f06 molar, pH 8,6), und 60 cnr Wasser,
das Produkt (Chym-BAC-I) wurde abzentrifugiert und siebenmal
mit Wasser gewaschen. Für Chym-BAC-I ergab sich eine 45 #ige
Aktivität gegenüber Ii-Iyrosin-lthylester. Die enzymatische
Aktivität von Chym-BAC-I war nach 3-monatiger lagerung nicht
zurückgegangen, vorausgesetzt, daß das Kuppeln durch eine Nachbehandlung
mit Merkaptoäthanol ergänzt wurde, dessen Menge dazu ausreichte, um mit den ungebundenen Bromgruppen zu reagieren.
Zu 50 mg BAC-I in 10 cnr 0,1-molarer Natriumphoephatlösung
wurden 10 mg Ribonuclease zugefügt. Das Heaktionsgemisch
wurde 16 Stunden bei 4°C gerührt. Nach fünfmaligem Waschen
mit 0,2-molarem Natriumacetat (pH 6,0) und zweimaligem Waschen
mit Wasser wurden die verbleibenden Bromgruppen durch Reaktion mit Merkaptoäthanol entfernt. Die enzymatische Aktivität wurde
gegenüber Cytidin-2*»5f-cykl.-phosphat und BHA geprüft und verglichen
mit natürlicher Ribonucleasen Die Aktivität gegenüber dem ersten Substrat war äquivalent derjenigen von 150 0 de»
natürlichen Enzyms, während sie gegenüber dem zweiten Substrat äquivalent SOOq war·
80980S/07U
Die Aktivität des unlöslichen enzymatisehen Präparates
nahm während dreimonatiger Lagerung nicht ab, vorausgesetzt, daß das Kuppeln durch eine Nachbehandlung mit Merkaptoäthanol
ergänzt wurde, dessen Menge ausreichte, um mit den ungebundenen Bromgruppen zu reagieren·
Stufe A: Bereitung von Jodacetylcellulose (IAO).
Bromacetylcellulose wurde entsprechend Beispiel I bereitet.
Zu 100 mg Bromacetylcellulose mit 5t9 # Brom,, wurden
600 mg Natriumiodid und 5 cm' 95 #iger Äthylalkohol hinzugefügt
und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Sie festen Bestandteile wurden abfiltriert, mit
Alkohol, wässriger Sicarbonatlösung, Wasser, Alkohol und
Äther gewaschen und getrocknet. Das Produkt enthielt 9»5 Gewichtsprozent
Jod.
Stufe Bjl Kuppeln mit Modellverbindungen
Das Kuppeln mit Merkaptoäthanol, Phenylalalin und v , erfolgte
Polylysin wmx*» bei pH 6,0 bzw. 7,0 bzw. 8,9.x*xsca*»HffiBx Sie Geschwindigkeit und der Umfang der Reaktionen wurden unter Benutzung eines pK-Stat-Gerätee beobachtet.
Polylysin wmx*» bei pH 6,0 bzw. 7,0 bzw. 8,9.x*xsca*»HffiBx Sie Geschwindigkeit und der Umfang der Reaktionen wurden unter Benutzung eines pK-Stat-Gerätee beobachtet.
80980 9/0 7 U
Claims (7)
1. Enzymatisch, aktive» wasserunlösliche Substanzen,
gekennzeichnet durch die allgemeine formel
Cell -(-0-C-CE2-X-Z)n
worin "Cell" Cellulose bedeutet, Z für ein Enzymmolekül steht*
und X eine für die enzymatisch^ Aktivität nicht wesentliche
funktioneile Gruppe des Enzymmoleküls, vorzugsweise -NH-, -S-eine
Phenol- oder eine Imidazolgruppe bedeutet·
2. Enzymatisch aktive, wasserunlösliche Substanzen,
gekennzeichnet durch an Bromacetylcellulose gebundenes Trypsin.
3. . Enzymatisch aktive, wasserunlösliche Substanzen,
gekennz ei ohne t durch an Bromacetylcellulose gebundenes Chymotrypsin·
4· Enzymatisch aktive, wasserunlösliche Substanzen, ge kennzeichnet durch an Bromacetylcellulose
gebundene Ribonuclease.
5. Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiven,
wasserunlöslichen Substanzen, definiert durch die allgemeine JOrmel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet
daß man zunächst eine Verbindung der Formel
Cell -(-0-CO-CH2-Y)3
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COPY
herstellt, worin "Cell" Cellulose bedeutet und Γ für Brom oder
Jod steht, worauf man mit dieser Verbindung über funktioneile Gruppen des Enzyms, die nicht wesentlich für seine enzymatische
Aktivität sind, vorzugsweise über die Sulfhydryl- oder die Aminogruppe, Enzymmoleküle kuppelt·
6. Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiven,
wasserunlöslichen Substanzen wie in der Beschreibung beschrieben.
7. Enzymatisch aktive, wasserunlösliche Substanzen wie in der Beschreibung beschrieben.
80S80S/07 U
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