DE2336829C3

DE2336829C3 - Wasserunlösliches Enzympräparat, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung

Info

Publication number: DE2336829C3
Application number: DE2336829A
Authority: DE
Inventors: Lawson William Powell
Original assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Current assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Priority date: 1972-07-22
Filing date: 1973-07-19
Publication date: 1981-06-19
Also published as: AR195617A1; US3883394A; DK139302B; IL42708A; CS173597B2; NL7310040A; HU167224B; CA993387A; FR2193832A1; SU499813A3; AU5831773A; DE2336829A1; ATA634273A; ZA734506B; SE428218B; DE2336829B2; SE7700442L; PL95095B1; JPS4950183A; GB1400468A

Description

Die Erfindung betrifft wasserunlösliche Enzympräparate, die eine die Amidbindung von Penicillinen spaltende Acylase enthalten. Diese Enzyme, im folgenden als Penicillinacylasen bezeichnet, eignen sich zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen, die durch Fermentation von Materialien natürlichen Ursprungs gewonnen werden.

Penicillinacylasen (oder Deacylasen) werden seit 1961 zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure au > Penicillinen verwendet Bei Verwendung des zellfreien Enzyms entstehen jedoch Schwierigkeiten, da dieses Enzym aus dem Reaktionsgemisch nicht leicht abgetrennt werden kann; außerdem kann man das zellfreie, wasserlösliche Enzym nicht leicht wiederverwenden. Um diese Schwierigkeiten zu beheben, wurde vorgeschlagen, das Enzym an ein polymeres Substrat zu binden und es damit wasserunlöslich zu machen. Es wurde auch vorgeschlagen, die Penicillinacylase dadurch wasserunlöslich zu machen, das man sie mittels eines wasserlöslichen Dialdehyds an eine feste, wasserunlösliche, absorbierende Substanz bindet, wobei Vernetzungen zwischen dem polymeren Substrat und dem Enzym auftreten können (vgl. DE-OS 21 43 062).

Obwohl die derart hergestellten unlöslichen Enzympräparate wiederverwendet werden können, ist bei ihrer Verwendung zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure die Gesamtausbeute an 6-Aminopenicillansäure nicht besonders hoch, da das Enzympräparat bei jedem weiteren Versuch an Aktivität verliert.

Aufgabe der Erfindung war es daher, wasserunlösliche Penicillinacylase-Präparate zur Verfügung zu stellen, die zwecks Wiederverwendung aus dem Reaktionsmedium isoliert werden können und für die Lagerung und den Transport des Enzyms geeignet sind. Außerdem sollte bei Verwendung dieser Enzympräparate zur Spaltung von Penicillinen 6-Aminopenicillansäure in hoher Reinheit und in guter Ausbeute erhalten werden.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein wasserunlösliches Enzympräparat, bestehend aus einer Penicillinacylase, die mittels eines wasserlöslichen Dialdehyds an eine feste, wasserunlösliche, absorbierende Substanz gebunden ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Acylase zusätzlich mittels eines aliphatischen Diamins, vorzugsweise eines Λ,ω-Diaminoalkans mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, an die feste Substanz gebunden ist

Das erfindungsgemäße wasserunlösliche Enzympräparat ist stabiler als die bisher hergestellten Enzympräparate und kann daher in einer größeren Anzahl von aufeinanderfolgenden Ansätzen zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure at» Penicillin verwendet werden.

Wird das erfindungsgemäße Enzympräparat für die Aufspaltung von Benzylpenicillin in 6-Aminopenicillansiure verwendet, so gewinnt man vorzugsweise die Penicillinacylase aus Bakterien, z. B. des Stammes Escherichia coli. Wird dagegen Phenoxymethylpenicillin gespalten, so gewinnt man die Penicillinacylase besser

aus Pilzarten und Actinomyceten.

Als wasserlöslichen Dialdehyd kann man Glyoxal oder insbesondere Glutaraldehyd verwenden.

Geeignete feste absorbierende Substanzen sind Ceüulosepulver und die verschiedenen bekannten Cellulosederivate, Ionenaustauscher-Harze, Silicagel und andere polymere Verbindungen. Besonders geeignet sind vernetzte Polyacrylsäureester- oder Polymethacrylsäureester-Harze, vorzugsweise mit einem großen Oberfläche/Gewicht- Verhältnis.

Da die Oberfläche, die für die Absorption des Enzyms zur Verfugung steht, mit abnehmender Teilchengröße .des Absorbens zunimmt, ist die wasserunlösliche absorbierende Substanz eine feinverteilte polymere Verbindung. Man erhält dann wasserunlösliche Enzympräparate mit einer hohen spezifischen Aktivität Bei Verwendung von vernetzten Polyacrylsäureester- oder Polymethacrylsäureester-Harz beträgt die durchschnittliche Teilchengröße vorteilhafterweise 0,6 mm, was einer Oberfläche von 450 m²/g Harz entspricht Mit abnehmender Teilchengröße steigen der Wirkungsgrad der Kupplungsreaktiog und die spezifische Aktivität des wasserunlöslichen Enzympräparats.

Als aliphatisches Diamin kann 1,3-Diaminopropan oder 1,6-Diaminohexan eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Enzympräparats durch Umsetzen in wSLOriger Lösung einer festen, wasserunlöslichen, absorbierenden Substanz, einer Penicillinacylase und eines wasserlöslichen Dialdehyds, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zusätzlich ein aliphatisches Diamin, vorzugsweise ein o^ü-Diaminoalkan mil 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, verwendet

Das erfindungsgemäße Enzympräparat kann in wäßriger Lösung bei einem pH-Wer· von 5—9 hergestellt werden.

Die Reihenfolge, in der die vier Bestandteile des erfindungsgemäßen Enzympräparats vermischt werden, ist oft von großer Bedeutung bei der Herstellung eines Präparats mit optimalen Eigenschaften. So wird z. B. die feste, wasserunlösliche, absorbierende Substanz zuerst mit der Penicillinacylase, gegebenenfalls in Gegenwart 'des Diamins, und dann mit dem Dialdehyd und — falls nicht vorher schon zugesetzt — auch mit dem Diamin in Berührung gebracht Vorzugsweise wird das Enzym in Gegenwart von 0,1 bis 5,0 Millimol, insbesondere von 0,2 bis 2,0 Millimol Diamin und von 0,1 bis 10,0, insbesondere von 24 bis 5,0 Millimol Dialdehyd je Gramm absorbierende Substanz gebunden.

Um nach der Kupplungsreaktion eventuell noch vorhandene freie Aldehydgruppen zu entfernen, wird das Enzym-Harz mit einer .Lösung von Natriummetabisulfit, Harnstoff, Glycin oder eines aliphatischen Diamins gewaschen.

Das derart hergestellte wasserunlösliche Enzympräparat ist stabil genug, um mindestens 25 aufeinanderfolgende Spaltansätze von Penicillin ohne wesentlichen Aktivitätsverlust des Enzyms durchfahren zu können.

Auch der pH·Wert, bei dem die Kupplungsreaktion durchgeführt worden ist, beeinflußt die Stabilität des wasserunlöslichen Enzympräparats. Um die Stabilitit des an das Harz gebundenen Enzyms schnell feststellen zu können, wird das mit einer Pufferlösung vom pH 7,8 angefeuchtete wasserunlösliche Enzympräparat bei 37°C inkubiert. Wird das Enzym nicht durch das Substrat oder die zugesetzten Produkte stabilisiert, so verliert es rasch an Aktivität.

Noch stabiler wird das wasserunlösliche Enzympräparat, wenn die feste, wasserunlösliche, absorbierende Substanz zuerst mit einem Gemisch des Diamins und des Dialdehyds vorbehandelt und dann mit der

Penicillinacylase in Br rührung gebracht wird Wesentlich bei dieser Herstellungsart sind die Mengen an aliphatischen! Diamin und an Dialdehyd sowie ihr molares Verhältnis. Das Diamin und der Dialdehyd werden je in einer Menge von 0,01 bis 20,0 Millimol, vorzugsweise von 0,1 bis 10,0 Millimol je Gram,T) absorbierende Substanz und in einem molaren Verhältnis von Diamin zu Dialdehyd von 1,0:0,1 bis 1,0:40, vorzugsweise von 1:1 bis 1 :10, verwendet Die Vorbehandlung des Harzes erfolgt vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen 4 und 9. Unter optimalen Bedingungen ist die Stabilität des erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Enzympräparats so groß, daß man 50 oder mehr aufeinanderfolgende Spaltansätze von Penicillin durchführen kann.

Man kann die Stabilität des an Harz, insbesondere an vernetztes Polyacrylsäureester- oder Polymethacrylsäureester-Harz, gebundenen Enzyms noch erhöhen, wenn man das Enzym mit einem Mono- oder Dialdehyd, wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd, vorbehandelt Das Enzym wird vor oder nach seiner Gewinnung, z. B. aus E.coli-Zellen, bei einem pH-Wert von 5 bis 8 2 bis 24 Stunden lang mit Formaldehyd in einer Konzentration von 04 bis 5 Prozent ode/ mit Glutaraldehyd in einer Konzentration von 0,01 bis 04 Prozent behandelt

Sowohl die Wirkung der Kupplungsreaktion als auch die spezifische Aktivität des wasserunlöslichen Enzympräparats steigen mit der Reinheit des verwendeten Enzyms. Geeignet ist ein Enzym mit einer Aktivität von 0,15 bis 50 μΜοΙ/MinVmg Protein, insbesondere von 14 bis 15 μΜοΙ/Mui/mg Protein.

Bei beiden Herstellungsverfahren, sowohl bei der Kontaktierung des Absorbens mit dem Enzym oder mit dem Enzym und dem Diamin und dem Dialdehyd als auch bei der Vorbehandlung des Absorbens mit dem Dialdehyd und dem Diamin und der anschließenden Umsetzung mit der Penicillinacylase, ist tür eine gute Absorption eine Reaktionszeit von 2 bis 24 Stunden wünschenswert Diese Kupplungsreaktion wird bei einer Temperatur von 1 bis 37"C, vorzugsweise von 15 bis 25° C, durchgeführt

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des wasserunlöslichen Enzympräparats zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure aus Benzylpenicillin oder Phenoxymethylpenicillin.

Die Reaktion erfolgt in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 6,0 bis 9,0, vorzugsweise von 7,0 bis 84.

Wegen der Abspaltung der Seitenkettensäure aus dem Penicillin muß dem Reaktionsgemisch portionswei se oder kontinuierlich Alkali zugesetzt werden, um den pH-Wert zu halten. Diese Reaktion erfolgt daher am besten als diskontinuierliche Reaktion in einem mit Rührer versehenen Reaktionsgefäß. Man kann jedoch auch eine das wasserunlösliche Enzympräparat enthal·

μ tende Kolonne verwenden, vorausgesetzt, das Reaklionsgemisch läuft so schnell durch, daß ein starker pH-Abfall verhindert wird, und der pH-Wert wird in

einem Reaktionsgefäß, das mit einem Rührer versehen und zur Kolonne in Serie geschaltet ist, wieder <>5 eingestellt.

Man kann das erfindungsgemäße wasserunlösliche Enzympräparat nicht nur wiederverwenden, sondern auch nach einer Reihe von PenicillinsDaltansätzen

wiedergewinnen. Das Restprotein wird dann durch Saurebehandlung entfernt, das Harz wird in oben beschriebener Weise wieder mit frischem Enzym beladen und das so hergestellte Präparat wiederverwendet.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Als absorbierende Substanz wird ein im Handel erhältliches vernetztes Methacrylsäureester-Harz (Amberlite XAD-7) verwendet Die Aktivität der Enzympräparate wird in μΜοΙ bei pH 7,8 und 37" C erzeugte 6-Aminopenicillansäure je Minute und je Gramm Präparat angegeben.

Beispiele 1-7

Zellen des Stammes Escherichia coli NCIB 8743 werden in einem Homogenisator mechanisch aufgebrochen. Nach Einstellen des pH-Wertes auf 5,0 werden die Zelltrümmer abfiltriert Das Enzym wird in herkömmlicher Weise, z.B. durch Ausfällen mit zu 75 Prozent gesättigtem Ammoniumsulfat, isoliert, gesammelt und in Wasser wieder aufgelöst Die Lösung wird dialysiert und entweder als solche für die Kupplungsreaktion mit dem wasserunlöslichen Absorbens verwendet oder gefriergetrocknet und dann bei Bedarf wieder gelöst Man kann diese Enzymlösung aber auch in herkömmlicher Weise weiter reinigen, z, B, durch Ionenaustauscher-Chromatographie oder durch Hitzebehandlung,
Das Diamin gemäß Tabelle I wird in 1500 ml 0,5 m Citrat-Phosphat-Puffer, pH 5,0, gelöst. Die Lösung wird auf pH 5,0 eingestellt, mit der Penicillinacylase und dann mit 100 g Methacrylsäureester-Harz versetzt Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden bei Raumternpera tür langsam gerührt 100 ml einer 50prozentigen

ίο wäßrigen Glutaraldehydlösung werden hinzugegeben, der pH-Wert wird auf 5,0 eingestellt und das Reaktionsgemisch weitere 18 Stunden bewegt Der Feststoff wird abfiltriert und mit Wasser, 5 Prozent Natriummetabisulfit, 1 m Natriumchlorid und 0,5 m Phosphatpuffer, pH 7,8, gewaschen. Die Aktivität der derart hergestellten Enzympräparate ist in Tabelle I angegeben.

Mit einigen dieser Enzympräparate wird in aufeinanderfolgenden Versuchen eine 6prozentige Kaliumbenzylpenicillinlösung in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt Die Reaktion erfolgt in einem 1-Liter-Reaktionsgefäß bei pH 7,8 und 37° C urr^rr Rühren. In Tabelle I ist die prozentuale Umwandlung Jiach 5 Stunden angegeben.

Tabelle I	Diamin 4er Formel H₂N(CH2),,NH₂	6	Menge	Acylasemenge	Aktivität des Präparats	Verwendung für die Deacyliemng	aufeinander folgende Versuche	Umwand lung
Beispiel Nr.	π	3				Menge		(%)
		2	15 g		(μΜοΙ/Min/g)	(g)	15	90
	4	11 ml	5g	16	200	25	90
1	5	10,2 ml	5g	24	100	10	85
2	8	14 g	100 ml	17,2	100	—	—
3	10	13 g	100 ml	40	-	-	-
4	18,7 g	15OmI	10	-	-	-
5	22,2 g	100 ml	12,8	-	-	—
6		100 ml	15,2	-
7

Beispiel 8

Es wird gemäß Beispiel 1 verfahren, mit dem Unterschied, daß nur 300 ml Pufferlösung verwendet werden. Außerdem werden 50 ml Penicillinacylase in 250 ml Wasser eingesetzt Das Enzym und das Harz werden 18 Stunden fcng gerührt, bevor 200 ml einer 25prözentigen wäßrigen Glutaraldehydlösung zugesetzt werden. Die Aktivität dieses Enzympräparats beträgt 20,6 μΜοΙ/MinVg.

Mit 103 g dieses Enzympräparats wird gemäß Beispiel 1 Benzylpenicillin gespalten. Nach 18 aufeinanderfolgenden Versuchen sind nach 5 Stunden 91 Prozent des Penicillins in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt.

Beispiele 9und 10

13'Diaminopfopan wird in 1500 ml 0,25 m Phosphat· puffer, pH 7,0, gelöst. Die Lösung wird auf pH 7,0 eingestellt, mit 25 ml Penicillinacylaselösung und dann mit 100 g Methacrylsäureester-Harz versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden lang leicht bewegt, dann mit 200 ml einer 25prozentigen Glutaraldehydlösung versetzt. Nach Einstellen des pH-Werts auf 7,0 wird das Reaktionsgemisch weitere 18 Stunden bewegt. Der Feststoff wird abfiltriert und gemäß Beispiel 1 gewaschen. Man erhält ein Präparat mit der in Tabelle Il angegebenen Aktivität. Bei der Deacylierung von 1 Liter einer 6prozentigen Kaliumbenzylpenicillinlösung bei pH 7,8 und 37°C erhält man die in Tabelle Il angegebene Umwandlung von Penicillin in 6-Aminopenicillansäure nach 5 Stunden in 10 aufeinanderfolgenden Versuchen.

Tabelle Π

60

Diamin- M enge	Aktivität des Prfjarats	Verwendung für Deacylierung	die
		Menge	Umwand lung
(ml)	(μΜοΙ/Min./g)	(g)	(%)

17.4
17,2

110 106

75 90

Beispiel ti

300 ml 0.5 m Phosphatpiiffer. pH 7,0, werden mit 60 ml Penicillinacylaselösung, dann mit 240 ml destilliertem Wasser und 100 g Methacrylsäureester-Harz versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden schwach bewegt. Il ml 1,3-Diaminopropan und 200 ml einer 25prozentigen wäßrigen Glutaraldehydlösung werden so zugegeben, daß der pH-Wert nicht über 8.0 steigt. Die Lösung wird dann auf pH 7,0 eingestellt und 18 Stunden gerührt. Der Feststoff wird gesammelt und gemäß Beispiel I gewaschen. Man erhält 107 g wasserunlösliches Enzympräparat, dessen Aktivität in bezug auf Kaliiimbenzylpenicillin 11,92 μΜοΙ/Min./g beträgt

Beispiel 12

schwach gerührt. Das an das Harz gebundene Enzym wird abfiltriert und in 500 ml Wasser, das ImI Diaminopropan. pH 7.0, enthält, eingebracht und weitere 8 Stunden schwach gerührt. Nach dem Abfiltrieren wird das an das Harz gebundene Enzym nacheinander mit I m Natriumchioridiosung. 2.5prozentiger wäßriger Natriummetabisulfitlösung und zweimal mit 0,2 m Phosphatpiiffer, pH 7,0, gewaschen. Die Aktivität dieses Enzympräparats beträgt 35μΜοΙ/ Min./g.

100 g dieses Enzympräparats werden zur Deacylierung bei pH 7.8 und 37¹C von einem Liter einer 7prozentigen Kaliumbenzylpenicillinlösung verwendet. In 25 aufeinanderfolgenden Versuchen sind nach 5 Stunden mehr als 90 Prozent Penicillin in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt.

Beispiel 15

phatpuffer. pH 7,0. werden mit 100 g Methacrylsätirecster-Har/ versetzt. Das Reaktionsgemisch wird Ib Stunden gerührt. Der Feststoff wird abfiltriert, in 500 ml einer 5prozentigen Glutaraldehydlösung in 0,1 m Phosphatpuffer, pH 7,0. eingebracht und 16 Stunden gerührt. Der Feststoff wird abfiltriert, in 500 ml einer 0.2pro/eniigen 1.3-Diaminopropanlösung in 0,1 m Phosphatpuffer. pH 7,0, eingebracht und 16 Stunden gerührt. Der Feststoff wird gesammelt und mit einer 5prozentigen wäßrigen Natriumchloridlösung, einer 2,5prozentigen Natriummetabisulfitlösung und 0,2 m Phosphatpuffer. pH 7,0. gewaschen. Die Aktivität dieses Enzympräparats beträgt 30.8 μΜοΙ/MinVg.

Beispiel 13

600 ml destilliertes Wasser und 200 ml einer 25prozentigen wäßrigen Glutaraldehydlösung werden mit 100 g Methacrylsäureester-Harz versetzt. Das Reaktionsgemisch wird auf pH 7,0 eingestellt, zwei Stunden gerührt, dann mit 2 ml 1,3-Diaminopropan versetzt und 18 Stunden schwach bewegt. Der Feststoff wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in 575 ml 0.2 m Phosphatpuffer. pH 7.0. suspendiert. Diese Lösung wird mit 25 ml Penicillinacylaselösung versetzt und 18 Stunden schwach bewegt. Der Feststoff wird mit 1 m Natriumchloridlösung und 0,2 m Phosphatpuffer. pH 7.8. gewaschen. Die Aktivität dieses Enzympräparats beträgt 42 μΜοΙ/Minyg.

120 g des Enzympräparats werden zur Deacylierung bei pH'7.8 und 37°C v«n einem Ltter einer 8prozentigen Kaliumbenzylpenicillinlösung verwendet. In 6 aufeinanderfolgenden Versuchen sind nach 5 Stundet: 80 Prozent des Penicillins in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt

Beispiel 14

500 ml einer 5volumenprozentigen wäßrigen Glutar- eo aldehydlösung. pH 7,0, werden mit 100 g Methacrylsäureester-Harz versetzt und 2 Stunden schwach gerührt Das Reaktionsgemisch wird dann mit 1 ml Diaminopropan versetzt mit Salzsäure auf pH 7,0 eingestellt und weitere 14 Stunden schwach bewegt Das Harz wird abfiltriert mit Wasser gewaschen und nochmals filtriert Eine Peniciiiinacyiaselösung in 0,2 m Phosphatpufier, pH 7,0, wird mit diesem Harz versetzt und 16 Stunden /entigen Glutaraldehydlösung in 0.2 m Phosphatpuffer werden bei den in Tabelle III angegebenen pH-Werten mit einer Enzymlösung (77 μΜοΙ/Min/g Harz) und 20 g vernetztem Polymethacrylsäiireester-Harz versetzt. Das Endvolumen wird auf 100 ml eingestellt. Das Reaktionsgemisch wird 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wird dann abfiltriert und mit Phosphatpuffer. pH 7.8. gründlich gewaschen. Die spezifische ' "Uivität des Harzes wird sofort und nach I -. 4- und 5tägiger Lagerung des feuchten Harzes bei 37 C bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IH zusammengefaßt.

Tabelle III

pH-Wert der Spezifische Prozent Gesamtaktivitätsverlust

Kupplungs- Aktivität des nach Lagerung

reaktion Enzym- bei 37 C Harzes

	(μΜοΙ/	Bei	1 Tag	4 Tage	_·> Tage
	Min./g)
4.5	38	22	40	40
5.5	41.5	19	33	33
6.5	38	12	31	31
7.5	39	11	26	26
8.5	35	7	23	23
	spiel 16

0,2 m Phosphatpuffer wird mit 16 ml einer 25prozentigen Glutaraidehydlösung und 1 ml Diaminopropan versetzt Die Lösung wird auf die in Tabelle IV angegebenen pH-Werte eingestellt Das Endvolumen beträgt 100 ml. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 25 g Methacrylsäureester-Harz versetzt und bei 25° C 16 Stunden gerührt Der Feststoff wird abfiltriert und in Puffer, pH 6,0, gewaschen. Eine Enzymlösung in 0,2 m Phosphatpuffer, pH 6,0, wird mit diesem Harz versetzt und 16 Stunden bei 25³C gerührt Der Feststoff wird dann abfiltriert und mit 0,2 m Puffer, pH 7,8, gewaschen. Die Aktivität des Enzympräparats wird sofort und nach 1-, 4- und 8tägiger Lagerung bei 37° C in feuchtem Zustand bei pH 7Jo im Puffer bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt

Tabelle IV

pH-Wert der Aktivität des Gesamtaktivitätsverlust nach

Vorhehand- Harzes lung mit 1,3-Diaminopropan und Olutaraldehyd (uMol/

Min./g)

Lagerung hei .17 C 1 Tag 4 Tage

8 Tage

37
26
12

I 0

Beispiel 17

14

0.2 m Phosphatpuffer wird mit den in Tabelle V angegebenen Mengen an 25prozentiger Gliitaraldehyd· ι™..,.. „j,jj r)|-.rnjn verse'..".. Der End-^H-Wer! '.viril suf 6.0. das Volumen auf 100 ml eingestellt. Diese Lösung wird mit 25 g Methacrylsäureester-Harz versetzt und 16 Stunden bei 25°C gerührt. Das Harz wird abfiltriert und mit 0.2 m Puffer. pH 6.0, gewaschen. F.ine Penicillinacylaselösung in 0.2 m Phosphatpuffer. pH 6.0. wird mit dem Harz versetzt und 16 Stunden bei 25" C gerührt. Der Feststoff wird abfiltriert und mit 0.2 m Puffer. pH 7.8. gewaschen. Die Aktivität des Enzympräparats wird sofort und nach 8tägiger Lagerung bei V C in feuchtem Zustand bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt.

Tabelle V

Vol.-Prozent Vol.-Prozent Aktivität Diaminnpropan Glutaraldehyd

Min/g)

Aktivität nach 8-tägigcr Lagerung

(■zMol/
Min./g)

34 29 29 26

1 4 40

4 4 4i

8 4 46

10 4 41

Beispiel 18

200 ml 0,2 m Phosphatpuffer, pH 6.0, werden mit 48 ml einer 25prozentigen wäßrigen Glutaraldehydlösung und mit 3 ml 13-Diaminopropan versetzt. Der pH-Wert wird auf 6,0 und das Volumen auf 300 ml mit Phosphatpuffer eingestellt. Die Lösung wird mit 100 g Methacrylsäureester-Harz versetzt und 16 Stunden bei pH 6,0 und 25° C gerührt. Das Harz wird abfiltriert und mit Puffer gewaschen. Die Penicillinacylaselösung wird in Puffer, pH 6,0, auf die in Tabelle VI angegebenen Anfangsaktivitäten eingestellt und 12 Stunden bei 25° C mit 1 Prozent Formaldehyd behandelt. Diese Enzymlösung wird dann mit dem vorbehandelten Harz versetzt und 16 Stunden bei pH 6.0 und 25° C gerührt Das an das Harz gebundene Enzym wird abfiltriert und mit Puffer gewaschen. Die spezifische Aktivität des Harzes und die

Wirkung der Kupplungsreaktion bei verschiedenen Enzymmengen sind in Tabelle Vl zusammengefaßt.

Tabelle VI	Spezifische Aktivität des Enzym-Harzes (μΜοΙ/Min./g)	Prozent Kupplung
Anfangsaktivität (uMol/Min./g Harz)	32 35 28	41,5 30 45
77 115 62

Beispiel 19

Es wird gemäß Beispiel 18 verfahren, mit dem Unterschied, daß verschieden reine Enzymlösiingen verwendet werden. Die Anfangsaktivität beträgt jeweils 77 uMol/Minyg Harz. Die spezifischen Aktivitäten und

zusammengefaßt.
Tabelle VlI

Spezifische Aktivität des verwendeten Enzyms

mg Protein)

Spezifische Aktivität des Enzym-Harzes

(yMol/Min./g)

Prozent Kupplung

31 40 59

40

52 77

Beispiel 20

Es wird gemäß Beispiel 18 verfahren, mit dem Unterschied, daß ein Methacrylsäureester-Harz mit einer geringeren Teilchengröße, z. B. zwischen 76 und 38 μ (im Vergleich zu 500 μ in Beispiel 19) mit zwei verschiedenen Enzymkonzentrationen beladen wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefaßt.

IUUClIC Till

Anfangsaktiviläl ίμΜοΙ/Min./g Harz)

Spezifische Aktivität des Enzym-Harzes

(μ Mol/M in./g)

Prozent Kupplung

135

86

Beispiel 21

Es wird gemäß Beispiel 18 verfahren, mit dem Unterschied, daß 5 kg Methacrylsäureester-Harz verwendet werdea Die Mengen der anderen Bestandteile werden entsprechend erhöht. Das derart hergestellte Enzympräparat hat eine Aktivität von 31 μΜοΙ/Minyg und wird zur Spaltung von 40 Litern einer 6.5gewichtsprozentigen Benzylpenicillinlösung verwendet. In 50 aufeinanderfolgenden Versuchen sind nach 6 Stunden durchschnittlich 95 Prozent Penicillin in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt.

Claims

Patentansprüche:

1. Wasserunlösliches Enzympräparat, bestehend aus einer Penicillinacylase, die mittels eines wasserlöslichen Dialdehyds an eine feste, wasserunlösliche, absorbierende Substanz gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylase zusätzlich mittels eines aliphatischen Diamins, vorzugsweise eines α,ω-Diaminoalkans mit 2 bis 10 Kohlenstoff- in atomen, an die feste Substanz gebunden ist.

2. Wasserunlösliches Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bindung des Enzyms das Diamin und der Dialdehyd je in einer Menge von 0,01 bis 20μΜοΙ je Gramm absorbierende Substanz und in einem molaren Verhältnis von Diamin zu Dialdehyd von 1,0 :0,1 bis 1,0 :40, vorzugsweise von 1 :1 bis 1:10, eingesetzt wurden.

3. Wasserunlösliches Enzympräparat nach An-Spruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Diamin in einer Menge von 0,1 bis 5,0 μΜοΙ, vorzugsweise von 0,2 bis 2,0μΜοΙ je Gramm absorbierende Substanz eingesetzt wurde.

4. Wasserunlösliches Enzympräparat nach Ansprach 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Dialdehyd in einer Menge von 0,1 bis 10,0 μΜοΙ, vorzugsweise von 2£ bis 5,0μΜοΙ je Gramm absorbierende Substanz eingesetzt wurde.

5. Wasserunlösliches Enzympräparat nach An- w spruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als feste, wasserunlösliche, absorbierende Substanz ein vernetztes Polyacrylsäureester- oder Polymethacrylsäureester-Harz, vorzugsweise mit einem großen Oberfläche/Gewicht-Verhältnis, eingesetzt wurde.

6. Verfahren zur Herstellung des wasserunlöslichen Enzympräparats nach Anspruch 1 bis 5 durch Umsetzen in wäßriger Lösung einer festen, wasserunlöslichen, absorbierenden Substanz, einer Penicillinacylase und eines wasserlöslichen Dialdehyds, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich ein aliphatisches Diamin, vorzugsweise ein «,eu-Diaminoalkan mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die absorbierende Substanz zuerst -n mit der Penicillinacylase, gegebenenfalls in Gegenwart des Diamins, und dann mit dem Dialdehyd in Berührung bringt

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die absorbierende Substanz zuerst mit dem Diamin und dem Dialdehyd vorbehandelt und dann mit der Penicillinacylase in Berührung bringt

9. Verfahren nach Anspruch 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Diamin und den Dialdehyd je in einer Menge von 0,01 bis 20 μΜοΙ je Gramm absorbierende Substanz und in einem molaren Verhältnis von Diamin zu Dialdehyd von

1,0 :0,1 bis 1,0:40, vorzugsweise von I : I bis 1:10, verwendet μ

10. Verfahren nach Anspruch 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das Diamin in einer Menge von 0,1 bis 5,0μΜοΙ, vorzugsweise von 0,2 bis 2,0 μΜοΙ je Gramm absorbierende Substanz verwendet. M

11. Verfahren nach Anspruch 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man den Dialdehyd in einer Menge von 0,1 bis 10.0 μΜοΙ, vorzugsweise von 2.5 bis 5,0μΜο1 je Gramm absorbierende Substanz verwendet.

IZ Verwendung des wasserunlöslichen Enzympräparats nach Anspruch 1 zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure aus Benzylpenicillin oder Phenoxymethylpenicillin.