DE1418452C - Tetranatriumkanamycin-tetra-N-methansulfonat, Dinatriumkanamycindi-N-methansulfonat und dessen freie Säure und Hexanatriumneomycin-hexa-Nmethansulfonat sowie Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Description

. ._{t M} . . , . _t, ., , sulfonat, wie aus Beispiel 1 oder 3 hervorgeht. Es

a mi Natnunihydroxymethansulfonat oder _{wurde fest estellt daß} ζ_{η SteUe} des Natriumhydroxv-

ί _^F°^rmf^d.^ehy^d "^nd Natnumbisulfit oder _methansJ_{oaats auch die} äquimolare Mischung des

c) mit Schwefeldioxid und dann mit Paraform- _{Formaldehyds und Natriumb}isulfits verwendet werden aldehyd oder waßnger Formaldehydlosung _{kann> wie a}'_us Beispiel 2 ersichtlich ist.

a\ , I h , , c u t υ λ α τ, c ^Dic Hydrolyse des oben erwähnten Tetra-natrium-

d) zunächst mit Schwefeld.oxyd und Paraform- kanamydn-tetra-N-methansulfonats mit verdünnter aldehyd oder waßnger Formaldehydlosung _ao chlorwasserstoffsäure macht Formaldehyd in einer und dann mit Natriumhydroxymethansulfonat _{solchen Menge frd> die beweist> daß das Derivat ein}

in entsprechenden Molverhältnissen umsetzt. N-Methansulfonat ist. Dies kann durch Elementaranalysen und die Bestimmung des infraroten Spek-

trums des Derivats bestätigt werden.

35 Wenn Kanamycinmonosulfat mit 2 Mol Natriumhydroxymethansulfonat in wässeriger Lösung zur

Die Erfindung betrifft Tetranatriumkanamycin-tetra- Reaktion gebracht wird, kann ein neues Derivat, näm-

N-methansulfonat, Di-natriumkanamycin-di-N-me- Hch Di-natriumkanamycin-di-N-methansulfonatsulfat

thansulfonat und dessen freie Säure und Hexa-natrium- nach folgender Reaktionsgleichung gewonnen werden:

neoinycin-hexa-N-methansulfonat sowie Verfahren zu 3« _{r u} η μ υ cn ι ι υη ru cn Mo

deren Herstellung. Diese Antibiotics sind gegen ^^fg¹'' ^MW £ N^ HSO ΠΠ
M. tuberculosis wirksam und weisen ein breites anti- Ci₈H₃₈U_nN₂(NH · CH₂ · 6U₃NaJ₂ · H₂^u₄ uu

baklerielles Spektrum auf. Beim Studium der Struktur Bei der Hydrolyse der Verbindung II mit verdünnter

des Kanamycins, das kürzlich praktische Bedeutung Chlorwasserstoffsäure entsteht Formaldehyd in einer

erlangt hat, wurde festgestellt, daß dieses Antibioticum 35 solchen Menge, die beweist, daß das Derivat ein

gegen chemische Behandlung sehr stabil ist. Die Stabi- N-Methansulfonat ist. Dies kann durch Elementar-

lität legte die Überlegung für Modifikationsmöglich- analysen und die Bestimmung des infraroten Absorp-

keiten von Kanamycin und Neomycin nahe, in der tionsispektrums des Derivates bestätigt werden, wie aus

Absicht, Derivate zu finden, die eine niedrigere Toxi- Beispiel 2, b) ersichtlich ist.

zität und die gleiche oder eine höhere antibiotische 40 Da das Kanamycinmonosulfat leicht kristallisations-

Wirksamkeit als diese Antibiotica aufweisen. fähig ist und daher das wichtigste Salz ist, das zur

Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen nun Reinigung des Kanamycins bei der handelsüblichen

tatsächlich eine viel geringere Toxizität als die Aus- Herstellung verwendet werden kann, ist die Herstellung

gangsantibiotica bei nahezu gleicher antibiotischer der Verbindung II durch die oben erwähnte Reaktion

Wirksamkeit auf. 45 bei der handelsüblichen Herstellung des Kanamycin-

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung N-methansulfonats besonders vorteilhaft,
von Tetranatriumkanamycin-tetra-N-methansulfonat, Wenn eine wässerige Suspension der freien Kan-

Di-natriumkanamycin-di N-methansuIfonat und des- amycinbase mit 2 Mol Schwefeldioxyd und dann mit

sen freie Säure und Hexanatriumneomycin-hexa-N-me- Paraformaldehyd zur Reaktion gebracht wird, kann

thanisulfonat ist dadurch gekennzeichnet, daß man 50 ein neues Derivat, nämlich Kanamycin-di-N-methan-

Kanamycin oder Neomycin bzw. deren Salze mit sulfonsäure (III), nach folgendem Reaktionsschema

Schwefelsäure oder einer schwachen Säure, wie Koh- gewonnen werden:

lensäure, in an sich bekannter Weise in wäßriger Lö- #- u χτ r» 1 iu or» 1 ou^u^
_s ° Ci₈H₃₆N₄U_n + 2H₂SU₃ + 2HCHU

χ ._fM.· u α >u if λ 55 -+QiH₁₈O₁₁(NHi)₁(NH. CH₁. SOi)₁+ 2H.O

a) mit Natriumhydroxymethansulfonat oder ⁵⁵ (IH)

b) mit Formaldehyd und Natriumbisulfit oder

c) mit Schwefeldioxyd und dann mit Paraformalde- ^Die Hydrolyse der Verbindung III mit verdünnter hyd oder wäßriger Formaldehydlösung oder Chlorwasserstoffsäure macht Formaldehyd in einer

d) zunächst mit Schwefeldioxyd und Paraformalde- ^{solchen Men}8^{e frei}> ^die anzeigt, daß das Derivat ein hyd oder wäßriger Formaldehydlösung und dann ^6o N-Methansulfonat ist. Das neue Derivat wird als mit Natriumhydroxymethansulfonat in entspre- ^inneres Komplexsalz oder Zwitterion angesehen und chenden Molverhältnissen umsetzt. ^{kann durch die Formel ITI d}argesteilt werden. Die

Struktur kann durch die Bestimmung des infraroten

Die Umsetzungen a) und b) verlaufen z. B. nach Absorptionsspektrums bestätigt werden (Beispiel 3). folgendem Reaktionsschema: 65 Durch Reaktion von Kanamycincarbonat mit 4 Mol

Natriumhydroxymethansulfonat kann Tetra-natrium-

Kanamycm + η HOCH₂SO₃Na kanamycin-tetra-N-methansulforiat gewonnen werden,

-*■ K(NH · CH₂ · SO₃Na)_n + ηH₂O (I) wobei das Derivat der allgemeinen Formel I mit η = 4

entspricht, wie aus Beispiel 1, c) ersichtlich ist. Die schem Verfahren eingeimpft wurden, ergab, daß alle Reaktion des Kanamycincarbonats mit entsprechenden oben beschriebenen N-Methansulfonate praktisch Mengen von Formaldehyd und Natriumbisulfit ergibt dieselben bakteriostatische Aktivitäten wie dje Ausebenfalls Tetra-natriumkanamycin-tetra-N-methansul- gangsantibiotika besitzen, fonat, wie im Beispiel 1, a) beschrieben ist. S Obwohl die oben beschriebenen N-Methansulfonate

Wird entsprechend Neomycin mit Natriumhydroxy- durch Säureeinwirkung oder Erhitzen die Ausgangsmethansulf onat (oder mit Formaldehyd und Bisulfit), antibiotika freigeben, wurde eine Zersetzung innerhalb wie es für die Herstellung des Tetra-natriumkanamycin- von 2 bis 3 Stunden in einer Pufferlösung kaum beobtetra-N-methansulfonats beschrieben wurde, zur Reak- achtet. Pharmakologische Untersuchungen der Spaltion gebracht, so wird Hexanatriumneomycin-hexa- io tung der N-Methansulfonatderivate in die Ausgangs-N-methansuifonat gewonnen. Es wurde festgestellt, antibiotika nach der Injektion bei Kaninchen bedaß auch dieses Neomycinderivat viel weniger giftig stätigten, daß während der Dauer des höchsten Blutais das Neomycin selbst ist, dabei antibakteriell wirk- spiegeis keine Zersetzung zu den Ausgangsantibiotika sam ist, wie aus Tabelle 3 ersichtlich ist. erfolgte. Somit ist bewiesen, daß die N-Methansulfo-

Neomycin ist im wesentlichen aus zwei Neomycin- 15 natderivate weniger giftig und von praktischer Verarten zusammengesetzt, nämlich Neomycin B und C, wendbarkeit sind, die Stereoisomere mit der gleichen Molekularformel

Cj₃H₄₆N₈Oj₃ sind und sechs Aminogruppen enthalten. Beispiel 1

Die Struktur des Neomycins ist teilweise bekannt. Da _ _XT . , . .. , ..

aber über seine üesamtstruktur noch Unklarheit ao Tetra-Natnumkanamyan-tetra-N-methansulfonat herrscht, kann die Struktur des durch N-Methansulfo- a) Eine Mischung von 3,6 g Kanamycin, 4,0 g Na-

nierung des Neomycins gewonnenen Produkts nicht triumhydroxymethansulfonat und 4,0 ecm Wasser genau angegeben werden. Durch Elementaranalysen, wurde auf einem Wasserbad unter Rühren 2 Stunden Hydrolyse mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure und erhitzt und dann auf Zimmertemperatur abgekühlt. Bestimmung des infraroten Absorptionsspektrums 15 Der Lösung wurden 300 ecm Methanol zugegeben, wurde jedoch sichergestellt, daß die hergestellte Ver- worauf sich sogleich ein viskoses Produkt bildete, das bindung das Hexanatrium-hexa-N-methansulfonat [vgl. sich beim Zerreiben mit einem Glasstab in ein kristalli-Beispiel 4, a)], des Neomycins ist. nes Pulver verwandelte. Ausbeute 4 g. Das Pulver

Die Hydrolyse des Produkts mit verdünnter Chlor- wurde in 9 ecm Wasser gelöst und der Lösung zum wasserstoffsäure macht Formaldehyd in einer solchen 30 fraktionierten Ausfällen Methanol zugegeben. Die Menge frei, das sichergestellt ist, daß das Derivat ein Hauptfraktion war ein sehr wasserlösliches, farbloses N-Methansulfonat ist. Die Bestimmung des infraroten kristallines Pulver; Schmelzpunkt ungefähr 202°C. Spektrums des Produkts ergibt charakteristische Ab- Das Produkt wurde bei ungefähr 105⁰C im Vakuum Sorptionen von N-Methansulfonat. getrocknet und analysiert. Die Elementaranalyse er-

Die gleiche Verbindung kann durch Reaktion von 35 gab, daß die Hauptfraktion Tetra-natriumkanamycin-Natriumhydroxymethansulfonat mit dem Neomycin- tetra-N-methansulfonat ist, entsprechend der Verbinsalz einer schwachen Säure, beispielsweise mit Neo- dung der allgemeinen Formel I mit η = 4. mycincarbonat, hergestellt werden, wie aus Beispiel4, b) Analyse:
ersichtlich ist. Die Reaktion des Neomycincarbonats

mit entsprechenden Mengen von Formaldehyd und 40 >._o2^: _in w _ λ At _m_ah c _ η on Natriumbisulfit ergibt ebenfalls Hexanatriumneomy- μ =9490/ · ~ ~ ~

cin-hexa-N-methansulfonat, wie es im Beispiel 4, c) ~~ ' '°'

beschrieben ist. · Berechnet für C₂₂H₄₀O₁₁₃N₄S₄Na₄:

Die vorstehend beschriebenen N-Methansulfonate c = 27,83, H = 4,25, N = 5,95, S = 13,51,

von Kanamycin bzw. Neomycin lassen sich von Kan- 45 Na = 9,70%. amycin bzw. Neomycin mittels Papierchromatographie [_a]jo — -(-65° (c = 1, Wasser),

mit 0,4% Ammoniumchloridlösung trennen, da das

freie Kanamycin bzw. Neomycin am verwendeten b) Eine Mischung von 3,0 g Natriumbisulfit und

Ionenaustauscher haften bleibt (Rf = 0), während die 3,2 g wässeriger Formaldehydlösung (35%) wurde gut N-Methansulfonate des Kanamycins bzw. Neomycins 50 verrührt. Der Lösung wurden 5,0 g Kanamycin und durch das Lösungsmittel eluiert werden. Als Ionen- 4,5 ecm Wasser zugegeben, und die Lösung wurde auf austauscher wird der Natriumtyp des Kationenaus- einem Wasserbad 1,5 Stunden erhitzt und auf Zimmertauschharzes »Amberlite IRC-50«, verwendet. temperatur abgekühlt. Der Lösung wurden 250 ecm

Wie erwähnt, weisen alle oben beschriebenen N-Me- Methanol zugegeben, um einen viskosen Niederschlag thansulfonate des Kanamycins und Neomycins eine 55 zu erhalten, der sich beim Zerreiben mit einem Glas-Starke antibakterielle Aktivität auf, sind jedoch viel stab in ein kristallines Pulver verwandelte; Ausbeute weniger giftig als die Ausgangsantibiotika. Tetra-na- 7,0 g. Das Pulver wurde in Wasser gelöst und durch triumkanamycin-tetra-N-methansulfonatweistein Acht- Zugeben von Methanol fraktioniert gefällt. Das Hauptzehntel, Di-natriumkanamycin-di-N-methansulfonatsul- produkt war Tetra-natriumkanamycin-tetra-N-methanfatundKanamycin-di-N-methansulfonsäure-nureinDrei-60 sulfonat, wie im Beispiel 1, a) beschrieben ist. zehntel der Toxizität des Kanamycinmonosulfats auf. c) Eine Mischung von 4,5 g Kanamycinmonosulfat

Hexanatriumneomycin-N-hexa-methansulfonat weist und 3,0 g kohlensaurem Barium in Wasser wurde unein Achtzigstel der Toxizität des Neomycinsulfats auf. gefähr 2 Stunden verrührt und bei Zimmertemperatur

Die Bestimmung der bakteriostatischen Aktivität stehengelassenem Bariumsulfat auszufällen, das durch der oben beschriebenen N-Methansulfonatderivate des 65 Filtration entfernt wurde. Das Filtrat, eine Lösung Kanamycins bzw. Neomycins drei Stunden nach ihrer von Kanamycincarbonat, wurde bei ungefähr 45°C Zugabe zu Medien, in die Staphylokokken nach einem im Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 10 ecm ein-Zylinderplattenschnellverfahren oder nephelometri- geengt, und 4,0 g Natriumhydroxymethansulfonat

wurden zugegeben. Die sich ergebende Mischung wurde auf einem Wasserbad 2 Stunden erhitzt, als die Entwicklung von Kohlendioxyd beobachtet wurde. Aus der resultierenden Lösung wurde durch Zugabe von Methanol in der gleichen Weise, wie im Beispiel 1, a) beschrieben.Tetra-natriumkanamycin-tetra-N-methansulfonat isoliert. Die analysierte Probe wurde durch fraktioniertes Ausfällen aus eine» wässerigen Lösung des Produkts durch Zugeben von Methanol gewonnen. Analyse:

Gefunden:

C = 28,10, H = 4,41, N = 6,15, S = 12,72, Na = 9,60%;

Berechnet für C₁AgV C = 27,83, H = 4,25, N = 5,95, S = 13,51, Na = 9,70%.

Das infrarote Absorptionsspektrum des Produkts war vollständig identisch mit dem des im Beispiel 1, a) beschriebenen Tetra - natri u mkanamyci η - tetra - D -methansulfonats.

d) Eine Mischung von 4,5 g Kanamycinmonosulfat und 3,0 g kohlensaurem Barium in Wasser wurde ungefähr 2 Stunden verrührt und bei Zimmertemperatur stehengelassen, um Bariumsulfat auszufälian, das durch Filtration entfernt wurde. Das Filtrat, eine Lösung von Kanamycincarbonat, wurde bei ungefähr 45°C im Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 10 ecm eingeengt, in das eine gui verrührte Lösung von 3,0 g Natriumbisulfit und 3,2 g wässerige Formaldehydlösung (35%) hinzugegeben wurde. Die Lösung wurde auf einem Wasserbad 1,3 Stunden erhitzt. Der auf Zimmertemperatur abgekühlten Lösung wurden 300 ecm Methanol zugegeben. Es bildete sich ein

viskoser Niederschlag, der sich beim Zerreiben mit einem Glasstab in ein kristallines Pulver verwandelte; Ausbeute 4,0 g. Fraktioniertes Ausfällen aus einer wässerigen Lösung des Produkts durch Zugeben von Methanol ergab Tetra-natriumkanamycin-tetra-N-inethansulfonat

Infrarotes Absorptionsspektrum:

Die Absorptionsmaxima des oben erwähnten Derivats lagen bei 3400 cm-¹ (breit, OH", NH), 1650 cm-¹ ao (— CH₁SO, —), 1200 cm-¹ und 1040 cm-¹ (— SO₈ —)·

Toxizität und antibakterielle Aktivitäten

Die Toxizität und die antibakteriellen Aktivitäten des Tetra-natrium-kanamycin-tetra-N-methansulfonats sind denen des Kanamycinmonosulfats in Tabelle 1 vergleichsweise gegenübergestellt.

, Tabelle

Toxizität und antibakterielles Spektrum*) von Tetra-natrium-kanamycin-tetra-N-methansulfonat

und Kanamycinmonosulfat

Versuchsorganismen

Mindesthemmkonzcntration je ecm

Tctra-natriumkanamycintetra-N-methansulfonat

Kanamycinmonosulfat

M. pyogenes var. aureus 209-P

B. anthracis

B. subülis

E. coli

E. coli streptomycinfast

K. pneumoniae

Pr. vulgaris OX-19

Ps. aeruginosa

Sh. flexneri

Sh. dysenteriae

Sh. sonnei

S. paratyphi A

S. paratyphi B

S. enteritidis

S. typliosa

M. phlci

M. tuberculosis

M.607

M. 607 streptomycinfest

C. diphteriae

Toxizilät bei Mäusen durch intravenöse Injektion LD₅₀ • Nach dem Agarplatlenverfahren.

Ferner wurde bestätigt, daß das Kanamycinderivat gegen die Infektion von Mäusen mit M. pyogcncs und S. typhosa wirksam ist.

Beispiel 2 Di-natriumkanamycin-di-N-methansulfonat

a) Eine Mischung von 3,6 g (0,0074 Mol) Kanamycin, 2,26 g (0,015MoI) Natriumliydroxymethansiilfonal und 4.6 ecm Wasser w unk· auf einem Wasscr-3,13

3,13

1,56

6,25

6,25

3,13
12,5
50

6,25

6,25

6,25

3,13

6,25

6,25

3,13

6,25

3,13

1,56

1,56

1,56
> 5500 mg/kg

0,6

1,25

0,6

5,0

5,0

1,25 10,0 25

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

2,5

2,5

0,5

2,0

2,5

2,5

0,75 313 mg/kg

bad 1,5 Stunden erhitzt und dann auf Zimmertemperatur abgekühlt. Der Lösung wurden 300 ecm Methanol zugegeben, um ein viskoses Piodukl auszufällen, das sich bald in einen pulverförmigcn festen Stoff verwandelte; Ausbeute 2,82 g (53%). Dieser Stoff wurde in 12 ecm W.'isscr gelöst und durch Zugeben von Methanol fraktioniert gefällt. Alle vier Fraktionen waren liypioskopisehe Pulver. Die Aiislicute an der /weilen liaklion betrug 400mg. Die lilcmentaranaIyse ergab, dall die Fraktion Di-nalriuinkanamycin-

di-N-methansulfonat war und der Verbindung der allgemeinen Formel I mit η — 2 entsprach. Analyse:

Gefunden:

C = 32,72, H = 5,41, N = 7,15, S = 9,07, Na = 5,71%.

Berechnet für C₂₀Hs₈O₁₇N₄SiNa₈: C = 33,46, H = 5,34, N = 7,81, S = 8,94, Na = 6,42%.

b) Eine Mischung von 3,0 g Kanamycinmonosulfat und 3,04 g Natriumhydroxymethansulfonat in 4 ecm Wasser wurde auf einem Wasserbad 1,3 Stunden unter Rückfluß erwärmt, um eine hellgelbe Lösung zu ergeben. Der kalten Lösung wurden 180 ecm Methanol zugesetzt. Es wurde viskoser Niederschlag erhalten, der beim Zerreiben mit einem Glasstab in ein kristallines Pulver überging; Ausbeute 5,5 g. Das Produkt wurde in 22 ecm Wasser gelöst und die Lösung filtriert. Dem Filtrat wurden 25 ecm Methanol zugegeben, und die Mischung wurde stehengelassen. Es bildete sich ein viskoser Niederschlag, der durch Dekantieren abgetrennt und durch Zerreiben mit einem Glasstab in ein kristallines Pulver umgewandelt wurde; Ausbeute 2,1 g, MT = +83,0° (c = 2, Wasser).

10

15 Es schmolz unter Zersetzung unscharf oberhalb 206⁰C.

Analyse:

Gefunden:

C = 28,75, H = 5,11, N = 6,25, S = 11,68,
Na = 5,69%.

Berechnet für C₁₅H₃₂N₂O_n(NHCH₂SO₃Na)₂ ·
H₂SO₄:

C = 29,45, H = 4,91, N = 6,87, S = 11,78,
Na =-- 5,64%.

Infrarotes Absorptionsspektrum

Starke Absorptionen lagen bei 3400 cm-¹ (breit, OH-, NH), 1630 cm-¹ (-CH₄SO₃-), 1200 bis 1110 cm-¹ (SO₈-).

Toxizität und antibakterielle Aktivität

Das Di-natriumkanamycin-di-N-methansulfonatsulfat ist viel weniger toxisch als Kanamycin selbst und besitzt eine starke anti bakterielle Aktivität, wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist. Ferner wurde bestätigt, daß das Derivat gegen die Infektion von Mäusen mit M. pyogenes und S. typhosa wirksam ist.

Tabelle

Antibakterielle Aktivität und Toxizität von Di-natrium-kanamycin-di-N-methansulfonatsulfat

im Vergleich zu Kanamycin-monosulfat

Versuchsorganismen

Mindesthemmkonzentration	Π Yy fm ILIIIJI....... ......
je ecm	anamycinmonosi
Di-natriumkanamycin-	0,6
di-N-methansulfonatsulfat	1.25
0,78 bis 1,56	0,6
0.39 bis 0,78	5,0
0,39 bis 0,78	5,0
6,25	1,25
3,1 bis 6,25	5,0
3,1 bis 6,25	5,0
6,25 bis 12,5	2,5
6,25 bis 12,5	5,0
3,1	5,0
3,1	2,5
6,25 bis 12,5	2,0
6,25	2,5
1,5	2,5
1,5	300 mg/kg
1,5
>4000 mg/kg

M. pyogenes var. aureus 209-P

S. anthracis

B. subtilis

E. coii

E. coli streptomycinfast

K. pneumoniae

Sh. flexneri

Sh. sonnei

S. typhosa

S. paratyphi A

S. paratyphi B

S. enteritidis

M. tuberculosis

M. 607

M. 607 streptomycinfest

Toxizität bei Mäusen durch intravenöse Injektion LD₆₀

Beispiel 3 Kanamycin-di-N-methansulfonsäure ,,

In eine Suspension von 4,85 g (0,01 Mol) freier Kanamycinbase in 5 ecm Wasser wurde SchwefeldiöXyd gegeben, bis die bcfcchncic Menge Von Schwefcioxyd (1,28 g) absorbiert worden war. Der pH-Wert der sich ergebenden viskosen Lösung lag bei 6,0. Der Lösung wurden 0,60 g Paraformaldehyd (oder 2,0 g 30%iger Formaldehydlösung) zugegeben, und die Lösung wurde bei Zimmertemperatur 24 Stunden stehen gelassen. Der pH-Wert der sich ergebenden Lösung betrug 7,2 bis 7,3. Die Lösung wurde in 40 ecm Äthanol gegossen, worauf sich ein viskoses ^s Produkt niederschlug, das durch Zerreiben mit einem Glasstab kristallisierte. Das Produkt wurde wieder in 10 ecm Wasser gelöst und nach Filtration durch Zugeben von 50 ecm Äthanol ausgefallt. Die Ausbeute an bei ungefähr 50⁰C getrocknetem kristallinem Pulver betrug 6,32 g (94%). Die Elementaranalyse ergab, daß das Produkt ein inneres Salz der Kanamycin-di-N-methansüi'unsäurc war.

Analyse:

Gefunden:
C = 34,90, H =

Berechnet für
C₁₈H₂₈O_n(NHi

6,23, N = 8,06, S = 8,96%;

H₁O:

C - 34,78, H -- 6,13, N --= 8,11,S- 9,53%.
S¹ =·- λ 103° (r = 2, Wasser).

509 686/120

Infrarotes Absorptionsspektrum:

Die Absorptionsmaxima des oben beschriebenen Derivats lagen bei 3350 cm"¹ (breit, OH", NH), 1630 cm"¹ (— CHuSO₃-), 1525 cm-¹ (NH⁺), 1170cm-¹ und 1030 cm-¹ (— SO₃-).

Toxizität und antibakterielle Aktivität

Das innere Salz der Kanamycin-di-N-methansulfonsäure wies eine Wirksamkeit von 710 E/mg, ausgedrückt in Kanamycineinheiten, gegen M. pyogenes var. aureus 209-P auf, und bei der Injektion bei Mäusen auf intravenösem Wege betrug die LD₅₀ 3500 mg/kg.

Beispiel 4 Hexa-natriumneomycin-N-hexa-methansulfonat

a) Das Sulfat der in diesem Versuch verwendeten Neomycinprobe wies eine Wirksamkeit von 640 y/mg auf. Durch Papierchromatographie mit wassergesätiligtem, 2% p-toluolsulfonsaureni Butanol wurde festgestellt, daß die Probe hauptsächlich Neomycin B und eine kleine Menge von Neomycin C enthielt.

Eine Mischung von 4,3 g (0,007 Mol) Neomycin, 6,4 g (0,048 Mol) Natriumhydroxymethansulfonat wurde in 6 ecm Wasser gelöst, auf einem Wasserbad unter Rühren 2 Stunden erhitzt und auf Zimmertemperatur abgekühlt. Der Lösung wurden 60 ecm Methanol zugegeben, worauf sich sofort ein viskoses Produkt bildete, das sich beim Zerreiben mit einem Glasstab in ein kristallines Pulver verwandelte; Ausbeute 8,5 g. Eine Probe von 7,0 g des Pulvers wurde in 25 ecm Wasser gelöst und durch Zugeben von Methanol fraktioniert gefällt. Die in der folgenden Tabelle aufgeführten Hauptfraktionen, F₂ und F₃, sind farblose, kristalline Pulver; F₃: [«]£ = \ 28,5° (c = 2, Wasser).

Zugegebenes	Fraktionen	Gewicht
Methanol		der Fraktionen
(ecm)	F1	(g)
48	F2	1,6
14	F3	2,3
18	F4	1,3
12	F5	0,34
28	F8	0,3
40	0,1

Die Ergebnisse der Elementaranalyse der Fraktionen zeigten, daß das gewonnene Hauptprodukt Hexanatrium-hexa-N-methansulfonat des Neomycins war.

Analyse:
F₂: Gefunden:

C = 24,3, H = 4,1, N = 5,7, S = 13,7,
Na--= 10,7%;

F₃: Festgestellt:

C = 25,7, H = 3,9, N = 5,9, S = 13,9,
Na= 10,5%;

Berechnet für C₂₃H₄₀Oi₃Nj(CH₂SO₃Na)₀:
_a5 C = 26,6, H = 4,0, N = 6,4, S = 14,7,
Na= 10,5 Vo-

Infrarotes Absorptionsspektrum:
Die Absorptionsmaxima lagen bei 1170 — 1210 cm-¹ (^S°5)·

Toxizität und antibakterielle Aktivität

Das Natriumneomycin-N-melhansulfonat war viel weniger toxisch als Neomycin selbst und zeigte eine starke antibakterielle Aktivität, wie aus Tabelle 3. ersichtlich ist. Die Toxizität des Derivats bei Mäusen durch intravenöse Injektion betrug ungefähr ein Achtzigste! der des Neomycins selbst.

Tabelle

Toxi/ität und antibakterielle Aktivität*) von Hexa-natrium-neomycin-hexa-N-methansulfonat

im Vergleich zu Neomycinsulfat

Versuchsorganisinen

Mindesthemnikonzenlration
je ecm

xanatriumneomycin- a-N-methansulfonat	Neomycinsulfat
3,13	1,56
1,56	1,56
1,56	1,56
25,0	3,13
25,0	3,13
12,5	3,13
25,0	3,13
>200	>200
50	3,13
50	3,13
50	3,13
12,5	3,13
50	3,13
12,5	3,13
12,5	3,13
3,13	1,56
5,0	2,5
3.13	1,56
3.13	1,56
>3500 rag/kg	50 mg/kg

M. pyogenes var. aureus 209-P

B. anthracis

B. subtilis

E. coli

E. coli streptomycinfast

K. pneumoniae

Pr. vulgaris OX-19

Ps. aeraginosa

Sh. fiexneri

Sh. dysenteriae

Sh. sonnei

S. paratyphi A '

S. paratyphi B

S. eniteritidis

S. typhosa

M. p'hlei

M. tuberculosis

M. 607

M. 607 streptomycinfest

Toxiirität bei Mäusen durch intravenöse Tnjektion LD₆₀ * Nach dem Agarverdünnungsverfahren.

b) Eine Mischung von 6,4 g Neomycinsulfat und 9,0 g kohlensaurem Barium in Wasser wurde mehrere Stunden verrührt und bei Zimmertemperatur stehengelassen, um Bariumsulfat auszufällen, das durch Filtration entfernt wurde. Das Filtrat, eine Lösung von Neomycincarbonat, wurde bei ungefähr 45°C im Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 10 ecm eingeengt. 6,4 g Natriumhydroxymethansulfonat wurden zugegeben. Die sich ergebende Mischung wurde auf einem Wasserbad 2 Stunden erhitzt, wobei inzwischen die Entwicklung von Kohlendioxyd beobachtet wurde. Aus der resultierenden Lösung wurde durch Zugabe von Methanol in der gleichen Weise, wie im Beispiel 5, a) beschrieben, Natrium-N=rnethansu!fonat isoliert.

Analyse:

F₂: Gefunden:

C = 24,25, H = 3,93, N = 5,67, S = 15,58,
Na = 10,70 %.

F₃: Gefunden:

C = 24,82, H = 4,09, N = 5,71, S = 14,84,
Na = 10,20%.

Berechnet für C₂₃H₃₄O₁₃(NH · CH₈ · SO₃Na)₈:
C = 26,56, H = 3,97, N = 6,41, S = 14,66,
Na =10,53%.

Es wurde festgestellt, daß das infrarote Absorptionsspektrum des Produkts F₃ dem des im Beispiel 5, a) beschriebenen Produkts vollständig entspricht.

c) Eine Mischung von 6,5 g Neomycinsulfat und 9,0 g kohlensaurem Barium in Wasser wurde 2 Stun-

ίο den verrührt und bei Zimmertemperatur stehengelassen, um Bariumsulfat auszufällen, das durch Filtration entfernt wurde. Das Filtrat, eine Lösung vor Neomycincarbonat, wurde bei ungefähr 45°C irr Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 10 ecm einge engt. Eine gut verrührte Lösung von 4,1 g wäßrigen' Formaldehyd (35%) und 5 g Natriumbisu'fit wurde hinzugegeben. Die Lösung wurde auf einem Wasser bad 2 Stunden erhitzt. Der in Eiswasser abgekühlter Lösung wurden ungefähr 100 ecm Methanol zugesetzt um ein viskoses Produkt auszufällen, das sich beirr Zerreiben mit einem Glasstab in ein kristallines Pulvc verwandelte; Ausbeute 8,2 g. Fraktioniertes Ausfället aus einer wässerigen Lösung des Produkts durch Zu gäbe von Methanol ergab ein Produkt, das mit dein in Beispiel 5, a) identisch war.

Claims (2)

1 2 Patentaniörüche · in der K den sich durch ^ Entfernung von (NH,)B aus vdem Kanamycinmolekül ergebenden Restteil darstellt;

1. Tetranatriumkanamycin - tetra -N- methan- η = 2 oder 4.

sulfonat, Di - natriumkanamycin - di - N · methan- Durch Einstellen des obigen Molverhältnisses von

sulfonat und dessen freie Säure und Hexa-natrium- 5 Natriumhydroxymethansulfonat zu Kanamycin sollen

neomycin-hexa-N-methansulfoaat. die obenerwähnten, zwei bis vier Hydroxymethansul-

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen fonatreste enthaltenden Verbindungen als Hauptpronach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dukte gewonnen werden. Wenn 4 Mol oder 2 Mol man Kanamycin oder Neomycin bzw. deren Salze Natriumhydroxymethansulfonat mit 1 Mol Kanamycin mit.Schwefelsäure oder einer schwachen Säure, wie io zur Reaktion gebracht werden, ist das gewonnene Kohlensäure, in an sich bekannter Weise in wäß- Hauptprodukt Tetra-natriuinkanamycin-tetra-N-meriger Lösung thansulfonat bzw. Di-natriumkanamycin-di-N-methan-