DE1255109B - Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansaeure - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

C07d

Deutsche Kl.: 12 ρ-4/01

Nummer: 1 255 109

Aktenzeichen: L 36093IV d/12 ρ

Anmeldetag: 6. Mai 1960

Auslegetag: 30. November 1967

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren tat Hetsteiluäg voil 6-AmmOpenieiliattsäure durch Deäcyiieiüng von Penicillinen, das dadüfch gekennzeichnet ist, daß Man ein durch Fermentation hergestelltes Penicillin oder ein Gemisch aus mehreren derartig hergestellten Penicillinen in einer Menge völi 1 bis 4 Gewichtsprozent einem Kulturmedium zufügt, das Wächsiumsföfderiide Substanzen in einem Verhältnis Von weniger als 0,5 Gewichtsteilen, vorzugsweise wenigei als 0,25 Gewichtsteileh Trockensubstanz je Gewichtstoil Penicillänsäure enthält Und in welchem eta Fungus der Öattühg Füsafium oder def Spezies Ce^halosporiUM öiferrii Vefona odet Cephälosporiüm äfcremönium Cda. Unter Belüftung sübiners gezüchtet wird, Worauf Mail die Züchtung des Pilzeis Und damit die Fermentation 32 bis 72 Stunden bei 27 ⁰C und einem pH-Wert von 6,5 fortsetzt und die gebildete 6-Aminopenicillansäure isoliert.

Vorzugsweise wird Penicillin, das als Ausgangümäteriäl benutzt Wird, einem Kulturmedium hirtzü- ao gefügt, in dem der Pilz schon mindestens 24 Stunden läng, vorzugsweise bei 25 bis 3O⁰C und einem pH-Wert von 6,5 bis 8,0, gezüchtet Worden war. Das KulturmediuM soll eine Quelle für Kohlenstoff enthalten, beispielsweise Glukose, neben anorganischen Stoffen, die für das Wachstum des Pilzes nötig sind.

Jede Art von durch Fermentation hergestellten Penicillinen oder auch eine Mischung Von solchen läßt sich als Ausgangsmäterial benutzen, vorzugsweise ifl Form vöh wasserlöslichen anorganischen Salzen, Wie den NatriuM-, Kalium-, Calcium- oder den AftmöiliüMSalzert. Das benutzte Penicillinsalz braucht nicht den Reinheitsgrad aufzuweisen, def für therapeutische Zwecke erförderlich ist. Es läßt sich zu dem KüiturmediuM in !ester Form öder als entsprechend konzentrierte wäßrige Lösung hinzufügen. Benzylpenicillin ist weniger geeignet als Phenoxymethylpenicillin, da es durch Pilze rascher deacyliett wird. ä-Heptylpenicillin (Penicillin K) wird ebenfalls rascher deäcylieft als Benzylpenicillin, jedoch sind die lterstellungskosten Von n-Heptylpehicillin höher als für PhenoxyMethylpenicÜlin, da kein Ausgängsstoff bekannt ist, der die Bildung von n-Heptylpenicillirt mittels des Penicillin her stellenden Pilzes zu fördern vermag.

Die Lösung, die sich durch Deäcylierung von Penicillin erhalten läßt, kann durch Adsorption und nächfolgende Eluierung gereinigt werden. Ein Ionenäüstäüscherhärz oder Aktivkohle läßt sich als Adsorptionsmittel verwenden, Wobei in beiden Fällen eine verdünnte Säurelösüng in geeigneter Weise zur ElUieruHg benutzt wird. Vor und/oder nach diesen Operationen kann eine Konzentrierung der Lösung Verfahren zur Herstellung
Von 6-Aminopenlcillaasäure

Anmelder:

L0vens kemiske Fabrik ved. A. Kongsted,

Bälleruf) ByVej (Dänemark)

Vertreter:

Df.-Ihg. F. Wuesthoff, Dipl.-Iög. G. Puls
und Df. M. V. Pechmaün, Patentanwälte,
München 90, Schweigerstr. 2

Als Erfinder benannt:

Wagn Öle Godtfredsen, Kopenhagen

Beanspruchte Priorität;

Großbritannien vom 6. Mai 1959 (15 605),
vdäi 19. Juni 1939 (21195),
vom 17. August 1959 (28 080),
vom 14. Januar I960 (1445) --

durch Eindampfen ίΜ Vakuum erfolgen. Vor einer detäftigeh Konzentrierung soll der pH-Wert der LÖSurig äüf einen Wert Zwischen 3 und 7 eingestellt Worden. Aus der gereinigten und konzentrierten Lösung Wird 6-Aminopenicillansäure in kristalliner Form durch Einstellen des pH-Wertes äüf etwa 4,3 ausgefällt.

Enthält die Lösung, die durch DeaCylierung von Penicillin erhalten wird, noch eine erhebliche Menge ao nicht umgewäftdeltom Penicillin, kann gegebenenfalls Vor der Gewinnung der 6-Aminopenicillansäure !Mindestens die Haüptmenge des zurückbleibenden Penicillins durch AriSäüfefn der Lösung und durch Extraktion Mit feinem organischen Lösungsmittel, das gewöhnlich zur Extraktion von Penicillinen verwendet wird, wie Bütyläcetat, abgetrennt werden. Das Mycel des Pilzes sollte aus def Flüssigkeit entfernt werden, beVör die 6-AmihOpfeniöillansäufe aus derselben gewonnen wird oder bevor das zurückbleibende Penicillin aus der Flüssigkeit entfernt wird.

Beispiel 1

ml eines sterilen Kulturmediums folgender Zusammensetzung

Glukose 10,00 g

Asparagin 0,75 g

(NH₄J₂SO₄ 2,64 g

709 690/496

3 4

KH₂PO₄ 2,38 g wurden in einen Fermenter aus rostfreiem Stahl ge-

K₂HPO₄ 5,56 g bracht und mit 21 einer Kultur von Fusarium cul-

MsSO · 7H O 100 g morum var. cereale (Stamm L. P. P. Z. S. 1100) ge-

* * ' impft, wobei diese Kultur schon 48 Stunden lang ge-

CUbO₄ · 5H₂U 6,4 mg _{5 wac}h_{sen war}. Daraufhin wurde das geimpfte Kultur-

FeSO₄ · 7H₂O 1,1 mg medium bei einer Temperatur von 27°C und einem

MnCl₂ · 4H₈O 7,9 mg pH-Wert von 6,5 66 Stunden lang gerührt und mit

ZnSO₄ -7H₂O 15 mg Luft behandelt. Hierdurch wurde ein sehr starkes

KonzentrierterHefeexirakt '.'.'.'.'.'.I 5,0g Wachstum des Pilzes bewirkt. Nach dieser Wachs-

_, . „ .„„, __ΛΛ , ίο tumspenode wurde eine sterile Losung von 18,0 kg

Maisquellwasser, 50 % 20,0 ml _{rohenij 99}o_/oigem Kalium-Phenoxymethylpenicillin in

CaCO₃ , 5,0 g 901 Leitungswasser hinzugefügt und das Rühren und

Wasser bis zu 1000 ml die Luftbehandlung weitere 48 Stunden bei 27⁰C fortgesetzt. Der pH-Wert von 6,5 wurde durch fortge-

wurden mit 11 einer sterilen Suspension von Fusarium- 15 setzte Zugabe einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung

avenaceum-Sporen (Stamm L. P. P. 1102) geimpft und aufrechterhalten. Nach dieser Zeit war der Gehalt an

das Kulturmedium 24 Stunden bei 27° C unter Luft- 6-Aminopenicillansäure im Kulturmedium 6 mg/ml,

einfiuß gerührt. Dann wurde die Kultur zu 51 eines was einem Umwandlungsgrad von 65% entspricht

sterilen Kulturmediums derselben Zusammensetzung Weiterhin enthielt das fermentierte Kulturmedium

gefügt, die nachfolgend weitere 72 Stunden in einem 20 nicht umgewandeltes Phenoxymethylpenicillin mit

10-1-Glasfermenter bei 27° C unter Lufteinfluß gerührt 4000 internationalen Einheiten je Milliliter, was 15°/«

wurde. der zugefügten Menge an Phenoxymethylpenicilliri

Daraufhin wurden 20,00 g Kalium-Phenoxymethyl- entspricht.

penicillin zu der Kultur gefügt und das Wachstum Der pH-Wert des fermentierten Kulturmedium? des Pilzes unter den gleichen Bedingungen weitere 25 wurde auf 7,5 eingestellt, 40 kg Diatomeenerde als 48 Stunden lang fortgesetzt. Das Mycel wurde dann Filterhilfe hinzugefügt und das Mycel im Kulturabfiltriert und die 6-Aminopenicillinsäure vom Filtrat medium durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde wie folgt isoliert: im Laufe von 8 Stunden durch eine Kolonne geleitet, Der pH-Wert des Filtrats wurde auf 7,5 eingestellt die 3001 des auch im Beispiel 1 verwendeten stark und das Filtrat dann im Laufe von 2 Stunden durch 30 basischen Anionenaustauscherharzes auf Polystyroleine Kolonne geleitet, diel !eines Anionenaustauscher- basis, das einen niederen Grad von Quervernetzung harzes auf der Basis von Polystyrol mit quaternären aufweist, enthielt. Dann wurde die Kolonne mit Ammoniumgruppen in der Chloridform enthielt. Dann Wasser gewaschen und das feuchte Harz in ein 800-1-wurde die Kolonne mit Wasser gewaschen und das Gefäß aus rostfreiem Stahl, das mit einem Rührer verfeuchte Harz in ein 3-1-Becherglas zusammen mit 35 sehen war, übergeführt. 2001 enthärtetes Wasser wur-500 ml Wasser gebracht. Dann wurde konzentrierte den zunächst hinzugefügt und dann im Laufe von Salzsäure hinzugefügt, bis ein pH-Wert von 1,8 er- 3 Stunden unter Rühren 20%ige Salzsäure so lange reicht wurde. Das Harz wurde abgefiltert und auf dem hinzugefügt, bis ein pH-Wert von 1,95 erreicht wurde. Filter mit 500 ml Wasser gewaschen. Das Filtrat und Dann wurde das Harz abfiltriert und dreimal gedie Waschlösungen wurden vereinigt, mit 2 n-Natron- 40 waschen, jedesmal mit 701 enthärtetem Wasser. Der lauge auf einen pH-Wert von 6,5 neutralisiert und dann pH-Wert des mit den Waschlösungen vereinigten durch Verdampfen im Vakuum auf ein Volumen von Filtrats mit den Volumen von 4001 wurde auf 7,0 100 ml konzentriert. Der pH-Wert der konzentrierten durch Zugabe einer 33%igen wäßrigen Natrium-Lösung wurde durch Zugabe von konzentrierter Salz- hydroxydlösung eingestellt, worauf die Lösung auf säure auf einen Wert von 4,3 eingestellt, die ausge- 45 75 1 durch Eindampfen im Vakuum konzentriert fallene 6-Aminopenicillansäure abfiliriert, mit Wasser wurde. Die konzentrierte Lösung wurde abfiltriert und nachfolgend mit Aceton gewaschen und schließ- und der pH-Wert des Filtrats durch Zugabe an lieh getrocknet. 8,5 g Rohprodukt wurden dabei er- konzentrierter Salzsäure auf 4,05 eingestellt. Die halten. Dieses Produkt wurde in 75 ml Wasser suspen- dadurch gefällte 6-Aminopenicillansäure wurde abdiert und durch Zugabe einer verdünnten wäßrigen 50 filtriert, mit Wasser und dann mit Aceton ge-Lösung von Natriumhydroxyd in Lösung gebracht. waschen und schließlich getrocknet. Dabei wurden Aus dieser Lösung wurde dann wieder 6-Amino- 3,1 kg eines Produktes mit dem Schmelzpunkt 199 penicillansäure durch Einstellen des pH-Wertes der bis 201⁰C und einem Reinheitsgrad von 93% Lösung auf einen Wert von 4,3 mittels Salzsäure aus- erhalten.

gefällt. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, 55 Das Rohprodukt wurde in 121 Wasser suspendiert,

mit Wasser und nachfolgend mit Aceton gewaschen und zu der Suspension, wurde dann eine 33%ige wäß-

und getrocknet. Hierbei wurden 7,7 g 6-Amino- rige Lösung von Natriumhydroxyd so lange hinzuge-

penicillansäure vom Schmelzpunkt 198 bis 200⁰C fügt, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Der

erhalten. pH-Wert dieser Lösung war dann 7,3. Die Lösung

Beisoiel 2 ^6o v™¹^ ^m^ ^O g Aktivkohle 15 Minuten lang behandelt

und dann schließlich filtriert. Der pH-Wert des Filtrats

8001 eines sterilen Kulturmediums folgender Zu- wurde dann durch Zugabe konzentrierter Salzsäure

sammensetzung: auf 4,05 eingestellt. Die gefällte 6-Aminopenicillan-

Maisquellwasser 50%, 24 0 ks ^{säure wurde abfiltriert und mit} Wasser und dann mit

' " ' 65 Aceton gewaschen. Dabei wurden 2,8 kg 6-Amino-

Lactose 24,U kg penicillansäure mit einem Schmelzpunkt von 202 bis

Calciumcarbonat 3,0 kg 204° C (Zersetzung) und einem Reinheitsgrad von 98 %

Leitungswasser bis zu 900 1 erhalten.

Beispiel 3

100 ml eines sterilen Kulturmediums folgender Zusammensetzung:

Diammoniumphosphat 2,5 g

Glucose 10,0 g

Calciumcarbonat 5,0 g

Leitungswasser bis zu 1,01

IO

wurden auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und in einem 300-ml-Kolben mit einer Suspension von Sporen der Fusarium-Art geimpft, die hier provisorisch als L. P. P. 1571 bezeichnet wird. Dann wurde der Kolben 72 Stunden lang bei 27° C geschüttelt, 2,0 g Kalium-Phenoxymethylpenicillin hinzugefügt und der Kolben weitere 72 Stunden lang geschüttelt. Nach dieser Zeit war der Gehalt an Phenoxymethylpenicillin, der durch die Agar-Tassen-Methode (agar cup method) bestimmt wurde, auf unter 300 internationale Einheiten Penicillin je Milliliter gesunken.

Das Mycel wurde dann abfiltriert, der pH-Wert des Filtrats auf 6,5 eingestellt und das Filtrat durch Eindampfen in Vakuum auf ein Volumen von 15 ml konzentriert. Nachdem die konzentrierte Lösung abgefiltert worden war, wurde ihr pH-Wert durch Zugabe konzentrierter Salzsäure auf 4,3 eingestellt. Der dadurch ausgefallene Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser und nachfolgend mit Aceton gewaschen und dann getrocknet. Es wurden 710 mg 6-Aminopenicillansäure mit einem Schmelzpunkt von 199 bis 201⁰C (Zersetzung) erhalten.

Beispiel 4

51 eines sterilen Kulturmediums folgender Zusammensetzung:

Maisquellwasser, 50% (Trockensubstanz) 10,0 g

Glucose 20,0 g

Calciumcarbonat 5,0 g

Leitungswasser bis zu 1,01

wurden auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und in einem 10-1-Glasfermenter mit 200 ml einer Kultur des schon erwähnten Fusarium L. P. P. 1571, die 24 Stunden lang gewachsen war, geimpft. Daraufhin wurde das geimpfte Kulturmedium unter Luftbehandlung 48 Stunden lang gerührt, während der pH-Wert auf 6,5 gehalten wurde. Dann wurden 100 g Kalium-Phenoxymethylpenicillin hinzugefügt und das Rühren und die Luftbehandlung weitere 72 Stunden lang bei 27° C und einem pH-Wert von 6,5 fortgesetzt.

Das Mycel wurde dann abfiltriert, der pH-Wert des Filtrats auf 6,5 eingestellt und das Filtrat durch Eindampfen im Vakuum auf 500 ml konzentriert. Nachdem die konzentrierte Lösung abfiltriert worden war, wurde ihr pH-Wert durch Zugabe an konzentrierter Salzsäure auf 4,3 eingestellt. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und dann in Wasser und Aceton gewaschen und schließlich getrocknet. Hierbei wurden 37 g 6-Aminopenicillansäure mit 93%ig^er Reinheit und einem Schmelzpunkt von 196 bis 199⁰C erhalten.

Das Produkt wurde in 150 ml Wasser suspendiert und in eine Lösung gebracht, deren pH-Wert durch Zugabe einer 30°/_oigen wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf 7,5 eingestellt worden war. Eine wäßrige Lösung von 1,0 g Aluminiumsulfat wurde hinzugefügt, der gebildete Niederschlag abfiltriert und das Filtrat mittels konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,3 eingestellt. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser und mit Aceton gewaschen und schließlich getrocknet. Hierbei wurden 32 g gereinigter 6-Aminopenicillansäure mit einem Schmelzpunkt von 205 bis 207⁰C erhalten.

Beispiel 5

Die Fähigkeit bestimmter Pilze, 6-Aminopenicillansäure durch Deacylierung von Phenoxymethylpenicillin herzustellen, ist aus folgenden Angaben ersichtlich:

100 ml eines sterilen Kulturmediums, das eine Zusammensetzung des Beispiels 2 besaß, wurde auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und in einen 300-ml-Schüttelkolben mit einer Suspension an Sporen des zu testenden Pilzes geimpft. Der Kolben wurde dann bei 27 ⁰C 48 Stunden lang geschüttelt. Dann wurden 2,0 g des Kaliumsalzes von Phenoxymethylpenicillin hinzugefügt und der Kolben unter Luftzufuhr bei 27⁰C weitere 48 Stunden lang geschüttelt. Das Mycel wurde abfiltriert, das Filtrat auf einen pH-Wert von 2,0 angesäuert und zweimal zur Entfernung von nicht umgewandeltem Phenoxymethylpenicillin mit Butylacetat extrahiert, worauf der Gehalt an 6-Aminopenicillansäure in der wäßrigen Phase jodometrisch bestimmt wurde. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle aufgeführt, wobei die Zahl in der rechten Spalte den Umwandlungsgrad des Phenoxymethylpenicillins in 6-Aminopenicillansäure darstellt.

	Gattung	Stamm	%
35	Fusarium anguioides	L. P. P. 1567	92
	Fusarium avenaceum	L. P. P. η 33	82
	Fusarium avenaceum	L. P. P. 1248, B	86
	Fusarium avenaceum	L. P. P. 1255	83
	Fusarium avenaceum	L. P. P. 1428	79
40	Fusarium avenaceum	L. P. P. 1677	82
	Fusarium avenaceum	L. P. P. 1681	80
	Fusarium bulbigenum	L. P. P. η 10	52
	Fusarium culmorum	L. P. P. η 32	77
	Fusarium culmorum	L. P. P. 1248, A	81
45	Fusarium culmorum	L. P. P. 1489	68
	Fusarium culmorum
	v. cereale	L. P. P. 1501	93
	Fusarium culmorum
	v. cereale	L. P. P. 1504	89
50	Fusarium equiseti
	v. bullatum	L. P. P. 1454	92
	Fusarium equiseti
	v. bullatum	L. P. P. 1508	84
	Fusarium lateritium	L. P. P. 1687	76
55	Fusarium minimum	L. P. P. η 34	72
	Fusarium monoliforme	L. P. P. η 12	78
	Fusarium monoliforme	C. B. S. 917	48
	Fusarium monoliforme
	v. subglutinans	L. P. P. 1682	75
60	Fusarium oxysporum	L. P. P. 9	84
	Fusarium oxysporum	L. P. P. 1637	80
	Fusarium semitectum	L. P. P. 1493	93
	Fusarium semitectum	L. P. P. 1540	82
	Fusarium semitectum	L. P. P. 1546	66
65	Cephalosporium diferrii
	Verona	L. P. P. 1748	78
	Cephalosporium acremonium
	Cda	L. P. P. 1753	71

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch Deacylierung von Penicillin, d a* durch gekennzeichnet, daß Man ein durch Fermentation hergestelltes Penicillin öder ein Gemisch aus mehreren derartig hergestellten Penicillinen in einer Menge von 1 bis 4 Gewichtsprozent einem Kulturmedium zufügt, das wachsttimsfördernde Substanzen in eitlem Verhältnis Von ιό weniger als ö,5 Gewichtsteilen Trockensubstanz je G6wichtsteil Penieillänsäure enthält und in WeI-' cheat ein Fungus der Gattung Ftisafium oder der Spezies Cephalosporium oiferrii Verona oder Cephalosporium acremonium Cda. unter Belüftung submefs gezüchtet wird,wöraüf man die Züchtung des Pilzes und damit die Fermentation 32 Öls 72 Stunden bei 27° C und einem pH-Wert van 6,5 fortsetzt und die gebildete 6-Aminopenicillansäure isoliert.

   In Betracht gezogene Druckschriften:
   The Enzymes, 195I₅ S. 1175;
   Nature, Bd. 183,1959, S. 258;
   Journal of Agriöulturäl Chemistry SoeHety öf
   Bd. 29, 1955, S. 4Ö0 bis 403.

   709 690/4% 11.87 © Bundesdruckerei Berlin