DE1232315B - Herstellung von Antibioticum 235 A und seinen Komponenten 235 L und 235 S - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

C12d

Deutsche KL: 30h-6

Nummer: 1232 315

Aktenzeichen: M 62568IV a/30 h

Anmeldetag: 25. September 1964

Auslegetag: 12. Januar 1967

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen und wertvollen Antibioticums, das bei der Inhibierung des Wachstums pathogener Bakterien, insbesondere der gramnegativen Bakterien, hochgradig wirksam ist.

Es ist bekannt, daß die Species Streptomyces lavendulae zahlreiche Antibiotica, wie Streptothricin, Streptin und Streptolin, erzeugt.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Streptomyces lavendulae NRRL 3076 oder Streptomyces avidini NRRL 3077 zur Herstellung des neuen Antibioticums 235 A und seiner Komponenten 235 L und 235 S durch Züchtung in einem üblichen Nährmedium und Gewinnung des Antibioticums aus der Kulturflüssigkeit durch Adsorption an stark saure Kationenaustauscher.

Die beiden Species (eigene Bezeichnung Nr. MA 669- bzw. Ma-833) wurden bei der Northern Utilization Research Branch des U. S. D. A. hinterlegt.

Die morphologischen Charakteristiken und Züchtungseigenschaften der das Antibioticum 235 A erzeugenden Streptomycesstämme sind in der folgenden Aufstellung angegeben.

Beschreibung der Züchtungseigenschaften von Organismen, die das Antibioticum 23 5 A erzeugen

(Inkubation: 20 Tage bei 28⁰C) Tomatenmark-Hafermehl-Agarplatten:

Kulturen MA-669, MA-788, MA-831 und MA-872 zeigen reichliche, flache, samtartige, weiße Büschel; rotes (5 de) Luftmycel und braune Unterseitenfarbe.

Herstellung von Antibioticum 235 A und seinen
Komponenten 235 L und 235 S

Anmelder:

Merck & Co., Incorporated,
Rahway, N. J. (V. St. A.)

Vertreter:

Dr.-Ing. W. Abitz und Dr. D. Morf,
Patentanwälte, München 27, Pienzenauer Str. 28

Als Erfinder benannt:

Louis Chaiet, Springfield, N. J. (V. St. Α.);

Justo Martinez Mata, Madrid

Beanspruchte Priorität:
V. St. v. Amerika vom 3. Oktober 1963
(313 477)

Kultur MA-751 zeigt reichliche, schwach erhöhte, samtartige, weiße Büschel; rotes (5de) Luftmycel und braune bis schwarze Unterseitenfarbe.

Kulturen MA-771 und MA-861 zeigen reichliche, flache, samtartige, weiße Büschel; rotes (5de) Luftmycel und braune bis schwarze Unterseitenfarbe.

Kulturen MA-819, MA-842 und MA-926 zeigen reichliche, schwach erhöhte, samtartige, weiße Büschel; rotes (5de) Luftmycel und braune Unterseitenfarbe.

Kultur MA-833 zeigt reichliche, flache, samtartige, weiße Büschel; graues (5fe) Luftmycel und braune Unterseitenfarbe.

Kultur MA-936 zeigt reichliche, schwach erhöhte, samtartige, weiße Büschel; rotes (5cd) Luftmycel und dunkelbraune Unterseitenfarbe.

Czapek-Agarplatten:

Kulturen MA-669, MA-751, MA-771, MA-788, MA-819, MA-831, MA-833, MA-842, MA-861, MA-872, MA-926 und MA-936 zeigen dünnes, zerstreutes, farbloses bis cremefarbiges Wachstum; weißes (a) -> rotes (5cb) Luftmycel; kein lösliches Pigment und weiße (b) Unterseitenfarbe.

Streptomyces lavendulae zeigt dünnes, verstreutes, farbloses bis cremefarbiges Wachstum; baumwollweißes -> weinfarbenlavendelfarbenes Luftmycel und kein lösliches Pigment.

Glycerin-Asparagin-Agarplatten:

Kulturen MA-669, MA-751, MA-771, MA-788,

MA-819, MA-831, MA-833, MA-842, MA-861,

MA-872, MA-926 und MA-936 zeigen kein lösliches Pigment.

Synthetischer Agar (Glucose-Asparagin-Agar)-Platten:

Kultur MA-669 zeigt gutes, flaches, samtartiges Wachstum; rotes (5de) Luftmycel; kein lösliches Pigment und gelbe (1 de) Unterseitenfarbe.

609 757/379

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Kultur MA-751 zeigt reichliches, flaches, samtartiges Wachstum; rotes (5de) Luftmycel; kein lösliches Pigment und gelbe (2db) Unterseitenfarbe.

Kultur MA-771 zeigt reichliches, flaches, samtartiges Wachstum; rotes (5de) Luftmycel; kein lösliches Pigment und gelbe (2fb) Unterseitenfarbe.

Kultur MA-788 zeigt gutes, flaches, samtartiges Wachstum; weißes (a) Luftmycel; kein lösliches Pigment und weiße (a) Unterseitenfarbe.

Kultur MA-819 zeigt gutes, erhöhtes, samtartiges Wachstum; rotes (5ge) Luftmycel; kein lösliches Pigment und gelbe (2db) Unterseitenfarbe.

Kultur MA-831 zeigt gutes, flaches, samtartiges Wachstum; rotes (6ec) Luftmycel; kein lösliches Pigment und gelbe (2db) Unterseitenfarbe.

Kultur MA-833 zeigt reichliche, flache, samtartige, weiße Büschel; graues (5fe) Luftmycel; kein lösliches Pigment und graue (2ih) Unterseitenfarbe.

Kultur 842 zeigt gutes, flaches, samtartiges Wachstum; weißes (a) Luftmycel; kein lösliches Pigment und gelbe (2fb) Unterseitenfarbe.

Kultur 861 zeigt gutes, flaches, samtartiges Wachstum; rotes (5cb — 5de) Luftmycel; kein lösliches Pigment und gelbe (2db — 2fb) Unterseitenfarbe.

35

Kultur MA-872 zeigt reichliche, flache, samtartige, weiße Büschel; rotes (5de) Luftmycel; kein lösliches Pigment und gelbe (2fb) Unterseitenfarbe.

Kultur MA-926 zeigt gutes, flaches, samtartiges Wachstum; weißes (a) Luftmycel; kein lösliches Pigment und gelbe (2fb) Unterseitenfarbe

45

Kultur MA-936 zeigt reichliches, flaches, samtartiges Wachstum; rotes (4ge) Luftmycel; kein lösliches Pigment und goldbraune Unterseitenfarbe.

Streptomyces lavendulae zeigt gelbliches Wachstum und weißes Luftmycel mit Lavendelton.

Kartoffelstück:

Kultur MA-669 zeigt gutes Wachstum; graues (d) Luftmycel und bräunlichschwarzes lösliches Pigment.

Kultur MA-751 zeigt reichliches Wachstum; graues -> rotes (5 de) Luftmycel und bräunlichschwarzes lösliches Pigment.

Kultur MA-771 zeigt reichliches, cremefarbenes Wachstum; graues -> rotes (5de) Luftmycel und braunes lösliches Pigment.

55

60 Kultur MA-788 zeigt gutes, braunes Wachstum; rotes (5 de) Luftmycel und bräunlichschwarzes lösliches Pigment.

Kulturen MA-819 und MA-831 zeigen gutes, braunes Wachstum; graues (e) Luftmycel und bräunlichschwarzes lösliches Pigment.

Kultur MA-833 zeigt reichliches, braunes Wachstum; graues (2 de) Luftmycel und bräunlichschwarzes lösliches Pigment.

Kultur MA-842 zeigt gutes, braunes Wachstum; graues (e) Luftmycel und bräunlichschwarzes lösliches Pigment.

Kultur MA-861 zeigt reichliches, braunes Wachstum; graues (2dc—g) Luftmycel und bräunlichschwarzes lösliches Pigment.

Kultur MA-872 zeigt reichliches, cremefarbenes Wachstum; graues (d) Luftmycel und braunes lösliches Pigment.

Kultur MA-926 zeigt gutes, cremefarbenes Wachstum; graues (2 de) Luftmycel und braunes lösliches Pigment.

Kultur MA-936 zeigt reichliches Wachstum; rotes (5ca—7ca) Luftmycel und rotes lösliches Pigment.

Streptomyces lavendulae zeigt dünnes, faltiges, cremefarbenes bis gelbliches Wachstum; kein Luftmycel und schwarzes lösliches Pigment.

Gelatine-Stichkultur (Verflüssigung):

Kulturen MA-669, MA-861 und MA-936 zeigen cremefarbenes Wachstum; kein Luftmycel; braunes lösliches Pigment und langsame Verflüssigung des Gelatinemediums.

Kulturen MA-751, MA-771 und MA-819 zeigen cremefarbenes bis dunkelbraunes Wachstum; kein Luftmycel; braunes lösliches Pigment und langsame Verflüssigung des Gelatinemediums.

Kulturen MA-788, MA-831, MA-833, MA-842, MA-872 und MA-926 zeigen cremefarbenes Wachstum; graues Luftmycel; braunes lösliches Pigment und langsame Verflüssigung des Gelatinemediums.

Streptomyces lavendulae zeigt cremefarbenes bis bräunliches Oberflächenwachstum; kein Luftmycel oder weißes Luftmycel; braunes lösliches Pigment und langsame Verflüssigung des Gelatinemediums.

Schwefelwasserstoff wird durch jeden der Mikroorganismen, einschließlich Streptomyces lavendulae, erzeugt.

Bei Züchtung auf Stärke-Agar-Platten wird Stärke durch Streptomyces lavendulae und jede der zwölf Kulturen hydrolisiert.

Auf Nitrit-Agar reduzieren die folgenden Kulturen Nitrate zu Nitriten: MA-751, MA-771, MA-831, MA-842. Die restlichen Kulturen MA-669, MA-788, MA-819, MA-833, MA-861, MA-872, MA-926, MA-936 und Streptomyces lavendulae bewirken keine feststellbare Reduktion von Nitraten zu Nitriten.

Kohlenstoffverwertung

Glucose

Xylose

Arabinose Rhamnose

Raffinose

Mannose

Lactose

MA-669 ....
MA-751 ....
MA-771 ....
MA-788 ....
MA-819 ....
MA-831 ....
MA-833 ....
MA-842 ....
MA-861 ....
MA-872 ....
MA-926 ....
MA-936 ....
Streptomyces
lavendulae

wechselnd

wechselnd

Die obige Beschreibung der das Antibioticum 23 5 A erzeugenden Mikroorganismen reicht aus, um die elf Stämme MA-669, MA-751, MA-771, MA-788, MA-819, MA-831, MA-842, MA-861, MA-872, MA-926 und MA-936 als Glieder der Species Streptomyces lavendulae zu klassifizieren und die Kultur MA-833 als neues Species von Streptomyces zu klassifizieren, der der Name Streptomyces avidinii in Anbetracht der ungewöhnlichen Art der Kultur und der Tatsache, daß gefunden wurde, daß ein biotinbindendes Mittel, Streptavidin, erzeugt werden kann, gegeben wird.

Die oben beschriebenen Mikroorganismen wurden aus Böden von über die Welt verstreuten Orten erhalten. Die Kultur MA-833 wurde aus einer in Spanien gefundenen Erdprobe isoliert. Die anderen beschriebenen Kulturen wurden aus in Nebraska, Massachusetts, West Virginia, Ohio und Utah, USA., sowie an Stellen in Europa und Südamerika gefundenen Erdproben isoliert.

Flüchtige Prüfungen der zwölf Kulturen bei Züchtung auf komplexen Medien zeigen, daß sie stark voneinander abweichen. Die verschiedenen Erdproben liefern demnach verschiedene Stämme von Kulturen, die alle zum Genus Streptomyces gehören.

Bei der Zuordnung dieser Stämme zu einer Species-Klassifizierung werden die in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, und in dem in Applied Microbiology, 5, S. 52 bis 79 (1958), erschienenen Aufsatz »A Guide for the Classification of Streptomycetes According to Selected Groups« von P r i d h. a m, Hesseltine und Benedict beschriebenen Schlüssel angewendet.

Es wurden eingehende Vergleiche zwischen den das Antibioticum 235 A erzeugenden Kulturen und den in Bergeys Manual oder in The Actinomycetes, Bd. 2, Classification, Identification and Descriptions of Genera and Species, S. A. Waksman (1961), für verwandte Kulturen, wie sie mit Hilfe der Schlüssel ausgewählt wurden, publizierten Eigenschaften angestellt.

Die zwölf Kulturen MA-669, MA-751, MA-771, MA-788, MA-819, MA-831, MA-833, MA-842, MA-861, MA-872, MA-926 und MA-936 erzeugen alle reichliches, dunkles, lösliches Pigment bei Züchtung auf organischen Medien, wie beispielsweise Tomatenmark-Agar oder Kartoffeln, und erzeugen ferner Schwefelwasserstoff. Alle Kulturen mit Ausnahme von MA-833 bilden lavendelfarbene Sporen auf komplexen Züchtungsmedien. Bei Prüfung mit dem Schlüssel für die in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, veröffentlichtenStreptomyceten erfüllen die Kulturen die Erfordernisse für Streptomyces lavendulae. Außerdem sind bei einem Vergleich mit der ausführlichen Beschreibung von Streptomyces lavendulae solche Unterschiede, wie sie vorliegen, von geringer Art, und die elf isolierten Kulturen werden daher als Glieder der Species Streptomyces lavendulae angesehen.

Alle Kulturen bilden Sporophoren, die in Sporenketten enden, die im frühen Stadium der Entwicklung der Kultur gewellt sind und bei weiterer Inkubation in einen gewundenen Zustand übergehen, wobei sie in einer dichten Spirale enden, die oft das Aussehen eines Balls aufweist. Alle Kulturen fallen daher nach der Klassifikation von Pridham, Hesseltine und Benedict unter die Sektion »Spira«. Nach Pridham, Hesseltine und Bendedi et beruht eine zweite Klassifizierung, die »Series«, auf der Farbe des sporolierenden Mycels. Alle Kulturen mit Ausnahmen von MA-833 sind Glieder der Red Series (rote Series), während MA-833 sich eindeutig von den anderen unterscheidet und in die Gray Series (graue Series) gehört.

In dem Aufsatz von Pridham, Hesseltine und Benedict sind vier bestätigte pigmentebildende Species unter Spira Section-Red Series aufgeführt, die im einzelnen in The Actinomycetes, Bd. 2, von S. A. Waksman beschrieben sind. Die oben angeführten Erzeuger von Antibioticum 235 A (mit Ausnahme von MA-833) können von zwei dieser zuvor beschriebenen Species aus den folgenden Gründen unterschieden werden: Streptomyces purpurascens bildet auf Czapek-Agar Luftmycel, gibt auf Kartoffeln orangegefärbtes Wachstum, zeigt geringe Hydrolyse von Stärke und bildet kein H₂S; Streptomyces roseocitreus ergibt rosaviolettgefärbtes Wachstum auf Nitrat-Agarmedien, bildet ein gelbes lösliches Pigment auf Asparagin-Agar, bildet kein lösliches Pigment auf Gelatine oder Kartoffeln und zeigt schwache Hydrolyse von Stärke.

Die in Frage stehenden elf Kulturen unterscheiden sich nicht signifikant von den Species Streptomyces lavendulae oder Streptomyces griseoviridis, wie sie in The Actinomycetes, Bd. 2, beschrieben sind. Da die ursprüngliche Beschreibung von Streptomyces lavendulae 1916 erfolgte, während die Beschreibung von Streptomyces griseoviridis erste 1956 publiziert wurde.

wird in Betracht gezogen, daß die elf Kulturen, die das Antibioticum 235A erzeugen, als Streptomyces lavendulae charakterisiert werden sollen. Dieser Schluß, der auf der Klassifikation von P r i d h a m, Hesseltine und Benedict und der in The Actinomycetes, Bd. 2, enthaltenen Beschreibung beruht, steht in Übereinstimmung mit dem, was mit Hilfe des in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, enthaltenen Schlüssels erreicht wird.

Die elf das Antibioticum 235 A erzeugenden isolierten Kulturen sind verschiedene Stämme der Species Streptomyces lavendulae.

Die stammdefinierenden Eigenschaften sind in der obigen Aufstellung angegeben und bestehen in den Unterschieden in den Farbtönungen des Luftmycels, den Unterschieden in der Konsistenz des Wachstums, den Unterschieden in der Farbe und dem Ausmaß des Wachstums auf chemisch definierten Medien, den Unterschieden in der Farbe des Wachstums auf Kartoffeln und den Unterschieden in dem Vermögen, Nitrat zu reduzieren.

Der schließlich verbleibende zu identifizierende Organismus ist Streptomyces MA-833. Die Kultur MA-833 zeichnet sich durch die Bildung von Spiralsporenketten, durch die Bildung eines löslichen braunen Pigments und durch die Bildung von Schwefelwasserstoff aus.

Auf einem komplexen Medium, beispielsweise Tomatenmark-Agar, wächst die Kultur stark, doch unterscheidet sie sich scharf von den anderen Erzeugern des Antibioticums 235 A durch Bildung ausgeprägt graugefärbter Sporen ohne Übertönungen von Rot oder Lavendel. Graugefärbte Sporen werden auch auf chemisch definierten Medien gebildet.

Es wurde versucht, die Kultur durch den Schlüssel auf die Species des Genus Streptomyces, publiziert in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, unter Berücksichtigung der graugefärbten Sporen in komplexem Medium zurückzuführen. Es wurde keine bekannte Species gefunden, der MA-833 zügeschrieben werden könnte.

Weiterhin wurden die neun lösliches Pigment bildenden Species in Section Spira-Gray Series, die in der Veröffentlichung von Pridham, Hesseltine und Benedict angeführt und im einzelnen in The Actinomycetes, Bd. 2, beschrieben sind, berücksichtigt. MA-833 konnte von den neun Kulturen auf Grund der folgenden Charakteristiken unterschieden werden: Streptomyces aureus zeichnet sich durch das Fehlen von Luftmycel auf organischem Agar und durch hellorangegefärbtes Wachstum auf Dextrose-Asparagin-Agar aus; Streptomyces collinus erzeugt kein lösliches Pigment auf Kartoffeln und karminrotes lösliches Pigment auf Dextrose-Asparagin-Agar; Streptomyces cyaneus ergibt blaugefärbtes Wachstum auf verschiedenen Medien und zeigt schwache Hydrolyse von Stärke; Streptomyces filipiensis bildet ein gelbgefärbtes lösliches Pigment sowohl auf Czapek-Agar als auch auf Glycerin-Asparagin-Agar; Streptomyces fimbriatus zeigt reichliches Wachstum auf Czapek-Agar, bildet lösliches Pigment auf Gelatine und ist für Pflanzen pathogen; Streptomyces griseochromogenes hat keine Spiralsporenketten und ergibt ein orangegefärbtes Wachstum auf Czapek-Agar; Streptomyces griseoruber ergibt rötlichoranges Wachstum auf Czapek-Agar, rötlichoranges Wachstum und ein gelbes lösliches Pigment auf Stärke-Agar; Streptomyces hawaiiensis zeigt nur schwache Verflüssigung von Gelatine und schwache Hydrolyse von Stärke; und Streptomyces olivochromogenes ist durch ein lösliches Pigment auf Dextrose-Asparagin-Agar und langsame Verflüssigung von Gelatine charakterisiert.

Es ist keine Mikroorganismen-Species bekannt, deren Haupteigenschaften mit MA-833 ausreichend übereinstimmen. In Anbetracht der charakteristischen Sporenfärbung auf Tomatenmark-Agar, die MA-833 klar von anderen das Antibioticum 235 A erzeugenden Streptomyceten unterscheidet, wurde entschieden, daß dieser unterschiedlichen Art durch Verleihung einer neuen Species-Bezeichnung Rechnung getragen werdea sollte. In Erkenntnis der ungewöhnlichen Art der Kultur und der ersten Feststellung, daß das biotinbindende Mittel, Streptavidin, durch einen Mikroorganismus erzeugt werden kann, wurde der Name Streptomyces avidinii gewählt.

Das erfindungsgemäß herstellbare neue Antibioticum 235 A enthält zumindest zwei Substanzen, von denen eine als Substanz 23 5 S bezeichnet wird; dieses Material besitzt verhältnismäßig kleines Molekulargewicht. Die andere der zwei Substanzen wird als 235 L bezeichnet und besitzt ein verhältnismäßig großes Molekulargewicht. Die Substanz 235 L, die auch »Streptavidin« genannt wird, ist eine proteinähnliche Substanz. Das neue Antibioticum 235 A ist in seiner Wirksamkeit insofern ungewöhnlich, als die einzelnen Komponenten keine antibiotische Wirksamkeit gegen pathogene Mikroorganismen in sich und als solche besitzen, außer wenn sie auf speziell hergestellten Medien geprüft werden, jedoch gegen pathogene Mikroorganismen wirksam sind, wenn Gemische der zwei Komponenten gegen pathogene Mikroorganismen geprüft werden. Das Antibioticum 235 A besteht demnach aus einem synergistischen Paar von Substanzen, die als 23 5 S und 23 5 L oder Streptavidin bezeichnet werden.

Das Antibioticum 235 S wirkt als Material mit verhältnismäßig niedrigem Molekulargewicht, das durch papierchromatographische Verfahren in zumindest drei Komponenten getrennt werden kann, die als 235S₁, 235S₂ und 235S₃ bezeichnet werden.

Unter Verwendung der folgenden Lösungsmittelsysteme zur Entwicklung der Chromatogramme werden die Werte Rf der drei einzelnen Komponenten unter Verwendung eines Präparats von Antibioticum 235 S bestimmt, das aus der Fermentationsbrühe durch eine Ionenaustauscherarbeitsweise isoliert wurde. Das Lösungsmittelsystemi ist n-Butylalkohol, der mit wäßriger 0,25 m-Dinatriumhydrogenphosphat-Pufferlösung (pH = 9,3) gesättigt ist. Das Lösungsmittelsystem II ist n-Butylalkohol, der mit 0,1 n-Ammoniumhydroxydlösung gesättigt ist. In jedem Falle wird das Papier zuerst mit dem wäßrigen Puffer oder der wäßrigen Ammoniaklösung vor Aufbringen der Probe auf das Papier gesättigt. Die Entwicklungszeit beträgt 6 bis 17 Stunden. Die Ergebnisse sind die folgenden:

235S₁
235S₂
235S₃

System I

Rf = 0,14
Rf = 0,28
Rf = 0,47

System II
6 Stunden

Rf = 0,15
Rf = 0,33
Rf = 0,51

Jede der niedermolekularen Komponenten des Antibioticums 235 S zeichnet sich durch die Eigenschaft aus, die intrazellulare Synthese von Biotin durch gramnegative Mikroorganismen zu inhibieren.

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Das Antibioticum 235S₃ wurde in kristalliner Form nach den im nachstehenden beschriebenen Arbeitsweisen erhalten. Das Antibioticum 235S₃ gibt charakteristische Reaktionen von primären Aminen und ist in Wasser, niedrigen Alkanolen, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Isopropanol, n-Butanol, und in wäßrigen Acetonlösungen löslich.

Das Antibioticum 235S₃ kann aus alkalischen wäßrigen Lösungen durch Zugabe von Aceton kristalli-Hydrolyse mit 6n-Salzsäure unter Rückfluß ist das Hydrolyseprodukt eine «-Aminosäure mit einem Rf-Wert von 0,5₂ bei Papierchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems, das aus 100 Teilen Butanol, 12 Teilen Eisessig und 100 Teilen Wasser besteht, und Ninhydrin zur Lokalisierung des Aminosäurefleckens auf dem Chromatogramm. Diese Aminosäure besitzt einen Schmelzpunkt von 240 bis 241⁰C. Das Antibioticum 235S₂ andererseits ergibt einen

siert werden. Das auf diese Weise hergestellte kristal- io positiven Biuret-Test, was das Vorhandensein einer line Antibioticum 235S₃ hat einen Schmelzpunkt von Amidbindung zeigt. Bei Hydrolyse mit 6n-Salzsäure etwa 217° C.
Das Antibioticum

235S₃ ist eine optisch aktive

unter Rückfluß wird ein Gemisch von Aminosäuren erhalten, von denen eine einen Rf-Wert von 0,52 unter Verbindung mit einem Drehvermögen [x]²i = + 8,5° Anwendung der papierchromatographischen Prüfung (c = 2 % in 0,1 η-Salzsäure) und [x\²ü = +9,5° (c = 2% ¹S ergibt, die für das Hydrolyseprodukt des Antibioticums in 3,5 n-Salzsäure).

Eine Lösung des Antibioticums 235S₃ zeigt keine feststellbaren Maxima im ultravioletten Absorptionsbereich.

235S₃ angewendet wurde.

Eine Osmometerbestimmung des Molekulargewichts des Antibioticums 238 S₃ ergibt einen Wert von 322, der zusammen mit den mikroanalytischen Daten eine

Die Infrarotabsorption einer Probe von kristallinem 20 Summenformel C₁₇H₂₈N₃O₃ anzeigt. In Anbetracht

Antibioticum 23 5 S₃, suspendiert in Mineralöl (NUJOL), wurde mit einem Infrarotspektrophotometer der Baird Associates Modell 12 B unter Verwendung eines Natriumchloridprismas gemessen und zeigte eine Anzahl charakteristischer Maxima, deren ausgeprägtere sich bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in μ, befanden: 3,04, 3,7 bis 4,8 und 6 bis 6,6. Das Infrarotspektrum ist in der Figur gezeigt. Es sei bemerkt, daß das Infrarotabsorptionsspektrum eine Messung der Absorption des Antibioticums 235S₃ in kristalliner Form, das durch langsame Zugabe von Aceton zu einer wäßrigen ammoniakalischen Lösung des Antibioticums 235 S₃ hergestellt war, ist. Es wurde zwar nur eine kristalline Form erhalten, doch existieren viele Substanzen in polymorphen Modifikationen, wobei in diesem Fall das Infrarotabsorptionsspektrum kleine Unterschiede zwischen den verschiedenen kristallinen Formen zeigen kann.

Das Antibioticum 235S₃ enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff. Die folgende Elementaranalyse wurde für eine Probe von kristallinem 235S₃ erhalten:

Kohlenstoff 63,1

Wasserstoff 8,9

Stickstoff 13,04

Sauerstoff (durch Differenz) 14,96

Das Antibioticum 235S₃ ist ein primäres Amin, das Salze bei Reaktion mit Säuren bildet. So werden bei Reaktion mit starken anorganischen Säuren, wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure und Phosphorsäure, die entsprechenden Aminsäuresalze gebildet. Ebenso werden bei Reaktion mit organischen Säuren die Salze des Antibioticums 235S₃ mit der organischen Säure gebildet.

Die basische Natur des Antibioticums 235S₃ ist auch ein unterscheidendes Merkmal dieser neuen Verbindung. Wird eine Probe von Antibioticum 235 S₃ potentionietrisch mit 0,1 η-Salzsäure titriert, so werden zwei basische bindende Gruppen beobachtet. Die erste Bindung erfolgt bei einem pH-Wert von etwa 5,5. Die zweite Bindung erfolgt bei einem pH-Wert von etwa 8,5. Diese Titration zeigt ein PH₁₂ von etwa 7,5 und ein Molekulargewicht von 373.

Das Antibioticum 235S₃ ergibt eine negative Reaktion unter den Bedingungen des Biuret-Tests. Bei der Tatsache, daß das Molekulargewicht, wie es mit Hilfe des Osmometers bestimmt wird, ein Maß einer colligativen Eigenschaft des Moleküls ist, wird angenommen, daß diese Bestimmung eine zuverlässigere Methode zur Bestimmung des Molekulargewichts als die Titration ist, die leicht Fehler in dem Falle gibt, in welchem kleine Mengen stark saurer ober basischer Verunreinigungen vorhanden sind.

Die antibiotische Substanz 235 L, die zweite des in dem Antibioticum 235A enthaltenen synergistischen Paares von Antibiotica, wurde ebenfalls in kristalliner Form nach den im folgenden beschriebenen Arbeitsweisen hergestellt. Eine Lösung des Antibioticums 23 5 L zeigt ein einziges Maximum im ultravioletten Absorptionsbereich bei 282 πιμ (E₁O.,. = 47). Der Schmelzbereich des Antibioticums beträgt von 220 bis 230⁰C (Zersetzung).

Das Antibioticum 235 L enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff. Die folgende Elementaranalyse wurde mit einer Probe des kristallinen Antibioticums 235 L erhalten:

Kohlenstoff 51,1

Wasserstoff 7,4

Stickstoff 16,4

Schwefel 0,2

Sauerstoff (durch Differenz) 24,9

Der Kohlehydratgehalt des 235 L-Moleküls ist bei Messung nach der Orcin-Methode nach H. E. W e i m e r und J. R. M ο s h i m in Arch. Biochem. & Biophys., 92, (1952), S. 97, Null. Wird die modifizierte Molisch-Prüfung (Z. D i s c h e , Mikrochemie, 7, 33 [1929]) angewendet, so wird festgestellt, daß das 235L-Molekül weniger als 1,0% Hexose enthält.

Das verhältnismäßig große Molekulargewicht des Antibioticums 235 L wird durch die Tatsache gezeigt, daß dieses durch eine Cellophanmembran nicht dialysierbar ist. Eine Bestimmung des Molekulargewichts durch Ultrazentrifugieren zeigt ein Molekulargewicht von etwa 60 000.

Bei der Scheibenelektrophorese an 7,5%igem PoIyacrylamidgel nach der von Reisfeld und Mitarbeiter in Natur, 195 (1962), S. 281, beschriebenen Methode trennt sich das Antibioticum 235 L in Banden in einem charakteristischen Muster. Das 7,5°/_oige Polyacrylamidgel wird in einer Säule mit Phosphatpuffer von pH 8,7 suspendiert, und 0,01 ml einer

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Lösung von Streptavidin wird oben auf die Säule auf- Antibioticum 23 5 S als Inhibitor für das Wachstum gebracht. Die Elektrophorese wird 1 Stunde bei 5 mA pathogener Mikroorganismen wirkt. Das Antibioticum und 100 Volt durchgeführt. Die Arbeitsweise wird auch 235 L ist daher ein wirksames Laboratoriumsmittel, mit Avidin, einem bereits bekannten Protein von etwa das zur Untersuchung unbekannter Proben voa dem gleichen Molekulargewicht durchgeführt. Die 5 Mikroorganismen auf deren Fähigkeit, Antibiotica zu durch das Elektrophoreseverfahren gebildeten Banden erzeugen, die hauptsächlich durch die Inhibierung der werden mit Bromphenolblau angefärbt. Die sich aus Biotinsynthese durch verschiedene pathogene Mikrcder Elektrophorese des Antibioticums 235 L (Strepta- Organismen wirken, verwendet werden kann,
vidin) ergebenden Banden zeigen das Vorhandensein Die antibiotische Wirksamkeit des Antibioticums

von größeren Mengen von zwei Proteinen und kleineren io 235 A wird nach der AgardifFusionsmethode oder der Mengen von zwei anderen Proteinen, die sich eng Reagensglas-Verdünnungsprüfmethode unter Verwenzusammen gegen die Anode hin bewegen. Das durch dung von in einem natürlichen Medium wachsenden Elektrophorese von Avidin entwickelte Muster zeigt Escherichia coli bestimmt. Die Bestimmung des sechs weit voneinander getrennte Banden, von denen Antibioticums 235 A wird dadurch kompliziert, daß es nur zwei geringere Komponenten im Bereich des 15 aus einer Substanz mit großem Molekulargewicht, Antibioticums 235 L liegen. die langsam diffundiert, und Substanzen mit niedrigem

Das Antibioticum 235 L scheint eine proteinähnliche Molekulargewicht, die rasch diffundieren, besteht Verbindung oder eine Verbindung vom Polypeptid- Infolgedessen wird bei den üblichen Agardirfusions-Typ zu sein, da saure Hydrolyse bei erhöhten Tempe- Prüfungen nur die Menge der vorhandenen langsam raturen zu Hydrolyseprodukten führt, die eine positive 20 diffundierenden Komponente gemessen, da das rasch Reaktion mit Ninhydrinreagens ergeben, was eine diffundierende Material bei gewöhnlichen Prüfungen Spaltung von Amidbindungen zeigt. Das Antibioticum selbst nicht aktiv ist, Sind die zwei Arten von Materia-23 5 L besitzt nur eine beschränkte Löslichkeit in Wasser lien einmal getrennt, so ist es möglich, Prüfplatten von weniger als etwa 1 mg/ml. Die Löslichkeit in unter Zugabe einer ausreichenden Menge, 90y/ml, der Wasser kann jedoch bis zu etwa 10 mg/ml durch 25 Verbindung mit großem Molekulargewicht zu der Zugabe wechselnder Menge Natriumchlorid zu der Probe herzustellen, so daß dessen Diffusion die Wirk-Lösung erhöht werden. samkeit der kleinen Komponenten nicht beschränkt.

Das Antibioticum 235 A ist zur Inhibierung des Die Agardiffusionsmethode wird wie folgt durchWachstums von gramnegativen Mikroorganismen geführt:

wirksam. Obgleich die Einzelkomponenten des Anti- 30 Ein Kolben, der 150 ml eines Prüfmediums enthält, bioticums235A, d.h. die Antibiotica 235Sund235L, das 0,3% Rindfleischextrakt, 0,5% Pepton, 0,2% für die Inhibierung des Wachstums von pathogenen Hefeextrakt, 1,5% Agar und Wasser auf das geMikroorganismen unwirksam sind, wenn sie einzeln wünschte Volumen enthält, wird durch Behandlung im in üblichen Prüfsystemen geprüft werden, wirkt die Autoklav während 20 Minuten bei 120° C bei etwa Kombination dieser beiden in Form von Antibioticum 35 1,3 at (18 psi) sterilisiert. Der bei 45 bis 50⁰C ge-235A synergistisch. Das Antibioticum 235A als ein haltenen flüssige Agar wird mit 5 ml einer über Nacht Gemisch gleicher Teile 235 S und 235 L ist zur In- bei 37° C gehaltenen Nährbrühenkultur von Escherichia hibierung des Wachstums von Salmonella typhosa coil W beimpft, die auf eine Zellendichte von 60 auf 2866, Salmonella schottmuelleri MI, Escherichia coli W einem Lumetron-Kolorimeter unter Verwendung eines und Shigella sonnei 1832 wirksam. 40 600-m^-Filters eingestellt worden war. 5 ml des

Das Antibioticum 235A ist ein verhältnismäßig beeimpften Agars werden dann in eine genormte nichttoxisches Material. Bei Verwendung von Mäusen sterile 90-mm-KunststoffpetrisehaIe einpipettiert und als Testtieren sind bis zu 500 mg/kg der Komponente verfestigen gelassen. Nach der Verfestigung wird 235 S und 400 mg/kg der Komponente 235 L bei Ver- die Schale bis zur Verwendung innerhalb der folgenden abreichung an die Mäuse durch intraperitoneale 45 24 Stunden gekühlt. Bei der Durchführung der Injektion ohne irgendwelche beobachtbaren toxischen Prüfung wird eine genormte 12,7-mm-Papierscheibe Manifestationen verträglich. mit der Antibioticumlösung durchfeuchtet und dann

Das neue Antibioticum 235A ist ein wertvolles an einem Papiertuch abgetrocknet und auf die Ober-Mittel zur Inhibierung des Wachstums von gramnega- fläche einer mit Escherichia coli W beimpften Agartiven pathogenen Organismen. Es ist auch zur Ge- 50 platte aufgebracht. Die Platten werden dann 18 bis winnung von reinen Kulturen von Mikroorganismen 24 Stunden bei 25° C inkubiert. Die antibiotische wertvoll, wobei ein empfindlicher Organismus von Wirksamkeit wird dann durch Messung der inhieinem resistenten abgetrennt werden kann. Wird das bierungszone um die Scheibe herum in Millimeter Antibioticum 235 A in seine Einzelkomponenten ge- bestimmt.

trennt, so können die Einzelkomponenten 235 S und 55 Die Reagensglas-Verdünnungsprüfung wird wie 235L als Hilfsmittel bei der Suche nach anderen folgt durchgeführt: Eine Lösung wird durch Zugabe ähnlichen Materialien verwendet werden. So wirkt von 32 g Difco-Phenolrot-Brühengrundlage und 20 g 235 S als Inhibitor des Wachstums von Mikroorganis- Dextrose zu 1000 ml destilliertem Wasser hergestellt, men in Medien, die kein exogenes Biotin enthalten, 2 ml der Lösung werden in ein Reagensglas einist jedoch in Systemen, die biotinaktive Substanzen 60 gebracht. Neun andere Reagensgläser, die jeweils 2 ml enthalten, zur Inhibierung des Wachstums von Mikro- der obigen Lösung, verdünnt mit 2 ml Wasser, entorganismen völlig inaktiv. halten, werden ebenfalls zubereitet. Man gibt 2 ml der

Auf diese Weise kann das Antibioticum 235S₃ in Antibioticumlösung in das erste Reagensglas und mikrobiologischen Prüfsystemen zur Prüfung auf das mischt. Dann überführt man 2 ml der erhaltenen Vorhandensein von Biotin oder verwandten biotin- 65 Lösung in das zweite Reagensglas und mischt. Aus aktiven Materialien verwendet werden. diesem zweiten Reagensglas überführt man 2 ml in

Das Antibioticum 23 5 L andererseits wirkt als Biotin das dritte Reagensglas und mischt. Diese Arbeitsweise komplex bindendes Mittel und ermöglicht so, daß das wird bis zum zehnten Reagensglas wiederholt, aus dem

2 ml der erhaltenen Lösung entfernt und verworfen werden. In jedes der zehn Reagensgläser wird ein Tropfen des wie oben beschrieben hergestellten Lumetron-60-Impfmaterials aus einer serologischen 5-ml-Pipette eingebracht. Die Reagensgläser werden dann in ein Wasserbad bei 37⁰C etwa 2 Stunden lang inkubiert, bis das Kontrollglas (eines mit halbkonzentrierten Nährstoffen, jedoch ohne Antibioticum) seine ursprüngliche rote Farbe in ein vollständiges Gelb geändert hat. Die Reihe mit den zehn Gläsern wird dann geprüft, und das Reagensglas mit der höchsten Verdünnung, dessen Inhalt noch rot gefärbt ist, wird als die minimale Hemmkonzentration (MHK) des Antibioticums enthaltend angesehen.

Das Vorhandensein von Antibioticum 235 L kann durch Routine-AgardifFusionsmethoden unter Verwendung von E. coli bestimmt werden, vorausgesetzt, daß ausreichend Antibioticum 235 S in den Agar eingebracht wird. Wegen des großen Molekulargewichts und der entsprechend geringen Änderung im Verlauf mit dem Verdünnen entbehrt diese Methode der Genauigkeit. Mit regulärem Nähragar ergibt, wie gefunden wurde, das Vorhandensein von 0,6 mg Antibioticum 235 S je ml zufriedenstellende Ergebnisse.

Die Menge an Antibioticum 235 L kann etwas genauer durch Anwendung der genormten Reagensglas-Verdünnungsprüfung mit E. colis unter Zugabe eines Überschusses an Antibioticum 235 S (100 γ) zu dem Prüfmedium bestimmt werden. Das Ergebnis wird in y/ml ausgedrückt, die für die minimale Hemmkonzentration (MHK) erforderlich sind. Das Antibioticum 235 S kann quantitativ auf Agardiffusionsplatten unter Verwendung von E. coli bestimmt werden. Wenn Nähragar verwendet wird, sind 9Oy Antibioticum 235 L je Millimeter Agar zufriedenstellend. Wird ein synthetisches Prüfmedium verwendet, so ist kein Antibioticum 235 L erforderlich.

In letzterem Falle wird die Wirksamkeit inhibiert, wenn Biotin in den Agar eingebracht wird. Diese Methode wird zur Bestätigung der Produktion von Antibiotica vom Typ 235 durch Kulturen verwendet, die in dem Aussonderungsprogramm erhalten sind.

Das Antibioticum 235 S kann auch nach Reagensglas-Verdünnungsmethoden in Gegenwart eines Überschusses von Antibioticum 235 L bestimmt werden.

Bei der Reagensglas-Verdünnungsprüfung sind die minimalen Hemmkonzentrationen der antibiotischen Komponenten 0,5y/ml für das Antibioticum 235L, 25y/ml für das Antibioticum 235S₂ und 31y/ml für das Antibioticum 235S₃.

Die Gewinnung des neuen Antibioticums 235 A wird durch aerobe Submersf ermentation verschiedener Stämme von Streptomyces lavendulae oder Streptomyces avidinii in geeigneten wäßrigen Medien vorgenommen. Wäßrige Medien, wie diejenigen, die sich zur Gewinnung anderer bekannter Antibiotica eignen, sind im allgemeinen zur Produktion des Antibioticums 235A geeignet. Solche Medien enthalten durch die Mikroorganismen assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und gewisse anorganische Salze, die für rasches Wachstum der Mikroorganismen unentbehrlich sind. Außerdem enthält das Fermentationsmedium Spuren von Metallen, die für das Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind; dieses sind gewöhnlich in komplexen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in dem Medium vorhanden.

Im allgemeinen sind Kohlenhydrate, wie beispielsweise Zucker, z. B. Dextrose, Saccharose, Dextrin

u. dgl., geeignete Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff. Die genaue Menge der Kohlenstoffquelle hängt teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediums ab, doch wurde im allgemeinen gefunden, daß eine Menge an Kohlehydrat zwischen etwa 1 und 6 Gewichtsprozent des Mediums zufriedenstellend ist. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden, oder es können mehrere solcher Quellen in dem Medium vereinigt werden.

Verschiedene Stickstoffquellen, wie beispielsweise Caseinhydrolysate, Aminosäuren, z. B. Asparagin, Glycin, Arginin, Aufschlüsse von Sojabohnenmehl, Distiller's Solubles u. dgl., werden leicht von den das Antibioticum 23 5 A erzeugenden Mikroorganismen assimiliert und können in Fermentationsmedien zur Gewinnung dieses Antibioticums verwendet werden. Es wurde gefunden, daß im allgemeinen organische Stickstoffquellen, insbesondere Sojabohnenmehl, sehr zufriedenstellend für die Erzeugung des neuen Antibioticums sind. Verschiedene organische und anorganische Stickstoffquellen können entweder allein oder in Kombination in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 6 Gewichtsprozent des wäßrigen Mediums verwendet werden.

Die folgenden Rezeptoren sind Beispiele für Medien, die sich für die Züchtung von Kulturen von Streptomyces avidinii MA 833 und Streptomyces lavendulae eignen, die Antibioticum 235 A erzeugen.

Medium Nr. 1

Hefeextrakt 1%

Dextrose 1 %

Agar, gelöst in Wasser 2 °/₀

Medium Nr. 2

Bacto-Pepton 0,5%

Fleischextrakt 0,3%

Dextrose 1 %

Hefeextrakt 0,1%

gelöst in Wasser. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,0 eingestellt.

Medium Nr. 3

Dextrose 1 %

Asparagin 0,1 %

K₂HPO₄ 0,01%

MgSO₄-7H₂O ' 0,05%

Hefeextrakt 0,05%

ZnSO₄ · 7H₂O 300y/l

FeSO₄-7H₂O 250y/l

MnSO₄-H₂O 45y/l

CuCl₂-2H₂O 277/I

(NH₄)₆MoO₂₄ · 2H₂O 19y/l

Borsäure 55 γ/Ι

CaCl₂ lmg/1

MgSO₄-7H₂O 250y/l

gelöst in Wasser. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,0 eingestellt.

Medium Nr. 4

Dextrose 10,0 g

DL-Asparagin 1,0 g

K₂HPO 0,1 g

MgSO₄-7H₂O 0,5 g

FeSO₄-7H₂O 0,01 g

Hefeextrakt 0,5 g

Destilliertes H₂O 1000 ml

Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,2 eingestellt.

Medium Nr. 5
Sojamehl 30,0 g

ίο

15

Distiller's Solubles

Technische Dextrose (Cerelose)

NaCl

CaCO₃

7,5 g
20,0 g

2,5 g

10,1g
Destilliertes H₂O 1000 ml

Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,0 eingestellt.

Nach beendeter Fermentation wird das Antibioticum aus der Fermentationsbrühe durch Inkontaktbringen der filtrierten Brühe mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz gewonnen. Ein typisches Beispiel für das bei der Gewinnung des Äntibioticums 235 A verwendete Kationenaustauscherharz ist Dowex50X2, das ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat mit Sulfonsäuregruppen, die durch die ganze Harzmatrix substituiert sind, enthält. Beim Inkontaktbringen der Fermentationsbrühe mit dem Kationenaustauscherharz wird der Hauptteil des Äntibioticums 235 S (der Komponente mit kleinerem Molekulargewicht) an dem Harz zusammen mit einer kleineren Menge Antibioticum 235 L adsorbiert. Der Hauptteil des Äntibioticums 235 L geht durch das Harz und wird aus dem Abfluß nach den im nachstehenden beschriebenen Arbeitsweisen gewonnen.

Der Abfluß aus dem Harz enthält Antibioticum 235 L, das in roher Form durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat gewonnen wird. Das rohe Antibioticum 235 L wird weiter durch Ausfällung aus wäßriger Lösung unter Verwendung von Aceton oder Äthanol als Fällungsmittel gereinigt. Die rohe Ausfällung kann alternativ auch durch Dialyse einer wäßrigen Lösung des Rohmaterials und anschließende Ausfällung des teilweise gereinigten Äntibioticums 23 5 L aus dem Dialyserückstand unter Verwendung von Aceton als Fällungsmittel gereinigt werden. Das Antibioticum 23 5 L kann auch aus dem Dialyserückstand durch Chromatographie an einer Sephadex-G25-Säule zur Entfernung von zurückgebliebenem Salz isoliert und dann erneut unter Verwendung von Diäthylaminoäthylcellulose als Adsorbens chromatographiert werden. Das Antibioticum 235 L wird aus dem Abfluß der Diäthylaminoäthylcellulosesäule durch teilweises Eindampfen und Kühlen zur Kristallisation des antibiotischen Materials gewonnen.

Das Antibioticum 235 S wird aus dem Ionenaustauscherharzadsorbat durch Elution des Harzes mit verdünntem Ammoniak gewonnen. Das Ammoniakeluat des Harzes, das rohes Antibioticum 23 5 S, vermischt mit einer kleinen Menge des Äntibioticums 235 L, enthält, wird weiter nach einer Arbeitsweise durch Readsorption an Dowex-W50-X-Ionenaustauscherharz gereinigt. Nach Elution des readsorbierten Äntibioticums 235 S aus dem Harz mit verdünntem Ammoniak wird kristallines Antibioticum 235 S durch Einengen ausgewählter Fraktionen und Kristallisation aus Wasser-Aceton-Gemischen bei alkalischem pH erhalten.

Alternativ kann das Dowex-W50-X-Eluat, das Antibioticum 235 S enthält, durch Extraktion mit Butylalkohol und Readsorption des Extrakte an Dowex-W50-X-Harz weiter gereinigt werden. Kristallines Material wird aus ausgewählten Fraktionen des Eluats beim Einengen erhalten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Ein Fermentationsmedium der nachstehend angegebenen Zusammensetzung wird hergestellt, und der pH-Wert wird auf 7,0 eingestellt:

Dextrose

1%

Asparagin 0,1 %

K₈HPO₄ 0,01%

MgSO₄-7H₂O 0,05%

Hefeextrakt 0,05%

ZnSO₄ · 7H₂O 300y/l

FeSO₄-7H₂O 250y/l

MnSO₄-H₂O 45 γβ

CuCl₂-2H₂O 27 γβ

(NH₄)₈MoO_ai · 2H₂O 19y/l

Borsäure 55 γ/Ι

CaCl₂ lmg/1

MgSO₄-7H₂O 250y/l

gelöst in Wasser.

Etwa 38001 (1000 gallons) eines wäßrigen Mediums der obigen Zusammensetzung wird sterilisiert und mit einem vegetativen Impfmaterial von Kulturen von Streptomyces avidinii MA 833 beimpft. Das vegetative Impfmaterial wird auf folgende Weise hergestellt Ein steriles wäßriges Medium wird mit dem lyophilisierten Inhalt eines Reagensglases mit lebendem Streptomyces avidinii MA 833 beimpft, wobei die Zusammensetzung des Mediums etwa 1% Hefeextrakt und 1 % Dextrose in Wasser ist. Agar-Schrägkulturen werden aus dieser Suspension von Mikroorganismen hergestellt, und nach einer Entwicklung von 4 bis 5 Tagen bei 28 ⁰C werden die entwickelten Sporen in eine Suspension von sterilem wäßrigem Medium geschabt, das 0,1% Hefeextrakt, 1% Dextrose, 0,5 % Bacto-Pepton und 0,3% Fleischextrakt enthält. Die so hergestellte Sporensuspension wird dann in einen 2-1-Erlenmeyerkolben mit Sperre, der 500 ml steriles wäßriges Medium Nr. 2 enthält, eingebracht. Das beimpfte Medium wird dann bei 28 ⁰C auf einer Drehschüttelvorrichtung etwa 24 Stunden lang inkubiert, während welcher Zeit ein starkes vegetatives Wachstum der Kultur auftritt.

17 18

Die in der obigen Weise hergestellte vegetative Es ist keine antibiotische Wirksamkeit in irgendeiner Kultur wird dann in ein Fermentationsgefäß ein- der gesammelten Fraktionen bei Prüfung durch gebracht, das etwa 115 bis 1501 (30 bis 40 gallons) Escherichia-coli-Agar-Plattenprüfung vorhanden,
eines sterilen Mediums enthält, das die oben als Zwei Eluatkonzentrate werden durch Kombination Medium Nr. 2 beschriebene Zusammensetzung hat. 5 der Fraktionen 1 bis einschließlich 9 und der Frak-Das beimpfte Medium wird dann bei 28⁰C etwa tionen 17 bis einschließlich 20 hergestellt. Die Frak-48 Stunden inkubiert, während welcher Zeit das tionen 1 bis einschließlich 9 werden auf 20 ml einMedium kräftig bewegt und belüftet wird, um ein geengt und enthalten eine konzentrierte Lösung von starkes vegetatives Wachstum der Kultur zu bilden. Antibioticum 235L, das durch Lyophilisation ge-

Etwa 8,4% der in der obigen Weise hergestellten io wonnen wird. Die Fraktionen 17 bis einschließlich 20

vegetativen Kultur werden zu etwa 455 1 (120 gallons) werden auf 10 ml eingeengt; das teilweise gereinigte

eines sterilen Mediums zugegeben, das die oben als Antibioticum 23 5 S wird in fester Form durch Lyophili-

Medium Nr. 2 beschriebene Zusammensetzung hat. sation des Konzentrats gewonnen.

Das beimpfte Medium wird bei 28 ⁰C etwa 36 Stunden Der obige Chromatographieversuch wird unter

inkubiert, während welcher Zeit das Medium bewegt is Verwendung von 60 ml des gleichen konzentrierten

und kräftig belüftet wird. Dowex-W-50-X-Eluats als Ausgangsmaterial wieder-

Der Antibioticumgehalt der Fermentationsbrühe holt. Die Eluatfraktionen 8 und 9 aus der Chromatowird durch die Agar-Diffusionsprüfung oder die graphiesäule werden vereinigt und eingeengt. Nach Reagensglas-Verdünnungsprüfmethode unter Ver- Stehen kristallisiert das Antibioticum 235 L aus der Wendung des Organismus Escherichia coli, wie oben ao Lösung aus und wird durch Filtrieren gewonnen,
beschrieben, verfolgt. Wenn die antibiotische Wirksamkeit in etwa 24 bis etwa 60 Stunden ein Maximum Beisüiel 3
erreicht, wird die Fermentation abgebrochen und die

Fermentationsbrühe aus dem Fermentationsgefäß Etwa 38601 (1020 gallons) in der gleichen Weise

geerntet. 25 wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellte filtrierte

Etwa 4551 (120 gallons) der auf die oben be- Fermentationsbrühe werden durch Leiten durch schriebene Weise hergestellten Fermentationsbrühe Dowex-W50-X2-Harz adsorbiert, und das Harzwerden filtriert, und die Zellen werden verworfen. Das adsorbat wird mit 0,5 n-Ammoniumhydroxydlösung die Antibioticumaktivität enthaltende Filtrat wird eluiert. Eine 2,6-1-Fraktion des Eluats (ein Sechzehntel auf pH 5 eingestellt und durch eine Säule mit 8 1 30 des Gesamtvolumens) wird unter Verwendung einer DowexW50X (ein stark saures Kationenaustauscher- wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf pH 9 eingeharz mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix, die ihre stellt und dreimal mit je 61 n-Butylalkohol extrahiert. Austauschkapazität von dem Vorhandensein von Der n-Butylalkoholextrakt wird mit Wasser verdünnt SuIfonsäuregruppen, die in der Harzmatrix enthalten und im Vakuum auf ein Volumen von 2800 ml einsind, erhält) in der Natriumform bei einer Menge von 35 geengt. 11 des n-Butylalkoholkonzentrats wird weiter etwa 800 ml je Minute perkoliert. Nach Adsorption auf ein Volumen von 40 ml eingedampft und an einer der antibiotischen Aktivität an dem Harz wird das Chromatographiesäule von 21 Sephadex 25 (Dextran) Harz mit Wasser gewaschen und unter Verwendung chromatographiert. Die Abflüsse aus der Säule mit von 0,5 n-Ammoniumhydroxyd bei einer Elutions- hohem Gesamtfeststoffgehalt werden auf pH 3,8 eingeschwindigkeit von 250 ml je Minute eluiert. Die *o gestellt und dann an 50 ml Dowex-W50-X2-Harz in Hauptmenge der antibiotischen Aktivität wird in einer Menge von 1 ml je Minute adsorbiert. Das etwa vier Fraktionen von je 21 Eluat gesammelt, das erhaltene Harzadsorbat wird mit 0,2 n-Ammoniumeine Hauptmenge Antibioticum 235 S und eine kleinere hydroxydlösung eluiert, und ammoniakalische Eluat-Menge Antibioticum 235 L enthält. fraktionen mit einem Volumen von 25 ml werden

Die zweite und dritte Fraktion werden vereinigt, 45 gesammelt. Die Fraktionen 11 und 12, die 50 ml

und der pH-Wert wird auf 7,5 eingestellt. Dann wird ausmachen, werden auf etwa die Hälfte des Volumens

auf ein Volumen von etwa 440 ml eingedampft. Etwa eingedampft und mit 96 ml Aceton zur Ingangsetzung

90 ml dieses konzentrierten Dowex-W50-X-Eluats der Kristallisation verdünnt. Die auf diese Weise

werden in einem Cellophanschlauch unter Verwendung erhaltenen Kristalle sind Antibioticum 235S₃ in

von dreimal 11 Wasser als Dialysefiüssigkeit dialysiert. 50 praktisch reiner Form.

Die Dialysate werden dann vereinigt und auf etwa Die Harzfraktionen 6 bis einschließlich 10 werden

80 ml eingedampft. Weder das Dialysatkonzentrat vereinigt und auf etwa 20 ml eingeengt, und 120 ml

noch der Dialyserückstand besitzt irgendeine anti- Aceton werden zur Ingangsetzung der Kristallisation

biotische Aktivität bei Prüfung gegen Escherichia zugegeben. Die erhaltenen 1,2 g Kristalle bestehen, wie

coli mittels der Reagensglas-Verdünnungsprüfung; 55 gefunden wurde, aus einem Gemisch von Antibioticum

bei Wiedervereinigung des Rückstands und des 235S₃ und Antibioticum 235S₂ in einem Verhältnis

Dialysats besitzt die erhaltene Kombination jedoch von etwa 9:1.

antibiotische Wirksamkeit bei der gleichen Escherichia- . ■ 1 ₄

coli-Reagensglas-Verdünnungsprüfung. e 1 s ρ 1 e 1

. 60 Etwa 38001 (1000 gallons) gemäß der Arbeitsweise

Beispiel 2 _von ß_ej_Spj_ei ι hergestellte filtrierte Fermentations-

60 ml konzentriertes Eluat von DowexW50X, das brühe werden durch etwa 801 Dowex-W50-X2-Harz

wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt ist, werden geleitet. Der Abfluß aus der Harzsäulenadsorption

an einer l-l-Sephadex-25-Säule chromatographiert, wird mit Ammoniumsulfat in einer Menge von 500 g

wobei das Entwicklungsmittel für das Chromato- 65 Ammoniumsulfat je Liter Abfluß behandelt, und die

gramm destilliertes Wasser ist. Die anfänglichen erhaltene Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt.

360 ml Abfluß werden verworfen; die folgenden Der Niederschlag wird in etwa 341 (9 gallons) Wasser

27 Fraktionen von jeweils 25 ml werden gesammelt. gelöst und in Cellophanbeuteln etwa 24 Stunden

- : . -..:..., 609757S79

dialysiert. Der Rückstand aus der Dialyse wird mit 1,5 Volumina Aceton verdünnt, um ein Rohmaterial auszufällen, das Antibioticum 235 L enthält. Der rohe Niederschlag wird in Wasser gelöst, wieder mit Äthylalkohol ausgefällt und getrocknet. Etwa 50 g der auf diese Weise hergestellten Festsubstanz werden in Wasser aufgeschlämmt, die Aufschlämmung wird zentrifugiert, und die überstehende Lösung wird an 5,51 Sephadex 25 unter Verwendung von destilliertem Wasser als Entwicklungsmittel chromatographiert. Etwa 1550 ml Lösung, die praktisch reines Antibioticum 235 L enthält, werden gesammelt und gefriergetrocknet. 1 g der auf diese Weise hergestellten Festsubstanz wird in 25 ml Wasser gelöst, und die wäßrige Lösung wird durch 15 ml Diäthylammoäthylcellulose geleitet. Der vereinigte Abfluß wird auf etwa 5 ml eingeengt und abgekühlt, worauf praktisch reine Kristalle von Antibioticum 235 L vom F. = 225 bis 229° C erhalten werden.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verwendung von Streptomyces lavendulaeNRRL 3076 oder Streptomyces avidini NRRL 3077 zur Herstellung des neuen Antibioticums 235A und seiner Komponenten 235 L und 235 S durch Züchtung in einem üblichen Nährmedium und Gewinnung des Antibioticums aus der Kulturfiüssigkeit durch Adsorption an stark saure Kationenaustauscher.

   In Betracht gezogene Druckschriften:
   Korzybski und Kurylowicz, »Antibiotica«, 1961, S. 295 bis 300 und 406 bis 411,413 bis 421.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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