DE1236727B - Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des neuen Antibiotikums Kasugamycin - Google Patents

Description

DEUTSCHES PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Deutsche Kl.: 30h-6

Nummer: 1236 727

Aktenzeichen: Z 11248 IV a/30 h

J 236 727 Anmeldetag: 24. Dezember 1964

Auslegetag: 16. März 1967

Die Erfindung betrifft die Gewinnung einer neuen wirksamen Substanz, die Kasugamycin benannt wurde, und bezieht sich insbesondere auf die Erzeugung dieser Substanz durch Fermentwirkung und Methoden der Abtrennung und Reinigung. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die anfallende neue antibiotische Substanz sowie deren Säureadditionsverbindungen in Form von verdünnten Lösungen, als Rohkonzentrate, als Rohfeststoffkörper oder als gereinigte feste Substanzen und in reiner Kristallform anfallen. Die erfindungsgemäß gewonnene Substanz wirkt gegen Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Brucella und einige Klebsiella. Sie ist nichttoxisch und zeigt Heilerfolge bei Infektionen von Pseudomonas und sonstigen sensitiven Organismen bei Mäusen. Die erfindungsgemäß gewonnene Substanz wirkt auch heilend bei Infektionen von Pseudomonas und sonstigen sensitiven Organismen bei Menschen und Tieren. Ferner wirkt diese Substanz inhibierend auf das Wachstum von Piricularia oryzae, die eine schwerwiegende Krankheit von Reispflanzen verursacht. Die erfindungsgemäß gewonnene Substanz verhält sich auch gegen Pflanzen nichttoxisch und dient zur Vorbeugung gegen Infektionen mit Piricularia oryzae bei Reispflanzen. Sie läßt sich daher zur vorbeugenden Behandlung von Reispflanzen gegen Krankheitsbefall verwenden.

Die erfindungsgemäß gewonnenen antibiotische Substanz, die inhibierend wirkt gegen Pseudomonaceae, Salmonella, Shigella, Brucella und einige Klebsiella und Blastmyces, ist in Wasser löslich, in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Äther, Chloroform und Benzol weitgehend unlöslich; sie zeigt keine Absorption im UV-Licht von 220 bis 400 πιμ, weist positive Reaktion gegen Ninhydrin-Reagenz in Pyridin auf, reagiert jedoch negativ auf folgende Reaktionen: Sakaguchi, Molisch, Elson-Morgan, Fehling, Tollens und Ferrichlorid. Das Hydrochlorid ist eine kristalline Substanz, die mit KBr zu Pellets gepreßt charakteristische Absorption im IR-Spektrum bei folgenden Wellenlängen aufweist: 3520, 3350, 3200, 3070, 2950, 2050, 1695, 1670, 1625, 1522, 1462, 1379, 1323, 1286, 1224, 1180, 1135, 1120, 1090, 1080, 1060, 1042, 1025, 975, 945, 908, 890, 870, 846, 825, 783, 709 cm-¹. Die Substanz ist optisch aktiv, rechtsdrehend und hat eine spezifische Drehung von [«]!? = +120° (c = 1,6 in H₂O); sie entspricht der empirischen Formel

C₁₅H₂₇O₁₀N₃ · HCl · H₂O

und schmilzt bei 202 bis 204° C unter Zersetzung. Bei der Titration ergibt sich ein ExponentPK a von /,1, und der Äquivalentwert liegt bei etwa 453; ferner läßt sich von dem erfindungsgemäß gewonnenen Kasug-Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des
neuen Antibiotikums Kasugamycin

Anmelder:

Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyukai,
Tokio

Vertreter:

Dipl.-Ing. R. H. Bahr und Dipl.-Phys. Ε. Betzier, Patentanwälte. Herne, Freiligrathstr. 19

Als Erfinder benannt:
Hamao Umezawa,
Tomio Takeuchi,
Yoshiro Okami,
Masa Hamada, Tokio

Beanspruchte Priorität:
Japan vom 28. Dezember 1963 (70718),
vom 9. April 1964 (19 767)

amycin ein kristallines Salz mit HBr, Schwefelsäure usw. herstellen; bei saurer Hydrolyse von Kasugamycin fällt (+)-Inositol an, und bei der Methylierung erhält man den restlichen Teil in methylierter Form, während bei Hydrolyse mit Baryt

Ci₄H₂₆O₁₀N₂ · H₂O
anfällt, das weiterhydrolysiert werden kann zu
C₁₂H₂₆O₇N₂

und Oxalsäure.

In den Zeichnungen gibt

F i g. 1 das Infrarot-Absorptions-Spektrum des erfindungsgemäß gewonnenen Kasugamycin-Hydrochlorids, aufgenommen in KBr, wieder, während

F i g. 2 das kernmagnetische Resonanzspektrum, aufgenommen in D₂O gegen das Natriumsalz von 3-(Trimethylsilyl)-propansulfonsäure als Standard wiedergibt.

Erfindungsgemäß stellt man das Antibiotikum Kasugamycin in einer wäßrigen Kohlehydratlösung, die stickstoffhaltiges Material enthält, unter aeroben Bedingungen dar, und zwar über eine solche Zeit, bis sich eine nennenswerte Menge an Kasugamycin in dieser Lösung angesammelt hat.

709 519/514

Der Organismus, aus dem erfindungsgemäß dieses neue Antibiotikum Kasugamycin gewonnen wird, wurde erstmals von dem Erfinder dieses Verfahrens gefunden und wurde aus einer bei Kasuga shrine, Nara city, Japan, entnommenen Bodenprobe gesammelt. Es handelt sich um eine neue, als Streptomyces kasugaensis bezeichnete Art der Streptomyceten. Eine Kultur der lebenden Organismen, die aus dem Boden isoliert und im Laboratorium mit der Kennziffer M338-M1 versehen wurde, ist in der American Type Culture Collection, Washington D. C, hinterlegt und ist dort der ständigen Kollektion der Mikroorganismen als ATCC Nr. 15714 und 15715 zugefügt worden.

Streptomyces kasugaensis hat die folgenden Merkmale:

1. Mikroskopische Untersuchung: Das Myceliensubstrat zeigt gute Verzweigung und bringt lange Luftmycelien hervor, deren Spitzen zum Teil schleifenförmig oder spiralisch mit ausgebildeten ao Sporenketten erscheinen. Es wurden aber keine quirlförmigen Ausbildungen beobachtet. Unter dem Elektronenmikroskop ist die Oberfläche der Sporen glatt und zeigt keine Spinn- oder Haarstruktur.

2. Auf einer bei 27 ⁰C bebrüteten Lage Glyzerin Czapek-Agar-Platte (Glyzerin-Nitrat-Agar) ergab eine cremefarbige bis olivgrüne oder gelblich braungefärbte Wuchsmasse, ein dürftiges weißes Luftmycelium, und blaßolivfarben oder blaßgelblichbraunes Pigment in dem Medium.

3. Bei 27°C auf Krainsky-Glucose-Asparagin-Agar-Nährboden bebrütet entstand eine Wuchsmasse mit gelblicher bis hellbrauner Färbung oder rötlichbraunem Ton. Das Luftmycelium war weißlich bis helloliv oder olivgrau, und das Pigment in dem Medium war dunkelgelblich oder dunkelgelblichbraun gefärbt.

4. Auf Calcium-Malat-Agar-Nährboden bei 27⁰C bebrütet hatte die Wuchsmasse eine elfenbeingelbe Färbung. Das Luftmycelium war weiß bis sandfarben gefärbt, und es war kein lösliches Pigment vorhanden. Das Calciummalat war um die Wuchsmasse herum gewöhnlich gelöst und transparent geworden, wenn jedoch das Wachstum nur gering war, wurde dieses Merkmal nicht beobachtet.

5. Auf Stärke-Agar-Nährlösung, bebrütet bei 27° C, war die Wuchsmasse elfenbeingelblich gefärbt; das Luftmycelium war weiß, und es ■ war kein lösliches Pigment vorhanden. Die hydrolytische Aktivität ist sehr schwach oder fehlt ganz.

6. In Peptonlösung mit 0,2% NaNO₃, bebrütet bei 37° C, war die Wuchsmasse an der Oberfläche farblos; es waren kein Luftmycelium und kein Pigment vorhanden. Nitrat wurde reduziert.

7. Auf einem schräggeneigten Nähragar bei 37° C bebrütet, zeigte die Wuchsmasse eine cremefarbene bis blaßgelblichbraune Färbung oder einen rötlichbraunen Ton. Es wurde kaum Luftmycelium gebildet, und es waren keine löslichen Pigmente vorhanden.

8. In abgerahmter Milch bei 37° C war die Wuchsmasse farblos, und es wurden keine Luftwurzeln ausgebildet. In der Regel wurde keine Koagulation oder Peptisation beobachtet, jedoch trat manchmal eine geringe Koagulation und schwache Peptonisation auf. Lösliches Pigment war nicht vorhanden.

9. Auf Gelatinekultur, bebrütet bei 18 bis 20°C, fiel die Wuchsmasse farblos und nur gelegentlich rötlichbraungefärbt an. Es war ein blaßbräunliches lösliches Pigment vorhanden, und gelegentlich wurde Verflüssigung der Gelatine beobachtet.

10. Als Kohlenstoffquellen für den Wuchs auf Pridham-Gottlieb's Flächenmedium beim Bebrüten bei 27 ⁰C sind verwendbar Glucose, Fruktose, Galaktose, Mannose, Inositol, Maltose und Raffinose, und darauf war das Wachstum sehr reichlich. Rhamnose, Sorbitol, Salicil, Dulcitol, Saccharose und Inulin sind schlechter verwendbar. Arabinose, Lactose, Dextrin und Stärke kann man kaum verwenden.

11. Die Merkmale des für die erfindungsgemäße Gewinnung des Antibiotikums Kasugamycin eingesetzten Stammes Nr. M 338-M1 können wie folgt zusammengefaßt werden: Er gehört zu der Art der Streptomyceten und hat lange Luftmycelien, deren Spitzen schleifenförmig oder spiralisch geformt sind. Die Oberfläche der Sporen ist glatt. Die proteolytische Aktivität ist schwach. Das Luftmycelium ist weiß bis olivgrau, und die Wachstumsmasse ist cremefarben bis blaßgelblichbraun gefärbt oder rötlichbraun getönt. Es gehört nicht zu den chromogenen Typen. Es bildet Kasugamycin.

Beim Vergleich mit bekannten Arten von Streptomyceten wurden Streptomyces galvus und Streptomyces fulvissimus als dem Stamm Nr. M 338-M1 verwandt gefunden. Jedoch sind S. galvus auf der Oberfläche der Sporen haarförmig ausgebildet, und S. fulvissimus ergibt goldgelbes lösliches Pigment und zeigt starke proteolytische Wirksamkeit. Der Stamm M338-M1 dient auch, wenn er aus dem Boden isoliert ist, zur Gewinnung anderer Antibiotika, Aureothricin und Thiolution. Daher kann man den Stamm M 338-M1 vergleichen mit Streptomyces thiluteus, Streptomyces celluloflavus und Streptomyces cyanoflavus. Streptomyces· thioluteus bildet quirlförmige Spitzen. S. celluloflavus bildet gelblichgrünes Pigment und zeigt starke proteolytische Wirkung. S. cyanoflavus ist nicht spiralisch geformt, bildet grünlichblaues Pigment und zeigt starke proteolytische Wirkung. Durch diese Merkmale kann der Stamm M 338-M1 von den anderen Arten unterschieden werden. Außerdem ist der Stamm M 338-MI von diesen Arten hinsichtlich deren Sensitivität gegen verschiedene Antibiotika unterschiedlich.

Die vorgenannten Merkmale reichen aus, um den erfindungsgemäß gewonnenen Mikroorganismus von den bisher beschriebenen Arten an Streptomyceten zu unterscheiden und zu zeigen, daß der Stamm M 338-MI zu einer neuen Art gehört. Variationen und Mutationen des zuvor beschriebenen Organismus können natürlich auftreten, wie dies bei einem Actinomyces üblich ist.

Unter Streptomyces kasugaensis ist demnach der zuvor beschriebene typische Stamm sowie alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten dieses Stammes zu verstehen. Das bedeutet, daß der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm Streptomyces kasugaensis alle diejenigen Stämme einschließt, aus denen Kasugamycin gewonnen werden kann, es sei denn, sie seien ersichtlich unterschiedlich. Beispielsweise kann ein Streptomyces, der Aureothricin, Thiolutin und Kasugamycin bildet, als ein Streptomyces kasugaensis im Sinne der vorliegenden Erfindung be-

zeichnet werden, sofern er sich nicht vollständig unterscheidet von dem Stamm Nr. M 338-M1 und den Varianten und Mutanten, die man von diesem Stamm erwartet.

Mutanten des Stammes Nr. M 338-M1 haben verstärkt intensive Gelbfärbung und lassen sich durch Monosporenselektion aus dem Stamm M 338-M1 gewinnen, und Mutanten mit einer purpurroten oder rötlichen Färbung konnten gewonnen werden, wenn jede einzelne Kolonie nach ultravioletter Bestrahlung abgetrennt wurde. Mutanten, mit denen kein Aureothricin und Thiolutin, wohl aber Kasugamycin gewonnen werden konnte, wurden aus dem Stamm M 338-M1 erhalten, mit dem seinerseits Aureothricin und Thiolutin dargestellt werden können.

In einem Beispiel, bei dem mittels eines Grundmediums aus 1,5 % Sojabohnenmehl, 0,1 % K₂HPO₄, 0,05 °/o MgSO₄-7 H₂O und 0,3% NaCl gearbeitet wurde, konnte die Gewinnung von Kasugamycin mit den nachfolgenden Kulturen aus M 338-M1 beobachtet werden: Die Mutante Nr. Ml, die dem Orinigal entspricht:

504 γ/ccm in einem Medium mit

1,0 °/₀ Glucose am 6. Tag (pH 8,0);

390 γ/ccm mit 1,0 % Glucose und

0,35% CaCO₃ am 6. Tag (pH 8,0);
488 γ/ccm mit 1,5% Maltose am 5. Tag (pH 7,2);

666y/ccm mit Maltose 1,5% und

0,35%CaCO₃ am 5. Tag (pH 7,4).

Die Mutante Nr. M 2, die dem Originalstamm ähnlich war:

126 γ/ccm Kanamycin, hergestellt in einem 1,0 % Glucose enthaltendem Medium am 5. Tag
(pH 7,4);

504 γ/ccm mit 1,5 % Glucose und

0,35% CaCO₃ am 6. Tag (pH 8,0);

702 γ/ccm mit 1,5 % Maltose am 4. Tag (pH 6,6);

576 γ/ccm mit 1,5% Maltose und

0,35 % CaCO₃ am 5. Tag (pH 7,4).

Eine gelbliche Mutante Nr. 5 wurde nach einzelner Sporenselektion erhalten:

414y/ccmin einem 1,5% Glucose enthaltendem Medium am 6. Tag (pH 8,2);

396 γ/ccm mit 1,5% Glucose und

0,35% CaCO₃ am 4. Tag (pH 6,6);

900 γ/ccm mit 1,5% Maltose am 4. Tag (pH 6,4);

702 γ/ccm mit 1,5% Maltose und

0,35% CaCO₃ am 6. Tag (pH 7,6).

Eine purpurrote Mutante Nr. Ul wurde nach Ultraviolettbestrahlung erhalten:

414y/ccm in einem Medium von 1,5% Glucose
am 6. Tag (pH 8,2);

504y/ccm mit 1,5% Glucose und

CaCO₃ am 5. Tag (pH 8,0);

630 γ/ccm mit 1,5% Maltose am 6. Tag (pH 8,0);

468 γ/ccm mit 1,5% Maltose und

CaCO₃ am 6. Tag (pH 7,8).

Eine rötliche Mutante Nr. U 2 wurde nach Ultraviolett-Bestrahlung erhalten:

324y/ccm in einem 1,5% Glusoce enthaltendem Medium am 6. Tag (pH 8,0);

558 γ/ccm mit 1,5 % Glucose und

0,35% CaCO₃ am 5. Tag (pH 6,4);

684 y/ccm mit 1,5% Maltose am 4. Tag (pH 6,4);

ίο 540 γ/ccm mit 1,5% Maltose und

0,35% CaCO₃ am 5. Tag (pH 7,4).

Aureothricin und Thiolutin werden oft gleichzeitig mit Kasugamycin gewonnen. Jedoch ändern sich die Mengen in Abhängigkeit von den Stämmen und Medien, die verwendet werden. Beispielsweise gewinnt man aus der Mutante Nr. M 5 und einigen der nach Ultraviolettbestrahlung erhaltenen Stämme Kasugamycin, jedoch keinerlei Aureothricin und Thiolutin.

Wenn S. kasugaensis unter geeigneten Bedingungen sich vermehrt, kann man Kasugamycin gewinnen. Man kann einen zum Bebrüten geeigneten Ansatz mit Kasugamycin herstellen in der Weise, daß man Sporen oder Mycelien von Kasugamycin hervorbringenden Organismen in ein geeignetes Medium gibt und dann unter aeroben Bedingungen bebrütet. Man kann für die Gewinnung von Kasugamycin feste Nährböden einsetzen, jedoch ist es für die Herstellung größerer Mengen vorteilhafter, das Kulturmedium in flüssiger Form einzusetzen. Es kann bei irgendeiner Temperatur bebrütet werden, die innerhalb des Bereiches liegt, bei dem die Kasugamycin hervorbringenden Organismen wachsen können und das Kasugamycin bilden können, dabei wird eine Temperatur von 25 bis 3 5 ⁰C bevorzugt.

Es können mit Erfolg alle solche Medien für die Gewinnung von Kasugamycin eingesetzt werden, die irgendeine Art von Nährstoffquelle für Actinomyceten enthalten. Beispielsweise kann man handelsübliche Produkte wie Pepton, Fleischextrakt, Getreideweichwasser, Baumwollsaatmehl, Erdnußmehl, Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, N-Z-Amine, Kasein, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat oder andere stickstoffhaltige Materialien, wie beispielsweise Mehltau u. dgl. als Stickstoffquelle, mit Vorteil einsetzen.

Die im Handel erhältlichen Produkte wie beispielsweise Lactose, Glyzerin, Saccharine, Stärke, Glucose, Maltose, Melasse und andere kohlehydrathaltige Stoffe oder Fette im reinen oder rohen Zustand können als Kohlenstoffquelle mit Vorteil verwendet werden. Reine oder rohe Maltose oder Stärke, die zu Maltose hydrolysiert ist, gehört zu denjenigen Kohlenstoffquellen, die für die erfindungsgemäße Gewinnung von Kasugamycin bevorzugt werden. Natriumchlorid, Natriumoder Kaliumphosphat, Calciumcarbonat oder Magnesiumsulfat können ebenfalls zugegeben werden. Es können, falls erforderlich, Spuren von Metallsalzen zugegeben werden. Demzufolge sind alle Arten von Zusätzen erlaubt, die verwendet werden können von den Kasugamycin hervorbringenden Organismen für die Produktion des Kasugamycins. Dazu gehören alle diejenigen Materialien, die bei der Züchtung von Actinomyceten, die beispielsweise in der USA.-Patentschrift 2 931 798 beschrieben, mit Vorteil eingesetzt werden.

Die Bebrütung wird fortgeführt, bis sich eine nennenswerte Menge an Kasugamycin gebildet hat. Beispielsweise wurden Sporen und Mycelien von der schräg angeordneten Kultur von Streptomyces ka-

sugaensis in ein aus 2% Glucose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,1 % K₂HPO₄, 0,05 % MgSO₄ 7 H₂O und 0,3 % NaCl bestehendes Medium eingepflanzt, dann wurde der pH-Wert auf 7,0 einreguliert, und durch Schütteln der Kultur wurden darin die aeroben Bedingungen bei 5 27 °C eingestellt. Es wurde dann in 3 bis 5 Tagen die Ansammlung von Kasugamycin beobachtet. In diesem Falle wurden Aureothricin, Thiolutin und polyene antifungicide Substanzen gleichzeitig gewonnen. Kasugamycin läßt sich schwierig aus der Gärlösung in organische Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanol, Butylacetat, Äthylacetat u. dgl., überführen, während Aureothricin, Thiolutin und Polyenantibiotika von den organischen Lösungsmitteln ausgezogen werden, insbesondere von Butanol. An Hand dieser Eigenschäften kann man Kasugamycin aus der Gärlösung von den anderen Antibiotika in der Gärlösung abtrennen.

(1) Probe von Kasugamycin

a) 100 g grüner Blätter oder Stroh von Reispflanzen wurden in kleine Stücke geschnitten, und dazu wurde 11 Wasser gegeben. Nachdem man 30 Minuten gekocht hatte, wurde durch vier Schichten Gaze filtriert, und das Filtrat wurde mit Wasser auf 11 aufgefüllt. Zu dieser Lösung wurden Saccharose und Agar zügegeben, und zwar in solchen Mengen, daß eine Konzentration von 5 bzw. 2,2% vorlag. Dann wurde 20 Minuten bei 120⁰C im Autoklav behandelt. Alsdann wurde eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5, die aus M/15-Na₂HP0₄ und M/15-HC1 (oder M/10-Zitronensäure und M/5-Natriumphosphat, gemischt in einem Verhältnis von 24,3:25,7, so daß sich ein pH-Wert von 5,0 ergab) sterilisiert. Das zuvor genannte Medium und die Pufferlösung wurden im Verhältnis von 1:1 vermischt, und von dieser Mischung wurden 10 ecm in einer Petrischale (mit einem Durchmesser von 10 cm) zum Erstarren gebracht. In dieses Medium wurden Sporen von Piricularia oryzae suspendiert. In üblicher Weise wurde auf dieses geimpfte Agarmedium zylinderförmige Gefäße aufgesetzt und mit einer Untersuchungsprobe oder einer Standardlösung gefüllt. Der pH-Wert der Probelösung wird dem des Mediums angeglichen. Es wird 48 Stunden lang bei 27 ⁰C bebrütet. Der Durchmesser der inhibierten Zone rund um jeden Zylinder wird dann gemessen. Kasugamycin-Hydrochlorid von 30y/ccm zeigte eine Inhibitionszone von etwa 30 mm Durchmesser. Wenn Aureothricin, Thiolutin oder Polyensubstanz in der Probelösung enthalten ist, wird die Untersuchung durchgeführt, nachdem diese Antibiotika durch Butanol bei einem pH-Wert von 2,0 extrahiertworden sind.

b) Pseudomonas tabaci wird auf eine schräggestellte Kultur, bestehend aus 0,2% Natriumglutamat, 0,2%

K₂HPO₄, 0,1% MgCl₂ · 7 H₂O, FeSO₄ · 7 H₂O, 2,0% Saccharose, 0,2% Hefeextrakt, 0,5 % Pepton (Polypepton) und 1,2% Agar (pH 6,8) geimpft und bei 27° C 24 Stunden lang bebrütet. Von dieser Kultur wurde ein schleifenreicher Impfling in eine 1% Glucose enthaltende Bouillon gebracht und 24 Stunden bei 27°C bebrütet. Dann wurden 5 ecm eines aus 0,5% Glusoce, 0,5 % Pepton (Polypepton) und 2,0 % Agar (pH 7,0) bestehendes Medium in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 9 cm eingebracht, und darauf wurde eine aus 5 cm des gleichen Mediums, das mit der zuvor beschriebenen Kulturmasse in einer Konzentration von 0,5 bis 1,5 % beimpft worden war, darübergeschichtet. Eine Scheibe (8 mm Durchmesser), die eine Prüfprobe enthielt, wurde auf die Platte aufgesetzt und bei 27⁰C 17 bis 18 Stunden lang bebrütet. Das Beispiel und die Standardprobe wurden mit Phosphatpuffer vom pH 7,0 verdünnt. Gewöhnlich zeigt Kasugamycin dann bei 400 γ/ccm einen Inhibitionsdurchmesser von etwa 18 mm.

(2) Eine Schüttelkultur wurde in einer Flasche mit einem Inhalt von 500 ecm, die 125 ecm eines Mediums enthielt, bei 27 bis 29° C auf einer hin- und hergehenden Schüttelmaschine (mit einer Amplitude von 8 cm bei 200 Gängen je Minute) dargestellt.

(3) Eine Behälterkultur wurde in einem 30-1-Tank aus rostfreiem Stahl angesetzt, der 15 1 eines Mediums enthielt, das mit 201 Luft je Minute belüftet wurde und worin mit 600 Umdrehungen pro Minute gerührt wurde. Wenn man einen 400-1-Behälter einsetzt, dann benötigt man 180 bis 2001 des Mediums. Man muß dann mit 2001 je Minute belüften und mit 200 Umdrehungen pro Minute rühren.

(4) Der Ansatz für die Schüttelkultur und für die Behälterkultur wurde wie folgt hergestellt: Ein schleifenreiches Impfstück von einer schräg angeordneten Kultur des Stammes Nr. M 338-M1 oder seiner Nachkulturen, wurde auf das Medium (pH 7,0), bestehend aus 1,5 % Glucose, 1,5 % Sonnenblumenmehl, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄-7 H₂O, 0,3% NaCl und 0,5 % CaCO, aufgeimpft, und dann wurde 3 Tage lang bei 27 bis 29 ⁰C unter Schütteln bebrütet. Die dabei erhaltene Brutmasse wurde für die Kulturansätze verwendet.

Gewinnung von Kasugamycin durch Fermentation

Bei einem Beispiel, bei dem zu einem Basismedium, bestehend aus 1,5% Sojabohnenmehl, 0,1% K₂HPO₄, 0,05 % MgSO₄ · 7 H₂O und 0,3 % NaCl, verschiedene Kohlenstoffquellen zugegeben und das pH auf 7,0 eingestellt war, wurden unter Verwendung einer Schüttelkultur die nachfolgenden Ergebnisse erzielt:

		Dauer der Fermentation in Tagen
1	2	3		5	6
1,5% Maltose
pH-Wert	6,6	6,8	7,0	6,6	7,0	7,0
Kasugamycin, μg/ccm	0	216	763	1037	1224	1224
Reduzierender Zucker, mg/ccm	20,0	18,5	12,0	10,2	8,6	8,4
1,5% Maltose und 0,5% CaCO3
pH-Wert	6,4	6,8	7,0	6,6	7,0	7,2
Kasugamycin μg/ccm	0	180	799	907	1044	900
Reduzierender Zucker, mg/ccm	21,2	17,0	11,9	5,8	8,4	8,3

9 10

Tabelle (Fortsetzung)

		Dauer der Fermentation in Tagen
1	2	3	4	5	6
1,5% Glucose und CaCO3 = 0,5%
_TT pH	6,0	6,2	6,4	6,2	7,0	Π Λ 7,4
υ	117	547	576	410
ID, I	15,4	6,7	2,6	6,0	A ά.
1,0% lösliche Stärke und 0,5% Glucose
pH	6,U	6,8	8,0	8,0	8,4	ο,δ
U	95	86	187	122	yu
1? OniiTiAiiATinor f 11 r* L*O r ύυ\ rr I r*r*fv\	1 J, J.	12,6	11,3	6,0	12,1
1,0% Glyzerin und 0,5% Glucose
PH	5,6	5,2	6,8	6,8	7,6	8,4
Kasugamycin, μg/ccm	0	54	112	241	130	85
Reduzierender Zucker, mg/ccm	11,4	10,0	4,2	2,5	5,1	4,6
Hydrolysierte Stärke 3,0%
pH-Wert	6,0	6,4	7,0	7,0	7,2	7,4
Kasugamycin, u.g/ccm	0	36	299	563	439	504
Reduzierender Zucker, mg/ccm	27,1	23,7	12,5	5,0	18,0	11,8

Wenn Medien, die verschiedene Stickstoifquellen aufweisen, untersucht wurden, unter Verwendung des Grundmediums, bestehend aus Maltose 1,5%, 0,3% NaCl, 0,1% K₂HPO₄, 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,0007% CuSO₄-5 H₂O, 0,0001% FeSO₄-7 H₂O, 0,0008 % MnCl₂ · 4 H₂O und 0,0002% ZnSO₄-7 H₂O (pH 7,0), wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:

Tage

Stickstoffquellen	3 pH	μg/ccm	pH	4 μg/ccm	pH	μg/ccm	pH
6
0,75% Pepton \ 0,3% Fleischextrakt J	7,8	450	8,0	324	8,0	576	7,8	324
0,75% Pepton \ 0,3% Hefeextrakt J	6,8	252	6,8	324	6,4	360	5,6	396
0,75 % Kaseinhydrolysat \ 0,3% Fleischextrakt J	8,0	342	8,2	216	8,4	270
0,75% NZ-Amin A ) 0,3% Fleischextrakt J	8,2	198	8,4	144	8,6	270
1,5% Sojabohnenmehl	6,6		6,4	396	6,6	720	6,6	396
1,5 % Sojabohnenmehl 1 0,2% (NH4)2SO4 J	7,0	414	6,8	342	7,0	864	6,6	540
1,5 % BaumwolIsaatmehI	6,0		6,0	360	6,2	360	6,4	216
1,5 % Sojabohnenmehl \ 0,3 % Fleischextrakt J	6,6	252	6,4	432	6,4	612	7,6	900

Die Ergebnisse zeigen, daß vielerlei stickstoffhaltige dies notwendig ist. Wenn beispielsweise Aureothricin Materialien bei der erfindungsgemäßen Herstellung 55 und Thiolutin vorhanden sind, so können diese von Kasugamycin brauchbar sind. Substanzen durch Extraktion mit solchen Lösungsmitteln entfernt werden. Wenn ein Polyen-Antibioti-Extraktion und Reinigung des Kasugamycins J_{curtl5 das näufig durch vie}i_e Arten von Streptomyceten

Das erfindungsgemäße Verfahren enthält die Extrak- produziert wird, vorhanden ist, so kann man dieses tion und Reinigung von Kasugamycin und dessen 60 durch Extraktion mit Butanol in saurem Medium Säureadditionsverbindungen. Kasugamycin, dessen entfernen. Aureothricin-Antibiotika und Polyen-Anti-Säurechlorid oder dessen Sulphat sind in Wasser biotika können auch durch Adsorptionsmethoden leicht löslich, und in der Gärbrühe befindet sich das unter Verwendung von aktiver Kohle oder von Kasugamycin zur Hauptmenge in der flüssigen Phase. Ionenaustauscherharzen abgetrennt werden.
Kasugamycin _ ist weitgehend unlöslich in Butanol, 65 Wenn man Kasugamycin in wäßriger Lösung bei Allylacetat, Äther, Chloroform und Benzol, und die verschiedenen pH-Werten bei 60° C 1 Stunde lang Behandlung mit diesen Lösungsmitteln kann dazu erhitzt, so behält es beim pH-Wert von 2,0 82,5% dienen, einige Verunreinigungen abzuziehen, wenn seiner Aktivität, bei einem pH-Wert von 5,0 99,0%

seiner Aktivität und bei pH-Werten von 7,0 und 9,0 100 % seiner Aktivität. Nach Aufbewahren in 0,1 n-HCI bei Zimmertemperatur über 6 Stunden trat kein Abbau ein, und nach 6stündiger Lagerung in Ο,Ιη-NaOH verblieben noch 85% der Aktivität. Demzufolge ist das beim erfindungsgemäßen Verfahren anfallende Kasugamycin so ausreichend beständig, daß es im Vakuum destilliert, versprüht, getrocknet oder sonstwie behandelt werden kann zwecks Konzentrierung, Trocknung aus der Gärlösung oder aus wäßrigen Kasugamycin enthaltenden Lösungen.

Das beim Konzentrieren und Trocknen der Gärflüssigkeit gewonnene Pulver kann zur Vorbeugung gegen den Befall von Reis mit Mehltau benutzt werden. Falls erforderlich, kann dieses Pulver mit Methanol, Äthanol, Aceton oder Butanol zwecks Entfernung von Verunreinigungen gewaschen werden. Mit Adsorbentien kann Kasugamycin ebenfalls aus der Gärlösung oder aus seiner wäßrigen Lösung abgetrennt werden. Als Adsorbens nimmt man zu diesem Zweck vorteilhaft Aktivkohle. Wenn Kasugamycin an Aktivkohle adsorbiert ist, kann man es wirksam mit Methanol, wäßrigem Äthanol, wäßrigem Aceton oder mit butanolgesättigtem Wasser eluieren, insbesondere bei saurem pH, nachdem man mit Salzsäure angesäuert hat.

Da Kasugamycin in einen sehr schwach basischen Charakter aufweist, kann man es auch an Ionenaustauscherharzen adsorbieren. IR-120, das Sulfcnsäurereste hat, adsorbiert Kasugamycin besser als ein Kationenaustauscherharz wie IRC-50, das Carboxylsäurereste aufweist, Man eluiert mit wäßriger Säurelösung oder noch wirksamer mit wäßrigem Ammoniak. Wenn man Schwefelsäureharze einsetzt, erhält man gute Elution, wenn man mit erhöhter Konzentration an Salzsäure oder Schwefelsäure, beispielsweise mit einer Konzentration von über 0,5 normal arbeitet.

Das erfindungsgemäß gewonnene Kasugamycin zeigt in wäßrigem Ammoniak bei 37°C folgende Stabilität: In 0,5n-Ammoniak wurde es bei der Zeit 0 nicht zerstört, 45 % der Aktivität lagen auch nach 4 Stunden noch vor und 15% der Aktivität nach 18 Stunden; in Ι,Οη-Ammoniak verblieben bei der Zeit 0 95%, nach 4 Stunden 25% und nach 18 Stunden 5,0%; in 2,0n-Ammoniak verblieben bei der Zeit 0 76 und 12,5% o^ach 4 Stunden; in 4,0n-Ammoniak verblieben bei der Zeit 0 55 % und nach 4 Stunden 5,0 %. Es ist daher wünschenswert, die Elution mit Ammoniak bei Temperaturen vorzunehmen, die so niedrig wie möglich liegen und ebenfalls bei den geringstmöglichen Konzentrationen von Ammoniak. Weiterhin ist es wünschenswert, den pH-Wert des Eluates so einzustellen, daß die Reaktion so schnell wie möglich neutralisiert ist, und dann im Vakuum zu konzentrieren, nachdem der pH-Wert eingestellt ist. Kasugamycin ist im Hinblick auf seine Struktur eine Art Zucker, und es kann daher an Anionenaustauscherharzen, die mit Borsäure behandelt worden sind, adsorbiert werden und kann mit wäßriger Salzsäurelösung eluiert werden. Die Anionenaustauscherharze vom OH-Typ sind Mittel, die vorzüglich geeignet sind, um die saure Lösung von Kasugamycin zu neutralisieren. Der KationenexponentPK des Kasugamycins beträgt 6,6 bis 7,1, d. h. Kasugamycin ist eine schwache Base. Adsorption von Kasugamycin an Kationenaustauscherharzen wird verringert oder inhibiert durch starke basische Verunreinigungen. Daher läßt sich Kationenaustauscherharz auch mit Vorteil einsetzen, und zwar zur Entfernung von stark basischen Verunreinigungen,

wenn dies erforderlich ist. Ein Material, das Kasugamycin und stark basische Verunreinigungen enthält, wird dazu durch eine eine ausreichende Menge von IRC-50 als Na- oder H-Typ enthaltende Kolonne geleitet, und dabei werden die stark basischen Verunreinigungen entfernt; danach wird das Kasugamycin an IRC-120-Harz adsorbiert, und aus diesem wird es eluiert.

Danach zentrifugiert, filtriert man oder benutzt ίο sonstige übliche Methoden, um die MyceHummasse von der fermentierten Brühe abzutrennen. Die Abtrennung des Myceliums wird leichter, wenn die fermentierte Brühe auf einen sauren pH-Wert eingestellt und aktive Kohle hinzugegeben wird. Die fermentierte Brühe wird zunächst von den Feststoffen befreit, zu denen auch das Mycelium gehört, und dann kann man es durch eine Ionenaustauscherharzkolonne durchschicken. Man kann auch als erstes durch ein Sieb hindurchfiltrieren, das fein genug ist, um das Harz zu tragen; und dann kann man dieses feine Mycelien enthaltende Filtrat einem Ionenaustauschertunn aufgeben.

Die Fermentierungsbrühe wird auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt, dann wird die aktive Kohle in einer Menge bis zu 0,5 % Endkonzentration hinzugegeben. Nachdem man genügend gerührt und filtriert hat, wird das Filtrat auf einen pH-Wert von 5,5 bis 6,5 eingestellt. Dieses Harz wird auf eine Säule mit einer solchen Menge an Austauscherharz IRC-50 vom H-Typ aufgegeben, daß sie nicht zur Adsorbierung von Kasugamycin ausreicht. Der pH-Wert der durchlaufenden Lösung wird auf 4,0 eingestellt, und dann wird die Lösung auf eine Kolonne aufgegeben, die IR-120-Harz (Η-Typ oder Ammoniak-Typ, die dem Na-Typ vorgezogen werden), und an dieser Säule wird das Kasugamycin adsorbiert. Danach wird mit wäßrigem Ammoniak eluiert, und das Eluat wird neutralisiert. Dabei sollte die Elution möglichst bei Temperaturen von weniger als 15° C vorgenommen werden, und das Eluat sollte 5 Stunden nach der Elution neutralisiert werden. Das Eluat wird zur Trockene verdampft oder durch Gefriertrocknung konzentriert, und man erhält das Kasugamycin als Rohpulver. Bei einer anderen Art des erfindungsgemäßen Verfahrens fügt man Aktivkohle zu dem Gärbrühefiltrat hinzu. Das adsorbierte Kasugamycin wird mit wäßrigem, Salzsäure enthaltendem Methanol eluiert, und das Eluat wird konzentriert und getrocknet. Das so erhaltene Rohpulver kann weiterhin durch IR-120-Austauscherharz gereinigt werden, wie dies zuvor beschrieben wurde.

Bei einer anderen Verfahrensvariante wird das rohe Pulver in Wasser gelöst und durch eine Kolonne mit aktiver Kohle hindurchgeleitet. Nach dem Waschen wird mit Salzsäure (beispielsweise mit 0,05 n-Salzsäure) eluiert, und die aktive Fraktion wird durch Anionenaustauscherharze neutralisiert. Nachdem man im Vakuum konzentriert hat, wird das 10- bis 25fache Volumen an Äthanol zugegeben. Danach wird bei niedrigen Temperaturen stehengelassen, und dabei erscheinen dann Kristalle von Kasugamycin-Hydrochlorid. Dieses zuvor beschriebene Verfahren ist eines der bevorzugten Verfahren zur Extraktion und Reinigung von Kasugamycin.

Wie üblich bei der Gewinnung von verschiedenen Antibiotika können die Kristalle auch ohne den Zwischenschritt der KohlenstofFchromatographie gewonnen werden, wenn die Konzentration des Kasu-

gamycins in der Brühe ausreichend erhöht ist. So erhält man z. B., wenn man das Eluat aus dem IR-120-Harz im Vakuum eindampft, kristallines Kasugaymcin-Hydrochlorid, wenn die Fermentationsbrühe mehr als 500 jAg/ccm an Kasugamycin enthält. Wenn man an Stelle von Salzsäure Schwefelsäure einsetzt, so kann man Kasugamycin-Sulfat erhalten. Wie weiter unten noch in den Beispielen näher dargelegt wird, geht man bei einer der bevorzugten Arbeitsweisen zur Gewinnung von Kasugamycin in der Weise vor, daß man das Kasugamycin an einem Kationenaustauscherharz direkt aus dem Filtrat der Fermentationsbrühe adsorbieren läßt und dann eluiert.

Infolge der schwach basischen Natur des Kasugamycin kann man es aus wäßrigen Lösungen mit Säuren und wasserunlöslichen Substanzen wie beispielsweise Pentachlorphenol, Laurylsulfonsäure usw. entfernen.

Es seien nun die Eigenschaften von Kasugamycin näher beschrieben. Kasugamycin ist farblos und seine Salzsäureadditionsverbindung erhält man in Form von weißen Kristallen. Die Salzsäureverbindung zersetzt sich bei 202 bis 204° C Die Salzsäureverbindung ist leicht löslich in Wasser, fast unlöslich in Methanol und unlöslich in Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Chloroform und Benzol. Die maximale Löslichkeit des Hydrochlorids in Wasser beträgt etwa 1 g/80 ecm. Im Ultraviolettlicht innerhalb des Bereiches von 220 bis 400 ηιμ findet keine maximale Adsorption statt. Das IR-Spektrum ist in F i g. 1 dargestellt. Die spezifische optische Drehung beträgt +120° (1,6% in Wasser). Die Substanz ist schwach basisch und hat einen Kationenexponenten PK_a' von 7,1. Das Molekulargewicht wurde osmotisch auf 449 und durch Titration auf 453 ermittelt. Die Elementaranalyse und die Bestimmung des Kristallwassers ergeben die folgende Formel für das Hydrochlorid:

C ₁₅H ₂₇O ₁₀N₃-HCl-H ₂O:
Berechnet

C 38,84, H 6,52, N 9,06, O 37,94, Cl 7,64;
gefunden

C 38,58, H 6,94, N 9,66, O 37,05, Cl 8,16,
38,34, 6,62, 9,04, 37,54, 8,39.

Die Elementaranalyse des Hydrobromids war folgende :

Ci ₅H ₂₇O ₁₀N₃-HBr-H ₂O:
Berechnet

C 35,44, H 5,95, N 8,27, O 34,62, Br 15,72;
gefunden

C 35,27, H 6,00, N 8,48, O 33,31, Br 16,94.

Das kernmagnetische Resonanzspektrum des Hydrochloride in D ₂O-Losung mit Natriumsalz der 3-(Trimethylsilyl)-propansulfonsäure als Standardprobe und aufgenommen mit einem Varian-60-Instrument ist in Fig. 2 veranschaulicht. Man erkennt Linien an den folgenden Stellen ppm: 1,22, 1,32, 2,25, 2,33, 2,42, 2,50, 3,55, 3,79, 4,05, 4,38, 4,50, 4,70, 5,32, 5,35. Die Ninhydrinreaktionen unter Verwendung von Pyridin und Perjodatpermanganat sind positiv, dagegen sind die Reaktionen von Seliwanoff, Sakaguchi, Ferrichlorid und Fehlingsche Lösung negativ. Die Anthron-

und Elson-Morgan-Reaktionen, ausgeführt unter üblichen Bedingungen, verlaufen negativ. Bei der Anthron-Reaktion tritt nach Behandlung mit salpetriger Säure eine rotbraune Färbung auf. Elektrophorese unter hoher Spannung mit

HCOOH — CH₃COOH — H₂O

(25 : 75 : 900) bei einem pH-Wert von 1,8, 3000 V/

ίο 40 cm, 15 bis 20mA/10cm und IO⁰C 15 Minuten lang ergibt eine Verschiebung zur Anode hin von 3,7 cm. Der Rf-Wert auf einem Perchromatogramm unter Verwendung von Toyo-Filterpapier Nr. 519 und Butanol—Essigsäure—Wasser (2:1:1) liegt bei 0,28, der Rf-Wert in gleicher Weise bestimmt, jedoch unter Verwendung von Butanol—Äthanol—-Wasser und Ammoniak (4:1: 4,9 : 0,1) liegt bei 0,07, der Rf-Wert von der Substanz, die unter Verwendung von Butanol—Essigsäure—Wasser (6,3:1:2,7) erhalten wurde, beträgt 0,06.

Auf einem Agarmedium aus Pepton und Fleischextrakt, inhibierte Kasugamycin-Corynebacteriumxerosis bei 50μg/ccm, Sarcina lutea (X-Stamm) bei 100 ^g/ccm, einen Stamm von Klebsiella pneumoniae bei 50 μg/ccm, Proteus vulgaris (OX19) bei 100 μg/ccm, Pseudomonas aeriginos bei 10Ö μg/ccm, verschiedene Stämme von Ruhrbakterien bei 100 μg/ccm und Brucella melitensis bei 6,25 μg/ccm, während 100 μ§/εεηι keine sonstigen Arten von Bakterien, die geprüft wurden, inhibierten. Auf einem synthetischen Medium von Stephenson —Whetham wurde eine höhere antibakterielle Aktivität gewonnen als auf einem Pepton-Fleischextrakt-Medium. In Peptonlösung wurden von 6,25 bis 25,0μg/ccm an Kasugamycin zwanzig klinische Isolierungen an Pseudomonas inhibiert, während 25,0 bis 50,0 μg/ccm zwölf Isolierungen inhibierten. Die Zugabe von Serum verschlechterte die Antibakterielle Aktivität nicht, verstärkte jedoch die Aktivität gegen S. typhi, S. paratyphi, K. pneumoniae, Shigella. In 10%ig^er Serumbrühe wurden S. flexneri und Kl. pneumoniae bei Konzentrationen von 6,25 μg/ccm inhibiert. Auf Blutagar wurde Pneumococci bei 50 bis 100 μg/ccm inhibiert.

Die Toxität ist sehr niedrig. Die Verträglichkeit bei Mäusen bei intravenöser, subkutaner oder intraperitonealer Injektion von 1000 mg/kg blieb ohne jede Nebenwirkung. Affen vertrugen 800 mg/kg bei intravenöser Injektion. Tägliche Gaben von 2 g, die injiziert wurden, zeigten keinerlei Nebenwirkung bei Menschen. Wenn oral genommen, so wurden durch eine Gabe von 3 g täglich keine Zeichen von Toxidität bei Menschen beobachtet. Es erfolgt keine Reizung. Die toxische Wirkung auf Fische ist ebenfalls niedrig.

Killifish überlebte in 100 μg/ccm Kasugamycin enthaltendem Wasser. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Kasugamycin dient als chemotherapeutisches Mittel gegen Bakterieninfektionen, einschließlich Pseudomonas. Die hohe Schutzwirkung gegen Reismehltau wird erreicht, ohne daß die Substanz auf die Pflanzen toxisch wirkt. Obgleich das beim erfindungsgemäßen Verfahren anfallende Kasugamycin bei 100μg/ccm in Sabouraudmedium nicht gegen Piricularia oryzae wirksam ist, inhibiert es dessen Entwicklungjedoch bei 0,1 bis 1 μg/ccm in auf saurem pH-Wert eingestelltem Reissaftmedium. Es ist auch bei Topftesten wirksam. Die Topfteste werden wie folgt ausgeführt: Die Blätter werden mit Reismehltau

infiziert und in steriles Wasser eingebracht, wobei sich eine Sporensuspension von Piricularia oryzae bildet. Nach ausreichendem Schütteln wird diese Suspension über die Blätter junger Reispflanzen gesprüht, die aus direkter Aussaat von Reiskornmasse auf »Moko-Filter« (Moko strain) in dem Topf gewachsen waren, nachdem zwei bis drei Blätter sich an jeder Pflanze gebildet hatten. Nach dem Besprühen wurde der Topf 20 bis 24 Stunden lang in dem feuchtigkeitshaltigen Treibhaus stehengelassen, und dann wurden die Testproben versprüht. Anschließend wurde wieder 7 Tage lang in dem Treibhaus stehengelassen, und dann wurden die Stellen mit Krankheitsbefall auf zehn Blättern in drei verschiedenen Töpfen gezählt. Bei einem Versuch wurde gefunden, daß durch Besprühen mit Kasugamycin in einer Konzentration von 5 μg/ccm die Anzahl der Krankheitsstellen je zehn Blättern auf 8 und in einer Konzentration von 20 fxg/ccm auf 0,3 und in einer Konzentration von 40 μg/ccm auf 0 verringert wurde, während die Kontrollprobe, die nicht mit Kasugamycin besprüht war, 176 Stellen mit Krankheitsbefall zeigte, die auch noch in der Weiterentwicklung begriffen waren. Dieser Besserungseffekt war weitaus höher als derjenige von Blasticidin S. lCK^g/ccm Kasugamycin zeigten keinerlei Toxität gegenüber den Reispflanzen. Wenn man das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Kasugamycin zum Schutz gegen Reismehltau einsetzen will, so ist es nicht erforderlich, es bis zu einem Reinheitsgrad zu reinigen. Es kann vielmehr bereits die Nährflüssigkeit des erfindungsgemäß zur Herstellung des Kasugamycins eingesetzten Organismus als solche oder aber in Form eines getrockneten Pulvers verwendet werden.

Blasticidin S. ist bekannt als ein wirksames Antibiotikum gegen Reismehltau, das von Organismen produziert wird, die zu den Actinomyceten gehören, und Blasticidin S läßt sich leicht von Kasugamycin unterscheiden an Hand der physicochemischen Eigenschaften, der antimikrobialen Wirkungen und der Toxidität. Blasticidin S wirkt stark toxisch gegen Tiere und Menschen und ist bei einer Konzentration von mehr als 20 μg/ccm auch toxisch gegenüber Pflanzen. Kasugamycin, das man auf Grund seiner physicochemischen Eigenschaften als einen Aminozucker ansehen kann, läßt sich von Trehalosamin auf Grund der Molekularformel, auf Grund der antimikrobialen Aktivität und an Hand der papierchromatographischen Analyse unterscheiden, und es läßt sich ebenfalls leicht unterscheiden von Hygromycin B und B₂ an Hand des optischen Drehvermögens, der antimikrobialen Aktivität und sonstiger Kennzeichen. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Kasugamycin zeigt ein spezielles antimikrobiales Spektrum unter Spezialbedingungen, und es gibt keine ähnliche Kornponente unter den bekannten Antibiotika. Durch Säurehydrolyse erhält man aus Kasugamycin (+^Inositol. Es ist dies die erstmalige Isolierung von (+)-Inositol aus mikrobialen Produkten.

Nachfolgend ist das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise veranschaulicht, ohne daß jedoch die Erfindung darauf beschränkt sein soll. Da die Kennwerte des Kasugamycins inzwischen klar erkannt wurden, ist es leicht, verschiedene Modifikationen der vorliegenden Erfindung durchzuführen. Wie vorstehend ausgeführt, enthält das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung des Kasugamycins und schließt weiterhin die mittels bekannter Methoden durch-

geführte Konzentrierung, Extraktion und Reinigung des Kasugamycins ein.

Beispiel 1

Ein 1,5% Glucose, 1,2% Sojabohnenmehl, 0,1% K₂HPO, 0,05% MgSO₄ ·7Η₂0, 0,3% NaCl, 0,5 % CaCO₃ und Silikonharz (40 ecm) enthaltendes Medium (1801) wurde in jeden der 400 1 großen Edelstahlgärbehälter eingefüllt. Nach dem Sterilisieren wurde der pH-Wert auf 6,6 eingestellt. Ein weiterer Behälter mit 900 ecm Sojabohnenöl wurde innen in die Gärvorrichtung eingesetzt, und nach 30stündiger Bebrütung wurden zusätzlich 500 ml Sojabohnenöl zugegeben. Einer Anbaukultur des Stammes M 338-M1 wurde in dem gleichen Medium 48 Stunden lang bei 27 bis 29° C unter Schütteln gezüchtet, worauf die Gärlösung mit 11 der auf diese Weise erhaltenen Kulturbrühe beimpft wurde.Es wurden folgende Kulturbedingungen verwendet: Es wurde mit 200 Umdr./Min. gerührt, und 1801 Luft je Minute durchgeleitet. Die Bebrütungstemperatur betrug 27° C Die pH-Werte nach 24stündiger Bebrütung und jeweils weiteren 6 Stunden bis zu 90 Stunden waren folgende: 6,2, 5,4, 5,1, 5,2, 5,3, 5,8, 5,8, 5,9, 6,0, 5,7, 6,6 und 6,6. Nach 92stündiger Gärung wurde die Kulturfiüssigkeit abgezogen. Das in dieser Kulturflüssigkeit vorhandene Kasugamycin zeigte eine inhibierende Wirkung von 30 mm Durchmesser bei einem Versuch nach Methode (a), und die 128mal verdünnte Lösung war gegen Reismehltau in dem Topftest wirksam. Die Nährbrühe wurde scharf zentrifugiert, und dabei wurde das Mycelium von 3101 Filtrat abgetrennt. Der pH-Wert des Filtrates wurde auf 7,0 eingestellt, und dann wurden 12,5 kg Aktivkohle zugegeben. Es wurde gerührt, und danach wurde die Kohle durch Filtertuch und Filterpapier abfiltriert. Das Filtrat zeigte nur 5 bis 10% der Wirkung des Kulturfiltrates. Zu dem kohlehaltigen Filterkuchen wurden 37,51 Lösungsmittel, das aus Butanol und Wasser (1:2) bestand, hinzugegeben, und es wurde bei 45° C und einem mit Salzsäure auf 2,0 eingestellten pH-Wert eluiert. Diese Arbeitsweise wurde dreimal wiederholt. Die Eluate wurden vereinigt. Das Gesamteluat (112,5 1) wurde stehengelassen und die 901 ausmachende Wasserschicht wurde im Vakuum auf 3,58 1 konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde der Gefriertrocknung unterworfen, wobei 1,253 g eines braunen Pulvers mit einer l,8%igen Reinheit an Kasugamycin anfielen.

Beispiel 2

Es wurden 1801 des wie im Beispiel 1 beschriebenen Mediums mit 18 ecm eines Silikonharzes versehen und in einen 4001 fassenden Gärbehälter eingefüllt. Der pH-Wert wurde mit 1 n-NaOH auf 7,0 eingestellt und danach wurde 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Zu diesem Medium wurden 1500 ecm einer 3 Tage lang geschüttelten Kulturbrühe des Stammes Nr. M338-M1 zugegeben. Der mit 900 ecm Sojabohnenöl gefüllte Behälter wurde innen in die Gärvorrichtung eingesetzt, um ein Schäumen zu verhindern. Es wurden zusätzlich200 ecm Sojabohnenöl nach 21stündiger Bebrütung und 300 ecm nach 22stündiger Bebrütung zugegeben. Es wurde mit 200 Umdr./Min. gerührt und während der Gärperiode wurde mit 1501 Luft je Minute belüftet. Die Temperatur wurde bei 27 bis 28 ⁰C gehalten. Nach 12 Stunden, 24 Stunden und den jeweils folgenden 6 Stunden bis zu 92 Stunden wurden der

pH-Wert, der Gesamtzuckergehalt und die Menge an Kasugamycin bestimmt. Die Ergebnisse sind nachfolgend aufgezeichnet. Bei diesem Gärprozeß wurden gleichzeitig Aureothricin (oder Thiolutin) gebildet.

Fermen tation Stunden	pH	Gesamt zucker mg/ccm	Kasug amycin y/ccm	Aureothricin y/ccm
O	6,2 bis 6,4	23,0	0	0
12	6,4	22,7	0	0
24	6,4	19,1	0	0
30	6,4	17,8	0	0
36	6,4	15,7	57,6	8
42	5,8	12,4	144	18
48	5,4	8,94	198	26
54	5,6 bis 5,8	7,04	252	36
60	6,2	6,56	432	15
66	6,2 bis 6,4	5,39
72	6,4	5,28	396	14
78	6,2 bis 6,4	5,23	504	11
90	6,4	5,61	450	18
92	6,8	5,61	518	24

Die so erhaltene Gärlösung (die 518 μg/ccm an Kasugamycin, insgesamt 82,994 g enthielt), wurde mit 1 n-HCl auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt, und dann wurden 0,5% Aktivkolhe zugegeben. Die Mischung wurde mit 15 000 Umdr./Min. scharf zentrifugiert, und es wurden 1601 an Filtrat (460μg/ccm, insgesamt 73,728 g Kasugamycin) erhalten. Das Filtrat wurde mit 1 n-NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, und dann wurden 3,2 kg Aktivkohle (2,0 %) zwecks Adsorbierung des Kasugamycins zugegeben. Alsdann wurde erneut scharf zentrifugiert und der kohlenhaltige Kuchen gesammelt. Die Flüssigkeitsanteile enthielten Kasugamycin in einer Konzentration von 17,12 μg/ccm, und die Aktivität belief sich auf 29,1% derjenigen der Originalgärfiüssigkeit. Zu dem kohlenstoffhaltigen Kuchen wurden 22,51 90%iges Methanol zugegeben, und dann wurde der pH-Wert mit 1 n-HCl auf 2,0 eingestellt. Alsdann wurde bei 40 °C eluiert, es wurde weiteres 80%iges Methanol zugegeben und zum zweiten Mal eluiert, und dabei fielen dann 45,211 an Eluat an. Dieses Eluat enthielt 851,8 μg/ccm an Kasugamycin (insgesamt 38,501 g), und die Ausbeute aus der Original-Gärflüssigkeit betrug 46,41 %. Der pH-Wert des Eluates wurde auf 4,0 bis 5,0 eingestellt, und das Methanol wurde im Vakuum entfernt. Die so erhaltene wäßrige Lösung wurde der Gefriertrocknung unterworfen, und das resultierende blaßgelbliche Pulver hatte eine Wirksamkeit von 54μg/mg (insgesamt 36,504 g, als Kasugamycin berechnet). Die Ausbeute an Pulver, bezogen auf die Original-Gärfiüssigkeit, betrug 44,0%, und die Reinheit des Pulvers wurde zu 5,4% berechnet.

Beispiel 3

150 g des rohen Pulvers (1,8 % Reinheit), wie es aus Beispiel 1 erhalten worden war, wurden in 21 destilliertem Wasser gelöst, und auf eine 100 cm lange und 5 cm im Durchmesser Kolonne, die mit für chromatographische Verwendung bestimmter Kohle gefüllt war, aufgegeben. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 3 ccm/Min., und es wurde bei Zimmertemperatur gearbeitet. Die durchgelaufene Flüssigkeit zeigte keine Anwesenheit von Kasugamycin. Die mit Kohle ge-

füllte Kolonne wurde mit 41 destilliertem Wasser gewaschen, und eine 0,05 n-HCl-Lösung wurde durchlaufen gelassen. Die erste Fraktion von 1600 ecm hatte einen pH-Wert von 5,6 und enthielt kein Kasugamycin. Die nächste 3000 ecm starke Fraktion hatte einen pH-Wert von 1,0, und die folgende 200 ecm starke Fraktion hatte einen pH-Wert von 1,0. Diese beiden Fraktionen enthielten Kasugamycin. Diese aktiven Fraktionen wurden mit Ionenaustauscherharz neutralisiert und im Vakuum auf 10 ecm konzentriert. Dazu wurden 200 ecm Äthanol zugegeben, und es wurde über Nacht bei 4° C stehengelassen. Dabei fiel ein leicht gelblichgefärbter weißer Niederschlag aus. Nach Abfiltrieren und Trocknen des Niederschlages wurden 10,84 g eines weißen Pulvers erhalten. Die Reinheit dieses Pulvers betrug 24,4%. Die Ausbeute wurde auf 97,8% berechnet.

Beispiel 4

Ein in gleicher Weise wie im Beispiel 3 beschrieben erhaltenes Pulver hatte eine Reinheit von 36 %· 1*15 g dieses Pulvers wurden in 150 ecm destilliertem Wasser gelöst, und der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt.

Die Lösung wurde auf eine mit Kohlenstoff gefüllte Kolonne von 29 cm Länge und 3 cm Durchmesser aufgegeben. Es wurde bei Raumtemperatur gearbeitet, und die Durchflußgeschwindigkeit betrug 1 ccm/Min. Die Kolonne wurde mit 350 ecm destilliertem Wasser gewaschen, dann wurden 0,02 n-HCl durchlaufen gelassen, und die durchlaufende Flüssigkeit wurde jeweils in 10-ccm-Fraktionen aufgeteilt. Die erste Fraktion von 520 ecm wies einen pH-Wert von 5,6 auf und enthielt kein Kasugamycin. Die nächsten beiden Fraktionen von 20 ecm hatten einen pH-Wert von 4,0 und enthielten kein Kasugamycin. Die folgende 10-ccm-Fraktion wies einen pH-Wert von 2,0 auf und enthielt Kasugamycin, jedoch zeigte sich bei der Papierchromatographie, daß noch andere ninhydrinpositive Substanzen darin enthalten waren. Die folgenden 130 ecm hatten einen pH-Wert unter 1,0 und enthielten Kasugamycin, jedoch enthielten auch sie andere ninhydrinpositive Substanzen. Die folgenden 430 ecm zeigten einen pH-Wert unter 1,0 und enthielten Kasugamycin ohne sonstige ninhydrinpositive Substanzen. Diese letzte Fraktion wurde mittels Ionenaustauscherharz neutralisiert und im Vakuum auf ein Volumen _ von 5 ecm konzentriert. Dann wurden 100 ecm Äthanol zu diesem Konzentrat zugegeben, und man erhielt 301 mg eines weißen Pulvers mit einer 92%igen Reinheit (was einer Ausbeute von 66,8% entspricht). Dieses Pulver wurde aus Wasser umkristallisiert, und es resultierten 120 mg Kasugamycin-Hydrochlorid in Kristallform.

Beispiel 5

Das aus 1,5% Maltose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ · 7H₂0, 0,3% NaCl bestehende Medium (pH 7,0) wurde mit dem Stamm M338-M1 angeimpft und in Schüttelkultur bebrütet. Die 3450 ecm der Lösung, die das Kasugamycin enthielt, wurde mit 1 n-HCl auf einen pH-Wert von 2,0 einreguliert, und es wurden Hyflosuper-Zellmaterial (1%) ^un(i Aktivkohle (0,5%) zugegeben und dann filtriert. Bei diesem Verfahren zeigte sich, daß Kasugamycin praktisch nicht adsorbiert wurde. Das Filtrat wurde auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,4 eingestellt,

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und dann wurde Aktivkohle in einer Menge von 2% zugegeben, um das Kasugamycin zu adsorbieren. Der das adsorbierte Kasugamycin enthaltende kohlenstoffhaltige Kuchen wurde gesammelt. In diesem Falle enthielt das Filtrat noch etwa 10 bis 23 % Kasugamycin. Es wurden dann 690 ecm 80%iges Methanol zu dem kohlenstoffhaltigen Kuchen zugegeben, und der pH-Wert wurde mit 1 n-HCl auf 2,0 eingestellt. Alsdann wurde bei 45⁰C eluiert. Danach wurden weitere 350 ecm 80%igen Methanols zugegeben und das Eluieren wiederholt. Die beiden Eluate wurden vereinigt, und die Ausbeute an Kasugamycin in diesem Gesamteluat wurde auf 62% berechnet. Das methanolische Eluat wurde mit 1 n-NsOH auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und dann im Vakuum zu einem Sirup konzentriert. Zu dem Konzentrat wurde Äthanol zugegeben, bis keine weitere Ausfällung mehr auftrat. Der Niederschlag enthielt Kasugamycin, und die überstehende Flüssigkeit enthielt nur noch 5 bis 10 %· Der Niederschlag wurde gesammelt, und man erhielt ein gelblichweißes Pulver von Kasugamycin, das eine Reinheit von 5,3 % hatte. Die Ausbeute, bezogen auf die Original-Gärfiüssigkeit, betrug 45 %·

Beispiel 6 ^a5

5 g eines Pulvers mit einer Reinheit von 1,8 %, wie es gemäß Beispiel 1 gewonnen wurde, wurden in 500 ecm Wasser gelöst und auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt. Diese Lösung wurde auf eine mit 100 ecm Austauscherharz (H-Typ) gefüllte Kolonne aufgegeben, und die Durchflußgeschwindigkeit wurde auf 1 ccm/Min. eingestellt. Nach dem Auswaschen der Kolonne mit 11 destillierten Wassers wurden 0,5 n-NH₄OH mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ecm/ Min. hindurchgeleitet. Die durchgelaufene Lösung von 100 ecm wurde mit 1 n-HCl neutralisiert und dann einer Gefriertrocknung unterzogen, wobei 1,6 g eines hellgelben Pulvers mit einer Reinheit von 9 % anfielen. Es wurde berechnet, daß die Ausbeute 88,9% betrug.

Beispiel7

Ein vom Stamme M338-M1 durch Monosporenkultur erhaltener Stamm wurde in einem wie im Beispiel 1 beschriebenen Medium 72 Stunden lang einer Schüttelgärung unterzogen, und dann wurde 11 der Gärflüssigkeit zu 1001 eines Mediums hinzugegeben, das 1,5% Sojabohnenmehl, 1,5% Maltose, 0,3% NaCl, 0,1% MgSO₄ · 7H₂0, 0,0007% CuSO₄ · 5H₂0, 0,0008% MnCI₂ ·4Η₂0, 0,0001% FeSO₄ · 7H₂0, 0,0002% ZnSO₄ · 7H₂0 enthielt und einen pH-Wert von 7,4 hatte in einen 2001 großen Gärbehälter eingefüllt, und die Gärung wurde unter Belüftung mit 1001 Luft je Minute und unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 200 Umdr./Min. bei 28 ⁰C durchgeführt. Nach 48 Stunden wurde diese Lösung zu 14001 des gleichen Mediums, das sich in einem 20001 großen Gärbehälter befand, eingebracht, und die Gärung wurde fortgeführt. Nach weiteren 48 Stunden betrug der pH-Wert 6,9, und es waren 160 μg/ccm an Kasugamycin hergestellt, und nach 90 Stunden betrug der pH-Wert 7,2, und das gewonnene Kasugamycin betrug 530 μg/ccm. Diese Gärlösung enthielt 8,4 μg/ ecm an Aureothricin. Die Bebrütung wurde abgebrochen, und die Gärflüssigkeit wurde über Diatomeenerde filtriert. Einschließlich des zum Auswachsen des Filters benötigten Wassers wurden insgesamt 15701

an Filtrat erhalten. 3001 Austauscherharz wurden in die H-Form übergeführt, und es wurde Ammoniak in einer solchen Menge zugegeben, daß ein Viertel des Harzes in die Ammoniumform gebracht wurde, und dann wurde weiter mit Wasser gewaschen. Das Filtrat aus der Gärlösung wurde durch eine dieses zuvor beschriebene Harz enthaltende Kolonne durchlaufen gelassen. Die ersten 6101 des Auslaufes enthielten kein Kasugamycin, die weiteren 9501 des Durchlaufes enthielten 65,2 g Kasugamycin, diese Fraktion wurde über eine andere mit Austauscherharz gefüllte Säule geleitet. Dann wurde das Austauscherharz auf der ersten Säule unter Verwendung von 0,5 Ii-NH₄OH eluiert. Der erste Durchlauf von 53 1 enthielt 28,5 g an Kasugamycin. Der zweite Durchlauf von 2001 enthielt 780 g an Kasugamycin. Der dritte Durchlauf von 2001 enthielt 44,2 g an Kasugamycin. Das durchgelaufene Eluat wurde mit HCl auf einen pH-Wert von 6,6 neutralisiert. Das zweite Eluat wurde im Vakuum auf 6,321 konzentriert, und dazu wurden 601 Äthanol zugegeben. Man erhielt dann 580 g an Rohkristallen von Kasugamycin-Hydrochlorid (90% Reinheit).

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene neue antibiotische Substanz Kasugamycin ist also wirksam zum Inhibieren von Brucella, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, einigen Klebsiella- und Blastmyceten-Arten, sie dient zum Schutze von Reispflanzen gegen progressive Infektion von Piricularis oryzae. Es handelt sich um eine in Wasser lösliche, in Methanol wenig lösliehe, in Äthanol, Butanol, Estern, Chloroform und Benzol praktisch unlösliche Substanz, die kein Absorptionsspektrum im ultravioletten Licht von 220 bis 350 τημ. zeigt, die eine positive Ninhydrinreaktion gibt, dagegen negativ reagiert bei der Tollens-, Skaguchi-, Anthron- und Elson-Morgan-Reaktion. Die Substanz enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff, sie enthält freie primäre Aminogruppen, die schwach basisch reagieren und einen Kationenwert PK_a' von 7,1 ergeben, und die mit Säuren Additionssalze zu bilden vermögen. Das kristalline Kasu·* gamycin-Hydrochlorid hat die empirische Formel

C₁₅H₂₇O₁₀N₃ · HCl · H₂O

und weist eine spezifische Drehung von [x]²i = +120* (1,6% in H₂O) auf. Sie schmilzt bei 202 bis 204° C unter Zersetzung und zeigt ein Absorptionsspektrum im infraroten Spektralbereich, wenn sie in Kaliumbromid pelletisiert ist, mit folgenden Wellenzahlen, angegeben in cm-¹: 3520, 3350, 3200, 3070, 2950,2050, 1695, 1670, 1625, 1522, 1462, 1379, 1323, 1286, 1224, 1180, 1135, 1120, 1090, 1080, 1060, 1042, 1025, 975, 945, 908, 890, 870, 846, 825, 783 und 709. Das Kernresonanzspektrum in D₂O zeigt Linien bei den folgenden ppm: 1,22, 1,32, 2,25, 2,33, 2,42, 2,50, 3,55, 3,79, 4,05, 4,38, 4,50, 4,70, 5,32 und 5,35. Die Substanz zeigt ein Titrationsäquivalent von etwa 453, und bei der sauren Hydrolyse fällt (+)-Inositol an, während bei der Hydrolyse mit Baryt

Cl₄H₂₀O₁₀N₂ · H₂O

anfällt, das weiter hydrolysiert zu

C₁₂H₂₈O₇N₂

und Oxalsäure. Das Kasugamycin-Hydrobromid weist die empirische Formel

C₁₅H₂₇O₁₀N₃· - H 35 BHO

Claims (1)

1. auf. Das Kasugamycin-Sulfat ist in Wasser löslich. Es zersetzt sich bei 210 bis 218 ⁰C

   Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des neuen Antibiotikums Kasugamycin, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces kasugaensis (ATCC 15 714, ATCC 15 715) in

   einer üblichen Nährlösung unter submersen Bedingungen züchtet und das Antibiotikum aus der Nährlösung durch an sich bekannte Methoden gewinnt.

   In Betracht gezogene Druckschriften:
   Korzybski und Kurylowicz »Antibiotika«, 1961, S. 452 bis 460.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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