DE1196666B - Verfahren zur Herstellung neuer adrenocorticotrop wirksamer Tetracosapeptide - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

Nummer: Aktenzeichen: Anmeldetag: Auslegetag:

C07c

Deutsche Kl.: 12 q-6/01

1196 666 C26884IVb/12q 2. Mai 1962 15. Juli 1965

Verfahren zur Herstellung neuer adrenocorticotrop wirksamer Tetracosapeptide

Anmelder:

CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz) Vertreter:

Dr.-Ing. Dr. jur. F. Redies, Dr. rer. nat. B. Redies und Dr. rer. nat. D. Türk, Patentanwälte, Opladen, Rennbaumstr. 27

Als Erfinder benannt:

Dr. Heini Kappeier, Birsfelden; Dr. Robert Schwyzer, Riehen (Schweiz)

Beanspruchte Priorität: Schweiz vom 4. Mai 1961 (5242), vom 24. November 1961 (13 753)

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des Tetracosapeptids der Formel L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argi-5 nyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin sowie der entsprechenden Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweist, und ihrer Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe, z. B. derjenigen des Zinks. io

Die neuen Verbindungen haben eine hohe adrenocorticotrope Wirksamkeit und sollen in der Human- und Veterinärmedizin als reine, einheitliche Stoffe an Stelle von /S-Corticotropin verwendet werden. Die Verbindungen können ferner als Zwischenprodukte 15 zur Herstellung von Heilmitteln, die eine längere Kette von Aminosäuren aufweisen, wie der adrenocorticotropen Hormone selbst, verwendet werden.

Die neuen Tetrakosapeptide werden nach den für
die Peptidherstellung bekannten Methoden erhalten, 2°
wobei die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge
einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer *

Peptideinheiten verknüpft werden. So kann man eines

der Aminosäure- bzw. Peptidmoleküle in Form eines L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin mit dem Esters mit einem weiteren Aminosäure- bzw. Peptid- 25 Tetradecapeptid L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysylmolekül, das eine geschützte Aminogruppe enthält, in L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie eines L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin kondensiert, wie beispiels-Carbodiimids oder eines Phosphorigsäureesterhalo- weise im Schema F i g. 1 für die Verbindung, die als genids, verknüpfen oder man kann mit dem Amino- fünfte Aminosäure L-Glutaminsäure enthält, gezeigt säure- bzw. Peptidester mit freier Aminogruppe eine 30 ist. BOC bedeutet eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe, Aminosäure bzw. ein Peptid mit aktivierter Carboxyl- tBu eine tert-Butylgruppe und iBu eine Isobutylgruppe. gruppe (und geschützter Aminogruppe), z. B. ein Das als Ausgangsstoff verwendete Decapeptid kann Säurehalogenid, -azid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxa- z. B. durch Kondensation von tert.-Butyloxycarbonylzolid (z. B. aus N-Äthyl-S-phenylisoxazolium-S'-sul- ' L-seryl-L-tyrosy-L-serin-azid mit L-Methionyl-L-glutafonat [s. W ο ο d w a r d et al., J. Am. Chem. Soc, 89, 35 minyl-(oder y-tert.-butyl-L-glutamyl)-L-histidyl-L-phe-S. 1011 {1961}]) oder einen aktivierten Ester, wie nylalänyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycinoderdurchKon-Cyanmethylester oder Carboxymethylthiolester, um- densation von y-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosetzen. Umgekehrt kann auch eine Aminosäure bzw. syl-L-seryl-L-methionin-azid mit L-Glutaminyl-(oder ein Peptid mit freier Carboxylgruppe (und geschützter tert. - Butyl - L - glutamyl) - L - histidyl - l - phenylalanyl-Aminogruppe) mit einer Aminosäure bzw. einem Peptid 40 L-arginyl-L-tryptophyl-glycin hergestellt werden. Das mit aktivierter Aminogruppe (und geschützter Carb- Tetradecapeptid erhält man beispielsweise nach dem oxylgruppe),z.B.einemPhosphitamid, zur Reaktion ge- Schema der F i g. 1.

bracht werden. Alle genannten Methoden sind für jede Weiter erhält man das Tetrakosapeptid beispiels-

erfindungsgemäß in Betracht kommende Bildung von weise durch Kondensation des Tetrapeptids L-Seryl-PeptidbindungenanwendbarJedochsinddieindenBei-45 L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin mit dem Eikosapeptid spielen angewandten Verfahren besonders vorteilhaft. L-Glutamyl-(oder Glutaminyl)-L-histidyl-L-phenylala-Wie bereits erwähnt, bestehen verschiedene Möglich- nyl - L - arginyl - l - tryptophyl - glycyl - l - lysyl - l - prolylkeiten bezüglich des Aufbaus des Tetrakosapeptids L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-l-arginyl-L-arginyl aus den einzelnen Aminosäuren bzw. kleineren " L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin nach Peptideinheiten. Ein Verfahren besteht z. B. darin, 50 dem Schema der F i g. 2. Das als Ausgangsstoff verdaß man das Decapeptid L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl- wendete Tetrapeptidderivat kann z. B. durch Konden-L-methionyl-L-gIutamyl-(oder glutaminyl)-L-histidyl- sation von tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-

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L-serin-azid mit L-Methionin-methylester und Über- Beispiel 1
führung des Tetrapeptidesters in das Hydrazid

(Fig. 1 und 2 siehe Anlage) ^Stufe *

. ₊ iu α A-u ♦ -A τ> α v, « PZ-LyS-(BOC)-Pr₀-VaI-GIy-NH-NH₂

hergestellt werden, das Hexapeptid z. B. durch 5 ^J

Kondensation von Carbobenzoxy-(y-tert.-butyl)- 1,1Sg(I₁SInMQl)PZ-LyS-(BQC)-PrO-YaI-GIy-L-glutamyl-L-hjstiduv-azid mit L-Phenylalanyl-nitro- OCH₃, hergestellt durch Kondensation von PZ-Lys-L-arginyl-L-tryptophyl-^ycin-methylester und Abspal- (BOC)-OH mit H-Pro-Val-Gly-OCH₃, werden in tung der Estergruppe mit 1 η-Natronlauge in Dioxan. 15 ml absolutem Methanol mit 0,6 ml Hydrazinhydrat An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktionelle io während einer Stunde am Rückfluß gekocht. Das Gruppen werden zweckmäßigerweise geschützt, ins- Lösungsmittel dampft man im Vakuum zur Trockne besondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion ein und fällt das Hydrazid mit viel Äther aus. Das anleicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe Vorzugs- fänglich gallertige Produkt wird beim Kratzen fest, weise durch Veresterung, z. B. mit Methanol, tert.- Man filtriert ab und wäscht auf der Nutsche gut mit Butanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, die 15 Äther nach. Nach dem Trocknen über Schwefelsäure Aminogruppe beispielsweise durch Einführung des gewinnt man 1,1 g PZ-Tetrapeptidhydrazid, F. 130 Tosyl·, Tritylrestes oder der Carbobenzoxygruppe bis 13 Γ.

oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo- Eine Probe, aus heißemJWasser umkristallisiert, zeigt

benzyloxycarbonylgruppe und der p-(p'-Methoxy- den gleichen Schmelzpunkt. Das Hydrazid ist in der phenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, oder insbeson- ao Kälte noch in 25^Q/„iger Essigsäure gut löslich,
dere des terL-Butyloxycarbonylrestes. Zum Schutz der
Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginine

ist die Nitrogruppe geeignet; die genannte Amino- Stufe 2

gruppe des Arginins muß aber bei der Reaktion nicht „ . ,_XT„ * _D „.„

notwendig geschützt werden. 25 Z-Ar₈-(NU^-PrO-OCH₃

Die Umwandlung einer geschützten SH- oder 3,06 g (23JmMoI) Prolinmethylester in 20 ml Aceto-

NH_a-Gruppe in eine, freie Gruppe sowie die Über- nitril gibt man zur Lösung von 7,18 g (20,3 mMol)

führung einer funktionell abgewandelten Carboxyl- Carbobenzoxy-nitro-L-arginin in 20 ml Dimethyl-

gruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des formamid, kühlt mit Eiskochsalz auf ·» —5 bis —10°

Verfahrens zur Herstellung der Tetrakosapeptide und 30 und versetzt hierauf mit der Lösung von 4,9 g Dicyclo-

Zwischenprodukte erfolgt nach an sich bekannten hexylcarbodümid in 12 ml Dimethylformamid ■—Aceto-

Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden nitril = 1:1. Die Reaktionslösung wird noch mit

bzw. reduzierenden Mitteln. 20 ml eiskaltem Acetonitril verdünnt und 17 Stunden

Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungs- bei 0° belassen. Der gebildete Harnstoff wird abfiltriert,

formen des Verfahrens, bei denen von man einer auf 35 mit Acetonitril gewaschen und zur Lösung 5 Tropfen

irgendeiner Stufe des Verfahrens als Zwischenprodukt Eisessig gegeben. Nach 30 Minuten dampft man das

erhältlichen Verbindung ausgeht und die fehlenden Lösungsmittel zur Trockne ein, nimmt den Ver-

Verfahrensschritte durchführt oder das Verfahren auf dampfungsrückstand in Essigester auf, filtriert noch-

irgendeiner Stufe abbricht. mais durch Watte vom abgeschiedenen Harnstoff ab

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen 4° und wäscht die Essigesterlösung dreimal mit 10 ml

Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. ln-Salzsäure, zweimal mit Wasser, so lange mit

Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die ln-Natriumbicarbonatlösung, bis beim Ansäuern der

Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum alkalischen Auszüge keine Trübung mehr feststellbar

lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur ist, und zum Schluß mit Wasser neutral.

Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet 45 Beim Eindampfen der getrockneten Essigesterlösung

sind, Salze gewinnen, wie z. B. solche mit anorganischen auf ein kleines Volumen fällt der Carbobenzoxydi-

Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise peptidester beinahe quantitativ aus. Ausbeute: 6,16 g

Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, (65,5«/₀ der Theorie), F. 155 bis 157° (Sintern 153°).
Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder
Phoepharsäürea, oder organischen Säuren, wie Amei- 50

seasäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, ^ie *

Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malon- _w A_TO_c>jni_p_rn_nrH

säur^BÄfHSteißsäureMaleinsäureFumarsäureÄpfel- ^{s y ϋ 3}

säure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hy- 8,4 g Z-Arg~(NOa)-Pro-OCH₃ werden unter Er-

droxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoe- 55 wärmen in 27 ml Eisessig in der Wärme gelöst und bei Säure, Phenylessigsäure, 4-Amino-benzoesäure, 4-Hy- Zimmertemperatur mit 27 ml ~ 4n-Bromwasserstoffdroxy-benzoe^ur^AnthranilsäurejZimtsäure.Mandel-Eisessig-Lösung versetzt. Nach einer Stunde dampft säure, Salicylsäure, 4-Amino-salicylsäure, 2-Phenoxy- man im Vakuum bei 40° auf ein kleines Volumen ein beozoe&äure, 2-Acetoxy-beazoesäure, Methansulfon- und fällt das Decarbobenzoxylylierungsprodukt mit säure, ÄthansulfoQSäure, Hydroxyäthansulfonsäure, 60 viel absolutem Äther aus. Das anfänglich klebrige Benzolsölfonsäure, p-Toluokulfonsäure, Naphthalin- Produkt wird so lange mit absolutem Äther behandelt, sitffansäure oder SmIfauilsämre. bis ein feines Pulver resultiert. Zur weiteren Reinigung

Die verf&brensgeHiäß erhaltenen Tetrakosapeptide wird das Dihydrobromid des Dipeptidesters noch könaaen in Form von pharmazeutischen Präparaten einmal aus Methanol—Äther umgefällt. Die leicht gelb-VerweaduHg flodea. 65 gefärbte Verbindung nimmt man in 4 ml Wasser auf,

Die Erfin4unf wird in den nachfolgenden Beispielen gibt dazu 150 ml Chloroform und kühlt das Gemisch besehriebea. Die Temperatureo sind in Celsiusgraden im Eisbad auf 0° ab. Unter intensivem Umschwenken angegeben, gibt man in Portionen so lange festes Kaliumcarbonat

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dazu, bis alles Wasser verbraucht ist und sich das Stufe 6

Kaliumcarbonat fest abscheidet. Das Kaliumcarbonat /r,/-i/-\ τ /r>^/-<\ α /xm \ α m« ν

wird noch ein zweites Mal mit frischem Chloroform T-L_ys(BOQ-Lys^OQ-/tfg(NO_a)-ArgCNO_>)-

extrahiert, die vereinigten Chloroformextrakte über ° ^^"s

wasserfreiem Kaliumcarbonat getrocknet und durch 5 1,07 g (2,01 mMol) H-Arg(NO₂)-Arg(NQa)-Proeine G4-Glasfilternutsche durch wenig Cellit filtriert. OCH₃ in 16,5 ml Dimethylformamid—Acetonitril 1: 1 Nach dem Verdampfen des Chloroforms bei 40° werden auf —10° gekühlt. Unter intensivem Rühren erhält man 5,5 g (90% der Theorie) Nitro-L-arginyl- trägt man rasch 1,44 g T-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OH, prolin-methylester. Die Verbindung wird ohne weitere hergestelltdurchKondensationvonPZ-Lys(BOC)-OH Umsetzung weiterverarbeitet. io mit H-LyS(BOC)-OCH₃, hydrogenolytische Ab

spaltung der PZ-Gruppe, Tritylierung des geschützten Dipeptidesters und Abspaltung der Estergruppe mit ^u ln-Natronlauge in Dioxan, in die Lösung ein, verdünnt

7-ArerNO ϊ-ArefNO ϊ-Pro-OCH ¹^ ^1Omi vorgekühltem Acetonitril und gibt nach

Z Ar₈(NO₃) Ar₈(NO₂) Pro OCH₃ ^ ₁₀ Minuten 456 mg (2,2 mMol) Dicyclohexylcarbodi-

8,34 g (25,2 mMol) H-ATg(NO₂) -Pro -OCH₃ in imid in 5 ml eiskaltem Acetonitril dazu. Nach 25 ml frisch destilliertem Dimethylformamid werden 20stündiger Reaktionszeit bei 0° filtriert man vom mit der Lösung von 8,92 g (25,2 mMol) Z-Arg(NO₂) - Harnstoff ab und dampft das Lösungsmittel im Vakuum OH vereinigt, mit 50 ml Acetonitril verdünnt und im bei 40° ab. Den nicht umgesetzten Tripeptidester fällt Kältebad auf —10° gekühlt. Nach 30minutigem 20 man mit viel Essigester aus, dampft hierauf die Essig-Stehen bei dieser Temperatur gibt man unter Rühren esterlösung zur Trockne ein und nimmt den Ver-5,71 g (27,7 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in dampfungsrückstand in wenig Aceton auf. Nach dem 12,5 ml eiskaltem Acetonitril, dazu und läßt 22 Stunden Filtrieren durch Watte wird der N-Trityl-pentapeptidbei 0° reagieren. Der Harnstoff wird abfiltriert und das ester mit viel Äther ausgefällt.

Lösungsmittel im Vakuum bis auf ein kleines Volumen 35 Eine mit wasserfreier Trifluoressigsäure gespaltene eingedampft. Den sirupösen Rückstand nimmt man in Probe des Trityl-pentapeptidesters zeigt im Papier-Chloroform auf, wäscht dreimal mit 10 mil n-Salzsäure, chromatogramm im System 49 neben dem Pentazweimal mit 10 ml Wasser und so lange mit In-Na- peptidmethylester Rf 0,29 noch sehr wenig der beiden triumbicarbonat und 1 n-Sodalösung, bis beim An- Ausgangsmaterialien. (Dipeptid-H-Lys-Lys-OH säuern der alkalischen Auszüge keine Fällung bzw. ₃₀ [Rf = 0,12] und Tripeptidester Nitro-arginyl-nitro-Trübung mehr nachweisbar ist. Zum Schluß werden arginyl-prolinmethylester [Rf = 0,53].) die Chloroformauszüge mit Wasser neutral gewaschen Zw Analyse werden 200 mg nach Craig zwischen

und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Ver- 80% Methanol und Chloroform—Tetrachlorkohlendampfen des Lösungsmittels erhält man 10,4 g (62%) stoff 1: 1 über 100 Stufen multiplikativ verteilt. Die rohen Carbobenzoxy-tripeptidester. 35 Hauptmenge der Substanz (180 mg) befindet sich in

Eine Probe des Rohproduktes mit 2n-Bromwasser- den Elementen 16 bis 28. Diese werden vereinigt und stoff-Eisessig-Lösung, 1 Stunde bei Zimmertemperatur noch einmal aus Aceton—Äther umgefällt. F. 134 gespalten, zeigt im Papierchromatogramm in den bis 136°; [λ]|⁵ = —41,2 ± 0,4° (c = 2,709 in Me-Systemen 54 und 49 neben dem Tripeptid noch weitere thanol). UV-Spektrum: l_max 271 ΐημ. (ε = 32 500) in Mengen von Nitroarginin und einem anderen Neben- 40 Feinsprit,
produkt. Zur Reinigung werden 4,6 g Rohprodukt aus Stufe 7

140 ml n-Butanol kristallisiert. Ausbeute: 2,2 g reinen , „ , . . , . , _ΤΛ.

Carbobenzoxy-tripeptidester, F. = 120° (Zersetzung); H-Lys(BOQ-LysCBOQ-Arg(NO,)-ArgCNO,)-

[«]» = -43,9° ± 1 ° (c = 1,032 in Methanol). PrO-OCH₃

Im UV-Spektrum zeigt der Carbobenzoxy-tripeptid- 45 1,46 g (1,19 mMol) Na-Trityl-pentapeptidmethylester bei 271 ιημ das für Nitroarginin charakteristische ester (Beispiel 6) werden in 50 ml 75%iger Essigsäure Maximum (ε = 32 200). während 45 Minuten bei 30° gespalten, dann bei 30°

die Essigsäure im Hochvakuum abgedampft und der

Verdampfungsrückstand zwischen l%iger Essigsäure

^btute -> 5o und Äther verteilt. Nach dem Verdampfen der Äther-

H-ArgiNO^-ArgiNO^-Pro-OCHs ^ung gewinnt man in quantitativer Ausbeute das

öv 2/ &V. 2j 3 Tnphenylcarbinol. Die Essigsaurelösung wird ebenfalls

2,19 g (3,3 mMol) Z-ATg(NO₂)-Arg(NO₂)-Pro- im Hochvakuum bei 40° verdampft und der Rückstand OCH₃ werden in 13,2 ml 2U-BrOmWaSSCrStOfTSaUTe-EiS- im Scheidetrichter zwischen n-Butanol und N-Sodaessig-Lösung während 1 Stunde bei Zimmertemperatur 55 lösung verteilt. Der pH-Wert der wäßrigen Phase muß decarbobenzoxyliert. Nach dem Verdampfen der pH 8,5 sein. Die Butanolauszüge wäscht man mit überschüssigen Säure fällt man das Decarbobenz- Wasser neutral und trocknet sie über Natriumsulfat, oxylierungsprodukt mit viel absolutem Äther aus. Das Ausbeute: 1,03 g (88%ig)·

Rohprodukt nimmt man in 2 ml Wasser auf, extrahiert Die Verbindung wird ohne weitere Reinigung direkt

zweimal mit frischem Essigester, wäscht die Essigester- 60 weiterverarbeitet, phasen noch einmal mit Wasser und gibt die ver- Stufe 8

einigten wäßrigen Lösungen auf eine Ionenaustauscher- _,„ _{T /n}^„_N „ ,_r , „,

säule Merck II. Den freien Tripeptidester eluiert man r^mSP^^w*^

mit 200 ml Wasser und dampft das Wasser im Vakuum Lys(BOC)-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-

bei 40° ab. Ausbeute: 1,3 g (74% der Theorie). 65 900 mg (1,2 mMol) PZ-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-

Im Papierchromatogramm in den Systemen 43,49 hydrazid werden in 10 ml Dimethylformamid auf und 54 gibt der freie Tripeptidester mit Ninhydrin nur —10° gekühlt, dann läßt man langsam 4 ml In-SaIzje einen positiven Fleck. Rf 43/0,42 ,-49/0,67 und 54/0,49. säure einlaufen und tropft anschließend bei —10

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unter gutem Rühren 1,4 ml eiskalte ln-Natriumnitrit- Vorgängig werden 4 g (17,2 mMol) N -BOC-Lysin

lösung dazu. Nach 30 Sekunden beginnt sich das Azid unter Rühren langsam in 32 ml Wasser, das 2,45 ml als klebrige Verbindung abzuscheiden. Man läßt noch (17,2 mMol) N-Triäthylamin enthält, eingetragen. Die 3 Minuten bei—10° reagieren und versetzt hierauf das letzten Portionen des N^e-BOC-Lysins lösen sich Reaktionsgemisch mit 150 ml Eiswasser. Das klebrige 5 nicht mehr gut. Beim Abkühlen mit Eis scheidet sich schlecht filtrierbare Azid wird mit eiskaltem Essigester wieder wenig feste Substanz aus der wäßrigen Lösung extrahiert und die Essigesterphasen mit Wasser neutral aus. Diese Lösung gibt man rasch unter intensivem gewaschen (dreimal), dann in der Kälte über Ma- Rühren und Kühlen zu der frisch zubereiteten Lösung gnesiumsulfat getrocknet und durch eine kalte G4-Glas- des gemischten Anhydrids und läßt 30 Minuten bei nutsche in die eisgekühlte Lösung von 1,03 g(~ ImMoI) ioZimmertemperatur reagieren. Die Reaktionslösung H-LysiBOQ-LysiBOQ-ArgiNCy-ArgiNCy-Pro- wird im Vakuum bei 40° auf ein kleines Volumen ein-OCH_sfiltriert.Manläßt22Stundenbei0°und3Stunden gedampft, unter Eiskühlung mit 100ml Wasser und bei 30° reagieren. Die Reaktionslösung wird mit 40 ml 10%iger Zitronensäurelösung versetzt. Die Wasser (40 ml), viermal mit 10 ml l%ig^er Essigsäure- schmierige Ausfällung wird beim Zerkratzen mit Äther lösung, fünfmal mit 10 ml 1 n-Natriumbicarbonat- 15 fest. Das rohe PZ-Valyl-N⁸ -BOC-Lysin wird ablösung und zum Schluß mit Wasser und gesättigter filtriert, mit viel Wasser und Äther gewaschen und bei Kochsalzlösung gewaschen. Beim Eindampfen der 50° im Hochvakuum getrocknet. Ausbeute: 4,41 g; getrockneten Lösung fällt das Nonapeptidderivat aus. F. 167 bis 169° (Sintern 165°).

Ausbeute: 1,70 g Rohprodukt. Die Ätherphase wird abgetrennt und über Natrium-

Zur weiteren Reinigung nimmt man 1,52 g Roh- ao sulfat getrocknet. Beim Abdampfen des Äthers scheiden produkt in wenig Chloroform auf und filtriert durch sichnochweiterel,07gPZ-Dipeptidaus.F. 167 bis 169°. eine Säule von 45 g Siükagel. Einmaliges Umfallen Die Gesamtausbeute beträgt 5,48 g (70% der

des Eluates aus 10 ml Chloroform mit Äther ergibt Theorie). Die Analysenfraktion schmilzt nach ein-1,06 g PZ-Nonapeptidmethylester. F. 134 bis 140° (Zer- maligem Kristallisieren aus Essigester bei 167 bis 169°. setzung). as Das UV-Spektrum in Feinsprit zeigt bei X_max 230 πιμ

Im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel G.; ε = 13400 und X_max 322 πιμ ε = 23000. Merck) im System Dioxan—Wasser = 9:1 ist nur

eine Substanz mit dem Rf-Wert 0,75 nachweisbar. In Stufe 11

den Systemen Chloroform—Aceton 7: 3 und Benzol— .. _ntR

Aceton 1: 1 bleibt die Verbindung am Start. Die 3o λ vai iyr rro uxbu

Substanz schmilzt, aus Acetonitril kristallisiert, bei Zu 11,25 g (27,4 mMol) Carbobenzoxy-valyl-tyrosin

136 bis 138°; im UV-Spektrum in Äthanol weist sie (deutsche Auslegeschrift 1 125 942) in 100 ml frisch Maxima auf bei λ = 272ΐημ (ε == 26600) und destilliertem Acetonitril gibt man die Lösung von λ = 320 ηιμ (ε = 22400). 4,65 g (27,4 mMol) Prolin-tert.-butylester in 25 ml

35 Acetonitril und kühlt im Eisbad auf 0° ab. Dann gibt

Stufe 9 man die Lösung von 6,21 g Dicyclohexylcarbodiimid

in 10 ml kaltem Acetonitril dazu und läßt 15 Stunden

PZ-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)- _{bei 0}<> _reagi_eren. Der auskristallisierte Harnstoff wird

LyS(BOC)-A^(NO₄)- ATg(NO₂)-Pro-OH abfiltriert (90 % der Theorie) und die Reaktionslösung

1,06 g (0,62 mMol) PZ-Nonapeptidester (Stufe 8) 40 mit ImI Eisessig versetzt. Nach 15 Minuten dampft

in 6ml 75%igem Dioxan werden mit 1,24ml 1,95 n-Na- man das Acetonitril im Vakuum ab, nimmt den Ver-

tronlauge während 15 Minuten bei Zimmertemperatur dampfungsrückstand in Essigester auf und filtriert

verseift. Anschließend gießt man die Reaktionslösung nochmals vom ausgeschiedenen Harnstoff ab. Die

in 110 ml Eiswasser, die 2,5 mil η-Salzsäure enthalten, Essigesterlösung wird zweimal mit 10 ml eiskalter

und filtriert die flockige Ausfällung durch eine G3-Glas- 45 2n-Salzsäure extrahiert, anschließend so lange mit

fritte. Den Niederschlag wäscht man gut mit Wasser 2n-Sodalösung — bis angesäuerte Proben keine Aus-

und trocknet ihn über Phosphorpentoxyd im Hoch- fällung mehr anzeigen — und zum Schluß mit Wasser

vakuum. Ausbeute: 970 mg amorphes Produkt. neutral gewaschen. Die Essigesterextrakte trocknet

Rf = 0,52 im Dünnschichtchromatogramm für Di- man über Natriumsulf at und dampft das Lösungsmittel

oxan—Wasser = 9:1. 5° unter vermindertem Druck ab. Ausbeute: 14,1 g

200 mg im System Methanol—Wasser—Chloro- (88 % der Theorie) amorphen Carbobenzoxy-tripeptid-

form—Tetrachlorkohlenstoff =8:2:5:5, über 121 ester.

Stufen verteilt, geben 162 mg reines Peptidderivat Der Carbobenzoxy-tripeptidester ist in den meisten

K = 0,65. organischen Lösungsmitteln, außer Äther, Petroläther

UV-Spektrum: X_max 320 πψ. (ε = 21700) und 271 ηιμ 55 und Benzol, gut löslich. Er wird ohne weitere Reinigung (ε = 37200) in Feinsprit. direkt weiter verarbeitet.

Die Substanz schmilzt, aus Acetonitril kristallisiert,
bei 140 bis 145° (Zersetzung). Stufe 12

Stufe 10 60 H-Val-Tyr-Pro-OtBu

P_{7 Va1 TWROO OH} 14,13 g (24,9 mMol) Z-Val-Tyr-Pro-OtBu werden

VL-Val-Lys(BUC)-OH _in ^_{50 m}i 90%igem Methanol, enthaltend 4,5 ml Eis-

4,75 g (13,4 mMol) PZ-Valin in 65 ml absolutem essig, in Gegenwart von 2 g 10 %ig^em Pd-Kohlekataly-

Dioxan werden in Eiswasser so gekühlt, daß ein Teil satorhydrogenolytisch gespalten. Das gebildete Kohlendes Dioxans fest ist. Dann man 3,45 ml (14,4 mMol) 65 dioxyd wird mit Kalilauge in einer zweiten, dazwischen-

N-Tributylamin und nach weiteren 5 Minuten 1,38 ml geschalteten Hydrierente absorbiert. Nach 2 Stunden

(13,4 mMol) Chlorameisensäureäthylester dazu und ist die Wasserstoffaufnahme beendet. Die vom Kata-

läßt 15 Minuten unter Kühlung reagieren. lysator befreite Lösung dampft man im Vakuum bei

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40° zur Trockne ein und verteilt den Verdampfungs- In den Systemen 54 und 49 wandert die Verbindung

rückstand zwischen 200 ml Essigester und zweimal mit der Lösungsmittelfront.

20 ml eiskalter 2n-Sodalösung. Die Sodalösungen Im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel G) im werden nochmals mit frischem Essigester extrahiert, System Dioxan—Wasser = 9: 1 ist der Rf-Wert 0,65. die Essigesterphasen mit Wasser neutral gewaschen 5
und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum gewinnt man ature 15 7,69 g (71 % der Theorie) freien Tripeptidester. PZ-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Im Papierchromatogramm in den Systemen 43, 45 Lys(BOC)-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-Pro-Val- und 54 wandert der Tnpeptidester mit der Losungs- io LvsfBOO-Val-Tvr-Pro-OtBu mittelfront und gibt mit Ninhydrin und Paulyreagens

je ein Fleck. 276 mg (0,16 mMol) PZ-Lys-Pro-Val-Gly-

Stufe 13 Lys(BOC) - Lys(BOC) - ATg(NO₂) - Arg(NO₂) - Pro -

_,„ _ΛΤ , _T ,„„„, ,, , „ ,.. „_iT> OCH₃ (über Phosphorpentoxyd im Hochvakuum bei

PZ-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu _{ij$ 80}o_{C g}^_trocknet) ^_erc£_{n im} '_{Gemisch 1} ^ _absolutes

Die Lösung von 10,36 g (17,7 mMol) PZ-VaI- Dimethylformamid, 2 ml absoluter Tetrahydrofuran Lys(BOC)-OH und 7,69 g (17,7 mMol) H-Val-Tyr- gelöst und im Eiskochsalz-Kältebad auf —10° gekühlt. Pro-OtBu in 140 ml frisch destilliertem Dimethyl- Dann gibt man 0,16 mMol Triäthylamin in 1,6 ml formamid wird bei 0° mit 4,2 g Dicyclohexylcarbodi- Tetrahydrofuran dazu und nach weiteren 5 Minuten imid (15%iger Überschuß) in 12 ml Dimethylform- 20 0,16 mMol Chlorameisensäur-eisobutylester in 1,6 ml amid versetzt und 2 Tage bei 0° belassen. Die vom absolutem Tetrahydrofuran. Man läßt 15 Minuten im Harnstoff befreite Lösung läßt man noch weitere Kältebad reagieren und gibt dann 140 mg H-VaI-30 Minuten mit 0,5 ml Eisessig stehen, dampft das Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu, gelöst in 2 ml abLösungsmittel im Vakuum bis auf ein kleines Volumen solutem Tetrahydrofuran, dazu.- Man rührt noch ab und nimmt den sirupösen Rückstand in viel Essig- 25 15 Minuten im Eisbad und anschließend 1 Stunde ester auf. Die Essigesterphase wird viermal mit 25 ml bei Zimmertemperatur, dann dämpft man das ■ Lö-O,2n-Ammoniumhydroxydlösung, zweimal mit 30 ml sungsmittel im Vakuum bei 40° ab und fällt das Wasser, zweimal mit 30 ml eiskalter 10%iger Zitronen- Reaktionsprodukt mit viel Äther aus. Das getrocknete säurelösung und zum Schluß mit Wasser neutral Rohprodukt (395 mg) wird ίή^; 4 ml alkoholfreiem gewaschen. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat 30 Chloroform auf eine Aluminiumoxydsäule (Akti- und Verdampfen des Lösungsmittels erhält man 17 g vitätlll; 40 g) gegeben und mit 100 ml Chloroform rohes amorphes Reaktionsprodukt. Zur weiteren durchgewaschen. Die gelbe Zone mit dem Peptid-Reinigung gibt man das Rohprodukt, in 100 ml derivat wandert dabei nur langsam. Anschließend Chloroform gelöst, auf eine mit 10%igem Wasser wird mit 80 ml Chloroform—Methanol = 95: 5 desaktivierte Silikagelsäule (570g Durchmesser; 5,6cm, 35 durchgewaschen. Dabei lassen sich 290 mg chromatoh = 41 cm). Mit Chloroform eluiert, wandert die graphisch einheitliches Produkt eluieren. Rf = 0,75, orangerote Zone nur langsam, während mit Chloro- Dioxan—Wasser = 9:1 im Dünnschichtchromatoform—Essigester 2: 1 sich zwei Fraktionen aus- gramm.
waschen lassen. Die Substanz schmilzt, aus Acetonitril kristallisiert,

Die erste Fraktion, 4,8 g, ist noch stark mitDicyclo- 40 bei 160 bis 165°. Das UV-Spektrum in Äthanol weist

hexylharnstoff und PZ-Dipeptid verunreinigt und läßt Maxima bei Λ = 272ΐημ (ε = 36800) und 319 ΐημ

sich aus Acetonitril nur in schlechter Ausbeute (ε = 20400) auf.

kristallisieren, während die zweite Fraktion (7,2 g) . ·

aus 200 ml Acetonitril als gallertiges Produkt wieder ^{btute 16}

ausfällt, Ausbeute: 5,1 g PZ-Pentapeptidester, F. 154 45 H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-

«· * 1 , , · ,·,-,· · Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-

Die Analysenfraktion schmilzt nach einer weiteren Val-Tyr-Pro-OtBu 3 CH COOH

Kristallisation bei 157 bis 159°. ' " ³

Im UV-Spektrum (in Feinsprit aufgenommen) 320mgPZ-Tetradecapeptid-tert.-butylester(Stufel4)

zeigt die Verbindung zwei Maxima bei 227 und 322 ΐημ 5° werden in 6 ml 90%iger Essigsäure und in Gegenwart

mit den ε-Werten 20700 und 21100. von 100 mg 10°/₀igeni Palladiumkohlekatalysator wäh-

Im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel G; rend 5 Stunden bei 5 at mit Wasserstoff geschüttelt.

Merck) sind die Rf-Werte: 0,23 (Chloroform—Aceton Anschließend füllt man die Reaktionslösung in eine

= 95: 5) und 0,60 (Benzol—Aceton = 1:1). Hydrierente, und schüttelt noch weitere 17 Stunden

55 mit 100 mg frischem Pd-Katalysator unter Normal-Stufe 14 bedingungen weiter. Zur Absorption des gebildeten

Kohlendioxyds wird noch eine zweite Hydrierente

H-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu _mit Kalilauge dazwischengeschaltet. Den abfiltrierten

1,4 g PZ-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu werden Katalysator wäscht man gut mit 90%iger Essigsäure

in 100 ml Methanol in Gegenwart von 400 mg 60 und Methanol und dampft das Lösungsmittel im

10%igenPalladiumkohlekatalysatorwährend 6 Stunden Vakuum zur Trockne ein. Nach dem Trocknen erhält

bei 5 at mit Wasserstoff im Autoklav geschüttelt. man 220 mg eines weißen amorphen Pulvers.

Man filtriert vom Katalysator ab, wäscht ihn wiederholt Das UV-Spektrum zeigt in Feinsprit bei 278 ΐημ

mit Methanol und dampft das Lösungsmittel im das für Tyrosin charakteristische Maximum (ε = 1500).

Vakuum ab. Der Verdampfungsrückstand wird mit 65 Im Papierchromatogramm in den Systemen 49, 50

viel Äther zerkratzt und im Hochvakuum getrocknet. und 54 wandert die Verbindung mit der Lösungsmittel-

Es resultiert ein feines amorphes Pulver. Ausbeute: wand und gibt positive Reaktionen mit Ninhydrin,

mg. Pauly- und Sakaguchi-Reagens.

Stufe 17

BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-

Val-Tyr-Pro-OtBu

210 mg Tetradekapeptid-tert.-butylester (Stufe 16) werden bei 0° in 10 ml Y^n-Salzsäure gelöst und die resultierende Lösung im Hochvakuum lyophil getrocknet. Den feinen weißen Rückstand trocknet man noch 2 Stunden bei 50° im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd. Gleichzeitig werden 160 mg (0,11 mMol) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH, hergestellt durch Kondensation von tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl- ¹S L-serin-azid mit i^Methionyl-y-tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin oder durch Kondensation von tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-azid mit y-lert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenyklanyl-L-arginyl^ao L-tryptophyl-glycin, in der Wärme in 1 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst, wieder auf Zimmertemperatur abgekühlt und zum Trihydrochlorid des Tetradekapeptids gegeben. Man verdünnt noch mit weiteren 2,5 ml Dimethylformamid und ^a5 erhält nach 10 bis 15 Minuten eine klare Lösung. Nach 2stündigem Stehen im Eisbad gibt man 42 mg (0,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 0,6 ml eiskaltem Acetonitril dazu, läßt 13 Stunden bei 0° und 48 Stunden bei Zimmertemperatur reagieren. Das rohe Reaktionsprodukt wird dann mit viel Essigester ausgefällt und im Hochvakuum bei 40° getrocknet. Rohausbeute: 330 mg.

Stufe 18

H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH, CH₃COOH

35

40

100 mg rohes geschütztes Tetrakosapeptid (Stufe 17), das noch mit Ausgangspeptiden verunreinigt ist, werden 1 Stunde bei Zimmertemperatur mit 2 ml wasserfreier Trifiuoressigsäure behandelt. Die überschüssige Säure wird bei Zimmertemperatur im Vakuum abgedampft und der resultierende Rückstand mit viel absolutem Äther zerkratzt. Das amorphe Spaltprodukt wird in 4,5 ml O,5n-Essigsäure einer kontinuierlichen Hochspannungselektrophorese unterworfen (700VoIt; 3OmA) Auftragsgeschwindigkeit: 1 ml/h. Total werden 23 Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 1 bis 9, 10, 12 und 13, 14 und 15, 16 und 17 bis 23 werden eingedampft. Die elektrophoretische Analyse zeigt, daß in den Fraktionen 12 bis 15 die Hauptmenge des gewünschten Tetrakosapeptides enthalten ist Zur weiteren Reinigung gibt man die vereinigten Fraktionen 12 bis 15, in 2 ml ¹J₁₀₀XaOIaXeIa Ammoniumacetatpuffer gelöst, auf eine Carboxymethylcellulosesäule (Durchmesser lern; 1,16cm; 2,5 g). — Die Carboxymethylcellulose wird mit 100 ml V₁₀₀molarem Ammoniumacetatpuffer in die Säule eingefüllt und noch mit weiteren 50 ml des gleichen Puffers durchgewaschen. — Das Peptid wird dann mit Ammoniumacetatpuffer (pH = 5,4) steigender Molarität (0,1 bis 0,7 m) von der Säule eluiert.

Es werden Fraktionen von 10 ml Volumen mit einem automatischen Fraktionensammler aufgefangen. Nach 15 Fraktionen ist das Peptid wieder quantitativ von der Säule getrennt. Man erhält total 15 Fraktionen. Die Gläschen 10 bis 13 enthalten elektrophoretisch reines Tetrakosapeptid. Der zurückgelegte Weg nach einer Stunde bei 3000 Volt und pH 1,9 beträgt 13 bis cm.

Im In-vitro-Test nach S äff ran und Schally zeigt das erhaltene Peptid eine starke ACTH-Aktivität.

Beispiel 2

Eine Lösung von 5,1mg (~1,5 · 10~^e Mol) des obigen Tetrakosapeptids in 2,0 ml 0,1 n-Kaliumchloridlösung wird mit 0,020 ml 0,1 η-Salzsäure und 0,020 ml Ojlmolarer Zinksulfatlösung versetzt. Sie enthält also: HCl: 2 · 10-^e Mol, Zn⁺² 2 · 10-" Mol; Tetrakosapeptid ~1,5 · 10-^e Mol.

Die Lösung wird mit Ο,ΐη-Natronlauge titriert. Die Titrationskurve zeigt einen Zinkkomplex mit pK = 8,35 an. Bei und oberhalb vom pH-Wert 8,35 beginnt der schwerlösliche Komplex in sehr feinverteilter, gelartiger Form auszufallen. Er wird bei pH 9,5 abzentrifugiert und mit Wasser gewaschen. Der Komplex besitzt eine starke ACTH-Aktivität.

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung neuer adrenocorticotrop wirksamer Tetracosapeptide der Formel L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutaminyl-(oderglutamyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L - valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin, ihrer Salze und Schwermetallkomplexe, dadurch gekennzeichnet, daß man zweckmäßigerweise unter Schutz der an der Reaktion nicht beteiligten Amino- und Carboxylgruppen,

a) das Decapeptid L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutaminyl-(oderglutamyl)-i.-histidyl L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin oder ein Derivat dieses Decapeptids mit aktivierter endständiger Carboxylgruppe und das Tetradecapeptid L-Lysyl-L-prolyl-L-valylglycyl -L- lysyl - l - lysyl - l - arginyl -L- arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin oder ein Derivat dieses Tetradecapeptids mit aktivierter «-Aminogruppe oder

b) das Tetrapeptid L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin oder ein Derivat dieses Tetrapeptide mit aktivierter Carboxylgruppe und das Eikosapeptid r-Glutaminyl-(oder Glutamyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl - glycyl - l - lysyl - l - prolyl - l - valyl - glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin oder ein Derivat dieses Eikosapeptids mit aktivierter «-Aminogruppe

kondensiert, nach Beendigung der Kondensation die geschützten Aminogruppen und Carboxylgruppen in Freiheit setzt und, wenn erwünscht, das erhaltene Tetracosapeptid in seine Salze oder Schwermetallkomplexe überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die ε-Aminogruppen des Lysins durch den tert-Butyloxycarbonylrest schützt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-argi-

nyl-L-tryptophyl-glycin mit einem Νε-tert-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-N⁸-tert. - butyloxycarbonyl - l - lysyl - l - valyl -L- tyrosyl-L-prolinester kondensiert und die Aminogruppen und Carboxylgruppen in Freiheit setzt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kondensation in Gegenwart eines Carbodiimids ausführt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Tetrapeptid tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-azidmiteinemL-Glutamyl-(tert.-butylester)-

IO

L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^e-tert.-butyloxycarbonyI-L-lysyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-i.-arginyl-L - prolyl- L - valyl - N⁸ - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolinester kondensiert und die Aminogruppen und Carboxylgruppen in Freiheit setzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Tetrakosapeptid in einen Zinkkomplex überführt.

In Betracht gezogene Druckschriften:
HeIv. Chim. Acta 44 (1961), S. 1136.

Bei der Bekanntmachung der Anmeldung sind zwei Prioritätsbelege ausgelegt worden.

Hierzu 2 Blatt Formeltabellen

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