DE1214242B - Verfahren zur Herstellung eines Tetracosapeptides - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

C07c

Deutsche Kl.: 12 q-6/01

Nummer: 1214242

Aktenzeichen: C 30563IV b/12 q

Anmeldetag: 27. Juli 1963

Auslegetag: 14. April 1966

Gegenstand des Patents 1196 666 ist die Herstellung eines neuen Tetrakosapeptides der Formel L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl -L- phenylalanyl - l - arginyl - l - tryptophyl - glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L - lysyl -L- valyl - l - tyrosyl-L-prolin sowie der entsprechenden Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamine aufweist, und ihrer Derivate, Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe. Diese Verbindungen haben eine hohe adrenocorticotrope (ACTH)-Wirksamkeit.

Es wurde nun gefunden, daß das Verfahren zur Herstellung des L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-Iy syl-L-arginyl - l - arginyl - l - pr olyl - l - valyl - l - lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolins, bei dem man das Dekapeptid der Aminosäuren 1 bis 10 mit dem Tetradekapeptid der Aminosäuren 11 bis 24 kondensiert, verbessert werden kann. Das bei diesem Verfahren verwendete Tetradekapeptidderivat N^s-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester wird vorteilhaft erhalten, wenn man L-Prolin-tert.-butylester mit Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosin-azid kondensiert, aus dem erhaltenen Tripeptidderivat die Carbobenzoxygruppe abspaltet, den freien Tripeptidester mit Carbobenzoxy-N^tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin kondensiert, aus dem erhaltenen Tetrapeptidester die Carbobenzoxygruppe abspaltet, den freien Tetrapeptidester mit Carbobenzoxy-L-valin kondensiert, aus dem erhaltenen Pentapeptidester die Carbobenzoxygruppe abspaltet, den so erhaltenen L-Valyl-tertbutyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolintert-butylester mit Carbobenzoxy-L-arginyl-L-arginyl-L-prolin zum geschützten Oktapeptidester kondensiert, aus diesem die Carbobenzoxygruppe abspaltet und den erhaltenen freien Oktapeptidester mit Carbobenzoxy-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysin-azid, das durch Kondensation von Carbor benzoxy-N^E-tert.-butyloxycarbonyl-L-rysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin mit N^e-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyltert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester zum Carbobenzoxy -N⁶-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L - valyl - glycyl - tert. - butyloxycarbonyl - L - lysyl - tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester und Überführung des Esters in das Hydrazid und Azid erhalten wird, zum Tetradekapeptidester kondensiert und schließlich aus diesem die Carbobenzoxygruppe ab-

Verfahren zur Herstellung
eines Tetracosapeptides

Anmelder:

CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter:

Dr.-Ing. Dr. jur. F. Redies,
Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. B. Redies
und Dr. rer. nat. D. Türk, Patentanwälte

Als Erfinder benannt:

Dr. Heini Kappeier, Birsfelden;

Dr. Robert Schwyzer, Riehen (Schweiz)

Beanspruchte Priorität:
Schweiz vom 1. August 1962 (9208),
vom 21. Februar 1963 (2209)

spaltet (vgl. Figur). BOC bedeutet die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, Z die Carbobenzoxygruppe.

Das erhaltene Tetradekapeptidderivat kann, wie im Hauptpatent 1196 666 beschrieben, mit dem Dekapeptidderivat tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-trosyl-L-seryl-L-methionyl-y-tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-•L-phenylalanyl-L-argmyl-L-tryptophyl-glycin oder mit der entsprechenden am Histidinrest tritylierten Verbindung zum Tetrakosapeptidderivat kondensiert werden, aus dem dann, wie im Hauptpatent beschrieben, in einer Stufe sämtliche Schutzgruppen abgespalten werden.

609 558/399

BOC

BOC BOC BOC

-Lys Pro VaI GIy-

-OH H-

BOC

I -Lys Lys4-0CH₃ Z-

-Arg-

-OH Z-

	BOC I	Z-	I -Lys Pro	VaI	GIy	BOC I	BOC
Z-	I -Lys Pro				Lys	Lys-
BOC I	VaI	GIy	BOC	BOC I
	Lys	Lys-

-OCH₈

-NH-NH₂

Z-- Arg

Z-

-Arg

Z-

BOC BOC

-Arg—OH H-

Z-

-Arg

H-

-Arg

Arg

Arg

-Pro-

-OCH, Ζ—VaI-

-OH Z-

-Lys-

-OH Z-

-VaI Tyr-

-OCH₃ H— Pro-

-OtBu

Pro-

-OCH₃

VaI Tyr—NH — NH₂(N₃)

PrO-OCH₃

Pro-

Z-

-VaI Tyr

-OCH,

H-

BOC

Pro-

-OH

BOC

BOC

-VaI Tyr

Pro-

Pro-

Z-	I -Lys	H-	I -Lys	VaI Tyr	Pro-
BOC I
VaI Tyr	Pro-

	-VaI	Z-	-VaI	BOC I	VaI Tyr	Pro-
H-		Lys
	BOC I	VaI Tyr	Pro-
Lys

-Arg	Arg	Pro	VaI	Lys	VaI Tyr	Pro-
				BOC I
-Arg	Arg	Pro	VaI	I Lys	VaiTyr	Pro-

OtBu OtBu

-OtBu -OtBu -OtBu --OtBu -OtBu -OtBu -OtBu -OtBu

-Lys Pro VaI GIy

Lys Lys

Arg

Pro

Lys

VaI Tyr

Pro-

BOC

BOC BOC BOC

H—Lys Pro VaI GIy

Lys Lys

Arg

Pro

Lys

VaI Tyr

Pro-

Die Erfindung wird im nachfolgenden Beispiel beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Für die Papierchromatographie wurden die folgenden Systeme benutzt:

System 40: n-Butanol—Äthanol—Wasser = 2:2:1. System 43: tert.-Amylalkohol—Isopropanol—

Wasser = 100: 40: 55. System 45: sek.-Butanol—3 % Ammoniak

= 100:44.
System 49: sek.-Butanol—Triäthylamin—Diäthyl'

barbitursäure—Wasser—Isopropanol

= 100: 0,8 :1,8 g: 60:10. System 53: n-Butanol—Ameisensäure—Wasser

= 480: 6: 314.
System 54: sek.-Butanol—Isopropanol—Mono-

chloressigsäure—Wasser

= 70:10: 3 g: 40. System 56: sek.-Butanol—-Isopropanol—5 °/_ö Ve- ^ao

ronal—Natrium in Wasser

= 100 :15:10: 60. System 87: Isopropanol—Ameisensäure—Wasser

= 400: 20: 60.
System 100: Essigester—Pyridin—Essigsäure—

Wasser = 60: 20:1 System 101: n-Butanol—Pyridin—Essigsäure—

Wasser = 30: 20: 6: 24 System 102: Essigester—Methyläthylketon—

Ameisensäure—Wasser

= 50: 30:10; 10.

Beispiel

Stufe 1. L-Prolin-tert.-butylester a) Hydrochlorid

35

In einer Druckflasche werden 5 g trockenes L-Prolin, 150 ml trockenes, alkoholfreies Chloroform, 5 ml reinste, konzentrierte Schwefelsäure und 150 ml flüssiges Isobutylen bei Zimmertemperatur so lange geschüttelt, bis Lösung eintritt (etwa 3 bis 4 Tage). Nach Abkühlen auf —15° wird das Druckgefäß geöffnet und das Isobutylen unter Feuchtigkeitsausschluß im Vakuum abdestilliert. Die verbleibende Chloroformlösung wird unter Eiskühlung mit 200 ml 20 % Kaliumcarbonatlösung gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Nach Abnutschen des Natriumsulfats wird der Gehalt der Chloroformlösung an L-Prolin-tert.-butylester durch Titration einer Probe mit verdünnter Salzsäure ermittelt. Hierauf wird die restliche Chloroformlösung auf —15° gekühlt und mit der genau berechneten Menge Salzsäure in Alkohol versetzt. Eindampfen und Zerreiben des Rückstands mit Äther gibt 6,88 g kristallines L-Prolin-tert.-butylester-hydrochlorid (76°/₀ der Theorie) vom F. 107 bis 108°. Das Produkt ist äußerst hygroskopisch.

b) freier Ester

60

Zur Überführung in den freien Ester wird das Hydrochlorid in möglichst wenig Wasser gelöst, die Lösung mit viel Äther überschichtet und durch Zugabe von konzentrierter Kaliumcarbonatlösung stark alkalisch gestellt. Der dabei ausgeschiedene Ester wird in dem Äther aufgenommen; die Ätherlösung gibt nach Trocknen und Eindampfen öligen L-Prolin-tert.-butylester, der direkt weiterverarbeitet werden kann.

Stufe 2. Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosin-azid

12,9 g (0,3 Mol) Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosinhydrazid (H. Schwarz, F. M. Bump us und LH. Page, J. Am. Chem. Soc, 79, S. 5697 [1957] werden in einem Gemisch von 600 ml 2 n-Salzsäure und 1200 ml Dimethylformamid gelöst und nach Kühlen auf —15·° unter Rühren mit 70ml einer 5normalen wäßrigen Lösung von Natriumnitrat versetzt. Die Losung wird weitere 5 Minuten bei —10^ό gerührt und anschließend in viel Eiswasser eingetragen. Das ausgeschiedene Azid wird abfiltriert, in kaltem Essigester gelöst, die Lösung bei 0° mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Eiswasser gewaschen, kurz über Magnesiumsulfat getrocknet und direkt für den weiteren Umsatz verwendet.

Stufe 3. Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosyl'-L-prolintert.-butylester

51,5 g L-Prolin-tert.-butylester werden in der nach Stufe 2 erhaltenen Lösung von Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosin-azid in etwa 2,91 Essigester von 0° gelöst und während 5 Stunden bei 0° und 15 Stunden bei 22° im Dunkeln stehengelassen. Das Reaktiohsgemisch wird nun im 5-1-Kolben bei 40° auf das halbe Volumen eingeengt. Dabei fällt der kristalline Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester aus, der durch eine Glasfritte abfiltriert, mit wenig Essigester, dann mit Benzol (50 ml) und mit Benzol—Petrolather 1:1 (75 ml) gewaschen und zuletzt bei 55° im Vakuum getrocknet wird. Ausbeute: 79,5 g, F. 173 bis 175°. Das Filtrat (Volumen etwa 1,51) wird in einem Scheidetrichter abgekühlt und bei 0° wie folgt gewaschen: zweimal mit 450 ml Zitronensäure 10 ⁰I₀; dreimal 300 ml gesättigter Natriumchloridlösung; zweimal mit 250 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung; dreimal mit 150 ml Wasser. Die Essigesterphase wird nach Zusatz von 200 ml Benzol zur Trockene eingedampft, nochmals mit 100 ml Benzol versetzt und wiederum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 25 ml Acetonitril durch Erwärmen gelöst, mit 45 ml Benzol versetzt und nach Animpfen über Nacht bei 0° kristallisieren gelassen. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit wenig Benzol und zuletzt mit Petrolather gewaschen und bei 55° im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 29 g, F. 163 bis 167°. Durch einmaliges Umkristallisieren dieser 29 g aus 430 ml heißem Acetonitril erhält man 19,2 g reines Material vom F. 173 bis 175°, durch Aufarbeiten der noch verbliebenen Mutterlauge noch weitere 3 g vom F. 172 bis 173°. Papierchromatographie: nach 1 Stunde bei 40° mit konzentrierter Salzsäure; 200 γ auf Whatman I, Anfärbung mit Ninhydrin und Pauly: Rf (40) = 0,65; Rf (45) = 0,48.

Stufe 4. L-Valyl-L-tyrosyl·L-prolin*tert.-butyίester

28,35 g Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolintert.-butylester vom F. 173 bis 175° werden in 250 ml Methanol (dest.) suspendiert und nach Zugabe von 3 g Palladiumkohle 10 % unter Absorption des sich bildenden Kohlendioxyds in der Schüttelente hydriert. Die Wasserstoffaufnahme ist in weniger als 2 Stunden beendet, und nach insgesamt 4 Stunden wird der Katalysator durch eine G4-Nutsche abfiltriert und mit 25 ml Methanol ausgewaschen. Die klare, farblose Lösung wird im Vakuum eingeengt und bei 45° getrocknet. Die amorphe, schaumige Masse wird fein pulverisiert und im Hochvakuum bei 45° bis zur Gewichtskonstanz

7 8

nachgetrocknet. Man erhält 21,3 g (98,5 °/₀) chromate- —10° abgekühlt. Dazu läßt man unter Rühren und

graphisch reinen L-Valyl-L-tyrosyl-L-prohn-tert.-butyl- Kühlen bei —10° während etwa l^x/₂ Minuten 4,57 ml

ester vom F. etwa 100° (unscharf) [α]χ> = —47,4° Isobutylchlorcarbonat zutropfen. Man spült mit 12 ml

(c = 2 in Methanol). Essigester nach und rührt noch während 15 Minuten

Papierchromatographie: direkt oder nach Hydrolyse 5 bei —10°. Sodann werden 21,92 g N^s-tert.-Butyloxymit konzentrierter Salzsäure während 1 Stunde bei carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butyl-40°; 20Oy auf Whatman 1, Anfärbung mit Ninhydrin ester, gelöst in 50 ml absolutem Essigester, während und Pauly: Rf (40) = 0,87; Rf (45) = 0,92; nach Salz- 5 Minuten bei —5° zugetropft und mit 15 ml Essigsäurebehandlung: Rf (40) = 0,65; Rf (45) = 0,48. ester nachgespült. Man rührt das Gemisch 30 Minuten

ίο bei 0°, läßt dann die Temperatur auf 20° steigen und

Stufe 5. Carbobenzoxy-N*-tert.-butyloxycarbonyl- ^rüIirt noch 1 Stunde bei Zimmertemperatur weiter.

L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prohn-tert.-butylester ^Zur Aufarbeitung versetzt man mit 170 ml Wasser und

extrahiert mit 270 ml Essigester. Die Essigesterlösung

19,15 g Carbobenzoxy-N-^etert.-butyloxycarbonyl- wird nacheinander gewaschen mit 85 ml Weinsäure

x-lysin und 21,8 g L-Valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert-bu- 15 10 °/q (0°), 85 ml Wasser, zweimal mit je 100 ml Natri-

tylester werden in 200 ml destilliertem Acetonitril ge- umbicarbonatlösung, zweimal mit je 100 ml verdünnter

löst und dazu bei 20° auf einmal und unter Rühren Natriumsulfatlösung. Nach Stehenlassen über Magne-

11,4 g Dicyclohexylcarboddimid in fester Form züge- siumsulfat dampft man zur Trockne ein und erhält

geben. Es löst sich sofort, unter gleichzeitigemAus- nach Pulverisieren und Nachtrocknen bei 45° 29,98 g

kristallisieren von Dicyclohexylharnstoff. Anfänglich 20 eines amorphen Rohproduktes. Dieses wird heiß in

wird kurz mit Eis gekühlt, damit die Temperatur nicht 300 ml Acetonitril gelöst, angeimpft und unter Rühren

über 25° steigt. Man rührt sodann während 3 Stunden erkalten gelassen. Nach Stehenlassen bei Zimmer-

bei Zimmertemperatur und läßt noch über Nacht temperatur filtriert man den kristallinen Niederschlag

stehen. Nach Zugabe von 1 ml Eisessig rührt man ab und trocknet ihn bei 45° im Vakuum. Man erhält

30 Minuten bei Zimmertemperatur, dann 30 Minuten 25 23,55 g Carbobenzoxy-L-valyl-N^s-tert.-butyloxycarbo-

bei 0° und filtriert den ausgeschiedenen Dicyclohexyl- nyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester

harnstoff ab. Das Filtrat ergibt beim Eindampfen zur vom F. 159 bis 1.64°, das zur weiteren Reinigung noch-

Trockene 44,3 g eines amorphen Pulvers, das in 44,3 ml mais während 3 Minuten in 235 ml siedendem Aceto-

Essigester warm gelöst und durch Zugabe von 221 ml nitril gerührt wird. Nach Stehenlassen über Nacht bei

Petroläther wieder ausgeschieden wird. Nach Dekan- 30 Zimmertemperatur wird filtriert, mit 70 ml Acetonitril

tieren des Lösungsmittels und Trocknen der pulveri- gewaschen und im Hochvakuum bei 45° getrocknet,

sierten Fällung bei 45° im Hochvakuum erhält man Man erhält 22,55 g Reinprodukt vom F. 162 bis 165°.

37,94 g Carbobenzoxy-N^e-tert.-butyloxycarbonyl-L-ly- [<x]_D = —71,4 ± 1° (c = 0,9 in Methanol).

syl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester vom F. Papierchromatographie: nach 1 Stunde bei 40° in

etwa 100°. Das Produkt wird direkt hydriert. [a\_D 35 konzentrierter Salzsäure. 200 γ auf Whatman I, An-

= -62,3 ± 0,5° (c = 1,98 in Methanol). färbung mit Ninhydrin und Pauly, Rf (40) = 0,40;

Papierchromatographie: nach 1 Stunde bei 40° mit Rf (45) = 0,36.

konzentrierter Salzsäure. 200γ auf Whatman 1, An- _o. . _o

färbung mit Ninhydrin und Pauly: Rf (40) = 0,40; ^{Stufe 8};

Rf (45) = 0 28 40 L-valyl-L-t

47,98 g Carbobenzoxy-L-valyl-N^s-tert.-butyloxy-

Stufe6. Νε-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl- carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proHn-tert.-butyl-

L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester ^{ester vom F}·^{161 bis 163}° werden in 320 ml Methanol

suspendiert und nach Zugabe von 3,2 g Palladium-

37,37 g Carbobenzoxy-N^s-tert.-butyloxycarbonyl- 45 kohle 10 % in der Schüttelente unter Kohlendioxyd-

L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester wer- absorption hydriert. Die Wasserstoffaufnahme erfolgt

den in 200 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von unter gleichzeitiger Auflösung des suspendierten

3 g Palladiumkohle 10% in der Schüttelente unter Pentapeptides und ist in etwa 3 Stunden beendet. Nach

Kohlendioxyd-Absorption hydriert. Die Wasserstoff- weiteren 1 bis 2 Stunden wird der Katalysator durch

aufnahme ist in etwa 6 Stunden beendet. Man filtriert 50 eine G4-Fritte abfiltriert, mit Methanol nachge-

den Katalysator durch eine G4-Fritte ab, spült mit waschen und das Filtrat zur Trockne eingeengt. Das

Methanol und dampft das Filtrat zur Trockene ein. pulverisierte Material wird im Hochvakuum bei 45°

Nach Pulverisieren trocknet man im Hochvakuum bei bis zur Gewichtskonstanz nachgetrocknet. Man erhält

45° und erhält so 29,68 g chromatographisch einheit- dabei 40,27 g (98,7% der Theorie) amorphen L-Valyl-

lichen NMert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyro- 55 N^e-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L -valyl-L-tyrosyl-

syl-L-prolin-tert.-butylester vom F. 95 bis 100°. [«]# L-prolin-tert.-butylester mit unscharfem Schmelzpunkt

= —61,8 ± 0,5° (c = 2,0 in Methanol). bei etwa 130°. [tx]_D = —69,2 ± 0,6° (c = 2 in Me-

Papierchromatographie: 200 γ auf Whatman 1, An- thanol).

färbung mit Ninhydrin und Pauly: Rf (40) = 0,86. Papierchromatographie: 200 γ auf Whatman I, An-

60 färbung mit Ninhydrin und Pauly: Rf (40) = 0,92;

Stufe 7. Carbobenzoxy-L-valyl-Ne-tert.-butyloxy- Rf (⁴⁵) = °>⁹⁴·

carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.- _{stufe 9} Carbobenzoxy-L-arginyl-L-prolin-methyl-

butylester ester-hydrochlorid

In einem Dreihalskolben mit Rührwerk, Tropf- 65 154 g (0,5 Mol) Carbobenzoxy-L-arginin und 83 g

trichter, Thermometer und Kalziumchloridrohr werden (0,5 Mol) L-Prolin-methylester-hydrochlorid werden in

8,73 g Carbobenzoxy-L-valin und 5,09 ml Triäthyl- 2,51 Chloroform suspendiert und unter kräftigem

amin in 85 ml absolutem Essigester gelöst und auf Rühren mit 112 g (0,55 Mol) Dicyclohexyl-carbodiimid

9 XO

versetzt. Das Reaktionsgemisch wird während 5 Stun- je 100 ml Chloroform extrahiert. Die wäßrige Lösung den bei 50° gerührt, darauf auf 20° gekühlt und unter wird im Vakuum vollständig eingedampft und der Rühren mit 5 ml Eisessig versetzt. Nach weiterem Rückstand im Hochvakuum bei 40° getrocknet: Rühren während 2 Stunden bei 0 bis 5° wird das Zäher hydroskopischer Schaum; 78 g (berechnet kristalline Gemisch von Dicyclohexylharnstoff und 5 64,8 g); enthält Wasser, das sich durch weitere Reaktionsprodukt abgenutscht, mit Chloroform ge- Trocknung nicht .entfernen läßt,
waschen und im Vakuum bei 40° getrocknet. Man ver- Zur weiteren Reinigung werden 90 g Rohprodukt in rührt das Gemisch mit 21 Wasser während 30 Minuten 200 ml Methanol gelöst und unter Rühren mit 11 bei 40° und filtriert vom ungelösten Dicyclohexylharn- Essigester ausgefällt. Das abgeschiedene ölige Produkt stoff ab. Das wäßrige Filtrat wird im Vakuum bei io verfestigt sich bei mehrmaligem Verreiben mit Essig-40 bis 50° Badtemperatur zum Sirup konzentriert und ester zu einem amorphen Pulver. Nach Trocknen bei mit 150 ml Äthanol versetzt. Nach 2 Stunden wird das 40° und 0,1 mm Hg: 86 g, F. 90 bis 120°. Das umausgeschiedene kristalline Produkt abfiltriert und mit gefällte Produkt enthält etwa 3 °/₀ L-Arginyl-L-prolin Äthanol gewaschen. Man erhält 192 g (=84%) und etwa 3% Carbobenzoxy-L^arginin; es ist jedoch Carbobenzoxy-LTarginyl-L-prolin-methylester-hydro- 15 genügend rein für den weiteren Umsatz,
chlorid vom F, 164 bis 165°.

Aus der Mutterlauge gewinnt man nach Einengen stufe 12. Carbobenzoxy-L-arginyl-L-arginylweitere 5 g vom F, 163 bis 165°, total 197 g (= 86% L-prolin-hydrochlorid
der Theorie). Nach Umkristallisieren aus 1,5 1 absolutem Äthanol schmilzt das Produkt bei 165 bis 167°; ao 32,4 g (etwa 50 mMol) rohes Carbobenzoxy-[#]f == —71,9° (c = 1,8 jn Wasser). —64,4° (e — 1,9 in L-arginyl-L-arginyl-L-prolin-methylester-dihydrochlorid Methanol) und —67,1° (c = 2 in Methanol—Wasser werden unter Rühren in 100 ml 1 n-Natronlauge 1; 1), Das Produkt ist papierchromatographisch ein* gelöst und 20 Minuten bei 20° weitergerührt. Dann heitljch, Rf-Werte in den Systemen 43; 0,79; 49: 0,90; gibt man unter gutem Rühren 52 ml 2 η-Salzsäure zu 54: 0,86; 87: 0,82. Anfärbung mit Sakaguchi. 25 und dampft die Reaktionslösung im Vakuum bei 30°

_. . _1A * . 1 1· ^t. 1 * ein. Der zähflüssige Rückstand wird bis zur Gewichts-

Stufe 10. L-Arginyl-L-prolin-methylester- _{kongtanz bd 0>1} ^_{m Hg m w mm sprödeil)} ^

dinycirocrüond _{losen Schauni} getrocknet; 34 g Gemisch, enthaltend

45,6 g (0,1 Mol) Carbobenzoxy-L-arginyl-L-prolin* etwa 70% Carbobenzoxy-L-arginyl-L-arginyl-L-prolinmethylester-hydroehlorid werden in 400 ml Methanol 30 dihydrochlorid neben Natriumchlorid und anderen unter Erwärmen gelöst und nach Kühlen auf Zimmer- Verunreinigungen.

temperatur mit einer Lösung, enthaltend 0,15 Mol Zur Überführung in das Carbobenzoxy-tripeptid-

Chlorwasserstoff in Methanol, versetzt. Nach Zugabe monohydrochlorid werden 34 g des Dihydrochloride von 2,0 g Palladiumkohle (10%ig) wird bei Zimmer- in 150 ml Dimethylformamid aufgenommen, vom temperatur und Normaldruck hydriert; innerhalb 35 unlöslichen Natriumchlorid abfiltriert und unter 30 Minuten werden 2180 ml Wasserstoff aufgenommen. Rühren bei Raumtemperatur mit 10,1 g Triäthylamin Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert, im versetzt. Das ausgeschiedene Triäthylamin-hydro-Vakuum bei höchstens, 35° eingedampft und der chlorid wird abfiltriert und das klare Filtrat mit dem Rückstand bei 0,1 mm Hg über Ka.liumhydroxyd Monohydrochlorid des Carbobenzoxytripeptids angetrocknet. Das erhaltene Öl ergibt beim Verreiben 4° geimpft. Das Monohydrochlorid kristallisiert langsam mit 150 ml Essigsester 35 g (98%) eines farblosen in feinkörniger Form aus. Man läßt 20 bis 24 Stunden amorphen Pulvers, des L-Arginyl-L-prolin-methylester- bei Raumtemperatur stehen, saugt dann das Kristallin dihydrochlorids. Die Substan? ist papierphromato^ sat ab und wäscht mit Dimethylformamid und Essiggraphisch einheitlich: Rf-Werte in den Systemen 49: ester nach. Nach Trocknen im Vakuum bei 50° erhält 0,57; 54: 0,37; 56: 0,42; 87: 0,36 (Anfärbung mit 45 man 19 g (=66% der Theorie) Carbobenzoxy-Sakaguchi-Reagens), L-arginyl-L-arginyl-L-prolin-monohydrochlorid vom F.

„,,__,,, . , . , 248 bis 249°. Umkristallisiert durch Lösen in 100 ml

Stufell. Carbobenzoxy-L^rgmyl-L-argmyl- Methanol, enthaltend 1 Äquivalent Chlorwasserstoff

L-prohn-methylester-dihydrochlorid ^ _{Zugabe von 2} Äquivalenten Triäthylamin: 16,7 g.

30,8 g (0,1 Mol) CarbobenzQxy-L-arginin und 35,8 g 50 F, 259 bis 262°; [«]f = -64,8 ± 1° (c = 1,4 in (0,1 Mol) L-Arginyl-L-prolin-methylester-dihydrochlo- Wasser); schwer löslich in allen organischen Lösungsrid werden in 100 ml Dimethylformamid suspendiert mitteln; leicht löslich in Wasser. Die Substanz ist und bei Zimmertemperatur 30 Minuten verrührt bis einheitlich im Papierchromatogramm (200 γ einer zur fast vollständigen Lösung. Nach Zugabe von 100 ml 5 %igen Lösung in Wasser): Rf-Werte in den Systemen Chloroform wird die Lösung auf —5° gekühlt und mit 55 49: 0,68; 54: 0,64; 56: 0,63; 87: 0,62; Anfärbung mit 22,7 g (0,11 Mol) Dicyclohexyl-carbodiimid versetzt. Sakaguchi-Reagens.

Anschließend werden unter Rühren bei—5° innerhalb „ „ „„ _, , , . , . ,

etwa 30 Minuten weitere 30QmI Chloroform zu- Stufe 13. Carbobenzoxy-L-arginyl-L-arginyl-

getropft, und das Reaktionsgemisch, aus dem sich L-prolyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-

allmählich Dicyelohexylharnstoff abscheidet, wird über 5a i-valyl-L-tyrosyl-L-prohn-tert.-butylester-sulfat
Nacht bei 0° gerührt. Nach Zugabe von 2 ml Eisessig 9 g (15 mMol) Carhobenzoxy-L-arginyl-L-arginyl-

und weiterem Rühren während 1 Stunde bei 0° wird L-prolin-hydrochiorid werden in 75 ml Dimethylder ausgeschiedene Dicyclohexylhamstoff abfiltriert formamid suspendiert und durch Zugabe von 7,5 ml und mit Dimethylformamid—Chloroform 1: 4 nach- einer 2 η-Lösung von Chlorwasserstoff in Essigester gewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum bei 40° zum Ss unter Rühren gelöst (Überführung ins Dihydrochlorid). Sirup eingedampft und der Rückstand in 300 ml Nach Kühlen auf —10° werden unter Rühren 1,8 g Wasser aufgenommen. Der unlösliche Dicyclohexyl- (15 mMol) frisch destilliertes Pivaloylchlorid und anharnstojf wird abfiltriert und das Filtrat zweimal mit schließend 1,5 g (15 mMol) Triäthylamin zugegeben,

11 12

und nach 10 Minuten wird die Lösung des gemischten Stufe 16. Carbobenzoxy-N^e-tert.-butyloxycarbonyl-Anhydrids mit 9,5 g (12,5 mMol) L-Valyl-N^e-tert.- L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxycarbonylbutyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-L-lysyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester

tert.-butylester, gelöst in 20 ml Dimethylformamid,

versetzt. Nach weiterem Rühren während 10 Minuten 5 23,3 g (36,8 mMol) Carbobenzoxy-N^E-tert.-butylbei —10° werden 100 ml Wasser zugegeben und an- oxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin werden in schließend 75 ml 2 n-Natriumsulfatlösung zugetropft. 200 ml absolutem Tetrahydrofuran und 5,65 ml Das ausgeschiedene kristalline Sulfat des Oktapeptid- (1,1 Äquivalente) absolutem Triäthylamin gelöst. Zu derivats wird noch 15 Minuten abfiltriert, mit Wasser der auf —15° gekühlten Lösung tropft man unter gewaschen und im Vakuum bei 40° getrocknet: io Rühren 3,63 ml Chlorameisensäureäthylester (1,03 13,7 g (78°/₀) farbloses Pulver mit unscharfem Äquivalente). Man rührt 20 Minuten bei —15° und Schmelzpunkt bei etwa 220°. Das Rohprodukt wird in tropft dann eine Lösung von 17,5 g (35,9 mMol) 75 ml 80°/₀igem Methanol gelöst und durch Zugabe N^e-tert. -Butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^tert.-butyloxyvon250ml Wasser ausgefällt: 11,8 g. Im Dünnschicht- carbonyl-L-lysin-methylester (dargestellt nach dem chromatogramm auf Silicagel sind die Rf-Werte 15 Verfahren der belgischen Patentschrift 594 338) in in den Systemen 100: 0,30; 102: 0,42. Die Substanz 80 ml absolutem Tetrahydrofuran zu. Das Reaktionsenthält Spuren einer langsamer laufenden Verbindung, gemisch wird 24 Stunden bei Raumtemperatur beist aber genügend rein für den weiteren Umsatz. lassen. Dann wird das ausgeschiedene Material

(Gemisch von Triäthylaminhydrochlorid und Hexa-

Stufe 14. L-Arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- ²⁰ peptidderivat) abgenutscht und mit Tetrahydrofuran

tert.-butyloxycarbonyl-i-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl- ^und viel Essigester gewaschen, wobei das Hexapeptid-

L-prolin-tert.-butylester-triacetat derivat wieder in Lösung geht. Man vereinigt die

Tetrahydrofuran- und Essigesterfiltrate, dampft zur

14g (10mMol) Carbobenzoxy-L-arginyl-L-arginyl- Trockne ein und verteilt den Rückstand zwischen L-prolyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl- 25 Wasser und viel Essigester. Die Essigesterlösung wird L - tyrosyl -L- prolin - tert. - butylester - sulfat werden in unter Eiskühlung mit verdünnter Zitronensäurelösüng, 200 ml 80°/₀igem Methanol suspendiert und in Wasser, Natriumbicarbonatlösung und Wasser geGegenwart von 2 g Palladiumkohle (10%ig) bei waschen, mit Natriumsulfat getrocknet und einZimmertemperatur und Normaldruck hydriert. Nach gedampft. Der Eindampfrückstand wird zweimal mit Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff kommt 30 je 500 ml Äther und dreimal mit je 11 Tetrahydrofurandie Hydrierung zum Stillstand. Die vom Katalysator Äther-Gemisch (1: 4) zerrieben. Dabei erhält man das abfiltrierte Lösung wird zur Entfernung von Sulfationen Hexapeptidderivat als unlösliches gallertiges Pulver; über eine Säule von 200 ml Amberlite IRA-400 die Ausbeute beträgt 31,3 g. Zur weiteren Reinigung (Handelsname) [Acetatform] nitriert und mit 80°/_oigem wird das Rohprodukt in 300 ml Acetonitril unter Methanol nachgewaschen. Das Eluat wird im Vakuum 35 Erwärmen gelöst und die Lösung in einem Wasserbad eingedampft und der Rückstand zum Pulver verrieben. von 60° (im Dewargefäß) langsam erkalten gelassen. Die Ausbeute an L-Arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- Dabei kristallisiert das Hexapeptidderivat im Verlaufe tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-pro- mehrerer Tage in feinen Nadeln aus, daneben scheidet lin-tert.-butylester-triacetat ist nahezu quantitativ. sich noch etwas gallertiges Material aus. Der Nieder-

Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel sind 40 schlag wird deshalb mehrere Male wieder auf etwa die Rf-Werte in den Systemen 54: 0,40; 101: 0,60; auf 50 bis 60° erwärmt, wobei die Kristalle ungelöst Aluminiumoxyd: 0,22 in System 102. Anfärbung mit bleiben und das gallertige Material in Lösung geht. Sakaguchi- und Reindel-Hoppe-Reagens. Schließlich wird auf diese Weise das Hexapeptidderivat

vollständig kristallin erhalten; F. 121 bis 126°, Aus-Stufe 15. Carbobenzoxy-Ns-tert-butyloxycarbonyl- 45 beute 30,12 g (76°/₀ der Theorie). Zur Analyse wird L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin aus Methanol und Acetonitril umkristallisiert, F. 121

bis 126°; [α]_Λ = -50,8° (c = 1,89 in Methanol).

40,85 g (61,7 mMol) Carbobenzoxy-N^E-tert.-butyl- Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagel-

oxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin-äthylester platten zeigt das geschützte Hexapeptidderivat nur (R. Schwyzer und W. R i 11 e 1, HeIv., 44, S. 159 50 einen Fleck, Rf-Wert = 0,03 in Essigester, Rf = 0,23 [1961]) werden in 800 ml Äthanol gelöst, die Lösung in Chloroform—Methanol — 19 :1; Rf = 0,65 in auf 5° gekühlt und 80 ml 1 η-Natronlauge zugegeben. Chloroform—Methanol = 9:1 (die Platten werden Nach 3 Stunden bei 5° wird 11 Wasser zugegeben, die mit Reindel-Hoppe-Reagens entwickelt), überschüssige Natronlauge durch Zugabe von festem

Kohlendioxyd neutralisiert und das Äthanol im 55 Stufe 17. Carbobenzoxy-N^E-tert.-butyloxycarbonyl-Vakuum abdestilliert. Dabei scheidet sich in der ver- L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyyl-tert.-butyloxy-

bleibenden wäßrigen Phase das Natriumsalz des carbonyl-L-lysyl-tert.-butyloxycarbonyl-

Tetrapeptidderivates als gallertiger Niederschlag aus. L-lysin-hydrazid

Er wird durch Erwärmen auf 45° gelöst, von etwas

ungelöstem Material abfiltriert, die Lösung auf 5° 60 20,00 g (18,10 mMol) Carbobenzoxy-N^s-tert.~butylgekühlt und mit 80 ml kalter 1 η-Salzsäure versetzt. oxycarbonyl-L-lysyl-L-propyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyl-Dabei fällt das Carbobenzoxy-N^-tert.-butyloxycarbo- oxycarbonyl-L-lysyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysinnyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin als feinpulveriger Nie- methylester werden in 200 ml Methanol gelöst und die ■derschlag aus. Er wird abfiltriert und mit Eiswasser auf 0° gekühlte Lösung mit 10 ml Hydrazinhydrat ■chloridfrei gewaschen, dann im Vakuum über Schwe- 65 versetzt. Die klare Lösung wird 3 Tage bei 2° belassen, feisäure getrocknet. Die Ausbeute beträgt 34,19 g hierauf auf ein kleines Volumen eingeengt und mit <88^O/_O der Theorie); F. etwa 71 bis 95°. Das Produkt viel Wasser versetzt. Das dabei ausfallende Produkt ist für weitere Umsetzungen genügend rein. wird gründlich zerrieben, genutscht und mit viel

Eiswasser gewaschen. Das noch feuchte Material wird wiederum in wenig Methanol gelöst und erneut mit Wasser gefällt. Abnutschen und Trocknen im Vakuum bei 40° gibt 18,82 g (94% der Theorie) rohes Hexapeptidhydrazid, F. 141 bis 145°.

37,0 g Rohprodukt liefert nach Umkristallisieren aus 500 ml tert.-Butanol—Wasser 2 : 3 34,30 g kristallines Hydrazid vom F. 156 bis 158°, [ocfi = —51,9 ± 0,5° (c = 1,91 in Methanol).

Bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten (6Oy des Hydrazids aufgetragen und mit Reindel-Hoppe-Reagens entwickelt) erhält man folgende Rf-Werte: 0,0 (Benzol—Essigester 1:1); 0,26 (Chloroform—Methanol 9:1); 0,73 (Dioxan—Wasser 9:1).

Stufe 18. Carbobenzoxy-N^tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxy-

carbonyl-L-lysyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-

L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-tert.-butyloxy-

carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-

butylester

6,26 g (5,66 mMol) Carbobenzoxy-N^s-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxycarbonyl - l - lysyl - tert. - butyloxycarbonyl - l - lysinhydrazid werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung auf —20° gekühlt und unter Rühren werden 15 ml 1 η-Salzsäure so zugetropft, daß die Temperatur nicht über —15° steigt. Hierauf werden in gleicher Weise 5,7 ml 1 n-Natriumnitritlösung eingetropft und die Lösung bei —7° 20 Minuten gerührt. Dann wird eine Lösung von 6,12 g (4,53 mMol) L - Arginyl - L - arginyl - L - pr olyl - L - valyl - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester-triacetat und 3,1 ml Triäthylamin in 60 ml Dimethylformamid bei —7° eingetropft und das Reaktionsgemisch 65 Stunden bei —2° belassen. Hierauf wird das Lösungsmittel bei 0,1 mm Hg und 40° Badtemperatur abdestilliert und der Rückstand mit Äther mehrmals unter Zerreiben gewaschen: 10,7 g Rohprodukt. Das Produkt zeigt in der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel das Tetradekapeptidderivat als Hauptfleck mit Rf 0,35 in System 100, 0,25 in System 53 (Anfärbung mit Sakaguchi- und Reindel-Hoppe-Reagens) und zusätzlich unverändertes Oktapeptidderivat sowie mehrere aus dem Hexapeptidanteil stammende Nebenprodukte.

Zur Abtrennung der Chlorionen wird das Rohprodukt in 200 ml 0,5 η-Essigsäure in 50°/₀igem Methanol gelöst, über eine Säule von 50 ml Merck-Ionenaustauscher II (schwach basisch, Acetatform) filtriert und mit 200 ml des gleichen Lösungsmittels nachgewaschen. Das im Eluat enthaltene Produkt wird direkt weiter umgesetzt.

55 Stufe 19. N^s-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-tert.-

butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-

L-prolyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-

L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester-tritosylat

Die Lösung des geschützten Tetradekapeptidesters wird mit 10 ml Eisessig versetzt und in Gegenwart von Ig Palladiumkohle (10°/₀ige Pd) hydriert. Nach 17 Stunden und Aufnahme von 157 ml Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Hierauf wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird mit Petroläther gewaschen und 18 Stunden bei 40° und 0,01mm Hg getrocknet. Man erhält 7,5 g Rohprodukt. Dieses wird in 50 ml tert-Butanol—Wasser 1:1 gelöst, auf eine Säule von 60 g Carboxymethylcellulose (im gleichen Lösungsmittelgemisch suspendiert) gegossen und unter Verwendung eines Uvicords und eines linearen Gradienten zwischen 11 50°/₀igem tert.-Butanol und 11 50°/₀igem tert.-Butanol, enthaltend 10 % Essigsäure, chromatographiert. Nach Durchlauf von 560 ml Lösungsmittel beginnt die Elution des Tetradekapeptidderivats. Dieses wird in mehreren Fraktionen aufgefangen, die separat eingedampft werden. Dabei werden 4,1 g reines N⁸-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyltert. - butyloxycarbonyl - l - lysyl - l - arginyl - l - arginyl-L-prolyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert. -butylester-triacetat gewonnen. Weitere 2,8 g unreinere Substanz werden in 10 ml Wasser gelöst und nochmals an 16 g Carboxymethylcellulose chromatographiert, unter Verwendung eines linearen Gradienten zwischen 500 ml Wasser und 500 ml 10°/₀iger Essigsäure. Dabei werden weitere 2,15 g reine Substanz erhalten; total 6,25 g (= 60%, berechnet auf das eingesetzte Oktapeptid). Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel sind die Rf-Werte: 0,23 im System 100, 0,25 im System 52.

Das erhaltene Triacetat des Tetradekapeptidderivats wird wie folgt in das Tritosylat übergeführt:

6,25 g (2,73 mMol) werden in 100 ml trockenem Pyridin gelöst, mit 1,70 g p-Toluolsulfosäure versetzt, die Lösung zur Trockne verdampft, der Rückstand zur Entfernung von Pyridinacetat 18 Stunden bei 35° und 0,01 mm Hg getrocknet und zur Entfernung von Pyridintosylat mit Aceton verrieben und abgenutscht: 7,26 g farbloses Pulver vom F. 155 bis 162°.

Der geschützte Tetradekapeptid-tert.-butylester wird in der im Hauptpatent beschriebenen Weise mit tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-y-tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin oder mit der entsprechenden am Histidinrest rtitylierten Verbindung zum geschützten Tetracosapeptid-tert.-butylester kondensiert und aus diesem mittels Trifluoressigsäure, wie im Hauptpatent beschrieben, sämtliche Schutzgruppen abgespalten.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Tetracosapeptides der Formel L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl - L - glutamyl - l - histidyl - l - phenylalanyl-L - arginyl -L- tryptophyl - glycyl - L - lysyl -L- prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin durch Kondensation von tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-y-tert.-butyl-L - glutamyl - l - histidyl - L - phenylalanyl - L - arginyl-L-tryptophyl-glycin mit N^e-tert.-Butyloxycarbonyl-L - lysyl -L- prolyl - L - valyl - glycyl - tert. - butyloxycarbonyl - L - lysyl - tert. - butyloxycarbonyl - L - lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester nach Patent 1196 666, dadurch gekennzeichnet, daß man das Tetradekapeptidderivat dadurch herstellt, daß man L-Prolin-tert.-butylester mit Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosin-azid kondensiert, aus dem erhaltenen Tripeptidderivat die Carbobenzoxygruppe abspal-

tet, den freien Tripeptidester mit Carbobenzoxy-N^£-tert.-butyloxyearbonyl-L-lysin kondensiert, aus dem erhaltenen Tetrapeptidester die Carbobenzoxygruppe abspaltet, den freien Tetrapeptidester mit Carbobenzoxy-L-valin kondensiert, aus dem erhaltenen Pentapeptidester die Carbobenzoxygruppe abspaltet, den so erhaltenen L-Valyl4ert.-butyloxy= carbonylrL-lysyl-L-valylrL-tyrosyl-L-prolin-tert.--butylester mit Carbobenzoxy-L-arginyl-l^arginylr L-prolin zum geschützten Oktapeptidester könden« siert, aus diesem die Carbobenzoxygruppe ab^ spaltet und den erhaltenen freien Oktapeptidester mit Carbobenzoxy-N⁶-tert. -[butyloxycarbonyk L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxycarbo^ nyl-L-lysyl-tert.-butyloxycarbonyl-rL-lysin-^zid zum Tetradekäpeptidester kondensiert und schließlich aus diesem die Carbobenzoxygruppe abspaltet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Hexapeptidderivat Carbobenzoxy-N^-tert.-butyloxycarbonyl-Ljysyl-L-prolyl-L-valyl-glyeyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysinazid durch Kondensation von Carbobenzoxy-N^tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin mit NHert.-Butyloxycarbonyl - l , lysyl - tert. - butyloxycarbonyl -. β - lysinmethylester zum Carhobenzoxy-N^e-tert.-butyloxycarbonylTL-.lysyl-L-prolylrLrvalyl-glycyl-tert.-butyloxycarbonyl·Lτlysyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysinmethylester und Überführung des Esters in das Hydrazid und Azid herstellt.

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