DE112008003552T5 - Thermocycler instrument and method for performing PCR - Google Patents
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Abstract
Ein thermisches Thermozykler-Instrument zur Durchführung eines Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Verfahrens in biologischen Proben unter vordefinierten Verfahrensparametern, wobei die biologischen Proben in einem Probenträger mit einer Vielzahl von Proben-Räume, die jede obere und untere Enden haben, aufgenommen sind, wobei das Instrument umfasst:
– Wärmeübertragungs-Mittel für automatisches Erwärmen und Abkühlen der Proben in dem Probenträger,
– beheizbare Verschluss-Mittel oberhalb der oberen Enden der Proben-Räume für das Verhindern von Kondensation von Proben-Dampf während des Verfahrens, und
– Mittel zum Anpassen der Temperatur des beheizbaren Verschluss-Mittels abhängig von mindestens einem der Verfahrensparameter.A thermal thermal cycler instrument for performing a polymerase chain reaction (PCR) method in biological samples under predefined process parameters, wherein the biological samples are collected in a sample carrier having a plurality of sample spaces having each top and bottom ends, the instrument comprising:
Heat transfer means for automatically heating and cooling the samples in the sample carrier,
Heated sealing means above the upper ends of the sample spaces for preventing condensation of sample vapor during the process, and
- means for adjusting the temperature of the heated closure means depending on at least one of the process parameters.
Description
Die Erfindung betrifft Thermozykler-Instrumente zum Durchführen von Nukleinsäureamplifikation durch das Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Ein solches Instrument umfasst Mittel zum automatischen Erwärmen und Abkühlen der Proben, die in einem Probenträger enthalten sind, der in das Instrument platziert wird, und beheizbare Verschlussmittel oberhalb der oberen Enden der Probenräume, um Kondensation von Probendampf während des Verfahrens zu verhindern. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein verwandtes Verfahren.The The invention relates to thermal cycler instruments for performing of nucleic acid amplification by the polymerase chain reaction method (PCR). Such an instrument includes means for automatic heating and cooling the samples in a slide contained in the instrument, and heatable Sealing means above the upper ends of the sample spaces, to condensation of sample vapor during the process to prevent. The invention also relates to a related method.
Thermozykler werden für die Amplifizierung von Nukleinsäuren verwendet, die in Probenröhrchen (oder in Vertiefungen) von Mikrotiterplatten oder ähnlichem enthalten sind, indem die Probenröhrchen der Platte, die ein biologisches Reaktionsgemisch enthalten, einem schnellen Temperatur-Zyklisierungsprotokoll unterzogen werden. Für diesen Zweck werden Mikrotiterplatten auf einem thermischen Block platziert, der thermisch mit einem Peltier-Element oder irgendeinem anderen Element, das für thermisches Pumpen (”thermal pumping”) geeignet ist, gekoppelt ist. Da die Proben gewöhnlich die Röhrchen nicht vollständig füllen und die Temperatur der Proben auf 70°C und mehr erhöht ist, findet beträchtliche Verdampfung der Probe statt.thermocycler be used for the amplification of nucleic acids used in sample tubes (or in wells) of microtiter plates or the like by the sample tubes of the plate, which is a biological reaction mixture subjected to a rapid temperature cyclization protocol become. For this purpose, microtiter plates are placed on a thermal block placed thermally with a Peltier element or any other element used for thermal pumping ("Thermal pumping") is coupled. Because the samples are usually not complete the tubes fill and the temperature of the samples to 70 ° C and more is increased, finds considerable evaporation the sample instead.
Erwärmte
Deckel, die auf der Oberseite der Probenplatte eingeführt
werden können, wenn die Platte einmal an der richtigen
Stelle auf dem thermischen Block ist, werden bei Thermozyklern eingeführt,
um Kondensation, die sich innerhalb des Röhrchens bildet,
zu verhindern. Bisher wurde ein Ölüberzug verwendet,
um zu verhindern, dass der Wasserdampf auf den Innenwänden
des Röhrchens, das über den erwärmten
Probenblock hervorsteht, und somit kälter und anfällig
für Kondensationsansammlung war, kondensiert. Diese Kondensation
könnte potentiell eine negative Wirkung auf die biologische
Reaktion haben, indem sie die Konzentration der Reaktanten an der
Unterseite des Röhrchens bis zu dem Punkt erhöht,
bei dem die Reaktion fehlschlagen könnte, oder könnte
falsche Ergebnisse einführen.
Thermozykler
und Gefäße für PCR sind traditionsgemäß so
entworfen worden, dass die Röhrchen ein hohes Profil haben,
wobei ein ausreichender Abstand zwischen der oberen Oberfläche
der biologischen Probe und der unteren Oberfläche des erwärmten
Deckels gelassen wird. Außerdem wurde die obere Oberfläche
der biologischen Probe häufig unterhalb des Niveaus des
Probenblocks gehalten. Bei solchen Designs war das Niveau der zulässigen
Deckeltemperaturvariabilität häufig über
einen weiten Bereich von recht hohen Temperaturen wirksam, typischerweise
zwischen 95°C und 115°C. Zum Beispiel offenbaren
Neueste Entwicklungen auf dem Gebiet der Thermozykler und Reaktionsgefäße haben zur Reduktion der Probenvolumen und zur Verringerung der Röhrchen-Profile geführt. Jedoch wurde ebenfalls eine unerwartete und bisher nicht beschriebene Verschlechterung von Messergebnissen aufgrund dieses neuen Kurses an Design beobachtet.Latest Developments in the field of thermocyclers and reaction vessels have to reduce the sample volume and reduce the tube profiles guided. However, it has also been an unexpected and so far not described deterioration of measurement results due observed this new course in design.
Es ist ein Ziel der Erfindung ein neues und robusteres Thermozykler-Design bereitzustellen, insbesondere für PCR Untersuchungen mit geringem Volumen (0.01–50 ul/Röhrchen, typischerweise < 20 ul/Röhrchen, insbesondere 1–10 ul/Röhrchen).It One object of the invention is a new and more robust thermal cycler design to provide, in particular for PCR investigations with low volume (0.01-50 μl / tube, typically <20 μl / tube, in particular 1-10 μl / tube).
Es ist ebenfalls ein Ziel der Erfindung ein PCR Verfahren bereitzustellen, das die Robustheit der PCR Amplifizierungsreaktionen, die in Thermozyklern durchgeführt werden, verbessert.It is also an object of the invention to provide a PCR method, the robustness of PCR amplification reactions in thermocyclers be improved.
Die Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass die Wärme, die durch den erwärmten Deckel bereitgestellt wird, nicht nur Verdampfung verhindert, sondern ebenfalls durch ihren Beitrag zur Temperatur der Probe eine signifikante Wirkung auf den Verlauf der Reaktion hat. Die Erfindung stellt eine Lösung bereit, bei der die Temperatur des erwärmten Deckels individuell auf das Verfahren eingestellt wird, das gegenwärtig mit der Vorrichtung durchgeführt wird, abhängig von den Verfahrensbedingungen. Dieses steht im Gegensatz zu der bestehenden Praxis, gemäß der die Temperatur des erwärmten Deckels bei einer vordefinierten „Instrumentspezifischen” Temperatur gehalten worden ist, unabhängig von den vorherrschenden Verfahrensparametern. Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass sogar eine relativ kleine Änderung der Deckel-Temperatur einen großen Verbesserungs-Effekt auf die Effizienz der Reaktionen haben kann.The Invention is based on the knowledge that the heat, the provided by the heated lid, not only Evaporation prevented, but also by their contribution to Temperature of the sample has a significant effect on the course of the Reaction has. The invention provides a solution at the temperature of the heated lid individually is set to the procedure currently with the device is performed, depending on the process conditions. This is in contrast to the existing one Practice, according to the temperature of the heated Lids at a predefined "instrument-specific" temperature has been held, regardless of the prevailing Process parameters. Surprisingly, it has turned out that even a relatively small change in the lid temperature one great improvement effect on the efficiency of the reactions may have.
Das Thermozykler-Instrument gemäß der Erfindung ist für das Durchführen eines Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Verfahrens in biologischen Proben unter vordefinierten Verfahrensparametern vorgesehen, wobei die biologischen Proben in einem Probenträger mit einer Vielzahl von Probenräumen, die ein offenes oberes Ende haben, aufgenommen sind. Folglich umfasst das Instrument Wärmeübertragungs-Mittel für automatisches Erwärmen und Abkühlen der Proben in dem Probenträger und beheizbare Verschluss-Mittel, wie eine Deckel-Platte, über den oberen Enden der Probenräume, um Kondensation von Probendampf während des Verfahrens zu verhindern. Weiter sind Mittel für das Anpassen der Temperatur des beheizbaren Verschluss-Mittels bereitgestellt, abhängig von mindestens einem der Verfahrensparameter.The thermocycler instrument according to the invention is for performing a polymerase chain Reaction (PCR) method provided in biological samples under predefined process parameters, wherein the biological samples are recorded in a sample carrier having a plurality of sample spaces having an open upper end. Thus, the instrument includes heat transfer means for automatically heating and cooling the samples in the sample carrier and heatable sealing means, such as a lid plate, above the upper ends of the sample spaces to prevent condensation of sample vapor during the process. Further, means are provided for adjusting the temperature of the heatable sealant, depending on at least one of the process parameters.
Die oben genannten Verfahrensparameter können eines oder mehrere der Folgenden umfassen: Menge der Probe in den Probenräumen, verwendetes Temperatur-Zyklisierungs-Protokoll, Typ des Probenträgers, Typ des Wärmeübertragungs-Mittels, Typ des Verschlusses, der für das Verschließen der oberen Enden der Probenräume verwendet wird, Typ des Enzyms. Abgesehen von dem Typ des Enzyms, können alle aufgeführten Parameter in Frage kommen, die Probentemperatur während des Verfahrens zu beeinflussen.The above process parameters may be one or more of the following: amount of sample in the sample spaces, used temperature cyclization protocol, type of sample carrier, type the heat transfer medium, type of closure, the for closing the upper ends of the sample spaces used, type of enzyme. Apart from the type of enzyme, all listed parameters can be considered, to influence the sample temperature during the procedure.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist einer der Verfahrensparameter, der in Betracht gezogen wird, wenn die Deckel-Temperatur angepasst wird, die Menge der Probe in den Probenräumen. Weiter kann das Instrument angepasst werden, um die Temperatur des beheizbaren Verschluss-Mittels für eine erste Menge der Probe niedriger festzusetzen, als für eine zweite Menge der Probe, wenn die erste Menge der Probe höher ist als eine zweite Menge der Probe. Je näher das Oberflächenniveau der Probe zum erwärmten Deckel ist, je niedriger ist somit die Temperatur des Deckels.According to one preferred embodiment is one of the process parameters which is taken into account when adjusting the lid temperature is the amount of sample in the sample spaces. Next can the instrument can be adjusted to the temperature of the heated Closure agent lower for a first amount of the sample to fix, as for a second amount of the sample, if the first amount of the sample is higher than a second amount the sample. The closer the surface level of the Sample to the heated lid is, the lower it is the temperature of the lid.
In dem Verfahren gemäß der Erfindung werden biologische Proben unter vordefinierten Verfahrensparametern gemäß des PCR Verfahrens behandelt, wobei die biologischen Proben in einem Probenträger mit einer Vielzahl von Probenräumen, die ein offenes oberes Ende haben, aufgenommen sind. Das Verfahren umfasst das sequentielle Erwärmen und Abkühlen der Proben in dem Probenträger, während die Kondensation von Probendampf innerhalb der Probenräume während des Verfahrens verhindert wird, indem Wärme zu den oberen Enden der Proben bereitgestellt wird, wobei die Menge der Wärme basierend auf mindestens einem der Verfahrensparametern bestimmt wird.In The method according to the invention will be biological Samples under predefined process parameters according to Treated PCR method, with the biological samples in one Sample carrier with a large number of sample spaces, which have an open top end are included. The procedure includes sequential heating and cooling of the samples in the sample holder, while the condensation of Sample vapor within the sample chambers during The process is prevented by adding heat to the top Ends of the samples is provided, with the amount of heat determined based on at least one of the process parameters becomes.
Überlegungen auf einem allgemeineren Level, bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Durchführung von PCR Reaktionen, bei denen eine Änderung bei irgendeinem oder mehreren der Verfahrensparameter durch Anpassen von einem oder mehreren der anderen Verfahrensparameter kompensiert werden kann, um unerwünschte Wirkungen der Änderung, wie zum Beispiel Verringern der Ausbeute des Produkts der Nukleinamplifikation, zu verhindern. In diesem generischen Modell kann die Temperatur des Deckels ebenfalls als ein Verfahrensparameter mit eingeschlossen werden (entweder ein passiver (unberührter) Parameter, ein Parameter, der kompensiert werden soll, oder ein kompensierender Parameter). Zusätzlich zur Temperatur des Deckels, liegen alle oben aufgeführten Parameter und ebenfalls andere Parameter, die zur Temperatur der Probe beitragen, innerhalb des Modells. Aufgrund ihrer Effizienz und gewerblichen Anwendbarkeit, wird die Deckel-Temperatur in diesem Dokument häufig als der (oder einer der) kompensierende Parameter (Parameter) bezeichnet.considerations on a more general level, the present invention provides a method for performing PCR reactions, in a change in any one or more of the process parameters by adjusting one or more of the other process parameters can be compensated for undesirable effects of the change, such as decreasing the yield of the product of the nucleic amplification, to prevent. In this generic model, the temperature can the lid also included as a process parameter be either a passive (untouched) parameter, a parameter to be compensated, or a compensating one Parameter). In addition to the temperature of the lid, lie all the parameters listed above and also other parameters, that contribute to the temperature of the sample, within the model. by virtue of Their efficiency and industrial applicability, the lid temperature is in this document often as the (or one of) compensating Parameter (parameter).
Die Erfindung erlaubt zum Beispiel, dass irgendwelche der folgenden Beziehungen in Betracht zu ziehen sind, um die gewünschten Ergebnisse des PCR Verfahrens zu erhalten (typischerweise die höchstmögliche Ausbeute):
- – Abhängigkeit der Temperatur der Probe von dem Probenvolumen durch Anpassen der Temperatur des erwärmten Deckels (zunehmendes Probenvolumen wird kompensiert durch abnehmende Deckel-Temperatur und umgekehrt),
- – Abhängigkeit der Temperatur der Probe von der Art eines Probenträgers durch Anpassen der Temperatur des erwärmten Deckels (höhere Wärmeleitzahl des Probenträgers wird kompensiert durch Verringern der Deckel-Temperatur und umgekehrt),
- – Abhängigkeit der Temperatur der Probe von dem verwendeten Verschluss-Mittel durch Anpassen der Temperatur des erwärmten Deckels (höhere Wärmeleitzahl des Verschluss-Mittels wird kompensiert, durch Verringern der Deckel-Temperatur und umgekehrt),
- – irgendeine Kombination, Aggregation oder Variation der oben genannten Beziehungen, einschließlich der Substitution irgendeines der Parameter, die mit dem verwendeten Temperatur-Zyklisierungs-Protokoll oder dem Typ des verwendeten Wärmeübertragungs-Mittels gelistet sind.
- Dependence of the temperature of the sample on the sample volume by adjusting the temperature of the heated lid (increasing sample volume is compensated by decreasing lid temperature and vice versa),
- Dependence of the temperature of the sample on the type of a sample carrier by adjusting the temperature of the heated lid (higher thermal conductivity of the sample carrier is compensated by lowering the lid temperature and vice versa),
- Dependence of the temperature of the sample on the sealing means used by adjusting the temperature of the heated lid (higher heat conductivity of the closure means is compensated, by lowering the lid temperature and vice versa),
- Any combination, aggregation or variation of the above relationships, including the substitution of any of the parameters listed with the temperature cycling protocol or type of heat transfer agent used.
Des Weiteren können unter Verwendung desselben Prinzips die folgenden Beziehungen in Betracht gezogen werden:
- – Abhängigkeit der Leistung des/der Polymeraseenzyms(e) von der Temperatur der Probe, die durch irgendeine der oben genannten Wechselwirkungen beeinflusst wird,
- – Abhängigkeit der Ausbeute des Verfahrens von der Temperatur der Probe, die durch irgendeine der oben genannten Wechselwirkungen beeinflusst wird.
- Dependence of the performance of the polymerase enzyme (s) on the temperature of the sample as determined by ir one of the above interactions is affected,
- Dependence of the yield of the method on the temperature of the sample, which is influenced by any of the above-mentioned interactions.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung, wird somit ein verbessertes Verfahren für Nukleinsäureamplifikation gemäß dem PCR Verfahren, das in einem Thermozykler-Instrument durchgeführt wird, das ein Reaktionsgemisch unter einer Anzahl von Verfahrensparametern enthält, bereitgestellt, wobei mindestens ein erster Verfahrensparameter bestimmt wird, bevor der Thermozykler unter Verwendung mindestens eines zweiten Verfahrensparameters gestartet wird, wobei mindestens einer des ersten/zweiten Verfahrensparameters ein Verfahrensparameter ist, der eine Wirkung auf die Temperatur des Reaktionsgemischs hat.According to one Aspect of the invention, thus becomes an improved method for Nucleic acid amplification according to the PCR method, which is performed in a thermocycler instrument, this is a reaction mixture under a number of process parameters contains, wherein at least one first process parameter is determined before the thermocycler using at least a second method parameter is started, wherein at least one of the first / second process parameters is a process parameter is that has an effect on the temperature of the reaction mixture.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung, ist der erste Verfahrensparameter (d. h. der kompensierende Verfahrensparameter) ein Parameter, der eine Wirkung auf die Temperatur des Reaktionsgemischs hat.According to one Another aspect of the invention is the first process parameter (i.e., the compensating process parameter) is a parameter that has an effect on the temperature of the reaction mixture.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung, ist der zweite Verfahrensparameter (d. h. der kompensierte Verfahrensparameter) ein Parameter, der eine Wirkung auf die Temperatur des Reaktionsgemischs hat.According to one Another aspect of the invention is the second process parameter (i.e., the compensated process parameter) a parameter that has an effect on the temperature of the reaction mixture.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung, ist der erste oder zweite Verfahrensparameter ein Parameter, der keine Wirkung auf die Temperatur des Reaktionsgemischs hat, wie der Typ des verwendeten Polymeraseenzyms.According to one Another aspect of the invention is the first or second process parameters a parameter that has no effect on the temperature of the reaction mixture has, like the type of polymerase enzyme used.
Die Erfindung stellt signifikante Vorteile bereit. Bei der Beobachtung von PCR-Reaktionen mit geringem Volumen, hat man herausgefunden, dass sogar kleine Variationen in der thermischen Verteilung innerhalb der Probe in Bezug auf den Erfolg des Experimentes kritisch sein können. Die Erfindung berücksichtigt Änderungen in der thermischen Umgebung, die von einer Messung zur anderen variieren kann, wobei deshalb die Vorhersagbarkeit und die Wiederholbarkeit der Experimente verbessert werden. Die Idee der Ausbildung des erwärmten Deckels (oder irgendeines anderen Wärme-beeinflussenden Teils des Systems) als ein Reaktions-ausgleichendes thermisches Element, ist eine Lösung, die wirkungsvoll ist und einfach bei einer neuen und bestehenden Instrumentkonfigurationen zu implementieren ist. Obwohl das vorliegende Design von besonderer Wichtigkeit für einen Thermozykler mit hoher Leistung, geringem Volumen ist, stellt es erhöhte Robustheit sogar im Falle von Reaktionen mit größerem Volumen bereit.The Invention provides significant advantages. At the observation low-volume PCR reactions, it has been found that even small variations in the thermal distribution within the Sample can be critical in terms of the success of the experiment. The invention takes into account changes in the thermal environment, which vary from one measurement to another can, therefore, the predictability and the repeatability the experiments are improved. The idea of training the heated Lids (or any other heat-influencing Part of the system) as a reaction-compensating thermal Element, is a solution that is effective and easy to implement in a new and existing instrument configurations is. Although the present design is of particular importance to a thermocycler with high performance, low volume is, provides it also increases robustness even in the case of reactions larger volume ready.
Wir sind in der Lage gewesen, einige Experimente erfolgreich unter Verwendung des vorliegenden Ansatzes durchzuführen, die unter Verwendung von Techniken aus dem Stand der Technik fehlgeschlagen sind. Dieses wird durch Beispiele, die später in diesem Dokument beschrieben werden, bewiesen. In Kürze, bisheriges Erhöhen oder Verringern des Probenvolumens von einem bestimmten Volumen hat in einer schwachen Amplifizierungsreaktion resultiert. Indem man die vorliegende Erfindung verwendete, ist diese Änderung im Volumen nur durch Anpassen der entsprechenden Deckel-Temperatur kompensiert worden. Auf der anderen Seite haben wir herausgefunden, dass aufgrund ihrer intrinsischen Eigenschaften (zum Beispiel niedrige Prozessivität), die meisten Enzyme, die im PCR verwendet werden, für die Temperatur und die thermischen Unregelmäßigkeiten innerhalb der Probe empfindlich sind. Dieses Problem kann ebenfalls unter Verwendung der vorliegenden Erfindung gelöst werden. Es hat sich ebenfalls gezeigt, dass der Typ der Mikrotiterplatte ein Parameter ist, der in dem vorliegenden Ansatz berücksichtigt werden kann. Das heißt, die Erfindung verbessert die Reaktionen in Bezug auf einen sehr breiten Bereich von Variablen.We have been able to successfully use some experiments of the present approach, using of prior art techniques have failed. This is exemplified by examples later in this document be proved. In short, previous increase or reducing the sample volume from a certain volume has resulted in a weak amplification reaction. By doing When using the present invention, this change is in volume only by adjusting the corresponding lid temperature been compensated. On the other hand, we found out that due to their intrinsic properties (for example, low Processivity), most of the enzymes used in PCR be, for the temperature and the thermal irregularities within the sample are sensitive. This problem can also be be solved using the present invention. It has also been shown that the type of microtiter plate is a parameter considered in the present approach can be. That is, the invention improves the reactions in terms of a very wide range of variables.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Temperatur des erwärmten Deckels für ein bevorstehendes Amplifizierungsverfahren durch einen mathematischen Algorithmus, der in die Hardware oder Software des Thermozyklers implementiert ist, bestimmt. Der Algorithmus ist so entworfen, dass die Temperatur des erwärmten Deckels für das Volumen der Reaktion und optional den Typ des verwendeten Gefäßsystems und/oder anderer Parameter optimiert ist, wobei sowohl die nachteilige Wirkung der Probenverdampfung als auch die Wirkungen der Wärmeübertragung vom Deckel zur Probe berücksichtigt wird. Für eine optimale Leistung muss eine Balance zwischen diesen Phänomenen gefunden werden. In der Praxis erfordert das Erreichen der Balance gewöhnlich, dass die Kondensation-verhindernde Wirkung des erwärmten Deckels für die thermische Gleichmäßigkeit der Probe leicht beeinträchtigt („compromised”) wird.According to one preferred embodiment, the temperature of the heated Lids for an upcoming amplification process through a mathematical algorithm that works in hardware or software of the thermal cycler is implemented. The algorithm is designed so that the temperature of the heated lid for the volume of the reaction and optionally the type of used Vascular system and / or other parameters optimized is, with both the adverse effect of the sample evaporation as also the effects of heat transfer from the lid is taken into account for the sample. For optimal performance a balance must be found between these phenomena. In practice, achieving balance usually requires that the condensation-preventing effect of the heated Lids for thermal uniformity the sample slightly compromised becomes.
Man hat herausgefunden, dass das Probenvolumen der wichtigste Faktor ist, wenn die Deckel-Temperatur bestimmt wird. Dies liegt daran, dass der Kopfraum und somit der Zwischenraum zwischen der oberen Oberfläche der biologischen Reaktion und der unteren Oberfläche der erwärmten Deckel-Platte in den neusten Zyklern und Gefäßdesigns signifikant verringert wurde. Die Gründe für diese Verringerung in verschlossenem Luftvolumen sind die Menge von verdampftem Wasser innerhalb des Röhrchens, was ermöglicht, das geringere Probenvolumen verwendet werden können, und ebenfalls, das Potential für Kondensation zu akkumulieren entlang den Innenwänden des Röhrchens für sehr geringe Volumenreaktionen, zu minimieren. Spezifischer ist das Problem, das durch ein solches Design verursacht wird, dass die Hitze, die von dem erwärmten Deckel zur biologischen Probe beiträgt, mit einer variablen Geschwindigkeit, die von dem Volumen der Reaktionen abhängt, transferiert wird, und somit die Überdistanz zwischen der Oberseite der biologischen Probe und der Unterseite des beheizten Deckels. Wärmeübertragung scheint sowohl von einer strahlenden als auch leitenden Form zu sein, so das Material und Geometrie der Reaktionsplatte ebenfalls eine beitragende Rolle bei dieser Wärmeübertragung spielen. Abhängend von dem Volumen der Reaktion, dem Material des Röhrchens und der Verschluss-Einheit und dem Probenhalter-Typ des Thermozyklers, kann genügend Wärme zu der Probe transferiert werden, um Änderungen von bis zu 5°C in der Massenprobentemperatur, verglichen mit erwarteten Ergebnissen, zu verursachen.It has been found that sample volume is the most important factor when determining the lid temperature. This is because the head space and thus the gap between the upper surface of the biological reaction and the lower surface of the heated lid plate has been significantly reduced in the latest cyclers and vessel designs. The reasons for this reduction in occluded air volume are the amount of evaporated water within the tube, which allows the clotting sample volume, and also to minimize the potential for condensation to accumulate along the inner walls of the tube for very low volume reactions. More specifically, the problem caused by such a design is that the heat contributing from the heated lid to the biological sample is transferred at a variable rate depending on the volume of the reactions, and thus the over-distance between the top the biological sample and the underside of the heated lid. Heat transfer appears to be of both a radiative and conductive form, so the material and geometry of the reaction plate also play a contributory role in this heat transfer. Depending on the volume of the reaction, the material of the tube and the closure unit and sample holder type of the thermal cycler, enough heat can be transferred to the sample to detect changes of up to 5 ° C in the bulk sample temperature compared to expected results. to cause.
Für eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit Slide-Größe („slide-sized”) (ungefähr 1/4 einer SBS Mikrotiterplatte mit Standardgröße), die mit dem Finnzymes Instruments PikoTM Thermozykler kompatibel ist, ist der Zwischenraum für 25 ul Reaktionsvolumen ungefähr 5.7 mm, für 10 ul Reaktionsvolumen ungefähr 8.0 mm und für 1 ul Reaktionsvolumen ungefähr 10.6 mm. Somit kann gesehen werden, dass die relative Zwischenraumvariation zwischen dem Oberflächenniveau der Probe und dem beheiztem Deckel signifikant ist.For a 96-well slide-sized microtiter plate (about 1/4 of a standard size SBS microtiter plate) compatible with the Finnzymes Instruments Piko ™ thermocycler, the clearance for 25 μl reaction volume is about 5.7 mm for 10 μl reaction volume about 8.0 mm and for 1 μl reaction volume about 10.6 mm. Thus, it can be seen that the relative gap variation between the surface level of the sample and the heated lid is significant.
Außerdem ist das Wärmemuster in den Proben so, dass ein vertikaler Gradient der Temperatur innerhalb der Probe jedes Röhrchens verursacht wird. Für hohe erwärmte Deckel Temperaturen (in diesem Fall über 90°C) macht dies das Erhalten thermischer Daten von der Probe sehr schwierig und ist anfällig für große Fehler. Diese Messfehler innerhalb der Probe werden überwiegend durch Einschränkungen im Design der Mess-Instrumentierung verursacht, so dass genaue Änderungen in der thermischen Sondenplatzierung von so wenig wie 1 mm signifikanten Änderungen in der gemessenen Temperatur der Probe verursachen können. Zusätzlich garantiert die Verwendung der optimalen Bulkproben-Temperatur für, Proben mit großen vertikalen thermischen Gradienten keinen Erfolg, da sich die Reaktion thermisch sehr wenig während der typischen Zyklisierungs-Protokolle mischt, und die resultierenden Reaktionseffizienzen geringer als gewünscht sein können.Furthermore is the heat pattern in the samples so that a vertical Gradient of the temperature within the sample of each tube is caused. For high heated lid temperatures (in this case over 90 ° C) this makes the receiving Thermal data from the sample is very difficult and prone for big mistakes. These measurement errors within the Sample are predominantly by restrictions caused in the design of the measurement instrumentation, making accurate changes in the thermal probe placement of as little as 1 mm significant changes in the measured temperature of the sample. In addition, the use of the optimal bulk sample temperature guarantees for, samples with large vertical thermal Gradients no success, since the reaction thermally very little during the typical cyclization protocols mixing, and the resulting reaction efficiencies lower than desired could be.
Um die Vorteile der Erfindung zusammenzufassen, ermöglicht die Erfindung den Unterschied in der Temperatur zwischen dem erwärmten Deckel und dem Thermozykler-Probenblock zu minimieren, so dass eine Balance zwischen der Kondensationsbildung auf den Innenwänden des Röhrchens und der beitragenden Wärmeübertragung vom Deckel zum Probe innerhalb des Röhrchens betroffen ist.Around to summarize the advantages of the invention allows the invention the difference in temperature between the heated Lid and the thermocycling sample block to minimize, leaving a Balance between the formation of condensation on the inner walls of the tube and the contributing heat transfer affected by the lid to the sample inside the tube is.
Der Begriff „Zwischenraum”, wenn nicht anders erwähnt oder der Kontext vorschlägt, betrifft den vertikalen Abstand zwischen der Oberseite der Probenflüssigkeit innerhalb des Reaktionsraums und der unteren Oberfläche der erwärmten Platte über der Probenflüssigkeit. Der Zwischenraum hängt natürlich von der Menge der Probe innerhalb des Probenraums ab. Aufgrund der Form der Röhrchen, die die Probenräume bilden, ist die Beziehung jedoch gewöhnlich nicht linear.Of the Term "space", unless otherwise stated or the context suggests concerns the vertical distance between the top of the sample fluid inside the reaction space and the lower surface of the heated Plate over the sample liquid. The gap Of course, this depends on the amount of sample inside from the sample room. Due to the shape of the tubes, the However, the relationship is common not linear.
Mit „Reaktionen mit geringem Volumen”, meinen wir hauptsächlich Reaktionen mit einem Reaktionsvolumen geringer als 20 ul, insbesondere zwischen 10 nl und 10 ul pro Röhrchen. Somit ist die Erfindung insbesondere für (SBS) Mikrotiterplatten mit Standardgröße mit 384 Vertiefungen und Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit Mikroskop Slide-Größe (ungefähr 1/4 der Standard SBS Platte) und dichteren Platten geeignet.With "reactions with low volume, "we mean mainly Reactions with a reaction volume less than 20 ul, in particular between 10 nl and 10 μl per tube. Thus, the invention especially for (SBS) standard size microtiter plates with 384 wells and 96-well microtiter plates Microscope slide size (about 1/4 of the Standard SBS plate) and denser plates.
Der Begriff „Temperatur der Probe” und gleichwertige Ausdrücke werden verwendet, um sowohl die Gesamttemperatur (Mittel) der Probe als auch die nicht-gleichmäßige Temperaturverteilung, die eventuell innerhalb der Probe vorliegt, zu beschreiben.Of the Term "temperature of the sample" and equivalent Expressions are used to indicate both the total temperature (Mean) of the sample as well as the non-uniform Temperature distribution that may be present within the sample, to describe.
Mit „Typen” der Verschluss-Einheit oder des Probenträgers oder des Probenblocks meinen wir hauptsächlich ihre Charakteristika in Bezug zu Wärmeleitfähigkeit, insbesondere Material und Geometrie.With "types" of Closure unit or the sample carrier or sample block we are mainly talking about their characteristics to thermal conductivity, especially material and Geometry.
Die „Anpassungs-Mittel”, die für Festsetzen der Temperatur der beheizbaren Verschluss-Mittel verwendet werden, können irgendeine Art eines geeignete Steuersystems sein, das funktionell mit einem Heizelement der beheizbaren Verschluss-Mittel verbunden ist (zum Beispiel ein Widerstand, ein Peltier-Element oder Heiz-Kanal, der thermisch mit den Verschluss-Mitteln verbunden ist), um dessen Temperatur zu regulieren, die für mindestens einen anderen Verfahrensparameter ansprechbar ist. Insbesondere können die Anpassungs-Mittel so konfiguriert sein, um die Temperatur des beheizbaren Verschluss-Mittels zu halten und weiter den Verschluss des Probenträgers unter 94, insbesondere unter 90°C.The "adjustment funds", the for fixing the temperature of the heated closing means can be used any kind of suitable Control system that is functional with a heating element of the heated Closure means is connected (for example, a resistor, a Peltier element or heating channel that thermally with the closure means connected) to regulate its temperature for at least one other process parameter can be addressed. Especially For example, the adjustment means may be configured to be the same Keep the temperature of the heated sealant and continue the Closure of the sample holder under 94, in particular below 90 ° C.
Als Nächstes werden die Ausführungsformen der Erfindung genauer mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.When Next will be the embodiments of the invention described in more detail with reference to the accompanying drawings.
Die unten beschriebenen Ausführungsformen betreffen alle Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Verfahren, die in einem Thermozykler durchgeführt werden. In dem Verfahren werden biologische Proben in einem Probenträger aufgenommen, wie zum Beispiel eine Mikrotiterplatte, der eine Vielzahl von Probenräumen hat, wobei jeder obere und untere Enden hat und die Proben sequentiell erwärmt und abgekühlt werden. Der Thermozykler umfasst Wärmeübertragungs-Mittel für automatisches Erwärmen und Abkühlen der Proben in dem Probenträger, beheizbares Verschluss-Mittel oberhalb der oberen Enden der Probenräume, um Kondensation von Probendampf während des Verfahrens zu verhindern. Bevor die zyklische Nukleinamplifikations-Phase des Verfahrens begonnen wird, wird mindestens ein Verfahrensparameter, vorzugsweise die Temperatur der beheizbaren Verschluss-Mittel, basierend auf mindestens einem anderen Verfahrensparameter angepasst. Die Erfindung kann zum Verringern der Anzahl fehlgeschlagener PCR Experimente verwendet werden, insbesondere aufgrund von Änderungen im Probenvolumen.The embodiments described below relate to all polymerase chain reaction (PCR) methods, which are carried out in a thermocycler. In the process biological samples are taken in a sample carrier, such as a microtiter plate containing a variety of sample spaces has, each having upper and lower ends and the samples sequentially heated and cooled. The thermal cycler includes heat transfer means for automatic heating and cooling of the samples in the sample holder, heated closure means above the upper ends of the sample chambers to condensation of sample vapor during the procedure. Before the cyclical Nucleic amplification phase of the procedure is started, at least a process parameter, preferably the temperature of the heated Closure means based on at least one other process parameter customized. The invention can be used to reduce the number of failed PCR experiments are used, in particular due to changes in the sample volume.
Normalerweise
werden Dichtungsmittel, das heißt, individuelle Verschlusskappen,
Aufleimer („cap strips”), eine Kappenplatte oder
ein ebener Dichtungsfilm oder -platte, typischerweise aus Polymermaterial,
an den offenen Enden der Reaktionsräume oberhalb der Plattform
Gemäß einer Ausführungsform werden Rechen-Mittel, die angepasst sind, um einen Algorithmus für die Bestimmung der optimalen Deckel-Temperatur und -mittel für das automatische Anpassen der Temperatur des erwärmten Deckels basierend auf dem Ausgang des Algorithmus auszuführen, bereitgestellt. Der Algorithmus kann basierend auf einer Reihe von Faktoren errichtet werden, hauptsächlich einschließlich des Blockformats des Systems, des Volumens der Reaktion, des Typs des Gefäßes, des Typ der verwendeten Verschluss-Einheit und der programmierten Temperatur des Protokolls. Einige dieser Parameter können vom Werk eingestellt werden (und somit integral zu dem Algorithmus als konstante Faktoren implementiert werden), während einige vom Benutzer des Instrumentes durch Benutzeroberflächen-Mittel (als Variablen) erhalten werden. Alternativ sind alle diese Parameter Benutzer-definierbar. Die Variablen können sich von Lauf zu Lauf in dem gleichen System unterscheiden, und somit wird die Temperatur des erwärmten Deckels vorzugsweise neuformuliert, wenn eine oder mehrere dieser Variablen geändert werden.In one embodiment, computing means adapted to execute an algorithm for determining the optimum lid temperature and means for automatically adjusting the temperature of the heated lid based on the output of the algorithm are provided. The algorithm can be built based on a number of factors, mainly including the block format of the system, the volume of the reaction, the type of vessel, the type of Ver final unit and the programmed temperature of the protocol. Some of these parameters can be factory set (and thus implemented integrally with the algorithm as constant factors), while some are obtained by the user of the instrument through user interface means (as variables). Alternatively, all these parameters are user-definable. The variables may differ from run to run in the same system, and thus the temperature of the heated lid is preferably reformulated when one or more of these variables are changed.
Unter Verwendung des vorliegenden Ansatzes kann die Gesamttemperatur des erwärmten Deckels für Proben mit kleinem Volumen kontinuierlich bei oder unter 94°C gehalten werden, insbesondere bei oder unter 90°C, vorzugsweise zwischen 50°C und 90°C, ohne die Gesamtleistung des Instrumentes zu beeinträchtigen.Under Using the present approach, the total temperature of the heated lid for small volume samples be kept continuously at or below 94 ° C, in particular at or below 90 ° C, preferably between 50 ° C and 90 ° C without affecting the overall performance of the instrument.
Die Temperatur des beheizbaren Verschluss-Mittels kann eine lineare oder ungefähr lineare Abhängigkeit von der Menge der Probe haben. Somit kann die Temperatur der Formel T = T0 – aV folgen, wobei T die Temperatur des beheizbaren Verschluss-Mittels ist, T0 eine vordefinierte konstante Temperatur ist, a eine Konstante ist und V das Volumen der Probe in jedem der Probenräume ist. Es hat sich gezeigt, das linear implementierte Abhängigkeit recht gute Resultate im üblichen Fall ergibt, bei dem obere Teile der Röhrchen einen konstanten Querschnittsbereich haben (zum Beispiel zylinderförmig oder nur leicht konisch). In solchen Systemen ist das Volumen der Probe direkt zu dessen Oberflächenniveauhöhe proportional. Trotz der Einfachheit dieses Modells, hat es sich als sehr wirkungsvoll erwiesen. Die Erfindung ist jedoch nicht auf irgendein spezielles Modell begrenzt, da, wie von einem Fachmann verstanden wird, andere Typen von Temperaturanpassungsalgorithmen ebenfalls verwendet werden können. Gemäß einer alternativen Ausführungsform ist die Abhängigkeit nicht linear.The temperature of the heatable sealant may have a linear or approximately linear dependence on the amount of sample. Thus, the temperature may follow the formula T = T 0 - aV, where T is the temperature of the heatable sealant, T 0 is a predefined constant temperature, a is a constant, and V is the volume of the sample in each of the sample spaces. It has been found that the linearly implemented dependence gives quite good results in the usual case, in which upper parts of the tubes have a constant cross-sectional area (for example cylindrical or only slightly conical). In such systems, the volume of the sample is directly proportional to its surface level height. Despite the simplicity of this model, it has proven to be very effective. However, the invention is not limited to any particular model since, as will be understood by one skilled in the art, other types of temperature adjustment algorithms may also be used. According to an alternative embodiment, the dependence is not linear.
Gemäß einer Ausführungsform wird die Temperatur des erwärmten Deckels während des Verfahrens variiert, abhängig von der Phase des PCR Zyklus. Vorzugsweise wird die Deckel-Temperatur parallel zu der Temperatur des Thermoblockes kontrolliert, d. h. die Deckel-Temperatur wird verringert, wenn die Proben abgekühlt werden, und erhöht, wenn die Proben erwärmt werden.According to one Embodiment is the temperature of the heated Lids varied during the procedure, depending from the phase of the PCR cycle. Preferably, the lid temperature controlled in parallel to the temperature of the thermoblock, d. H. the lid temperature is lowered when the samples are cooled and increases as the samples are heated.
Das beheizbare Verschluss-Mittel, d. h. der Deckel, umfasst vorzugsweise eine planare Platte, die eng an die oberen Enden der Probenräume angebracht ist, um die gesamte Platte gleichzeitig zu bedecken. Zwischen dem Deckel und dem Gefäß kann ein zusätzliches Dichtungsmittel bereitgestellt werden, wie zum Beispiel Röhrchenkappen oder ein Polymerfilm, der an das Gefäß angeklebt oder gebunden ist, um eine permanentere Dichtung bereitzustellen. Eine solche Dichtung verhindert auch Verschmutzung der Proben, wenn das Gefäß nicht in dem Zykler platziert ist und unter dem Deckel gehalten wird. Die thermischen Eigenschaften des zusätzlichen Dichtungsmittels können als einer der Parameter verwendet werden, die eine Wirkung auf die Deckel-Temperatur haben.The heated closure means, d. H. the lid preferably comprises a planar plate that fits tightly to the upper ends of the sample spaces is attached to cover the entire plate at the same time. Between the lid and the vessel can be an additional Sealants are provided, such as tube caps or a polymer film adhered to the vessel or bound to provide a more permanent seal. Such a seal also prevents contamination of the samples when the vessel is not placed in the cycler and is held under the lid. The thermal properties of the additional Sealant can be used as one of the parameters which have an effect on the lid temperature.
Das Wärmeübertragungs-Mittel umfasst typischerweise einen metallischen Block, der so geformt ist, um engen Kontakt mit dem Gefäß bereitzustellen, das einzelne Röhrchen als Vorsprünge auf der unteren Oberfläche davon enthält. Somit wird Wärme durch die Röhrchenunterseite (normalerweise U oder V-geformt) und die Seitenwände für das Maximieren der Temperaturbodengeschwindigkeiten („temperature ramping speeds”) geleitet.The Heat transfer means typically includes a metallic block shaped to make close contact with to provide the vessel, the single tube as protrusions on the lower surface thereof contains. Thus, heat is transmitted through the bottom of the tube (usually U or V-shaped) and the sidewalls for maximizing the temperature floor velocities ("temperature ramping speeds ").
Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Instrument Benutzereingabe-Mittel für das Erlauben manuellen Eingebens von mindestens einem Verfahrensparameter. Das Benutzereingabe-Mittel umfasst typischerweise eine Tastatur oder ein Tastenfeld. Alternativ oder zusätzlich können Detektions-Mittel für das automatische Bestimmen von einem oder mehreren der Verfahrensparameter bereitgestellt werden. Das Detektions-Mittel kann ein Probenoberfläche-Niveau, Volumen oder einen Massedetektor umfassen.According to one Embodiment, the instrument comprises user input means for allowing manual entry of at least one Process parameters. The user input means typically includes a keyboard or keypad. Alternatively or in addition can detection means for automatic Determining one or more of the method parameters provided become. The detection means may be a sample surface level, Volume or a mass detector.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Temperatur des beheizten Deckels so ausgewählt, damit der vertikale thermische Gradient, der innerhalb der Proben während des Verfahrens gebildet wird, verringert wird. Somit wird der durchschnittliche thermische Gradient, der über jedem PCR Temperaturzyklus berechnet wird, verringert, verglichen mit einer Konstante über 90°C, einer Temperatur die herkömmlich verwendet wird.According to one preferred embodiment, the temperature of the heated Lids are selected so that the vertical thermal gradient, which is formed within the samples during the process, is reduced. Thus, the average thermal gradient, which is calculated over each PCR temperature cycle, decreases, compared with a constant above 90 ° C, one Temperature that is conventionally used.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Temperatur des erwärmten Deckels aus dem Bereich, der sich von 50°C bis 90°C erstreckt, ausgewählt, oder die Temperatur wird während des Verfahrens innerhalb dieses Bereichs variiert.According to one preferred embodiment, the temperature of the heated Lids from the range extending from 50 ° C to 90 ° C extends, selects, or the temperature is during of the method varies within this range.
Mittel für das Steuern der Temperatur des erwärmten Deckels umfassen typischerweise einen Mikroprozessor und ein Programm, das von dem Mikroprozessor ausgeführt wird. Der Mikroprozessor ist typischerweise derselbe, der für das Steuern anderer Funktionen des Instrumentes verwendet wird, wie zum Beispiel die Implementierung der Thermozykler-Protokolle.medium for controlling the temperature of the heated lid typically include a microprocessor and a program that is executed by the microprocessor. The microprocessor is typically the same person responsible for controlling others Functions of the instrument is used, such as the Implementation of thermocycler protocols.
Die Erfindung und ihre verschiedenen Ausführungsformen können sowohl bei Endpunkt- als auch Echtzeit-PCR Apparaturen und Verfahren angewendet werden.The Invention and its various embodiments can both endpoint and real-time PCR equipment and procedures be applied.
Das Instrument und seine Ausführungsformen, die oben beschrieben werden, werden zum Ausführen eines Polymerase-Kettenreaktion-(PCR)-Verfahrens, wie zum Beispiel DNA Amplifizierung, verwendet. Die physikalischen Anforderungen des verwendeten Instruments, des Zieles und die Natur des in Frage stehenden Experiments bestimmen die Grenzen für die Reaktionsparameter, von denen einer oder mehrere variabel sein können, d. h. frei vom Benutzer definierbar. Sobald die variablen Parameter gewählt sind, werden diese über die Benutzerschnittstelle an das Instrument gegeben. Der Probenträger, der mit den gewünschten biologischen Reaktionsgemischen beladen ist, wird auf den Thermoblock der Vorrichtung platziert und der erwärmte Deckel wird auf den Träger gedrückt. Danach kann das PCR Verfahren gestartet werden, wobei eine Phase davon häufiges Erwärmen und Abkühlen der Proben ist. Währenddessen wird Zyklisierungskondensation des Probendampfs auf den Wänden der Röhrchen verhindert, indem Wärme zu den oberen Abschnitten der Röhrchen bereitgestellt wird, d. h. zu den Innenflächen des Luftraumes innerhalb der. Röhrchen. Die Menge der Wärme kann gemäß irgendeiner der oben beschriebenen Ausführungsformen bestimmt werden.The Instrument and its embodiments, described above are used to carry out a polymerase chain reaction (PCR) method, such as DNA amplification. The physical Requirements of the used instrument, the target and the nature of the experiment in question determine the limits for the reaction parameters, one or more of which may be variable, d. H. freely definable by the user. Once the variable parameters are selected, these are via the user interface given to the instrument. The sample carrier, with the loaded with desired biological reaction mixtures, is placed on the thermoblock of the device and the heated lid is pressed on the carrier. After that, that can PCR procedures are started, one phase of which is frequent Heating and cooling the samples is. Meanwhile is cyclization condensation of the sample vapor on the walls The tube prevents heat by moving to the top Sections of the tubes is provided, d. H. to the inner surfaces of the airspace within the. Tube. The amount of heat can be in accordance with any of the embodiments described above.
Beispiele:Examples:
Experimentelle Daten:Experimental data:
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Bedeutung der Anpassung der Deckel-Temperatur auf Basis von Reaktion-Parametern.The The following examples illustrate the importance of adaptation the lid temperature based on reaction parameters.
Beispiel 1 (
TAQ FZ mit Deckel-Temperatur-Modifikation: (13 vs 17 μl Beta-2-microglobulin)TAQ FZ with cover temperature modification: (13 vs 17 μl beta-2-microglobulin)
Ein
988 bp humanes genomisches Sequenz (beta-2-Mikroglobulin) Amplikon
wurde in Wiederholungsvertiefungen eines Gefäßes
mit ultradünnen Wänden (UTW) unter Verwendung
von Tag (Finnzymes) DNA Polymeraseenzym und einem Piko(TM) Thermozykler
mit 96 Vertiefungen amplifiziert. Die Deckel-Temperatur wurde auf
85°C, 87.5°C beziehungsweise 90°C mit
2 unterschiedlichen Reaktionsvolumen, 13 μl (
Beispiel 2 (
TAQ FZ mit Deckel-Temperatur-Modifikation: (13 vs 17 μl Dihydrofolat-Reduktase).TAQ FZ with cover temperature modification: (13 vs 17 μl dihydrofolate reductase).
Ein
922 bp humanes genomisches Sequenz (Dihydrofolat-Reduktase) Amplikon
wurde in Wiederholungsvertiefungen eines UTW Gefäßes
unter Verwendung von Tag (Finnzymes) DNA Polymeraseenzym und einem
Piko(TM) Thermozykler mit 96 Vertiefungen
amplifiziert. Die Deckel-Temperatur wurde auf 85°C, 87.5°C beziehungsweise
90°C mit 2 unterschiedlichen Reaktionsvolumen, 13 μl
(
Beispiel 3 (
TAQ FZ mit unterschiedlicher Deckel-Temperatur-Modifikation: (10 vs 20 μl beta-2-Mikroblobulin und Glutathion-Peroxidase 3)TAQ FZ with different cover temperature modification: (10 vs 20 μl beta-2 microblobulin and glutathione peroxidase 3)
Ein
1005 bp (beta-2-Mikroglobulin) und ein 1217 bp (Gluthathion-Peroxidase
3) humanes genomisches Sequenz Amplikon wurde in Wiederholungsvertiefungen
eines UTW Gefäßes unter Verwendung von Taq (Finnzymes)
DNA Polymeraseenzym und einem Piko(TM) Thermozykler
mit 96 Vertiefungen amplifiziert. Die Deckel-Temperatur wurde auf
75°C beziehungsweise 90°C mit 2 unterschiedlichen
Reaktionsvolumen, 10 μl (links,
Beispiel 4 (
Die Wirkung des Unterschiedes der Deckel-Temperatur auf unterschiedlichen DNA Polymeraseenzyme (DyNAzyme(TM) II Hot Start DNA Polymerase vs Taq Finnzymes)The Effect of Lid Temperature Difference on Different DNA Polymerase Enzymes ( DyNAzyme (TM) II Hot Start DNA Polymerase vs. Taq Finnzymes)
DuNAzyme(TM) II Hot Start DNA Polymerase- und Taq (Finnzymes) DNA-Polymeraseenzyme werden mit einem Piko(TM) Thermozykler mit 96 Vertiefungen verwendet, um 1.0. und 0.9 kb Amplikons bei einem Reaktionsvolumen von 20 μl zu amplifizieren. Beide Reaktionen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Amplifizierungsreaktion besser für DyNAzyme( TM) Enzym bei hoher Deckeltemperatur (85°C) arbeitet, im Vergleich zu Taq FZ, das besser bei niedriger Deckeltemperatur (75°C) arbeitet. Dieses könnte an der Tatsache liegen, dass DuNAzyme(TM) eine chemisch inaktiviert Polymerase ist und ein Voraktivierungs-Schritt (95 oder 94°C für 10 min) erforderlich ist, um die Polymerase zu aktivieren, wobei somit die Probentemperatur nicht die Stufe erreichen kann, um die gesamte Polymerase zu aktivieren, wenn die Deckel-Temperatur zu niedrig ist. Auf der anderen Seite arbeitet FZ Taq (das nur 1 min Voraktivierungs-Schritt benötigt), besser bei einer Deckeltemperatur von 75°C während des gesamten Durchlaufs.DuNAzyme (TM) II Hot Start DNA Polymerase and Taq (Finnzymes) DNA polymerase enzymes are used with a Piko (TM) 96-well thermocycler to provide 1.0. and 0.9 kb amplicon at a reaction volume of 20 μl. Both reactions were performed in 96-well plates. The results show that the amplification reaction works better for DyNAzyme ( TM) enzyme at high cap temperature (85 ° C) compared to Taq FZ, which works better at low cap temperature (75 ° C). This could be due to the fact that DuNAzyme (TM) is a chemically inactivated polymerase and a pre-activation step (95 or 94 ° C for 10 min) is required to activate the polymerase, thus the sample temperature can not reach the stage to activate the entire polymerase if the lid temperature is too low. On the other hand, FZ Taq (which requires only 1 min pre-activation step) works better at a cap temperature of 75 ° C throughout the run.
Während der Experimente wurde in der Praxis beobachtet, dass der Typ des Gefäßes (zum Beispiel dessen Kunststoff-Typ) einen Effekt auf die Experimente hatte.While In the experiments it was observed in practice that the type of Vessel (for example, its plastic type) one Had effect on the experiments.
Zusätzliche
Information auf die Reaktionsparameter, die in den Beispielen verwendet
werden: 
PCR Bedingung für alle Taq FZ Reaktion (30 Zyklen):PCR condition for all Taq FZ Reaction (30 cycles):
Taq, 1.0 kb und 0.9 kb Amplikons, B:Taq, 1.0 kb and 0.9 kb amplicons, B:
- 94°C 1 min94 ° C 1 min
- 94°C 15 s94 ° C 15 s
- 55°C 30 s55 ° C 30 s
- 72°C 1 min 72°C 5 min Endextension72 ° C 1 min 72 ° C 5 min end extension
Taq, 1.0 kb und 1.2 kb Amplikons, A:Taq, 1.0 kb and 1.2 kb amplicons, A:
- 94°C 1 min94 ° C 1 min
- 94°C 15 s94 ° C 15 s
- 63°C 30 s63 ° C 30 s
- 72°C 1 min 12 s72 ° C 1 min 12 s
- 72°C 5 min Endextension72 ° C 5 min end extension
PCR Bedingungen für DuNAzyme(TM) II Hot Start DNA Polymerase (30 Zyklen):PCR conditions for DuNAzyme (TM) II Hot Start DNA Polymerase (30 cycles):
- 94°C 10 min94 ° C 10 min
- 94°C 15 s94 ° C 15 s
- 55°C 30 s55 ° C 30 s
- 72°C 1 min per kb72 ° C 1 min per kb
- 72°C 10 min Endextension72 ° C 10 min end extension
Zusammenfassung:Summary:
Die Erfindung betrifft ein Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Verfahren und einen Thermozykler. In dem Verfahren werden biologische Proben in einem Probenträger mit einer Vielzahl von Probenräumen, von denen jeder obere und untere Enden hat, aufgenommen und die Proben werden sequentiell erwärmt und abgekühlt. Der Thermozykler gemäß der Erfindung umfasst Wärmeübertragungs-Mittel für automatisches Erwärmen und Abkühlen der Proben in dem Probenträger, erwärmbare Verschluss-Mittel oberhalb der oberen Enden der Probenräume, um Kondensation von Probendampf während des Verfahren zu verhindern, und Mittel zum Anpassen von einem Verfahrensparameter, bevorzugt der Temperatur der erwärmbaren Verschluss-Mittel, abhängig von mindestens einem anderen der Verfahrensparameter. Die Erfindung verhilft die Anzahl von fehlgeschlagenen PCR Experimenten, insbesondere aufgrund von Veränderungen im Probenvolumen, zu verringern.The The invention relates to a polymerase chain reaction (PCR) method and a thermocycler. In the process, biological samples in a sample rack with a large number of sample rooms, each of which has upper and lower ends, and the Samples are heated sequentially and cooled. The thermocycler according to the invention comprises heat transfer agents for automatic heating and cooling of the samples in the slide, heatable sealants above the upper ends of the sample chambers to condensation to prevent sample vapor during the procedure, and Means for adapting a process parameter, preferably the Temperature of the heatable sealing agent, depending of at least one other of the process parameters. The invention helps the number of failed PCR experiments, in particular due to changes in the sample volume.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION
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Zitierte PatentliteraturCited patent literature
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