DE1111777B

DE1111777B - Herstellung von 7-Chlor-6-desmethyl-tetracyclin

Info

Publication number: DE1111777B
Application number: DEA35300A
Authority: DE
Inventors: Joseph Jacob Goodman
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1959-08-07
Filing date: 1960-08-05
Publication date: 1961-07-27

Description

Herstellung von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin Die Erfindung betrifft die fermentative Herstellung des Antibiotikums 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin, insbesondere ein verbessertes Verfahren zur Steigerung der Produktion an diesem Antibiotikum und zur Verringerung der Produktion an 6-Desmethyltetracyclin bei einer derartigen Fermentation.
7-Chlor-6-desmethyltetracyclin und 6-Desmethyltetracyclin sind Glieder einer neuen Gruppe von Tetracyclin-Antibiotika. Die Desmethyltetracycline werden von gewissen mutierten Stämmen von S. aureofaciens gebildet, der von dem Chlortetracyclinbildner S. aureofaciens A-377 abgeleitet ist, von dem Proben beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Ill., als NRRL 2209 niedergelegt wurden. Die neuen Desmethyltetracyclin produzierenden Stämme entstanden durch Behandlung von A-377 mit mutierungserzeugenden Mitteln. Kulturen der neuen Desmethyltetracyclin produzierenden Stämme von S.aureofaciens sind bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C., unter den ATCC-Eingangsnummern 12551, 12552, 12553 und 12554 niedergelegt.
Bei der Bildung von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin durch mit Mutierungsmitteln behandelte Stämme wurde gefunden, daß geringe Mengen von 6-Desmethyltetracyclin ebenfalls gebildet werden, sogar wenn das Medium einen hohen Gehalt an Chloridionen enthält, wobei die Bildung von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin begünstigt wird. Die Anwesenheit von 6-Desmethyltetracyclin bringt schwierige Trennprobleme mit sich. Jedoch würde jede Methode äußerst wertvoll sein, die die Produktion von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin steigert und die Produktion von 6-Desmethyltetracyclin verringert.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Tatsache, daß Kupfer für die Biosynthese von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin wesentlich ist. Die Zugabe von Kupfer zu derartigen Fermentationen in geringen, sorgfältig gesteuerten Mengen führt leicht dazu, die Produktion von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin zu erhöhen und die Produktion von 6-Desmethylteträcyclin zu verringern, das gewöhnlich gleichzeitig gebildet wird. Bei der Zugabe von Kupfer zu der Fermentation in bestimmten Konzentrationen wurde gefunden, daß nur eine relativ geringe Menge 6-Desmethyltetracyclin gebildet wird, und zwar so wenig, daß sich eine Abtrennung dieses Antibiotikums von dem Hauptprodukt der Fermentation erübrigt.
Jede übliche Kupferverbindung kann angewandt werden. Erfindungsgemäß wird vorzugsweise ein wasserlösliches Kupfersalz verwendet, z. B. Kupfersulfat, vorzugsweise als Hydrat, CuSO4 - 5H20. Ähnlich können auch andere Kupfersalze wie das Nitrat, Acetat, Sulfat, Chlorid, Lactat, Tartrat und Citrat angewandt werden.
Die zu der Fermentation zuzugebende Kupfermenge ist ein Faktor von einiger Bedeutung insofern, als genügend Kupfer zugegeben werden muß, um die gewünschte Verringerung der Produktion an 6-Desmethyltetracyclin zu bewirken und als Kupfer über einer bestimmten Konzentration für die Mikroorganismen eindeutig toxisch ist und dadurch die gesamte Produktion an Antibiotika abfällt. Es wird bevorzugt, daß etwa 13 bis 250 Teile je Million Kupfer dem Fermentationsmedium als wasserlösliches Salz zugegeben werden. Bei Kupferkonzentrationen über 60 Teilen je Million ist es jedoch wünschenswert, die Konzentration der Nährstoffe in dem Medium zu erhöhen. Der Grund dafür ist nicht völlig geklärt, man nimmt jedoch an, daß dies in irgendeiner Weise die erhöhte Toxizität kompensiert, die durch die erhöhten Kupferkonzentrationen bewirkt wird.
Die Fermentationsbedingungen sind im allgemeinen dieselben wie für die bis jetzt bekannten Methoden zur fermentativen Herstellung von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin. Das heißt, das Fermentationsmedium enthält die üblichen Nährstoffe und Mineralien. Zu den geeigneten Nährstoffen, die die notwendigen Substanzen liefern, gehören Stärke, Dextrose, Rohrzucker, Glukose, Melasse, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Hefe, Fleischextrakte, Pepton, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Maisquellflüssigkeit, löslicher Destillationsrückstand, Fischmehl und andere übliche Substanzen. Zu den anorganischen Salzen gehören Substanzen wie Calciumkarbonat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und die verschiedenen Spurenelemente wie Mangan, Kobalt, Zink, Kupfer, Eisen u. dgl. Im allgemeinen wird die Anwendung eines 'chloridiönerireichen Mediums bevorzugt, auch weil dädurch höhere Ausbeuten an chlorierten Antibiotika= erhalten werden.
Die anderen allgemeinen Fermentatiorisbedingungen wie Wasserstoffionenkonzentration, Temperatur, Zeit, Belüftungsgeschwindigkeit, Herstellung der Impfkultur, Sterilisierung, Inoculierung u. dgl. sind wie üblich und können denen zur Bildung von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin ähnlich sein.
Was den erfindungsgemäß angewandten Mikroorganismustyp zur Herstellung von 7-Chlor-desmethyltetracyclin betrifft, so sollten ausgewählte mutierte Stämme eines 7-Chlor-7-desmethyltetracyclin bildenden Stamms von S. aureofaciens angewandt werden, wie es in Patent 1041213 beschrieben ist.
Zur Isolierung des 7-Chlor-6-desmethyltetracyclins aus dem Fermentationsmedium werden die in dem obenerwähnten Patent 1041213 beschriebenen Isolierungsverfahren angewandt.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern.

Beispiel 1 Es wurde ein Fermentationsmedium hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt: Stärke ...................... 55 g/1 Maisquellflüssigkeit .......... 25 g/1 Ca C 0...................... 8 g/1 (N H4)2 S O................... 5 g/1 N H4 Cl ..................... 1 g/1 Baumwollsamenmehl ......... 5 g/1 Zu diesemMedium wurden in getrenntenAnsätzen verschiedeneMengen an Kupfersulfathydrat Cu S 04 - 5 H20 gegeben. Diese Medien wurden in geeigneten Mengen in Kolben verteilt, die 2°/0 (V/V) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur eines 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin produzierendenStamms von S. aureofaciens (Stamm E-475) inoculiert und bei 26,5°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 144 Stunden inkubiert. Sie wurden anschließend auf ihren Gehalt an 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin geprüft. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle unten aufgeführt.

Tabelle 1
CuS 04 - 5 HGO 7-Chlor-6-desmethyltetra-
cyclin
Teile je Million Y/MI
0 1480
10 1195
50 1205
100 1765
*150* 1700

Aus der obigen Tabelle ist zu ersehen, daß die Zugabe von Kupfer eine Steigerung der Produktion an 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin bewirkt: Beispiel 2 Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei ein 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin produzierender Stamm von S.aureofaciens (Stamm E-1311) angewandt wurde. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

Tabelle 2

7-Chlor- 6-Des- 6-Desmethyl-

CUS04-5H30 6-desmethyl- methyl- tetracycfin

tetracyclin tetracyclin

Teile je Million y/ml Y/MI °1a

0 1000 560 36

10 1030 555 35

100 1445 485 25

Beispiel 3 Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, nur daß die Inkubation bei 26,5°C 24 Stunden und dann zusätzlich 120 Stunden bei 24°C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse waren wie folgt:

Tabelle 3

7-Chlor- 6-Desmethyl- 6-Desmethyl-

CU S 04 - 5 HZ O 6-desmethyl- tetracyclin tetracyclin

tetracyclin

Teile je Million Y/MI Y/MI °/o

0 1710 610 26

10 1770 590 25

100 2050 500 20

Beispiel 4 Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt, nur daß die Inkubation bei 25°C 144 Stunden lang durchgeführt wurde. Die Ergebnisse waren wie folgt:

Tabelle 4

CU S 04 - 5 H20 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin

Teile je Million Y/MI

0 1740

100 1840

Beispiel 5 Es wurde ein Fermentationsmedium hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt: Stärke ..................... 43,0 g/1 Maisquellflüssigkeit ......... 25,0 g/1 CaCO3 .................... 7,5 g/1 (N H4)2 S 04 ................. 5,6 g/1 N H4 Cl .................... 1,0 g/1 Baumwollsamenmehl ........ 5,0 g/1 Maismehl .................. 27,0 g/1 Mn S 04 ................... 0,080 g/1 Co C12 - 5H20 .............. 0,005 g/1 Zu einem Teil dieses Fermentationsmediums wurde CU S 04 - 5 H20 in einer Konzentration von 100 Teilen je Million gegeben, während ein anderer Teil zur Kontrolle zurückgehalten wurde. Die Medien wurden in entsprechenden Mengen in Kolben verteilt, die 20/, (V/V) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur von S. aureofaciens (Stamm E-1311) inokuliert, dann 24 Stunden bei 26,5° C und anschließend 120 Stunden bei 24°C inkubiert, d. h. bis zur Ernte. Der Inhalt der Kolben wurde auf 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin und 6-Desmethyltetracyclin geprüft, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:

Tabelle 5

7-Chlor- 6-Desmethyl- 6-Desmethyl-

CuS04-5H20 6-desmethyl- tetracyclin tetracyclin

tetracyclin

Teile je Million y/ml y/ml °/o

I

0 1975 800 29

100 2035 610 ' 23

Beispiel 6 Es wurde eine Vergleichsfermentation unter Anwendung des unten angegebenen Mediums durchgeführt:

A B

g/1 g/1

Stärke ......................... 55 35

Maisquellflüssigkeit .............. 25 -

CaCO3 ........................ 8 3,5

(N H4)2 S 04 ..................... 5 -

NH4C1 ........................ 1 1

Baumwollsamenmehl ............ 5 15

Hefe.......... ................ - 5

Getrockneter Fleischextrakt ....... - 10

MnCl2 - 4H20 .................. - 0,005

Zn S 04 - 7 Hz O ................. - 0,050

Zu Teilen des Mediums A und des Mediums B wurde CU S 04 - 5 H20 in einer Konzentration von 100 Teilen je Million gegeben, während andere Teile zur Kontrolle zurückgehalten wurden. Die Medien wurden in entsprechenden Mengen in Kolben verteilt, die 2 °/a (V/V) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur von S. aureofaciens (Stamm E-1311) inokuliert und auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung zuerst 24 Stunden bei 26,5'C und anschließend zusätzlich 120 Stunden bei 24°C inkubiert. Nach Beendigung des Tests (144 Stunden) wurden die Fermentationsmaischen geprüft, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden:

Tabelle 6

A B

7-Chlor- 6-Des- 7-Chlor- ' 6-Des-

Cu S 04-5 H2 O 6-des- methyl- 6-des- methyl-

methyl- methyl-

tetra tetra- tetra- tetra-

cyclin cyclin- cyclin cyclin

Teile je Million y/ml y/ml y/ml j y/ml

0 2025 725 1900 470

1 0 0 2325 615 2625 200

Beispiel 7 Es wurde ein Fermentationsmedium hergestellt, das. die folgenden Bestandteile enthielt: Stärke ..................... 45,0 g/1 Ca C03 .................... 10,5 g/1 NH,C1 .................... 1,5 g/1 Baumwollsamenmehl ........ 45,0 g/1 Hefe ...................... 1,5 g/1 Zu diesem Medium wurden in getrennten Ansätzen verschiedene Mengen an CU S 04 - 5 HZ O gegeben. Die Medien wurden in entsprechenden Mengen in Kolben verteilt, die 3 °% (V/V) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur von S. aureofaciens (Stamm ED-1723) inokuliert und auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 168 Stunden bei 25'C inkubiert. Der Ertrag der Maischen war wie folgt:

Tabelle 7
7-Chlor- 6-Desmethyl- 6-Desmethyl-
CuS 04 - 5 H2 O 6-desmethyl- tetracyclin tetracyclin
tetracyclin
Teile je Million -(/ml y/ml °/o
50 4340 1920 31
150 4635 1370 23
200 4510 1350 24
300 4080 1235 24

Beispiel 8 Es wurde ein Fermentationsmedium hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt: Stärke .................... 51,0 g/1 CaC0..................... 11,9 g/1 NH4C1 .................... 1,7 g/1 Baumwollsamenmehl ........ 51,0 g/1 Hefe ...................... 1,7 g/1 Zu diesem Medium wurden in getrennten Ansätzen verschiedene Mengen an CU S 04 - 5 H20 gegeben. Die Medien wurden in entsprechenden Mengen in Kolben verteilt, die 3 °/o (V/V) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur von S. aureofaciens (Stamm ED-2047) inokuliert und auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 160 Stunden bei 25°C inkubiert. Der Ertrag der Maischen war wie folgt:

Tabelle 8
7-Chlor- 6-Desmethyl- 6-Desmethyl-
CU S 04 - 5 Ha O 6-desmethyl- tetracyclin tetracyclin
tetracyclin
Teile je Million y/ml y/ml °/o
100 4225 1845 31
150 4930 1830 28
200 4830 1750 27
300 4980 1550 24

Beispiel 9 Es wurde ein Fermentationsmedium hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt: Stärke ...................... 30 g/1 CaC0...................... 7 g/1 NH,C1 ........ . ............ - 1 g/1 Sojabohnenölmehl ........... 30 g/1 Hefe ....................... 1 g/1 Zu diesem Medium wurden in getrennten Ansätzen verschiedene Mengen an CU S 04 - 5 H2 O gegeben. Die Medien wurden in entsprechenden Mengen in Kolben verteilt, die 3 °/o (V/V) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur von S. aureofaciens (Stamm ED-2047) inokuliert und auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 25°C 160 Stunden inkubiert. Der Ertrag der Maischen war wie folgt:

Tabelle 9
7-Chlor- 6-Desmethyl» 6-Desmethyl-
CuS04-5Hz0 6-desmethyl- tetracyclirc tetracyclin
tetracyclin
Teile je Million Y/rnl yiml °/o
50 2570 1415 35
100 2955 1280 30
200 3275 1130 26
300 2560 ( 765 23

Beispiel 10 Es wurden zwei BaumwollsamenmehImedien steigender Konzentration wie folgt hergestellt:

MediumA MediumB

gil

g/1

Stärke ...................... 45,0 60

CaC03...................... 10,5 14

NH4C1...................... 1,5 2

Baumwollsamenmehl.......... 45,0 60

Hefe ........................ 1,5 2

Zu diesen Medien wurden in getrennten Ansätzen verschiedene Mengen von CU S 04 - 5 HZ O gegeben. Die Medien wurden in entsprechenden Mengen in Kolben verteilt, die 3 °/o (V/V) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur von S. aureofaciens (Stamm ED-2047) inokuliert und auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 25°C 160 Stunden inkubiert. Der Ertrag der Maischen war wie folgt:

Tabelle 10

CuS04 - 5 H20 Medium A Medium B

A-VIII* A-IX* A-IX** A-VITI* A-IX** I A-IX**

Teile je Million Yiml I Y/MI I °/o Y/MI I Y/mi °/o

100 5135 815 I 14 3080 1510 33

200 - - - 3825 1585 29

300 - - - 4725 1705 27

400 - - ' - 5490 1660 i 23

500 - - - 5480 1540 i 22

* 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin. ** 6-Desmethyltetracyclin. -

Beispiel 11 Zwei Sojabohnenmehlmedien steigender Konzentration wurden wie folgt hergestellt:

MediumA MediumB

8/I

g/1

Stärke ...................... 40,0 45,0

CaC03 ...................... 9,0 - 10,5

T

Sojabohnenölmehl......... ... 40,0 45,0

Hefe ........................ 1,3 1,5

Zu diesen Medien wurden in getrennten Ansätzen verschiedene Mengen CU S 04 - 5 HZ O gegeben. Die Medien wurden in entsprechenden Mengen in Kolben verteilt, die 3 °/a (V/V) Schmalzöl enthielten, sterilisiert, mit einer vegetativen Impfkultur von S. aureofaciens (Stamm ED-2047) inokuliert und auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 160 Stunden bei 25°C inkubiert. Der Ertrag der Maischen war wie folgt:

Tabelle 11

CUS 04 - 5 H20 Medium A Medium B

A-VIII* f A-IX** A-IX** A-VIII* - A-IX** i A-IX**

Teile je Million Y,'ml I -(/ml °/u Y/MI - Y/MI ""

300 3520 -. j 1710 33 2470 1f 1730 f' 41

400 3685 I 1635 30 2970 1890 39

500 3090 1515 33 2900 1830 39

700 2635 1185 31 3180 1705 35

* 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin. ** 6-Desmethyltetracyclin.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin durch aerobe Fermentation eines wäßrigen Fermentationsmediums miteinem7-Chlor-6-desmethyltetracyclin produzierenden Stamm von S. aureofaciens, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation in Anwesenheit von zusätzlichem Kupfer durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem Fermentationsmedium 13 bis 250, vorzugsweise etwa 13 bis etwa 60 Teile Kupfer in Form seiner wasserlöslichen Salze je Million Fermentationsmedium zugesetzt werden.