DE1100623B - Verfahren zur Herstellung von 11- oder 19-Hydroxysteroiden - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von 11- oder 19-Hydroxysteroiden Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Oxydation von Steroiden in 11- oder 19-Stellung. Unter den in 11-Stellung oxydierten Steroiden gibt es eine Anzahl von Verbindungen, wie z. B. 17-Hydroxycorticosteron und 17-Hydroxy-11-dehydrocorticosteron, die in der Medizin verwendbar sind. Die in 19-Stellung oxydierten Steroide können in 19-Norsteroide umgewandelt werden, die therapeutisch wirksamer sind als die Ausgangsverbindungen und die darüber hinaus in verschiedene weibliche Sexualhormone, beispielsweise Östradiol oder Östratriol, umgewandelt werden können.
• Es wurden bereits ausgedehnte Versuche zur Oxydation von Steroiden in 11 -Stellung, insbesondere zur biochemischen Oxydation unter Verwendung von durch Mikroorganismen erzeugten Enzymen durchgeführt. Bei den meisten bekannten biochemischen Verfahren werden Pilze der Ordnung Mucorales (Klasse Thycomyces), der Ordnung Moniliales (Klasse Fungi imperfecti) oder der Ordnung Sphaeropsidales (Klasse Fungi imperfecti) verwendet.
• Demgegenüber wurde nun gefunden, daß Sauerstoff in Steroide in 11- oder 19-Stellung durch ein Enzym eingeführt werden kann, das von einem Pilz erzeugt wird, der zur Gattung Corticium (Ordnung Agaricales, Klasse Basidiomycetes) gehört. Diese nicht zu einer der vorstehend erwähnten Ordnungen und die Ausbeute bei diesem Verfahren ist keineswegs geringer als bei bekannten Verfahren.
• Im Rahmen der Erfindung bezieht sich der Name Corticium auf eine Gattung der Familie Thelepharaceae (Ordnung Agaricales, Klasse Basidiomycetes), die in Übereinstimmung mit dem 1954 von G. C. Ainsworth und G. R. B isb y veröffentlichten Buch »Dictionary of the Fungi« klassifiziert wurde. Unter den zur Anwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Pilzgattungen sind unter anderem zu nennen: Corticium sasakii (Shirai) Matsumoto, Corticium microsclerotia (Matz) Weber und Corticium praticola Kotila. Die Klassifizierung von Pilzen ist jedoch sehr kompliziert und manchmal verworren. Beispielsweise wird der vorstehend erwähnte Corticium sasakii (Shirai) Matsumoto oft Hypochnus sasakii Shirai, Corticium Vagum Br. et Cav., Rhizoctonia solani Kuhn oder Pellicularia filamentosa (Pat.) Rogers genannt. Nach Rogers (1943) und Exner (1953) gehören die erwähnten drei Species (Corticium sasakii, Corticium microsclerotia und Corticium praticola) zur Gattung Pellicularia. Der Gattungsname Pellicularia wird jedoch von europäischen Systemkundlern selten verwendet, -wie aus der Liste der Gattungen in dem vorstehend erwähnten »Dictionary of the Fungi« (1954) hervorgeht, auf die sich die Nomenklatur der Anmeldung bezieht. In der Beschreibung schließt deshalb die Gattung Corticium die Gattung Pellicularia von Rogers ein. Im Rahmen der Erfindung bezieht sich jedenfalls die Bezeichnung Corticium auf alle Pilze mit der Fähigkeit, Sauerstoff in Steroide in 11 -Stellung einzuführen, und die nach der Klassifizierung von Ainsworth und Bisby zur Gattung Corticium gehören, selbst wenn sie auch unter anderen Gattungsnamen bekannt sind.
• Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Corticiumstämme sind sämtlich bei bekannten Kultursammlungen, wie dem Centraalbureau voor Schimmelcultures (Holland) und dem Institute for Fermentation (Osaka), erhältlich. Ihre wilden Kulturen lassen sich leicht aus z. B. an bandförmigem Mehltau erkrankten Kulturpflanzen oder aus an Web-Mehltau erkranktem Reis, Zuckerrohr, Bohnen, Feigen usw. gewinnen. Erfindungsgemäß wird der Sauerstoff in die 11 -Stellung von Steroiden durch die Wirkung eines Enzyms eingeführt, das in einem Pilz der Gattung Corticium enthalten ist. Die Oxydation kann durch Behandlung der Steroide mit einem Pilzstamm der Gattung Corticium oder mit dem von einem solchen Mikroorganismus erzeugten Enzym in an sich bekannter Weise durchgeführt werden.
• Zu den erfindungsgemäß zu oxydierenden Steroiden gehören beispielsweise Progesteron, 17,21-Dioxyprogesteron, 21-Hydroxyprogesteron, 1-Dehydroprogesteron sowie andere Steroide mit einem oder mehreren Substituenten, wie Keto-, Hydroxyl-, Halogen- und Alkylresten, in einer oder mehreren der 16-Stellungen des Cyclopentanpolyhydrophenanthrenkerns außer in 11-Stellung. Das gemäß der Erfindung zu verwendende Enzym kann in rohem, gegebenenfalls aber auch in verhältnismäßig reinem Zustand verwendet werden. Die Reinigung des Enzyms erfolgt nach üblichen mikrobiologischen Verfahren.
• Das Enzym befindet sich meist im Myzel des zu verwendenden Pilzes. Aus diesem Grunde eignen sich die beiden folgenden Verfahren am besten für die Zwecke der Erfindung: (1) Ein Stamm des Pilzes wird in einem Medium gezüchtet, das neben geeigneten Nährstoffen auch das zu oxydierende Steroid enthält, oder (2) ein Stamm des Pilzes wird in einer Nährbrühe gezüchtet und das erhaltene Myzel aus der Brühe abgetrennt und anschließend unter geeigneten Bedingungen mit dem zu oxydierenden Steroid in Berührung gebracht.
• Bei diesen beiden Verfahren erfolgt die Züchtung des Mikroorganismus wie bei gewöhnlichen Mikroorganismen meist in einer wäßrigen Nährbrühe. Als Kohlenstoffquelle können beispielsweise Stärke, Zuckerrohr, Laktose, Dextrin, Glycerin und Maltose, als Stickstoffquelle die verschiedensten organischen und anorganischen stickstoffhaltigen Substanzen, wie Soyabohnenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Kasein, Hefe, Maisquellwasser, Nitrate, Harnstoff und Ammoniumsalze, verwendet werden. Gegebenenfalls können auch geringe Mengen von, anorganischen Salzen oder Spurenelementen zugesetzt `verden.
• Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Hydroxylierung geeignete Zusammensetzungen von Kulturmedien sind z. B. folgende

  (I) 11I0 (1I) 11l0

  Succrose .......... 3,0 Weizenstärke....... 3,0

  K Cl ............... 0,05 K Cl ............... 0,05

  M9S04 ........... 0,05 M9S04 ........... 0,05

  K H2 P 04 .......... 0,1 K H2 P 0........... 0,1

  Malzextrakt ....... 4,0 Kartoffelsaft ....... 20,0

  Kartoffelsaft ....... 20,0

  (11I) 0I0 (IV) 11I0

  Succrose ........... 3,0 Maislauge ......... 0,5

  Malzextrakt ....... 4,0 Lösliche Stärke ..... 2,0

  KCl............... 0,05 NaN0............. 0,2

  M9S04 ........... 0,05 KH,P0........... 0,1

  KH,P04.......... 0,1 M9S04 ........... 0,05

  Zn S 04 ............ 0,001

  (V) °I11 (VI) 11l11

  Maislauge ......... 1,0 Lösliche Stärke ..... 3,0

  Glukose ........... 4,0 NH4N03.......... 0,2

  NaN03............ 0,2 K2HP04.......... 0,1

  N H4C1 ............ 0,1 FeCl2 ............. 0,05

  KH,P0g .......... 0,1 KCl............... 0,05

  Mg S 04 ........... 0,05 Mg S 04 ........... 0,05

  ZnS04............ 0,01 Vitaminlösung...... 1,0

  1 1 Vitaminlösung enthält

  Biotin ...................... 0,2 mg

  Calciumpantothenat ........... 4,0 mg

  Folsäure ..................... 0,2 mg

  Inosit ....................... 200,0 mg

  Nikotinsäure . . . . . . . . . . . . . . 40,0 mg

  p-Aminobenzoesäure .......... 20,0 mg

  Vitamin-B s hydrochlorid ...... 40,0 mg

  Vitamin-Bl-hydrochlorid ....... 40,0 mg

  Riboflavinmononucleotid....... 20,0 mg

  Bei Durchführung der Oxydation nach dem Verfahren Nr. 1 wird der Stamm zweckmäßigerweise eine gewisse Zeit vorgezüchtet und dann die Züchtung in Gegenwart des zu oxydierenden Steroids fortgesetzt. Die Dauer der Vorzüchtung hängt unter anderem von der Art des Stammes und des Kulturmediums ab, im allgemeinen sind aber 2 bis 3 Tage am geeignetsten. Die Vorzüchtung erfolgt meist bei Temperaturen zwischen 20 und 30°C und pH-Werten von 4 bis B. Diese Werte können jedoch je nach den anderen Verfahrensbedingungen schwanken, wichtig ist nur, daß die Vorzüchtung so durchgeführt wird, daß das Enzym möglichst aktiviert wird.
• Die bei der Vorzüchtung erhaltene Kulturbrühe wird anschließend mit einer Suspension oder Lösung des zu oxydierenden Steroids vermischt und die Züchtung 1 bis 3 Tage oder länger fortgesetzt. Als Lösungsmittel für die Suspension oder Lösung wird meist ein wäßriges Lösungsmittel verwendet, gelegentlich können aber auch organische Lösungsmittel, wie Aceton, Methanol, Äthanol, Äthylenglykol oder Propylenglykol, verwendet werden. Gegebenenfalls kann ein Dispersionszusatz, z. B. ein oberflächenaktives Mittel, zusammen mit dem Steroid zugegeben werden, damit die Oxydation glatt verläuft.
• Bei der Oxydation nach Verfahren Nr.2 wird die Kulturbrühe, in der sich das Enzym in genügenden Mengen angesammelt hat, filtriert und das Myzel anschließend mit den zu oxydierenden Steroiden in ein geeignetes Lösungsmittel, z. B. eine Ringersche Lösung, gegeben. Auch in diesem Fall kann das Steroid in Form einer Suspension oder Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel zugegeben werden.
• Auf diese Weise wird das Ausgangssteroid in 11-Stellung oxydiert und aus der Reaktionsmischung unter Verwendung des unterschiedlichen Verhaltens von Produkt und Verunreinigungen hinsichtlich Löslichkeit, Adsorptionsfähigkeit, Verteilungskoeffizienten zwischen den beiden Lösungsmitteln usw. isoliert. Die Isolierung des Produktes erfolgt jedoch am einfachsten durch Extraktion mit einem das Produkt leicht lösenden Lösungsmittel. Geeignete Lösungsmittel sind chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Methylenchlorid, und Essigsäureester, wie Äthylacetat und Butylacetat.
• Die so erhaltene, in 11-Stellung oxydierten Steroide sind meist nicht rein. Sie können durch übliche Verfahren, wie Umkristallisieren, Chromatographie und Gegenstromverteilung, gereinigt werden. Geeignete Lösungsmittel für die Umkristallisation sind Alkohole, Aceton, Wasser und chlorierte Kohlenwasserstoffe. Die Chromatographie kann mit Aluminiumoxyd, Magnesiumsilikat und Aktivkohle durchgeführt werden. Die erfindungsgemäß hergestellten Steroide können aber auch nach anderen, bei der Reinigung von Steroiden angewandten bekannten Verfahren gereinigt werden.
• Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren fallen als Nebenprodukt in 19-Stellung oxydierte Steroide an.
• Es ist mit den Corticiumarten erstmals möglich, eine biologische Hydroxylierung auch bei A -Verbindungen durchzuführen. So geht 11-Desoxy-17-hydroxycorticosteron (I) dabei in Hydrocortison (Ia) und d1-11-Desoxy-17-hydroxycorticosteron (II) gegebenenfalls in Prednisolon (II a) über

  Mikroorganismus Ausbeute Ausbeute

  I-+- Ia

  II-+- Ha

  Absidia orchidis

  (IFO Nr. 5302) ........ 40 bis 50 0/0 0

  Curvularia lunata

  (ATCC Nr. 12017) ...... 5001,

  Corticium sasakii

  IFO Nr. 5254 ......... 400/0 30010

  Des weiteren hat man bisher noch niemals eine Hydroxylierung in 19-Stellung unter Verwendung von Mikroorganismen durchgeführt, insbesondere wurden für diesen Zweck noch niemals Pilze der Gattung Corticium verwendet. Die Wirkung dieser Pilzgattung, wie sie erfindungsgemäß erreicht wird, ist daher außerordentlich überraschend.
• Das erfindungsgemäße Verfahren wird in den folgenden Beispielen näher erläutert. Alle Temperaturen sind unkorrigiert, und die Analysenwerte sind in Prozent angegeben. Beispiel 1 Eine Mischung aus 30g Rohrzucker, 0,5g Kaliumchlorid, 0,5 g Magnesiumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 40 ccm Malzextrakt und 250 ccm 200/0igem Kartoffelsaft wird mit Leitungswasser auf 1 1 aufgefüllt. In dieses Medium wird ein Stamm von Corticium vagum geimpft und 70 bis 80 Stunden unter Schütteln gezüchtet. Anschließend wird eine Lösung von 200 mg 17-Hydroxydesoxycorticosteron in 20 ccm Methanol zugegeben und die Züchtung weitere 48 Stunden fortgeführt. Die vom Myzel abfiltrierte Brühe wird mit dreimal 300 ccm Methylenchlorid extrahiert. Das Myzel wird dreimal mit heißem Aceton extrahiert und das Aceton abdestilliert. Der Rückstand wird in Methylenchlorid gelöst und die Lösung mit dem Methylenchloridextrakt der Brühe vereinigt. Die vereinigte Lösung wird nach dem Waschen mit Wasser unter verringertem Druck in einer Stickstoffatmosphäre eingedampft und ergibt 250 mg eines gelben Rückstandes. Der Rückstand wird einer Adsorptionschromatographie in einer Magnesiumsilikatsäule unterworfen und das Produkt aus Aceton umkristallisiert. Hierbei werden 75 mg 11,17-Dioxycorticosteron, Fp. 205 bis 207°C, erhalten.
• [a] ö = -f-162° (in Äthanol), A' .*-..so' 242 m#t (e 15,600) und empirische Formel C21H3005.

  Analyse für C"H3005:

  Berechnet ... C 69,58, H 8,340/0;

  gefunden ... C 69,26, H 8,12 0/0.

  Das in diesem und im Beispiel 3 verwendete Corticium vagum wurde von dem National Institute of Agricultural Science, Tokyo, Japan, unter dem Namen Corticium vagum Br. et Cav. herausgebracht, der Stamm ähnelt aber Corticium sasakii (Shirai) Matsumoto in seinen mikrobiologischen Eigenschaften.
• Beispiel 2 In das Medium des Beispiels 1 wird ein Stamm von Corticium sasakii geimpft und 70 bis 80 Stunden unter Schütteln gezüchtet. Das aus der Kulturbrühe abgetrennte Myzel wird mit zweimal 500 ccm einer Ringerschen Lösung gewaschen und anschließend sofort in 1 1 Ringerscher Lösung suspendiert. Gleichzeitig wird eine Lösung von 200 mg 17-Hydroxydesoxycorticosteron in 20 ccm Äthanol zugegeben. Danach wird die Lösung 16 Stunden bei 28°C bewegt. Sowohl das Myzel wie die Ringersche Lösung werden dreimal mit je 500 ccm Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit einem Fünftel ihres Volumens mit einer 10/0igen Natriumbicarbonatlösung und anschließend zweimal mit Wasser gewaschen. Die Äthylacetatschicht wird unter verringertem Druck in einer Stickstoffatmosphäre eingedampft. Es werden 96 mg Rohprodukt erhalten, das aus Chloroform umkristallisiert wird. Hierbei werden 54 mg 11,17-Dioxycorticosteron in Form eines Produktes erhalten, das ein Additionsprodukt aus 1 Mol Hydrocortison und 1/2 Mol Chloroform darstellt; Schmelzpunkt unter Zersetzung 196 bis 198°C; [a]-D' = -f-137° (in Äthanol), IR 7@@,äs@°'°'' 2,95, 5,86, 6,09, 6,20, 13,30 (p,) und empirische Formel C21 H,0 0s - 1/2 C H C13.

  Analyse für C"H3006 ' 1/2 CHC13:

  Berechnet ... C 61,17, H 7,82, Cl 12,590/0;

  gefunden ... C 61,30, H 7,32, Cl 12,86 0/0.

  Diese Additionsverbindung wird aus Äthylacetat umkristallisiert, und man erhält das Hydrocortison des Beispiels 1. Beispiel 3 Eine Mischung aus 600g Rohrzucker, 10g Kaliumchlorid, 10g Magnesiumsulfat, 20g Kaliumdihydrogenphosphat und 5000 ccm Malzextrakt wird mit Leitungswasser auf 201 aufgefüllt. In dieses Medium wird ein Stamm von Corticium vagum geimpft und 70 Stunden aerob in einem Tank gezüchtet. Anschließend wird eine Lösung von 15g 17-Hydroxydesoxycorticosteron in 700 ccm Äthanol zugegeben und die Züchtung weitere 24 Stunden fortgesetzt. Brühe nebst Myzel werden mit 301 Äthylacetat extrahiert und die Äthylacetatlösung auf 500 ccm eingeengt. Nach dem Waschen mit 10/0iger Natriumbicarbonatlösung wird Äthylacetatlösung unter verringertem Druck eingedampft. Es verbleiben 16g eines gelben kristallinen Rückstandes. Der Rückstand wird mit Petroleumäther gewaschen, und es werden 10,5 g Rohprodukt erhalten, das eine Mischung aus oxydierten Steroiden darstellt, die eine geringe Menge von unverändertem 17-Hydroxydesoxycorticosteron enthält.
• Die Mischung wird mit Chloroform gewaschen, wobei 3,5 g Kristalle erhalten werden und Nebenprodukte, wie Hydrocortison, in der Mutterlauge zurückbleiben. Die Kristalle werden aus Methanol umkristallisiert. Es werden 1,2 g »Kristalle A«, Fp. etwa 200°C, erhalten. Aus der Mutterlauge wird nach dem Umkristallisieren das Methanol abdestilliert und der Rückstand aus Chloroform umkristallisiert. Hierbei werden 2,0 g »Kristalle B«, Fp. 190 bis 198°C, erhalten. Die vorstehend aufgeführten Eigenschaften der »Kristalle A« stimmen mit denen von 17,19-Dihydroxydesoxycorticosteron überein, dessen Eigenschaften in Helvetica Chimica Acta, Bd. 39, S. 2062 (1956), von S. R. Neher und Mitarbeitern beschrieben worden sind.

  Analyse für C"H3005:

  Theoretisch.. C 69,58, H 8,340/0;

  gefunden ... C 69,89, H 8,110/0.

  Das Diacetat schmilzt bei 190 bis 191'C. Die analytischen Werte stimmen mit denen von Trihydroxyprogesteron überein.
• Die »B-Kristalle« werden wiederholt aus Methanol umkristallisiert, und hierbei werden Kristalle folgender Eigenschaften erhalten: Fp.212bis216°C; [a]ö = -i-120° *) Handelsname für hochgereinigtes Paraffinöl. (Äthanol). Imax 242 m#t (814400), empirische Formel C21 H30 0 5-

  Analyse für C,Hso0s-

  Theoretisch.. C 69,58, H 8,3411/0;

  gefunden ... C 69,36, H 8,27 11/o.

  Das Diacetat hat folgende Eigenschaften: Fp. 201 bis 203°C; [a1-00 = -I-120° (Chloroform) ; Am"" 240 mp. (815000).

  Analyse für C24H3407:

  Theoretisch.. C 67,24, H 7,68 °/o;

  gefunden ... C 67,09, H 7,48 "/o.

  Diese Eigenschaften stimmen beinahe mit denen von Epihydrocortison überein [gemäß Literatur: Fp. 209 bis 212°C [a], = -I-117° (Äthanol) ; A.,'" 242 m#t (814700) ; Fp. des Diacetats 202 bis 203°C; Amax 240 m#t (814900)]. Das IR-Spektrum des Produktes stimmt gut mit dem von Epihydrocortison überein. Außerdem wird keine Erniedrigung des Schmelzpunktes beobachtet, wenn das Diacetat des Produktes mit einer authentischen Probe des Epihydrocortisons geschmolzen wird.
• Auf Grund der obigen Ergebnisse bestehen die »Kristalle B« aus Epihydrocortison.
• Beispiel 4 Ein Stamm von Corticium sasakü wird 72 Stunden in 11 eines Mediums nach Beispiel 1 vorgezüchtet. Anschließend wird eine Lösung von 200 mg Desoxycorticosteron in 20 ccm Methanol zugegeben und mit der Züchtung 48 Stunden unter Schütteln fortgefahren. Danach wird die Brühe wie im Beispiel 1 behandelt, und es werden etwa 280 mg eines gelben Rückstandes erhalten. Dieser Rückstand wird in einer Aluminiumoxydsäule chromatographiert. Die Fraktion mit dem gleichen Verhalten wie Corticosteron auf dem Papierchromatogramm wird gesammelt und das Produkt aus Acetonhexan umkristallisiert. Es werden 60 mg Kristalle mit folgenden Eigenschaften erhalten: Fp. 178 bis 180°C; [a]D5 = -[-216° (Äthanol).

  Analyse für C"H3004.

  Theoretisch.. C 72,80, H 8,73 %;

  gefunden ... C 72,76, H 8,55 %.

  Diese Eigenschaften stimmen mit dem in der Literatur für Corticosteron aufgeführten, Fp. 178 bis 180°C, und der optischen Drehung, [a], = -I-210,5° (Äthanol), überein. Ebenso stimmt das IR-Spektrum des Produktes mit dem einer authentischen Probe der Verbindung überein.
• Beispiel 5 Ein Stamm Corticium sasakii wird 72 Stunden in 1 1 des im Beispiel 1 beschriebenen Mediums vorgezüchtet und anschließend mit einer Lösungvon 200 mg1-Dehydro-17 hydroxydesoxycorticosteron in 20 ccm Methanol versetzt. Danach wird 48 Stunden mit der Züchtung unter Schütteln fortgefahren. Anschließend wird die Brühe nach Beispiel l weiterbehandelt, und hierbei werden 350 mg Rückstand erhalten. Aus dem mit Propylenglykel--Toluol als Lösungsmitteln erhaltenen Papierchromatogramm läßt sich der Rückstand als eine Mischung erkennen, die neben 1-Dehydrohydrocortison drei oxydierte Steroide enthält. Der Rückstand wird einer Chromatographie in einer Magnesiumsilikatsäule unterworfen und die 1-Dehydrohydrocortison enthaltende Fraktion gesammelt. Die so erhaltene Rohsubstanz hat einen Fp. von 223 bis 226'C. Die Ausbeute beträgt 75 mg. Durch Umkristallisieren aus Aceton werden 40 mg 1-Dehydrohydrocortison mit folgenden Eigenschaften erhalten: Fp. 232 bis 236'C (unter Zersetzung) ; [a]" = -I-100' (Dioxan). Sowohl UV- als auch IR-Spektrum des Produktes stimmen mit den Spektren einer authentischen Probe der Verbindung überein.
• Beispiel 6 Eine Mischung aus 30 g Maisstärke, 0,5 g Kaliumchlorid, 0,5 g Magnesiumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat und 250 ccm 20%igem Kartoffelwasser (die Angabe »200/,« bezieht sich auf das herzustellende Kulturmedium; zur Herstellung dieses Mediums wird die 5fache Menge Wasser zu den Kartoffeln gegeben und die Mischung 1 Stunde gekocht und anschließend filtriert), wird mit Wasser auf 1 1 aufgefüllt. Das Medium wird 15 Minuten bei einem Dampfdruck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert. Zu dieser Brühe werden 100 ccm einer Kultur von Corticium microsclerotia gegeben, und es wird 48 Stunden bei 28°C gezüchtet. Zu der so erhaltenen Brühe wird eine Lösung von 17-Hydroxydesoxycorticosteron in 20 ml Äthanol gegeben und die Züchtung 48 Stunden fortgesetzt. Danach werden die Steroide dreimal mit 500 ccm Athylacetat aus der Brühe extrahiert. Die Äthylacetatlösung wird mit 200 ccm einer 1 °/oigen Natriumhydroxylösung gewaschen und danach zweimal mit 200 ccm destilliertem Wasser. Die Athylacetatlösung wird unter verringertem Druck in einer Stickstoffatmosphäre zu 110 mg eines öligen Rückstandes eingedampft. Der Rückstand wird einer Chromatographie in einer Magnesiumsilikatsäule unterworfen und die dem Hydrocortison auf dem Papierchromatogramm entsprechende Fraktion gesammelt. Umkristallisation des rohen Steroids aus Aceton ergibt 15 mg Hydrocortison, Fp. 205 bis 207°C; [a] D' =-I- 162° (Äthanol.) Beispiel 7 Die im Beispiel l beschriebene Nährbrühe wird mit Dampf 15 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert. 100 ccm einer Kultur von Corticium practicola werden zu der Brühe gegeben, und es wird 48 Stunden bei 28'C gezüchtet. Eine Lösung von 100 mg 17-Hydroxydesoxycorticosteron in 20 ccm Äthanol wird zu der Nährbrühe gegeben und mit der Züchtung 48 Stunden unter den vorerwähnten Bedingungen fortgefahren. Anschließend wird die Brühe gemäß Beispiel 6 behandelt und ein öliger Rückstand erhalten. Aus dem Rückstand werden 3,2 mg Hydrocortison nach dem Verfahren des Beispiels 6 erhalten.
• Beispiel 8 Zu einer Mischung von 600 g Rohrzucker, 40 g Ammoniumnitrat, 20g Kaliumbiphosphat,10 g Eisen(II)-chlorid, 10 g Kaliumchlorid, 10 g Magnesiumsulfat und 200 ccm einer Vitaminlösung mit einem Gehalt von 0,04 mg Biotin, 8 mg Calciumpantothenat, 0,04 mg Folsäure, 40 mg Inosit, 8 mg Nikotinsäure, 4 mg p-Aminobenzoesäure, 8 mg Vitamin-B,hydrochlorid, 4 mg Ribofiavinmononucleotid und 8 mg Vitamin-Bi hydrochlorid in einem Fermentierungsgefäß wird zur Herstellung von 201 Kulturmedium Wasser zugegeben und das Kulturmedium mit 400 ccm vegetativem Myzel von Corticium microsclerotia, das 48 Stunden in einem Medium der vorstehend angeführten Zusammensetzung gewachsen war, unter Belüften und Rühren 48 Stunden bei 28' C bebrütet.
• Zu dieser Kultur wird eine Lösung von 15 g 17-Hydroxydesoxycorticosteron in 700 ccm Propylenglykol gegeben und unter den gleichen Bedingungen weitere 10 Stunden bebrütet.
• Der Brei wird mit 301 Äthylacetat extrahiert und die Äthylacetatlösung auf 500 ccm eingeengt. Nach dem Waschen mit Alkalilösung und Wasser wird die Äthyl acetatlösung unter verringertem Druck zur Trockne eingedampft. Der gelbe Rückstand wird mit Petroläther gewaschen, und man erhält 10,5 g Rohsteroide, die aus einer Mischung von oxydierten Steroiden mit einer geringen Menge von nicht umgesetztem 17-Hydroxydesoxycorticosteron bestehen.
• Die Mischung wird mit Chloroform und Methanol wie im Beispiel 3 behandelt, und man erhält 3,0 g »Kristalle C« mit einem Schmelzpunkt von 235 bis 236°C und 1,6 g »Kristalle D« mit einem Schmelzpunkt von 218 bis 219°C.
• Die Fraktion »Kristalle C« hat folgende Konstanten: [a], =-E-123° (die Ultraviolettabsorption der Verbindung wurde in Äthanol gemessen) Am'äss°' 242,5 m#L (E =15500); empirische Formel: C21H3005.

  C21 H3o O 6

  Berechnet .................. C 69,58,H 8,34°/o;

  gefunden ................... C 69,46, H, 8,35 %.

  Das Diacetat dieser Verbindung entspricht dem Diacetat der Fraktion »Kristalle A« im Beispiel 3.
• Aus den angeführten Eigenschaften der Fraktion »Kristalle C« ergibt sich, daß diese Verbindung dem 17,19-Dihydroxydesoxycorticosteron (44-Pregnen-17a, 19,21-triol-3,20-dion) entspricht.
• Die Fraktion »Kristalle D« ist nach den spektroskopischen Werten Hydrocortison.
• Beispiel 9 Zu einer Mischung von 900 g löslicher Stärke werden 60 g Ammoniumnitrat, 30 g Kaliumbibiphosphat, 15 g Ferrochlorid, 15 g Kaliumchlorid, 15 g Magnesiumsulfat und 300 ccm der im Beispiel 8 beschriebenen Vitaminlösung zugegeben. Es wird mit Wasser auf 301 aufgefüllt. Diesem Medium wird ein Anteil von etwa 10/" einer Kultur eines Stammes von Corticium micosclerotia zugesetzt. Es wird 48 Stunden bei 28°C unter Bewegung und Belüftung bebrütet. Anschließend wird eine Lösung von 12 g 4-Androsten-3,17-dion in 200 ccm Äthanol zugegeben und weitere 8 Stunden unter Rühren und Belüften bebrütet. Der erhaltene Brei wird mit Äthylacetat extrahiert und die Äthylacetatlösung eingeengt. Der Rückstand wird an einer Aluminiumoxydsäule chromatographisch adsorbiert und die Kolonne mit Benzol eluiert.
• Aus dem Eluat wird einRohprodukt mit einemSchmelzpunkt von 156°C gewonnen. Bei Umkristallisation dieses Produktes aus Aceton-Äther erhält man 4-Androsten-19-ol-3,17-dion in Form von Kristallen mit einem Schmelzpunkt von 165°C; La], =-E-180° (in Chloroform gemessen). Das Infrarotspektrum stimmt mit der einer Vergleichsprobe der angegebenen Verbindung überein.

Claims (3)

1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von 11- oder 19-Hydroxysteroiden durch Bebrütung eines entsprechenden in 11- und 19-Stellung keinen sauerstoffhaltigen Substituenten enthaltenden Steroids mit einer Kultur eines oxydierend wirkenden Mikroorganismus oder den daraus gewonnenen oxydierend wirkenden Enzymen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Pilz der Gattung Corticium als Mikroorganismus verwendet und das so in 11- oder 19-Stellung oxydierte Steroid nach bekannten Methoden, insbesondere durch Extraktion aus der Reaktionsmischung abtrennt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangssteroid Desoxycorticosteron, 17-Hydroxydesoxycorticosteron oder 1-Dehydro-17-hydroxydesoxycorticosteron verwendet werden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Pilz Corticium sasakii, Corticium microsclerotia und Corticium praticola verwendet werden.