DE1089512B

DE1089512B - Herstellung von Actinomycin Z

Info

Publication number: DE1089512B
Application number: DEC19419A
Authority: DE
Inventors: Dr Ernst Gaeumann; Dr Ernst Vischer
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1958-07-25
Filing date: 1959-07-18
Publication date: 1960-09-22

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen Antibiotikums, das im folgenden mit »Actinomycin Z« bezeichnet wird, seiner Komponenten, Derivate und Spaltprodukte.

Das Antibiotikum Actinomycin Z entsteht bei der Kultur eines neuen Stammes von Streptomyces fradiae, der im folgenden als Stamm NRRL 2765 beschrieben wird. Er wurde aus einer in Horsham, England, gesammelten Bodenprobe isoliert und wird in unseren Laboratorien und in der Eidgenössischen Technichen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter der Bezeichnung A 20 675 aufbewahrt.

Streptomyces fradiae NRRL 2765 bildet ein dunkelrotes zimtbraunes "bräunlichgraues Luftmycel. Die einzelnen Sporen sind glatt. Die Sporenketten bilden offene, regelmäßige Spiralen von meist mehr als fünf Windungen. Sie sind monopodial verzweigt und haben eine lange, gerade Hauptachse. Bei der Züchtung auf peptonhaltigen Nährböden verursacht der Stamm NRRL 2765 keine melanoide Verfärbung. Das Wachstum ist relativ wenig abhängig von der Temperatur; sowohl bei 18 als auch bei 40°C entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32° C.

Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum des Stammes NRRL 2765 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1 bis 7 und 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch. MikrobioL, 17, 361 [1952] hergestellt.

1. Synthetischer Agar

Wachstum punktförmig bis pustelig, sattgelb oder kastanienbraun. Luftmycel sammetig, weißgrau bis bräunlichgrau. Substrat sattgelb bis dunkelbraun.

2. Synthetische Lösung

Sediment, Flocken milchweiß bis hellbraun. Pellikel punktförmig, weißgelb. Substrat hellbraun.

3. Glukose-Agar

Wachstum dünn, schleierartig, weißgelb. Luftmycel wird nicht gebildet. Substrat umverfärbt.

4. Glukose-Asparagin-Agar

Wachstum dünn, schleierartig, anfangs dottergelb, später goldgelb bis bräunlichgelb. Luftmycel sammetig, zimtbraun bis bräunlichgrau.

5. Calciummalat-Agar

Wachstum punktförmig bis pustelig, dottergelb. Luftmycel sammetig, schneeweiß bis zimtbraun. Substrat bräunlichgelb.

6. Gelatinestich (18°C)

Oberflächenwachstum punktförmig, bräunlichgelb. Luftmycel wird nicht gebildet. Substrat kastenienbraun. Verflüssigung nach 20 Tagen 0,6 cm,. nach 30 Tagen 1,1 cm.

Herstellung von Actinomycin Z

Anmelder:
CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer Wall 10

Beanspruchte Priorität:
Schweiz vom 25. Juli 1958 und 5. Juni 1959

Dr. Ernst Gäumann, Vladimir Prelog, Zürich,

und Dr. Ernst Vischer, Basel (Schweiz),

sind als Erfinder genannt worden

7. Stärkeplatte

Wachstum pustelig, goldgelb. Luftmycel spärlich, staubig, einen feinen Überzug bildend, kreideweiß. Hydrolyse nach 8 Tagen 0,7 cm.

8. Kartoffeln

Wachstum runzelig, hellbraun. Luftmycel spärlich, hellgrau bis bräunlichgrau. Substrat nicht verfärbt.

9. Karotten

Wachstum runzelig, hellbraun. Luftmycel spärlich, kreideweiß. Substrat dunkelbraun.

10. Lackmusmilch

Wachstum spärlich, Pellikel dünn, hellgelb. Keine Peptonisierung oder Koagulation. Lackmus rot.

Der Stamm NRRL 2765 ist bezüglich Aussehen der Sporen, Farbe des Luftmycels, Spiralenbildung der Sporenketten und melanoider Verfärbung peptonhaltiger Nährböden identisch mit S. fradiae und wird deshalb vorläufig dieser Art zugezählt. Er unterscheidet sich von den bekannten Neomycin- und Fradicinproduzierenden Stämmen von S. fradiae (vgl. die deutsche Patentschrift 831754 und S.A. Waksman, »Neomycin«, Rutgers University Press [1953]), wie die folgende Tabelle zeigt:

009 608/311

	3	S. fradiae	S. fradiae	4	S. fradiae	S. fradiae
	(Originalbeschreibung)	Nr. 3535	Nr. 3554	NRRL 2765
Stamm	verzweigte Hyphen,	verzweigte Hyphen,	kurze, geschlossene	verzweigte Hyphen
Morphologie	ohne Spiralen	ohne Spiralen	Spiralen an den	mit Spiralen an den
des Luftmycels			Enden der	Enden der
			Sporophoren	Sporophoren
	rasche VerfL, keine	rasche Verfl., keine	rasche Verfl.., keine	rasche Verfl.,
Gelatinestab	Pigmente; punkt	Pigmente; flockiges	Pigmente; flockiges	Pigmente leicht
	förmig, creme	Wachstum	Wachstum	kastanienbraun;
	hellbraun			punktförmig,
				bräunlichgelb
	Peptonisierung;	starke	starke	keine
Lackmusmilch	leicht alkalisch	Peptonisierung;	Peptonisierung;	Peptonisierung;
		p_H gleich	p_H gleich	leicht sauer
	Wachstum orange;	Wachstum flechten	Wachstum flechten	Wachstum runzelig,
Kartoffel	kein lösliches	artig; orange; kein	artig; orange; kein	hellbraun; kein
	Pigment; wenig	lösliches Pigment;	lösliches Pigment;	lösliches Pigment;
	Luftmycel	wenig Luftmycel	wenig Luftmycel	wenig Luftmycel
	dünn, schleierartig,	spärliches Wachs	ziemlich reichliches	üppiges Wachstum;
Stärke-Agar	farblos, mit rosa	tum; Luftmycel	Wachstum mit rosa	Luftmycel kreide
	Luftmycel;	spärlich, rosa mit	Luftmycel mit	weiß,
	gute Hydrolyse	weißem Rand;	weißen Rändern;	gute Hydrolyse
		gute Hydrolyse	gute Hydrolyse
	Luftmycel	Luftmycel	Luftmycel	Luftmycel zimt
Glucose-Asparagin-	seemuschelrosa	hellbraunviolett	seemuschelrosa	braun bis braun-
Agar				grauviolett

Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung des Antibiotikums ActinomycinZ anbelangt, nicht auf die Verwendung des Stammes NRRL 2765 oder anderer der Beschreibung entsprechender Stämme beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen, gewonnen werden.

Actinomycin Z ist deutlich verschieden von den bekannten Antibiotika der Neomycingruppe und Fradicin, die von den obenerwähnten Stämmen von S. fradiae produziert werden. Die Neomycine sind gegen Bakterien aktive glycosidartig aufgebaute Verbindungen, während Fradicin, eine Verbindung der empirischen Formel C3oH₃₄N₄0₄, gegen Bakterien nicht aktiv, wohl aber fungicid wirksam ist (vgl. Waksman and Lechevalier, »Actinomycetes and their Antibiotics«, 1953).

Als Actinomycine bezeichnet man eine Gruppe von nahe verwandten roten, kristallinen, gegen Bakterien stark wirksamen Antibiotika, deren Molekül aus einem Farbstoffteil und einem Peptidteil aufgebaut ist. Bisher bekanntgeworden sind die Actinomycine A, B, C, F, I, J und X sowie deren Komponenten.

Actinomycin A (vgl. USA.-Patentschrift 2 378 876) ist eine von Streptomyces antibioticus gebildete, in zinnoberroten Plättchen kristallisierende Verbindung. Bei der Hydrolyse mit Salzsäure liefert sie die 5-Aminosäuren, L-Threonin, Sarkosin, L-Prolin, D-Valin und N-Methyl-L-valin (vgl. Ber., 87, 1045 [1954]).

Actinomycin B, aus einem nicht näher definierten Streptomyces-Stamm gewonnen (vgl. Todd et al., J. Chem. Soc. [1950], 2946), ist ebenfalls eine rote, kristallierte Substanz, die in zwei Hauptkomponenten B₁ und B₂ aufgeteilt werden kann und sich als identisch mit Actinomycin X bzw. dessen Komponenten X₁ und X₂ erwies (vgl. Brockmann, Ber., 87, 1045 [1954]). X₁ enthält die gleichen Aminosäuren wie Actinomycin A, aber in anderem Molverhältnis, während X₂ außerdem Oxyprolin enthält (vgl. Brockmann, Ber., 92, 1296 [1959]).
Actinomycin C (vgl. die deutschen Patentschriften 912 010, 925 064, 930 579 und 934715) ist eine von Streptomyces chrysomallus gebildete, in alizarinroten Bipyramiden kristallisierende Verbindung, die aus den Komponenten C₁, C₂, C₃ und zwei Nebenkomponenten besteht. Die Hauptkomponente C₂ weist außer den bereits genannten Aminosäuren noch Isoleucin auf, während die Hauptkomponente C₃ D-Valin nicht enthält, wohl aber auch Isoleucin; C₁ ist identisch mit Actinomycin A.

Actinomycin F (Hauptkomponenten F₁ und F₃; vgl. deutsche Patentschrift 1 021131 und Naturw., 43, 131 [1956]) ist ein Antibiotikum, das durch Zusatz von Sarkosin zu den Nährlösungen actinomycinbildender Streptomyceten erhalten wird; die Komponenten F₁ und F₃ unterscheiden sich von den bisher genannten Actinomycinen dadurch, daß sie kein L-Prolin enthalten; bei der Komponente F₃ fehlt auch VaHn; beide Komponente weisen Isoleucin auf.

Actinomycin I (vgl. die deutsche Patentschrift 934 715 und Naturw., 41,65 [1954]) enthält als Hauptkomponente Actinomycin I₁, das mit Actinomycin A identisch ist, daneben I₀, das die gleichen Aminosäuren, aber in anderem Molveihältnis, aufweist, und einige weitere Nebenkomponenten.

Actinomycin J₁ (vgl. J. Antibiot. Jap., 2, 181 [1949]) ist identisch mit Actinomycin B (vgl. Bossi et al., HeIv. Chim. Acta41,1645 [1958]), während J₂ ein Gemisch von J₁ mit einer antibiotisch inaktiven Verbindung ist.

Alle genannten Actinomycine unterscheiden sich durch

ihre Aminosäurekomponenten von Actinomycin Z.

Das Antibiotikum Actinomycin Z besteht aus mindestens sechs Komponenten Z₀, Z₁, Z₂, Z₃, Z₄ und Z₅, die mittels Papierchromatographie getrennt werden können und die verschieden sind von den Komponenten der Actinomycine C, X und I, auf die sich alle bekannten natürlichen Actinomycine zurückführen lassen. Die entsprechenden Daten sind in der folgenden Tabelle

I 089 512

zusammengestellt, wobei für die einzelnen Komponenten nach einem Vorschlag von Brockmann und Gröhne (Chemische Belichte, 87, 1036 [1954]) die RC₂-Werte (= Verhältnis der Laufstrecke auf dem Papier eines unbekannten Actinomycins zur Laufstrecke des Actinomycins C₂) angegeben werden:

Actinomycin Z ' RC₂-Wert	Z ca. 0,35	Z₁ 0,39	Z₂ 0,78	Z₃ 1,63	Z₄ 2,36	Z₅ 2,55
Actinomycin C RC₂-Wert		Ci 0,63	C₂ 1,00	C₃ 1,52
Actinomycin I RC₂-Wert		Ii 0,65
Actinomycin X	Xo 0,20	Xi 0,65	X₂ 1,05

in Wasser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel wie Aceton, Butanol oder Methyläthylketon.

Man kann auch die Kulturen direkt, ohne .vorgängige 5 Abtrennung des Mycels, in der angegebenen Art und Weise extrahieren.

Eine weitere Anreicherung läßt sich dadurch erzielen, daß man die antibiotikumhaltigen organischen Extrakte zuerst mit einer sauren wäßrigen Lösung mit einem ίο p_H unter 5 und dann mit einer alkalischen wäßrigen Lösung mit einem p_H über 8 wiederholt auszieht, wobei die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität in der organischen Phase bleibt, aus der das Actinomycin Z isoliert wird. Als saure wäßrige Lösungen eignen sich 15 verdünnte Säuren, wie Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure, oder Pufferlösungen, wie Citrat- oder Phosphatpuffer, und als alkalische wäßrige Lösungen verdünnte Alkalien, wie Natronlauge oder Kalilauge, oder Puffer-Für diese papierchromatographischen Untersuchungen lösungen, wie Phosphatpuffer u. dgl. bewährt sich ein Lösungsmittelsystem, bestehend aus ^ao D^as rohe Actinomycin Z kann aus den Konzentraten Natrium-metakresotinat und einem Gemisch von 1 Volum- solcher Extrakte durch Zugabe von Petroläther, Pentan, teil Di-n-butyläther und 3 Volumteilen n-Butylacetat. Hexan u. dgl. direkt als amorphes rotes Pulver ausgefällt

Die Nährlösung enthält als anorganische Salze beispiels- werden.

weise Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Ein gutes Reinigungsverfahren für das neue Anti-

Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan. Kohlen- ²5 biotikum stellt die Chromatographie dar, wobei sich stoffquellen sind vor allem Kohlehydrate, wie z. B. Aluminiumoxyd als Adsorbens besonders bewährt hat. Glukose, Saccharose, Lactose und Stärke. Als stickstoff- Die Gewinnung des reinen Antibiotikums in kristalliner haltige Verbindungen und gegebenenfalls zuzusetzende Form nimmt man z. B. aus organischen Lösungsmitteln, wachstumsfördernde Stoffe seien z. B. genannt: Amino- wie aus Aceton, Methanol, Äthanol, Chloroform, Acetonsäuren und ihre Gemische, Peptide und Proteine sowie 3o Methanol-Gemischen, Aceton-Äther-Gemischen oder

Aceton-Petroläther-Gemischen, vor. Zum Umkristallisieren dienen dieselben Lösungsmittel oder auch wäßrigorganische Lösungen, wie verdünnte Alkohole, verdünntes Aceton usw.

Das Actinomycin Z kristallisiert in roten feinen Stäbchen. F. 260 bis 264°C;[a]D = -314°C (c =0,246 in Chloroform). Die Elementaranalyse liefert folgende Werte: C = 54,88 ο/,,, 54,65 %; H = 6,42 ■>/„, 6,57 °/₀; N = 12,25 °/₀, 12,03 »/„; O (berechnet) = 26,60 ⁰I₀. Sein UV-Absorptions-Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als 4<> Spektrum zeigt Banden bei 242 πιμ (log E₁ ¹,.* = 2,34), Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 4O⁰C. bei 429 my. (log £^=2,25) und bei 443 πιμ (log Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nähr- E₁ ¹^₁ = 2,27). Im Infrarotspektrum, aufgenommen in lösung dabei im allgemeinen nach 24 bis 96 Stunden. Kaliumbromid (vgl. Fig. 1), sind Banden unter anderem

Zur Isolierung des Antibiotikums können z. B. folgende bei folgenden Wellenlängen sichtbar: 2,89, 3,36,3,40, 5,70, Verfahren dienen: Man trennt das Mycel vom Kultur- « 6,05,6,30,6,60,6,67,7,07,7,31,7,58,7,65,8,36,9,00,9,12, filtrat ab, wonach die Hauptmenge des Antibiotikums im 9,39, 13,30 und 14,40 μ.

Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem Zur Isolierung der sechs Komponenten des Actino-

namhafte Mengen des Antibiotikums am Mycel adsorbiert. mycins Z ist die Chromatographie geeignet. Als Adsorben-Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu tien haben sich Aluminiumoxyd oder Cellulose besonders eignen sich besonders organische, mindestens teilweise 5o bewährt. Auch die Verteilung zwischen zwei nicht oder wasserlösliche Lösungsmittel wie Alkohole, z. B. Meth- nur teilweise mischbaren Phasen ist für die Anreicherung anol, Äthanol und Butanole, oder Ketone, z. B. Aceton der einzelnen Komponenten sehr zweckmäßig. Vorteil- und Methyläthylketon. Diese Mycelextrakte werden hafterweise wird dabei nach dem Gegenstromverfahren entweder direkt oder nach vorheriger Konzentration im gearbeitet. Als besonders günstiges Lösungsmittelsystem Vakuum zum Kulturfiltrat gegeben. Man extrahiert das 55 hat sich ein Gemisch einer wäßrigen Lösung von Natrium-Gemisch mit einem mit Wasser nicht mischbaren orga- /5-naphthalin-sulfonat mit Isopropyläther erwiesen. Diese nischen Lösungsmittel, wie Estern niederer Fettsäuren, genannten Methoden können einzeln oder in Kombination beispielsweise Äthylacetat oder Amylacetat, Kohlen- miteinander angewandt werden. Für die Reindarstellung Wasserstoffen, z. B. Benzol, chlorierten Kohlenwasser- der sechs Actinomycin-Z-Komponenten hat sich folgende stoffen, z. B. Äthylenchlorid, Methylenchlorid oder 6o Kombination als besonders günstig erwiesen:

ihre Hydiolysate, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen bei der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwoll- 35 pflanze.

Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in

Chloroform, Ketonen, z. B. Methylpropylketon, Methylamylketon oder Diisobutylketon, Alkoholen, wie Butylalkoholen oder Amylalkoholen, Äthern, z. B. Äthyläther, Diisopropyläther, Dibutyläthern oder Glykoläthern u. dgl. An Stelle einer Lösungsmittelextraktion der Kulturen 65 oder in Kombination mit einer solchen als weitere Reinigungsoperation kann man das Antibiotikum auch durch Adsorption gewinnen, beispielsweise an Aktivkohle oder an aktivierten Erden, wie Fullererde oder Floridin, und

1. Chromatographie an Aluminiumoxyd, wobei die Komponenten Z₀ und Z₁ voneinander und von den Komponenten Z₂ bis Z₅ getrennt werden können;

2. Gegenstromverteilung, wobei die Komponente Z₅ abgetrennt wird;

3. Chromatographie an Cellulose, wobei die Komponenten Z₂, Z₃ und Z₄ voneinander getrennt werden.

Die Komponenten des Actinomycins Z können in

anschließende Extraktion des Adsorbates z. B. mit einem 7° kristalliner Form erhalten werden, wobei vorzugsweise

die für die Kristallisation des Actinomycins Z angegebenen Lösungsmittel und Lösungsmittelgemische verwendet werden. Im folgenden werden diese Komponenten näher charakterisiert:

Actinomycin Z₀

Orangebraunes mikrokristallines Pulver; bei 250°C Zersetzung; UV-Absorption in Feinsprit: Banden bei 236 ηιμ (log E₁ ¹,^ = 2,44) und bei 437 πιμ (log E₁** =2,17).

Actinomycin Z₁

Orangerote Kristalle; F. 256 bis 260°C (Zers.); [a]_D = —362° (c =0,185 in Chloroform); Elementaranalyse: C = 53,97%, H = 6,79%, N = 12,30%, (CH₃)N = 7,48 %, C H₃ O = 0 %; UV-Absorptionsspektrum in Feinsprit: Banden bei 240 ΐημ (log E₁ ¹^ =2,25), 427 πιμ (log E₁ ¹^ = 2,00) und bei 442 ηιμ (log E₁ ¹^ = 2,01).

Actinomycin Z₅

Rote Kristalle; F.261 bis 267°C (Zers.); [d\_D = - 284° (c = 0,244 in Chloroform); Elementaranalyse: C = 55,71%, H = 6,44%, N = 12,25%; UV-Ab-Sorptionsspektrum in Feinsprit: Banden bei 240 πιμ (log E₁ ¹^ = 2,40), bei 428 ΐημ (log E/£ = 2,21) und bei 443 πιμ (log E₁ ¹^ = 2,24).

Bei der sauren Hydrolyse von Actinomycin Z und von seinen Komponenten Z₀, Z₁, Z₂, Z₃, Z₄ und Z₈ entstehen unter anderem die Aminosäuren N-Methylvalin, Valin, N-Methylalanin, Sarkosin und Threonin.

Das Antibiotikum Actinomycin Z besitzt eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37° C bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen:

Testorganismen

Micrococcus pyogenes, var. aureus

Micrococcus pyogenes, var. aureus, peni-

cillinresistent

Streptococcus pyogenes

Streptococcus viridans

Streptococcus faecalis

Corynebacterium diphtheriae

Bacillus megatherium

Mycobacterium tuberculosis *)

Entamoeba histolytica**)

Trichomonas foetus***)

Hemmende

Konzentration
/ig/cm³

10

100

1000

<40

*) In Kirchners synthetischem Medium mit 5% bovinem Albumin kultiviert; Ablesung des Wachstums nach 2 Wochen.
**) Kultur in Bacto-Entamoeba-Medium; Ablesung der amoebiciden Wirkung nach 24 Stunden.

***) In Bouillon mit 10% Pferdeserum bei 37° C kultiviert; Ablesung nach 4 Tagen.

Die Entwicklung von Influenza-Virus auf isolierten Membranen der Hühner-Chorioallantois von 14tägigen Bruteiern wird noch in einer Konzentration von 10 μg/cm^s gehemmt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden außer den Herstellungsverfahren für das Antibiotikum Actinomycin Z sowie für seine Komponenten Z₀, Z₁, Z₂, Z₃, Z₄ und Z₅ auch die genannten Verbindungen selbst, weiter die mittels Hydrierung oder Oxydation erhaltenen Umwandlungsprodukte sowie die Spaltprodukte, wie sie z. B. bei der Hydrolyse des Antibiotikums Actinomycin Z erhalten werden.

Das Antibiotikum Actinomycin Z, seine Komponenten Z₀, Z₁, Z₂, Z₃, Z₄ und Z₅, die obengenannten Umwandlungs- und Spaltprodukte oder entsprechende Gemische können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die

ίο genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie

z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohol, Gummi, PoIyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremes, Suppositorien oder in flüssiger Foim als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne daß damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1

Man bereitet eine Nährlösung der Zusammensetzung: 20 g Sojamehl, 20 g Mannit und 11 Leitungswasser und stellt sie auf p_H 7,8 ein. Diese bzw. ein Vielfaches derselben wird in 500-cm³-Erlenmeyern (mit je 100 cm³ Nährlösung) oder in 500-1-Fermentern (mit je 3001 Nährlösung) abgefüllt und 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Dann impft man mit bis zu 10 % einer teilweise sporulierenden, vegetativen Kultur des Stammes NRRL 2765 an und inkubiert unter gutem Schütteln bzw. Rühren und in den Fermentern unter Belüftung (mit etwa 1 Volumen steriler Luft pro Volumen Nährlösung pro Minute) bei 27°. Nach 70 bis 120 Stunden Wachstum filtriert man die Kulturen unter Zusatz eines Filterhilfsmittels je nach Volumen durch eine Nutsche oder durch eine Filterpresse oder einen rotierenden Filter und befreit so die antibiotisch wirksame wäßrige Lösung vom Mycel und andeien festen Bestandteilen.

Beispiel 2

Verwendet man an Stelle des im Beispiel 1 angegebenen Mediums die im folgenden beschriebenen Nährlösungen a), b), c) oder d), so erhält man nach analoger Sterilisation, Beimpfung mit dem Stamm NRRL 2765, Inkubation bei 27° und Filtration wäßrige antibiotisch wirksame Lösungen:

a) 10 g Galaktose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt (Oxo Lab Lemco) und 11 Leitungswasser; p_H vor der Sterilisation: 7,5.

b) 20 g Malzextrakt, 20 cm³ Maisquellwasser (corn steep liquor), 5 g Natriumchlorid, 0,2 g sek. Kaliumhydrophosphat, 2 g Calciumcarbonat und 11 Leitungswasser; p_H vor der Sterilisation: 7,5.

c) 20 g Glycerin, 2,5 g Glykokoll, 1,0 g Natriumchlorid, 0,1 g sek. Kaliumhydrophosphat, 0,1 g krist. Ferrosulfat, 0,1 g krist. Magnesiumsulfat, 0,5 g Calciumcarbonat und 11 Leitungswasser; p_H vor der Sterilisation: 7,5.

d) 20 g Glycerin, 1 g Caseinhydrolysat, 10 g Kaliumnitrat, 5 g sek. Kaliumhydrophosphat, 5 g Natriumchlorid, 5 g

Magnesiumsulfat, 10 mgkrist. Ferrosulfatundl 1 Leitungswasser; p_H vor der Sterilisation: 7,5.

Beispiel 3

Der Filterrückstand eines gemäß Beispiel 1 oder 2 erhaltenen 120-1-Ansatzes wird mit 151 Aceton ausgerührt und erneut nitriert. Dies wird zweimal wiederholt, worauf man die antibiotikumhaltigen Acetonlösungeii vereinigt, im Vakuum auf 5 1 einengt und mit dem Kulturfiltrat vereinigt. Diese Lösung wird mit 701 Äthylacetat ίο ausgezogen, wobei die gesamte antibakterielle Aktivität in die organische Phase übergeht. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen, im Vakuum auf 5 1 eingedampft und dann mehrere Male mit 0,5n-Essigsäure und mit 2n-Natronlauge ausgeschüttelt. Schließlich trocknet man die Äthylacetatlösung über Natriumsulfat und konzentriert sie im Vakuum auf 21. Durch Zugabe von 11 Petroläther wird daraus das rohe Actinomycin Z in Form eines orangeroten Pulvers ausgefällt. (Ausbeute: 11,5 g.)

ao Beispiel 4

9,5 g des gemäß Beispiel 3 erhaltenen rohen Actinomycitts Z werden an einer Säule von 260 g neutralem Aluminiumoxyd der Aktivität III chromatographiert. Man eluiert die Säule mit je 500 cm³ abs. Benzol und Chloroform und mit 700 cm³ eines Gemisches von Chloroform— Methanol (98 : 2). Mit den ersten beiden Lösungsmitteln werden nur farblose, inaktive Nebenprodukte abgelöst, während das Chloroform-Methanol-Eluat tiefrotgefärbt ist und nach dem Eindampfen im Vakuum 4,5 g eines roten amorphen, biologisch aktiven Rückstandes liefert. Durch Kristallisation aus einem Gemisch von Aceton und Äther wird daraus das reine Actinomycin Z in Form von rotorangen Kristallen erhalten, die bei 260 bis 264° unter Zersetzung schmelzen. Die Elementaranalyse gibt folgende Werte: C = 54,88°/₀, H =6,42% und N = 12,25%, O (berechnet) = 26,45 %. Das in Feinsprit aufgenommene UV-Spektrum zeigt folgende Absorptionsmaxima:

log E₁ ¹

1% cm

242
2,34

429
2,25

443 πιμ.
2,27

Komponente	RC₂-Wert
Z₀	0,35
Z₁	0,39
Z₂	0,78
Z₃	1,63
Z₄	2,36
Z₅	2,55

Im Infrarot-Absorptionsspektrum (vgl. Fig. 1) finden sich unter anderem Banden bei 2,89, 3,36, 3,40, 5,70, 6,05, 6,30, 6,60, 6,67, 7,07, 7,31, 7,58, 7,65, 8,36, 9,00, 9,12, 9,39, 13,30 und 14,40 μ.

Die papierchromatographische Untersuchung des kristallinen Actinomycin Z (Rundfiltermethode mit 10%iger wäßriger Lösung von Natrium-meta-kresotinat als stationäre und mit einem Gemisch von 3 Volumteilen Butylacetat und 1 Volumteil Dibutyläther als mobile Phase) zeigt, daß es aus mindestens sechs Komponenten (Z₀, Z₁, Z₂, Z₃, Z₄ und Z₅) besteht, die folgende RC₂-Werte zeigen (RC₂ = Verhältnis der Laufstrecke der unbekannten Substanz zur Laufstrecke der Komponente C₂ des Actinomycins C):

65 Beispiel 5

Eine Lösung von 30 mg Actinomycin Z in einem Gemisch von 1 cm³ konz. Salzsäure und 1 cm³ Wasser wird in einem Glasrohr eingeschmolzen und 20 Stunden

auf 110 bis 120° erhitzt. Nach dem Erkalten wird das Hydrolysegemisch filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mittels zweidimensionaler Papierchromatographie untersucht, wobeifolgende Lösungsmittelsysteme verwendet werden:

a) wassergesättigtes Phenol und

b) ein Gemisch von n-Butanol, Eisessig und Wasser im Volumenverhältnis 4:1:1.

Die Papierchromatogramme werden einerseits mit Ninhydrin und andererseits mit Pyridin und p-Nitrobenzoylchlorid angefärbt. Auf diese Weise können im Hydrolysegemisch die Aminosäuren N-Methylvalin, VaHn, N-Methylalanin, Sarkosin und Threonin festgestellt werden.

Beispiel 6

Eine Lösung von 750 mg gemäß Beispiel 4 erhaltenem kristallinem Actinomycin Z in 20 cm³ Benzol wird auf eine Säule von 100 g Aluminiumoxyd (Aktivität III nach Brockmann, neutral) gegeben. Man läßt je 100 cm³ Benzol und Chloroform durch die Säule laufen, wobei keine Elution stattfindet. Dann entwickelt man das Chromatogramm mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol (99:1), wobei sich drei rote Zonen bilden. Die unterste kann mit 120 cm³ dieses Gemisches eluiert werden und besteht aus den Actinomycinen Z₂, Z₃, Z₄ und Z₅. Weitere 500 cm³ des genannten Gemisches eluieren die zweite Zone, die aus einheitlichem Actinomycin Z₁ besteht. Dieses wird aus Aceton—Äther kristallisiert und bildet orangerote Kristalle vom F. 256 bis 260° (Zers.); \a\_D = —362° (c = 0,185 in Chloroform); Elementaranalyse : C = 53,97 %, H = 6,79 %, N = 12,30 %, (C H₃) N = 7,48%, CH₃O = 0%; U V-Absorptionsspektrum in Feinsprit: A_max = 240 ηιμ (log E₁ ¹^ = 2,25), 427 ηιμ (log E/_c* = 2,00), 442 mti (log E₁ ¹.* = 2,01). Das IR-Spektrum stimmt mit dem von Actinomycin-Z-Gemisch völlig überein.

Die dritte Zone des Chromatogramms wird mit 150 cm³ eines Chloroform-Methanol-Gemisches (97 : 3) eluiert. Sie besteht aus einheitlichem Actinomycin Z₀. Aus Aceton— Äther erhält man dieses als orangebraunes, mikrokristallines Pulver, das sich bei etwa 250° zersetzt. Im Papierchromatogramm verhält es sich wie Actinomycin Z₁, die Zone ist aber weniger scharf. Sein UV-Absorptionsspektrum in Feinsprit zeigt Banden bei 236 πιμ (log E₁ ¹^ 2,44) und bei 437 πιμ (log E₁ ¹^ = 2,17).

Beispiel 7

390 mg des gemäß Beispiel 6 erhaltenen Gemisches der Komponenten Z₂, Z₃, Z₄ und Z₅ von Actinomycin Z werden einer hundertstufigen Gegenstromverteilung unterworfen, wobei folgendes Lösungsmittelgemisch verwendet wird: 2%ige wäßrige Lösung von Natrium-naphthalin-/3-sulfonat als stationäre Phase und ein Gemisch von 4 Volumteilen Isopropyläther und 1 Volumteil Essigester als mobile Phase. Nach hundert Überführungen finden sich drei Substanz- und Farbmaxima bei den Fraktionen 6, 55 und 88. Der Inhalt der Verteilungsgefäße 0 bis 15, 41 bis 65 und 81 bis 92 wird vereinigt. Die Fraktionen 0 bis 15 enthalten Actinomycin Z₁ und Verunreinigungen, während in den Fraktionen 41 bis 65 ein Gemisch der Actinomycine Z₂, Z₃ und Z₄ vorhanden ist, das aus Aceton—Äther in feinen roten Kristallen erhalten wird, die sich bei etwa 260° langsam zersetzen. [a]² _D° = —296° (c = 0,257 in Chloroform); UV-Absorptionsspektrum in Feinsprit: /l_max = 240 ΐημ (log E₁ ¹,.* = 2,36), 428 ταμ (log E₁^ = 2,17), 441 ταμ log E₁^* = 2,18). Aus den Fraktionen 81 bis 92 wird durch Behandlung mit Aceton und Äther reines kristaUines Actinomycin Z₅

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erhalten. F. 261 bis267° (Zers.); [d\_D = -284° (c = 0,244 in Chloroform); UV-Absorptionsspektrum in Feinsprit: Banden bei240 ταμ (log E/_c* = 2,40), bei 428ταμ (log E₁ ¹^ = 2,21) und bei 443 ηιμ (log E₁ ¹.* =2,24); Elementaranalyse: C =55,71%, H =6,44%, N = 12,25%, O (berechnet) =25,60%.

Beispiel 8

30 g Cellulosepulver werden mit 120 cm³ einer 10%igen wäßrigen Natrium-meta-kresotinatlösung verrührt und dann in eine Chromatographiersäule von 2,6 cm Durchmesser eingefüllt. Die überschüssige wäßrige Lösung wird entfernt, worauf die Säule mit einem Gemisch von 3 Volumteilen Butylacetat und 1 Volumteil Dibutyläther durchgewaschen wird. Man löst 280 gm Actinomycin Z in 15 cm³ dieses Lösungsmittelgemisches und bringt diese Lösung auf die Säule und eluiert weiter mit dem gleichen Gemisch, wobei folgende Fraktionen einzeln aufgearbeitet und papierchromatographisch untersucht werden:
Fraktion 1

40 cm³ Actinomycin Z₅, einheitlich;
Fraktion 2

40 cm³ Gemisch Actinomycin Z₄, Z₃ und Z₂;
Fraktion 3

180 cm³ Gemisch Actinomycin Z₃, Z₂ und Z₁;

Fraktion 4

130 cm³ fast ausschließlich farblose Nebenprodukte;
Fraktion 5

300 cm³ Actinomycin Z₁, einheitlich.

Beispiel 9

Nach der im Beispiel 8 beschriebenen Methode chromatographiert man 250 mg eines gemäß Beispiel 7 erhaltenen Gemisches von Actinomycin Z₂, Z₃ und Z₄ an 30 g Cellulosepulver, wobei Fraktionen von je 20 cm³ Lösungsmittel aufgefangen werden. Die Fraktionen 4, 6 bzw. 10 enthalten papierchromatographisch einheitliches Actinomycin Z₄, Z₃ bzw. Z₂. Diese Fraktionen werden einzeln aufgearbeitet. Durch Behandlung mit Aceton—Äther erhalt man die Actinomycine Z₄, Z₃ und Z₂ in kristalliner Form.

Beispiel 10

25 mg des Gemisches der Actinomycine Z₂, Z₃ und Z₄ (vgl. Beispiel 7) werden auf vier Bogen Whatman-Papier Nr. 1 nach dem im Beispiel 8 beschriebenen Verfahren getrennt. Die Zonen der einzelnen Komponenten werden ausgeschnitten und dreimal mit Alkohol eluiert. Die Eindampfrückstände der Eluate, die reichlich Natrium-metakresotinat enthalten, werden in Äthylacetat gelöst und dreimal mit verdünnter Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die getrockneten Lösungen werden eingedampft und die Rückstände an Kolonnen aus etwa 1 g Aluminiumoxyd nochmals gereinigt. Es werden so je etwa 5 mg der reinen Actinomycine Z₃ und Z₄ erhalten. Das Actinomycin Z₂ fällt in einer Menge von weniger als 1 mg an.

Bestimmung der Aminosäuren. Je etwa 3 bis 5 mg der reinen Actinomycine Z₀, Z₁, Z₃, Z₄ und Z₅ werden mit je 0,5 ml Wasser und 0,5 ml konz. Salzsäure in ein kleines Rohr eingeschmolzen und über Nacht bei etwa 110° hydrolysiert. Die Hydrolysate werden im Vakuum eingedampft und in je etwa 100 μΐ Wasser gelöst. Die Aminosäuren werden durch zweidimensionale Papierchromatographie bestimmt. Fließmittel: 1. Wassergesättigtes Phenol, 2. Butanol—Eisessig—Wasser (4:1:1). Mittels der Ninhydrin-Reaktion können in den Hydrolysaten von allen Actinomycin-Z-Komponenten dieselben fünf Aminosäuren nachgewiesen werden, nämlich Threonin, Sarkosin, N-Methylalanin, Valin und N-Methylvalin. Prolin wird in keinem Falle gefunden.

Claims

Patentanspruch:

Die Verwendung von Streptomyces fradiae NRRL 2765 oder eines dessen Eigenschaften aufweisenden Mikroorganismus zur Herstellung des Antibiotikums Actinomycin Z bzw. seiner Komponenten durch übliche biologische Züchtung, Gewinnung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat, gegebenenfalls Aufteilung in Komponenten und Reindarstellung.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Deutsche Patentschriften Nr. 831 754,912 010,925 064,

930 579,934 715,1021131;

USA.-Patentschriften Nr. 2 378 876, 2 667 441,

2 686 749, 2 698 821, 2 799 622;

Chem. Zentralblatt, 1952, S. 4315; 1953, S. 5198; 1954,

S. 10506; 1956, S. 13161; 1951, II, S. 1304; 1951,1,

S. 1019 bis 1020; 1956, S. 9488; 1950, II, S. 56 und 308; 1952, S. 2690.

In Betracht gezogene ältere Patente:
Deutsches Patent Nr. 1060 091,

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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