DE10352510A1

DE10352510A1 - Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes

Info

Publication number: DE10352510A1
Application number: DE2003152510
Authority: DE
Inventors: Gudrun Brockmann; Ulla Renne
Original assignee: FORSCHUNGSINSTITUT fur DIE BIOLOGIE LANDWIRTSCHAFTLICHER NUTZTIERE
Current assignee: FORSCHUNGSINSTITUT fur DIE BIOLOGIE LANDWIRTSCHAFTLICHER NUTZTIERE
Priority date: 2003-11-07
Filing date: 2003-11-07
Publication date: 2005-06-23
Also published as: WO2005045054A2; WO2005045054A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes.

Description

Fettleibigkeit stellt einen wesentlichen gesundheitlichen Risikofaktor für Typ II-Diabetes, koronare Herzerkrankungen und metabolische Erkrankungen dar. Nach Erhebungen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind etwa 8% aller Erwachsenen weltweit (etwa 300 Millionen Menschen) extrem fettleibig, gemessen am sogenannten „Body Mass Index" (BMI), der bei mehr als 30 kg/m² liegt. In Industrieländern mit westlichem Lebensstil sind etwa ein Viertel der Kinder und Heranwachsenden übergewichtig. Folglich konzentriert sich ein breiter Forschungszweig auf die Entschlüsselung der genetischen und physiologischen Faktoren, die Fettleibigkeit verursachen.

Die Fettleibigkeit resultiert aus der Einlagerung überschüssiger, aus Nahrung stammender Energie. Die physiologischen Ursachen der Fettleibigkeit können ein oder mehrere Veränderungen im Appetitverhalten, im Nährstoffwechsel, der Wärmeentwicklung oder der Energieverteilung sein. Das Körpergewicht und der Appetit werden im wesentlichen durch Neuropeptide reguliert, die vom Hypothalamus als Antwort auf Signale von Fett, Muskel, der Leber und des Gastrointestinaltrakts freigesetzt werden. Die Antworten des Hypothalamus können das symphatische Nervensystem aktivieren, das die inneren Organe innerviert. Das Gehirn kontrolliert auch den Energieaufwand über die Hypothalamus-Hypohyse-Schilddrüsen-Achse. Ferner ist der extrem fettleibige Phänotyp oftmals durch eine Störung der Homeostase begleitet, die durch mit der Fettleibigkeit verwandte Hormone reguliert wird, wodurch es beispielsweise zur Hyperleptinämie und Hyperinsulinämie kommen kann.

Die Fettleibigkeit ist ein komplexes Merkmal, das den Effekt eines Gen-Netzwerks reflektiert, und das durch Nahrung, Alter, Geschlecht und Bewegung beeinflußt wird. Ein Beweis für einen genetischen Einfluß auf die Fettleibigkeit stammte aus Zwillingsstudien. Die Vererbbarkeit der Fettmasse wurde auf etwa 40 – 70% geschätzt, und Umweltfaktoren tragen zu etwa 26% zur Phänotyp-Varianz bei.

Obwohl seltene Fälle monogener Fettleibigkeit meist bei Kindern beobachtet wurden (z.B. Unterbrechung des Single-minded Homolog 1-Gens oder Verlust der Funktion des für den Leptin-Rezeptor kodierenden Gens), erbringen unabhängige Ahnenstudien den klaren genetischen Beweis für oligogene oder polygene Prädisposition der Fettleibigkeit. Diese Studien zeigen auch genetische Unterschiede hinsichtlich der Prävalenz der Fettleibigkeit zwischen ethnischen Gruppen. Ferner zeigte die Studie Swedish Obese Subjects, daß unterschiedliche Gene für die Fettleibigkeit in verschiedenen Altersstufen verantwortlich sein könnten.

In Kopplungsanalysen bei der Maus, beim Menschen, beim Schwein, beim Rind, der Ratte und anderen Modelltieren wurden genomweit QTL (quantitative trait loci; quantitative Merkmalsloci) identifiziert, die einen Einfluss auf die Körpermasse und den Fettansatz haben. Bisher wurden nur vereinzelt Gene gefunden, die diesen QTL-Effekten unterliegen. Diese waren in der Regel Hauptgen-Effekte, d.h. sie trugen den Hauptanteil an der phänotypischen Varianz eines Merkmals (Eine Mutation im Gen PRKAG3 (protein kinase, AMP-activated, gamma 3 non-catatlytic subunit) erhöht zum Beispiel den Muskel-Glykogengehalt um 70 und ist als Hauptgen identifiziert worden, Milan et al., Science. 288 (2000) 1248–1251).

Eine Reihe von Genen mit Einfluß auf Körpermasse und Körperzusammensetzung wurde in monogenen Mausmodellen identifiziert. Die grundsätzliche Bedeutung dieser Gene für die Regulation der Körpermasse wurde bei Mensch und Tier nachgewiesen. Zu den identifizierten Genen gehören natürlicherweise mutierte Gene (z.B. im Leptin- oder im Leptin-Rezeptor-Gen) und genetisch modifizierte Gene in transgenen Modellen (z.B. Adipozyten-spezifische Genexpression von Hydroxysteroid 11-beta Dehydrogenase 1) oder in Knockout-Modellen (z.B. des Insulin-Rezeptors, Überblick bei Butler und Cone; Trends Genet. 17 (2001) 50–54) mit verändertem Wachstum and Fettansatz. In diesen drastischen Modellen führt das nutierte Gen in der Regel zum vollständigen Ausfall der Funktion des kodierten Proteins.

Chemisch oder durch Strahlung induzierte Mutanten bei der Maus haben eine besondere Bedeutung bei der Funktionsaufklärung von Genen mit Einfluss auf das Merkmalsspektrum. Potentiell kann, z.B. mittels ENU (ethylnitrosourea; Ethylnitrosoharnstoff), jede Base mutiert werden, wodurch auch weniger drastische Funktionsveränderungen von Genen erzeugt werden können (Hrabe de Angelis et al., Nat. Genet. 25 (2000) 444–447; Nolan et al., Nat. Genet. 25 (2000) 440–443). Mutanten werden in einem Screen jedoch nur dann erkannt, wenn die Differenz zur Basislinie groß genug ist. Die Identifizierung solcher Mutationen erfordert wiederholte Rückkreuzungen, um zu zeigen, dass der beobachtete Effekt auf ein Gen zurückzuführen ist, bevor verschiedenartige Methoden kombiniert werden, um das mutierte Gen zu finden.

Die Erzeugung artifizieller Mutanten ist zweifelsfrei ein wichtiges Werkzeug zur Funktionsaufklärung von Genen und damit für die Bereitstellung zahlreicher neuer, funktioneller Kandidatengene. Zwei wichtige Fragen können mit diesen Modellen jedoch nicht geklärt werden: erstens, ob die bisher identifizierten und oben beschriebenen Mutationen auch in selektierten oder natürlichen Populationen eine Rolle für die Regulation der Körpermasse spielen, und zweitens, inwieweit diese Gene im genomischen Netz komplexer und quantitativer Merkmale zum Phänotyp beitragen. Möglicherweise sind einige Genvarianten, die eine kompensatorische Aufgabe in der Regulation übernehmen können, evolutionär bevorteilt (Barton and Keightley, Nat. Rev. Genet. 3 (2001) 11–21). Funktionelle Daten, die an der Hefe Saccharomyces cerevisiae gewonnen wurden, demonstrieren, dass Interaktionen zwischen unverwandten Genen zum Beispiel die Hauptursache für Robustheit gegenüber loss-of-function Mutationen sind, d.h. Mutationen, die zu einem Funktionsverlust des betroffenen Gens führen (Wagner, Nat Genet. 24 (2000) 355–61).

Das Verstehen der komplexen Regulation von Körpermasse und Körperzusammensetzung setzt über die QTL-Kartierung hinaus die Identifikation der quantitativen Merkmalsgene (quantitative trait genes, QTG) voraus, einer sehr schwierigen und komplexen Aufgabe, die bisher kaum gelungen ist (Nadeau et al., Science 291 (2001) 1251–1255; Threadgil et al., Mamm. Genome 13 (2002) 175–8) .

Da, wie bereits erwähnt, die meisten Fälle hohen Körpergewichts und der Fettleibigkeit, sowohl beim Menschen als auch beim Tier, polygener Natur sind und durch Umweltfaktoren beeinflusst werden, besteht ein Bedürfnis, diejenigen Gene zu identifizieren, die für die genetische Prädisposition und Ausprägung verantwortlich sind.

Zur Lösung dieser Aufgabe wurde ein polygenes Tiermodell (Mausmodell) verwendet, das sich – zunächst allgemein ausgedrückt – dadurch auszeichnet, dass in den Tieren in spezifischen Geweben (Fett, Hypothalamus) ein Satz von Genen verstärkt und ein Satz von Genen vermindert exprimiert wird, so dass die von diesen Genen kodierten Proteine in verschiedenen Geweben im Vergleich zu durchschnittlichen Tieren in einem erhöhten bzw. erniedrigten Anteil gebildet werden. Darüber hinaus liegen bestimmte Veränderungen (Polymorphismen) in den Sequenzen einiger Gene bzw. regulatorischer Sequenzen derselben vor.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung genutzten Mauslinien (bezeichnet als DU6 und DU6i) zeichnen sich durch eine überdurchschnittlich hohes Körpergewicht und Fettakkumulation (Fettleibigkeit) aus. Sie unterscheiden sich von unselektierten Kontrollpopulationen um mehr als das etwa 2-fache bis zum etwa 4-fachen im Körpergewicht, um mehr als das etwa 3-fache bis zum etwa 7-fachen im Fettansatz und um das bis zu etwa 3-fache in der Muskelmasse. So wiesen Männchen/Weibchen der selektierten Linie DU6i am 42. Tag eine durchschnittliche Körpermasse von 60,1 ± 3,9 g/47,9 ± 4,3 g (je 52 untersuchte Tiere) auf, während die Körpermasse durchschnittlicher Kontrolltiere (DBA/2) bei 15,5 ± 1,7 g/14,8 ± 1,5 g (13 Männchen/12 Weibchen) lag, entsprechend einem Durchschnitt von 54,0 ± 4,1 g (DU6i) gegenüber 15,1 ± 1,6 g (DBA/2) bezogen auf alle Tiere. Darüber hinaus liegen bei den Selektionslinien gegenüber normalen Tieren signifikante Unterschiede bei einigen Faktoren des Nährstoffumsatzes und Energiehaushaltes wie Serum-Spiegel von Leptin, Insulin, IGF-I und IGF Bindungsproteinen vor. Durch die Kombination von Daten aus einer QTL-Kartierung und aus differentiellen Genexpressionsanalysen wurden Gene ermittelt, die an der Wachstums- und Fettleibigkeitsregulation in auf hohes Körpergewicht selektierten Mauslinien beteiligt sind.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung identifizierten differentiell exprimierten Gene stellen Gene dar, die Körpergewicht und Fettleibigkeit am Ende der juvenilen Entwicklungsphase kontrollieren. Die Tiere wurden ad libitum mit einer Züchtungs-Diät gefüttert, die 12,5 MJ/kg metabolische Energie und einen Durchschnittsgehalt von 22,5% Roh-Protein, 5% Roh-Fett, 4,5% Roh-Faser, 6,5% Roh-Asche, 13,5% Wasser, 48% N-freier Extrakt, Vitamine, Spurenelemente, Aminosäuren und Mineralien (Altromin-Diät 1314, Deutschland) enthielt.

Die differentielle Genexpressionsanalyse zwischen den beiden selektierten Mauslinien mit hohem Körpergewicht (DU6 und DU6i) und den beiden unselektierten Mauslinien (DUKs und DBA/2) zeigte einen Konsensus-Satz von 77, in derselben Weise differentiell exprimierten Genen (vgl. Tabelle 1). Die Gene kodieren für Proteine, die eine Rolle beim Metabolismus, bei der Signaltransduktion, der Zellteilung, dem Zytoskelett und bei Immunantworten spielen.

Die folgenden 77 Gene wurden bei den untersuchten fettleibigen Tieren im Vergleich zu Kontrolltieren im Epididymalfettgewebe signifikant erhöht (+) oder vermindert (–) transkribiert: Tabelle 1A: Different exprimierte Gene im Epididymalfettgewebe von männlichen Tieren der Linien DU6 und DU6i gegenüber DUKs und DBA/2 im Alter von 42 Tagen unter Standardhaltungs- und Fütterungsbedingungen.

Die folgende Tabelle 2A enthält 10 differentiell exprimierte Gene aus der obigen Tabelle 1A. Die Tabelle 2B enthält 4 differentiell exprimierte Gene aus der obigen Tabelle 1B. Diese 10 Gene befinden sich in Chromosomenbereichen, für die in genetischen Kopplungsstudien ein Einfluss auf die Körpermasse und den Fettansatz nachgewiesen wurde. Solche Chromosomenbereiche werden auch als quantitativer Merkmalsort oder "quantitative trait locus" (QTL) bezeichnet. Die Kopplungsanalysen zur Kartierung der QTL wurden in Kreuzungspopulationen zwischen den selektierten Linien DU6 × DUKs (Brockmann, G.A.; Haley, C.S.; Renne, U.; Knott, S.A.; Schwerin, M. (1998): QTLs effecting body weight and fatness from a mouse line selected for extreme high growth. Genetics 150: 369–381) und DU6i × DBA/2 (Brockmann, G.A.; Kratzsch, J., Haley, C.S., Renne, U., Schwerin, M., Karle, S. (2000): Single QTL effects, epistasis, and pleiotropy account for two thirds of the phenotypic F₂ variance of growth and obesity in DU6i × DBA/2 mice. Genome Res. 10: 1941–1957, Brockmann, G.A.; Haley, C.S.; Wolf, E.; Karle, S.; Kratzsch, J.; Renne, U.; Schwerin, M.; Hoeflich, A. (2001): Genome-wide search for loci controlling serum IGF-binding protein levels of mice. FASEB J. 15: 978–987) durchgeführt. Tabelle 2A: Liste der 10 im Fettgewebe different exprimierten und in QTL-Regionen liegenden Gene des polygenen Mausmodells:

Tabelle 28: Liste der 4 different exprimierten Gene in QTL-Regionen für Wachstum und Fettansatz des polygenen Mausmodells (Hypothalamus):

In den selektierten Tieren wurden erhöhte Transkriptmengen von Prkca, dem für Protein Kinase C alpha kodierenden Gen, gefunden. Die Genposition entspricht einem QTL für erhöhtes Körpergewicht und Fettakkumulation in den selektierten Mauslinien. Das Protein ist an G-Protein- und Wnt-signalling pathways (G-Protein- und Wnt-signalisierende Pfade) beteiligt, die Zellwachstum und -differenzierung regulieren. PRKCA ist ein intrazelluläres Signal-Protein, das die Phosphorylierung von Substratproteinen katalysiert und ubiquitär vorkommt. Für die Entfaltung seiner physiologischen Aktivität verändert das Protein bei Aktivierung seine Position aus dem Cytosol in zelluläre Membranen. Die Cl-Domäne von PRKCA ist eine Diacylglycerin/Phorbol-Ester bindende Region. Die vollständige Enzymaktivität erfordert Diacylglycerin, Phospholipid und Kalzium. Diacylglycerin wird als Zwischenprodukt bei der Biosynthese von Fettsäuren produziert und dürfte in den selektierten Mauslinien erhöht vorliegen.

Die cDNA von H1f2 (H1 Histonfamilie, Mitglied 2) tritt in den selektierten Tieren in einer erhöhten Häufigkeit auf. Histone sind grundlegende Kernproteine, die für die Nukleosomenstruktur der Chromosomenfasern in Eukaryoten verantwortlich sind. Das Linker-Histon H1 interagiert mit Linker DNA zwischen Nukleosomen und bewirkt die Verdichtung von Chromatin in höher geordnete Strukturen.

Das Gen Ak2, das in den selektierten Tieren erhöht exprimiert wird, kodiert die Adenylatkinase 2, die ein mitochondriales Enzym ist, das den Phosphortransfer zwischen ATP und AMP katalysiert. Als solches ist es an der Regulation des Energiestoffwechsels in Geweben beteiligt. Bislang wurden Knockout-Modelle für Adenylatkinase nicht mit einem verminderten Körpergewicht in Verbindung gebracht.

In den selektierten Tieren tritt die cDNA-Häufigkeit des Gens Cox8 vermindert auf. Dieses Gen, das für die Cytochrom c-Oxidase-Untereinheit VIII (COX Untereinheit VIII) kodiert, ist ein weiteres Gen, das an der Aufrechterhaltung der Energiehomeostase beteiligt ist. Cytochrom c ist das terminale Enzym der Atmungskette, das den Elektronentransfer von Cytochrom c an molekularen Sauerstoff bewirkt. Die COX Untereinheit VIII ist ein Kern-kodiertes Polypeptid. Die Funktion der Kern-kodierten Untereinheiten ist bislang nicht bekannt, obwohl vorgeschlagen wurde, dass sie an der Modulation der katalytischen Funktion beteiligt sein könnten. Änderungen in der Aktivität von Cox8 können die Effizienz der Energieverteilung beeinflussen.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die mRNA-Spiegel für Klkbp (Kallikrein bindendes Protein, alias Serpin) in den selektierten Tieren erhöht sind. KLKBP ist ein Serin- (oder Cystein-)Proteinase-Inhibitor. Er bindet an Kallikrein und inhibiert dessen Wirkung. Es wurde kürzlich an Rattenmodellen gezeigt, daß KLKBP ein potentieller pathogener Faktor der diabetischen Retinopathie ist und eine Rolle bei der tierischen Entwicklung und beim Wachstum spielen kann. In der Zwergratte wird das Klkbp-Gen durch Wachstumshormon induziert (Hatcher et al., FASEB J 13 (1999) 1839–1844). Ferner besitzt KLKBP eine mögliche Funktion in der Gefäßbiologie. Transgene Mäuse, die Kallikrein überexprimieren, sind chronisch hypotensiv. Kürzlich wurde im Rahmen einer Proteomanalyse gezeigt, daß Veränderungen im renalen Kallikrein-Stoffwechselweg bei Hypoxie-induzierter Hypertension vorliegen. Kallikrein findet man im Blutkreislauf und im Extrazellulärraum. Seine Affinität gegenüber KLKBP kann die biologische Funktion von Kallikrein koordinieren und regulieren. Erhöhte Transkriptmengen von Klkbp in adipösem Gewebe, wie sie in den erfindungsgemäßen, selektierten Mauslinien gefunden wurden, können zu erhöhten Serumspiegeln des sekretierten Proteins führen, die eine reduzierte Kallikrein-Aktivität verursachen oder mögliche unabhängige Aktionen des bindenden Proteins initiieren können, wie es beispielsweise bei IGF-bindenden Proteinen beobachtet wurde. Somit kann erhöhtes KLKBP einen protektiven Faktor im Verhältnis zwischen Adiposität und einem erhöhten Risiko für Bluthochdruck darstellen. Dies steht im Einklang mit dem gesunden Verhalten der selektierten Mäuse unter Stressbedingungen, während nicht-selektierte Tiere beispielsweise gelegentlich unerwartet sterben.

Die Gene Hfe und Igh-Ia, die das Hämochromatose-Protein und die schwere Kette Ia von Immunglobulin kodieren, sind an der Immunantwort beteiligt. Beide Gene sind in den auf hohes Körpergewicht selektierten Mauslinien hochreguliert. Das Hämochromatose-Protein der Maus reguliert die duodenale Aufnahme von Transferin-gebundenem Eisen aus Plasma. In der Hämochromatose, einer Erkrankung, die aus einer Mutation im Hfe-Gen herrührt, verursacht mit der Nahrung aufgenommenes Eisen eine erhöhte Eisen-Akkumulation in Leber, Herz und Pankreas. Im Zusammenhang mit Diabetes mellitus 22 wurde eine Insulinresistenz beobachtet, die mit einer übermäßigen Ansammlung von Eisen in der Leber assoziiert war (Roblin et al., Diabetes Metab 28 (2002) 335–339). Bislang wurde eine direkte Wirkung des Hfe-Gens auf die Fettleibigkeit nicht nachgewiesen. Hfe Knockout-Mäuse wurden auf Veränderungen des Körpergewichts und der -zusammensetzung nicht untersucht. Das Hämochromatoseprotein ist ein integrales Membranprotein mit Domänen für Immunglobulin und Klasse I Histokompatibilitätsantigene alpha 1 und alpha 2.

In den erfindungsgemäßen, selektierten Linien ist das Gen Pctp1, das für den Phosphatidylcholin-Transferprotein-ähnlichen Faktor kodiert, gegenüber Kontrollinien signifikant herabreguliert. Phosphatidylcholine umfassen die allgemeinste Phospholipidklasse in Eukaryontenzellen. Diese unlöslichen Moleküle werden zwischen Membranen durch ein hochspezifisches Phosphatidylcholin-Transferprotein (PC-TP), das zur Superfamilie der Steroidogenen Akuten Regulatorischen Protein-verwandten Transfer-(START-)Domäne gehört, transferiert (Roderick et al. Nat. Struct. Biol. 9 (2002) 507–511). Dasselbe Protein wurde auch als serologisch definiertes Kolon-Krebsantigen 28 ermittelt, was seine mögliche Rolle in der Wachstumsregulation nahe legt.

Die Minichromosom-Erhaltungsproteine (minichromosome maintenance proteins), eine Familie von 6 konservierten Polypeptiden, die im Nukleus aller Eukaryoten vorkommen, sind für die Initiation der DNA-Replikation essentiell. Die mRNA-Transkriptmengen von Mcmd7 (Minichromosome maintenance deficient 7; Minichromosom-Erhaltungsproteine) sind in den selektierten Tieren im Vergleich zu nicht-selektierten Kontrolltieren signifikant vermindert. In Neuroblastomen ist das MCM7-Protein ein direktes Target des MYCN-Transkriptionsfaktors. Daher kann die Transkriptmenge von Mcmd7 ein direktes Maß der Zellteilungsaktivität sein. Aus diesen Beobachtungen wird geschlossen, daß die Zellteilungsrate in epididymalem Fettgewebe in mageren Kontrolltieren sehr viel höher ist als im Vergleich zu selektierten, fetten Tieren. Diese Daten sind mit Beobachtungen konsistent, daß die Fettleibigkeit im Alter von 6 Wochen in selektierten Mäusen nicht durch eine Hypertrophie sondern vielmehr durch eine Hyperplasie begleitet wird (Timtchenko, D.; Kratzsch, J.; Sauerwein, H.; Wegner, J.; Souffrant, W.-B.; Schwerin, M.; Brockmann, G.A. (1999): Fat storage capacity in growthselected and control mouse lines is associated with linespecific gene expression and plasma hormone levels. Int. J. Obesity 23: 586–594).

Serin-Proteasen, wie Serpina3n, übernehmen wichtige Funktionen, unter anderem bei der Verdauung, der Blutgerinnung oder dem Komplementsystem (Immunantwort). Serpine (Serin Protease-Inhibitoren) inhibieren diese Aktivitäten irreversibel durch Nachahmung der dreidimensionalen Struktur des normalen Substrates der Protease [http://users.rcn.com/ jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/S/Serine Proteases.html].

Auch spielen Serpine möglicherweise eine Rolle während der Entwicklung [Inglis, J.D. et al. Isolation of two cDNAs encoding novel alpha 1-antichymotrypsin-like proteins in a murine chondrocytic cell live, 1991, Gene 106(2), 213–220].

Zusätzlich zu der gegenüber unselektierten Kontrolltieren im Fettgewebe beobachteten differentiellen Expression der oben genannten 10 positionellen Gene (vgl. Tabelle 2A), werden ferner verschiedene Polymorphismen in der Promoter-Sequenz beobachtet, die in der nachfolgenden Tabelle 3A dargestellt sind, wobei jeweils die EMBL Sequenz-Identifizierungsnummern angegeben sind. Für ein im Hypothalamus different exprimiertes Gen (vgl. Tabelle 2B) werden ferner verschiedene Polymorphismen in der Promoter-Sequenz beobachtet, die in der nachfolgenden Tabelle 3B dargestellt sind, wobei jeweils die EMBL Sequenz-Identifizierungsnummern angegeben sind. Eine Zuordnung zu den entsprechenden Gensymbolen ist in Tabelle 4 enthalten. Die Sequenzvergleiche der in den Tabellen 3A und 3B aufgelisteten Gene sind in 1 dargestellt.

Tabelle 4: Zuordnung der Gen-ID Nummern aus Tabelle 3 A und 3B zu den Gen-Namen

In einigen im Fettgewebe different exprimierten und in QTL-Bereichen positionierten Genen wurden weitere Polymorphismen im 3'-flankierenden Bereich gefunden. Die Gene mit den identifizierten polymorphen Varianten sind nachfolgend in Tabelle 5 aufgeführt. Die Zuordnung der Gene-ID zum Gen-Namen erfolgt in Tabelle 6. Die Sequenzvergleiche der in Tabelle 5 aufgelisteten Gene sind in 2 dargestellt.

Tabelle 6: Zuordnung der Gen-ID Nummern aus Tabelle 5 zu den Gen-Namen

Die 10 Gene, die sowohl im Fettgewebe different exprimiert als auch in solchen Chromosomenregionen lokalisiert sind (vgl. Tabelle 2A) , die einen Einfluss auf die Körpermasse und den Fettansatz gezeigt haben, sind Gene, die mit hoher Wahrscheinlichkeit die genetischen Ursachen für den erhöhten Fettansatz in der Selektionslinie sind. Das gleiche gilt für die 4 im Hypothalamus different exprimierten Gene, die auch in QTL-Regionen für Wachstum und Fettansatz des polygenen Mausmodells liegen (vgl. Tabelle 2B).

Die Gene unter den 10 (vgl. Tabelle 2A) bzw. 4 (vgl. Tabelle 2B), für die auch linienspezifische Polymorphismen in der Promoterregion und/oder im 3' untranslatierten Genbereich gefunden wurden, determinieren sehr wahrscheinlich Genvarianten, die direkt zum Unterschied im Fettansatz zwischen den selektierten und nicht-selektierten Tieren beitragen.

Die anderen Gene aus der Liste der 77 Gene (Fettgewebe, vgl. Tabelle 1A) bzw. der 23 Gene (Hypothalamus, vgl. Tabelle 1B) sind eher sekundär regulierte Gene, die infolge der genetisch fixierten Unterschiede eine erhöhte oder reduzierte Genaktivität zeigen. Sie sind mit großer Wahrscheinlichkeit am Stoffwechsel, der Regulation des Energiehaushaltes oder anderen Regelkreisen beteiligt.

Mit den im Rahmen der Erfindung anhand des polygenen Mausmodells erhaltenen Daten lassen sich nunmehr grundlegende Schlüsse zur komplexen Regulation von Wachstum und Fettansatz ziehen, die für Menschen und andere Tiere relevant sind. Ferner eignen sich die mit dem Modell identifizierten Gene und Polymorphismen zur Identifizierung von Wirkstoffen, die die Körpermasse und den Fettansatz beeinflussen, und damit auch von Wirkstoffen, die sich zur Behandlung oder Vorbeugung der Fettleibigkeit eignen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes, bei dem man nichtmenschlichen Säugern eine zu untersuchende Substanz verabreicht und man deren Einfluss auf die Expression der folgenden Gene bestimmt:

wobei es sich bei der Substanz um einen die Körpermasse und den Fettansatz beeinflussenden Wirkstoff handelt, wenn durch Verabreichung der Substanz die Expression eines oder mehrerer der genannten Gene verändert wird. Das vorgenannte Verfahren wird auch als "Screening-Verfahren" bezeichnet.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes, bei dem man ein vorgenanntes Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes durchführt und man den identifizierten Wirkstoff zu einer zur Verabreichung geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform handelt es sich um ein Verfahren, bei dem der Wirkstoff zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes geeignet ist, den Fettansatz zu beschränken (vermindern). In diesem Fall verabreicht man nicht-menschlichen Säugern eine zu untersuchende Substanz und bestimmt deren Einfluß auf die Expression der vorgenannten Gene, wobei es sich bei der Substanz um einen die Körpermasse und den Fettansatz beschränkenden (vermindernden) Wirkstoff handelt, wenn durch Verabreichung der Substanz die Expression eines oder mehrerer der in Tabellen 1A und 1B mit "(–)" gekennzeichneten Gene erhöht wird und/oder die Expression eines oder mehrere der in Tabellen 1A und 1B mit "(+)" gekennzeichneten Gene erniedrigt wird. Das vorgenannte Verfahren wird auch als "Screening-Verfahren" bezeichnet.

Die Erfindung betrifft somit ferner ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes, bei dem man ein vorgenanntes Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Erniedrigung (Verminderung) der Körpermasse und des Fettansatzes durchführt und man den identifizierten Wirkstoff zu einer zur Verabreichung geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert

Durch die Erfindung wird aber auch die Identifizierung von Wirkstoffen ermöglicht, die geeignet sind, den Fettansatz zu erhöhen, indem man nicht-menschlichen Säugern eine zu untersuchende Substanz verabreicht und man deren Einfluß auf die Expression der vorgenannten Gene bestimmt, wobei es sich bei der Substanz um einen die Körpermasse und den Fettansatz erhöhenden Wirkstoff handelt, wenn durch Verabreichung der Substanz die Expression eines oder mehrerer der in Tabellen 1A und 1B mit "(+)" gekennzeichneten Gene erhöht wird und/oder die Expression eines oder mehrere der in Tabellen 1A und 1B mit "(–)" gekennzeichneten Gene erniedrigt wird. Das vorgenannte Verfahren wird auch als "Screening-Verfahren" bezeichnet.

Die Erfindung betrifft somit ferner ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes, bei dem man ein vorgenanntes Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Erhöhung der Körpermasse und des Fettansatzes durchführt und man den identifizierten Wirkstoff zu einer zur Verabreichung geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert.

Bei den mit "(–)" gekennzeichneten Genen handelt es sich vorzugsweise um die in den Tabellen 2A und 2B mit "(–)" gekennzeichneten Gene, d.h. Cox8, Pctp1, Mcdm7, Serpina3n und/oder die Sequenz 4930506L07Rik. Bei den mit "(+)" gekennzeichneten Genen handelt es sich vorzugsweise um die in den Tabellen 2A und 2B mit "(+)" gekennzeichneten Gene, d.h. Prkca, Hlf2, Akt, Klkbp, Hfe, Igh-Ia, NA, Ly6a und/oder die Sequenz 2810037C14Rik. Besonders bevorzugt sind diejenigen der vorgenannten Gene, für die bei den auf hohe Körpermasse und hohen Fettansatz selektierten Tieren Polymorphismen im Promotor-Bereich oder im 3'-flankierenden Bereich nachgewiesen wurden.

Bei den nicht-humanen Säugern handelt es sich vorzugsweise um Nager, insbesondere um Mäuse. Die Erfindung schließt auch die Verwendung nicht-menschlicher Säuger, insbesondere Nager bzw. Mäuse, zur Verwendung in einem vorgenannten Screening-Verfahren ein.

Durch die vorliegende Erfindung ist es somit möglich, die nach den vorgenannten Screening-Verfahren identifizierten Wirkstoffe zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes, zur Erniedrigung der Körpermasse und des Fettansatzes bzw. zur Erhöhung der Körpermasse und des Fettansatzes zu verwenden.

Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein oder mehrere Wirkstoffe enthalten, die die Expression der oben bezeichneten Gene in der vorgenannten Weise beeinflussen, erhöhen bzw. erniedrigen.

Zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen können die Wirkstoffe entweder einzeln oder in Kombination miteinander verwendet werden und ggf. zusammen mit pharmazeutisch akzeptablen Hilfs- und/oder Trägerstoffen formuliert werden.

Mit der vorliegenden Erfindung werden Wirkstoffe, die die Expression der oben bezeichneten Gene in der vorgenannten Weise beeinflussen, erhöhen bzw. erniedrigen, zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes, zur Erniedrigung der Körpermasse und des Fettansatzes bzw. zur Erhöhung der Körpermasse und des Fettansatzes bereitgestellt.

Eine Konkordanz der jeweiligen Sequenz-Identifikationsnummern für die vorstehend genannten und im Sequenzprotokoll aufgeführten Gene ergibt sich aus folgender Tabelle:

Die angegebene SEQ ID NO. entspricht der unter Kennzahl 400 im Sequenzprotokoll nach WIPO Standard ST.25 angegebenen Nummer.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen beschrieben, ohne auf diese beschränkt zu sein.

Beschreibung der Figuren:

1: Sequenzvergleiche zwischen DU6, DU6i, DBA/2, DUKs und ENSEMBL für die in Tabelle 3A und 3B aufgeführten Gene.

2: Sequenzvergleiche zwischen DU6, DU6i, DBA/2, DUKs und ENSEMBL für die in Tabelle 5 aufgeführten Gene.

3: A: Chromosomenkarte der Maus mit den in der Kreuzung DU6i × DBA/2 identifizierten QTL Positionen und den in Fettgewebe differentiell exprimierten Genen; auf der rechten Seite jedes Chromosomes sind die QTL-Regionen als Balken in verschiedenen Graustufen gezeigt. QTLs sind folgendermaßen abgekürzt: BW* für Körpergewicht, Lepq* für Leptin, Igf1q* für insulin-like growth factor 1, Igfbp* für insulin-like growth factor binding protein, Afw* für abdominales Fettgewicht, Mwq* für Muskelgewicht.
B: Chromosomenkarte der Maus mit den in der Kreuzung DU6i × DBA/2 identifizierten QTL Positionen und den im Hypothalamus differentiell exprimierten Genen; auf der rechten Seite jedes Chromosomes sind die QTL-Regionen als Balken in verschiedenen Graustufen gezeigt. QTLs sind folgendermaßen abgekürzt: BW* für Körpergewicht, Lepq* für Leptin, Igf1q* für insulin-like growth factor 1, Igfbp* für insulin-like growth factor binding protein, Afw* für abdominales Fettgewicht, Mwq* für Muskelgewicht. Die Genorte von C85523 (kein Symbol) und L20450 (Zfp97) sind nicht bekannt.

4: Tierstruktur zum Aufbau von Chromosomensubstitutionslinien; i – Numerierung der Autosomen (i=1 bis 19) und Sexchromosom (i=X); a,b -Kennzeichen für Teilchromosomen; n – Anzahl Nachkommen pro zwei Würfe (n=16); * – aus der Nachkommenschaft ausgewähltes Tier mit DU6/DBA (DBA steht hier für DBA/2) Genotyp am Chromosom i und minimalem DU6 Genomanteil auf allen anderen Chromosomen j (j ≠ i).

5: Differenzen im Körpergewicht an Tag 42 zwischen CSSs and DBA/2 Mäusen in unterschiedlichen Rückkreuzungsgenerationen (BC). Sternchen markieren unterschiedliche Niveaus signifikanter Unterschiede zwischen den CSS and DBA/2 Tieren: *P<0.05, **P>0.01, ***P<0.001. In Generationen BC4 und BCS wurden nicht alle CSS erzeugt und somit sind für diese Linien keine Daten vorhanden.

6: Beispielhaftes Profil von IGFBP in Serumproben von ausgewählten F₂ Nachkommen; Das Beispiel zeigt die großen Unterschiede der IGFBP-Konzentrationen zwischen F₂-Tieren. Die Banden wurden durch Phospho-Imaging visualisiert und unter Verwendung der ImageQuaNT Software quantifiziert, wie es im Material und Methodenteil (Beispielteil) beschrieben ist. Serum-Level distinkter IGFBPs wurden halb-quantitativ gemessen (Kasten 1: IGFBP-3; Kasten 2: IGFBP-2; Kasten 33: IGFBP-4; Kasten 4: IGF-Bindungsaffinität zwischen 28 and 30 kDa; S: Standard-Serum, das in jedem Lauf zur Normierung der verschiedenen Blots eingeschlossen war).

Beispiel 1
Basis aller Mauslinien des Instituts für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere (FBN) ist der heterogene Auszuchtstamm Fzt:DU, der zu Beginn der 70iger Jahre durch systematische Kreuzung von 4 Auszucht- (NMRI orig., Han:NMRI, CFW, CF1) und 4 Inzuchtlinien (CBA/Bln, AB/Bln, C57BL/Bln, XVII/Bln) gezüchtet wurde und in einer effektiven Populationsgröße von 200 Tierpaaren gehalten wird.
Für die Untersuchungen zur Kartierung genetische Faktoren für Wachstum und Fettansatz wurden folgende Mauslinien des FBN verwendet:

– DU6, Auszuchtlinie, Zucht auf hohes Wachstum
– DU6i, Inzuchtlinie, abgesplittet aus der DU6, Zucht auf hohes Wachstum
– DUKs, Kontrolllinie
– Käuflich erworben wurde die Inzuchtlinie DBA/2.

Nachfolgend ist das Selektionsschema dargestellt.
Als Ergebnis der Selektion über 95 Generationen erhöhte sich in der DU6 das Körpergewicht von 30 g auf 72 g. Auch eine Reihe weiterer Merkmale der Körperzusammensetzung, sowie verschiedene Serumparameter veränderten sich.
Für die Analyse genetischer Faktoren wurden 2 Pedigrees entwickelt:
Pedigree 1
Den Linien DU6 und DUKs wurden in der 70. Generation 4 Männchen (DU6) und 4 Weibchen (DUKs) entnommen. Diese Tiere wurden 1:1 miteinander gekreuzt, um vier segregierende Intercross-Familienstrukturen im F₂-Design zu schaffen. Durch kontrollierte und wiederholte Vollgeschwisterverpaarungen von Nachkommen aus der F1-Generation wurden große Vollgeschwistergruppen (insgesamt 54 F₁ und 715 F₂-Nachkommen) erzeugt. Das Pedigree mit den meisten F₂-Nachkommen (341) wurde für den Scan des gesamten Genoms genutzt.
Die Tiere, die für die Analyse verwendet wurden, wurden phänotypisch charakterisiert hinsichtlich Körpergewicht, abdominalem Fettgewicht, sowie dem Gewicht von Leber, Nieren und Milz.
Pedigree 2
Auch hier wurden Intercross-Familienstrukturen aufgebaut unter Nutzung von weiblichen Tieren der von der DU6 abgesplitteten Inzuchtlinie DU6i (Entnahme aus der 4. Inzuchtgeneration) und männlichen Tieren der kommerziell verfügbaren Inzuchtlinie DBA/2. 12 F₂-Subfamilien wurden gebildet mit insgesamt 411 Nachkommen (233Männchen; 178 Weibchen), die phänotypisch charakterisiert wurden und für 93 Loci genotypisiert wurden.
Die Charakteristika der hierin genannten Mauslinien sind in der folgenden Tabelle 7 dargestellt: Tabelle 7: Charakterisierung der Mauslinien
Beispiel 2
QTL-Analysen in Kreuzungsexperimenten zwischen den extrem differenten Linien
Aus Kreuzungsexperimenten zwischen den merkmalsdifferenten Linien konnten im Genom solche Chromosomenregionen identifiziert werden, die einen signifikanten Einfluss auf die Körpermasse, den Fettansatz, die Muskelmasse und die Gewichte innerer Organe haben. Die chromosomalen Orte mit Einfluss auf die Merkmalsentwicklung werden als QTL (Quantitative Trait Locus) bezeichnet. Folgende Kreuzungen wurden einer genetischen Kopplungsanalyse zur Lokalisation von QTL unterworfen:
DU6 × DUKs
DU6i × DBA/2
In allen Experimenten wurden mehrere signifikante QTL im Genom lokalisiert. Neben den allgemeinen Charakteristika Körpermasse und Fettansatz wurden Subkomponenten, die an der Regulation des Merkmalskomplexes beteiligt sind, in die Kopplungsanalysen einbezogen und somit zusätzliche Informationen über Orte im Genom erhalten, die diese Subkomponenten wesentlich beeinflussen. Insbesondere sind das neu identifizierte QTL für Faktoren des Nährstoffumsatzes und Energiehaushaltes wie Serum-Spiegel von Leptin, Insulin, IGF-I (Insulin-like growth factor) und IGF Bindungsproteine, die an der IGF Regulation beteiligt sind und zum Teil unabhängige Funktionen in der Wachstumsregulation übernehmen.
Die chromosomalen Positionen und die Effekte sind getrennt für QTL mit Einfluss auf die Körpermasse und Zusammensetzung und für QTL mit Einfluss auf die Serumkonzentrationen von relevanten Proteinen und Hormonen in Tabelle 8 und Tabelle 9 zusammengefasst. 3 zeigt die Chromosomenkarte der Maus mit den in der Kreuzung DU6i × DBA/2 identifizierten QTL Positionen.
Die QTL-Analysen in den Familien DU6 × DUKs und DU6i × DBA/2 sind nachfolgend detaillierter in den Beispielen 3 und 4 beschrieben.
Beispiel 3:
QTL-Analyse in der Familie DU6 × DUKs

(Brockmann, G.A.; Haley, C.S.; Renne, U.; Knott, S.A.; Schwerin, M. (1998): QTLs effecting body weight and fatness from a mouse line selected for extreme high growth. Genetics 150: 369–381).

Mauslinien:
Die Untersuchung wurde mit der Auszucht-Mauslinie DU6, die über 70 Generationen auf hohes Körpergewicht selektiert worden war, sowie an der willkürlich gepaarten Kontrollinie DUKs durchgeführt. Beide Linien stammen von Originalkreuzungen von vier Basis-Populationen (NMRI orig., Han:NMRI, CFW, CF1) und vier Inzucht-Populationen (CBA/Bln, AB/Bln, C57BL/Bln, XVII/Bln) des Forschungsinstituts für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Dummerstorf, Deutschland (Schüler 1985 Mouse strain Fzt:Du and its use as model in animal breeding research. Arch. Tierzucht 28: 357–363). Die Populationsgröße in beiden Linien betrug 80 Paare pro Generation. Die Wurfgröße wurde standardmäßig auf 9 festgesetzt. Nachkommen wurden am 21. Tag abgesetzt. Die Tiere wurden ad libitum mit einer Züchtungs-Diät gefüttert, die 12,5 MJ/kg metabolische Energie und einen Durchschnittsgehalt von 22,5% Roh-Protein, 5% Roh-Fett, 4,5% Roh-Faser, 6,5% Roh-Asche, 13,5% Wasser, 48% N-freier Extrakt, Vitamine, Spurenelemente, Aminosäuren und Mineralien (Altromin-Diät 1314, Deutschland) enthielt. Das Körpergewicht am 42. Tag war in der selektierten Linie DU6 (58,3 ± 6,1g) mehr als doppelt so hoch wie das der willkürlich gepaarten Kontroll-DUKs (28,7 ± 2,3g) (BÜNGER, L., U. RENNE, and G. DIETL, 1992 Selection for body weight at 42 days in laboratory mice with and without litter size standardization-Direct response and correlated effects on litter size . Arch. Tierz. 35: 305–319; BÜNGER ET AL., 1990 Results of long termselection for growth traits in laboratory mice. Proceedings of the 4th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, Univ. Edinburgh, Edinburgh, Scotland 13: 321–324). Der prozentuale Anteil des epididymalen Fetts war in der Linie DU6 (2,2 ± 0,8%) doppelt so hoch wie in der Kontrolle (1,1 ± 0,4%) des gleichen Alters.
Stammbaum-Design:
Die QTL-Analyse wurde unter Verwendung von Stammbäumen des F₂-Kreuzungs-Design durchgeführt. Diese wurden durch Kreuzung von vier Männchen der auf hohes Wachstum selektierten Linie DU6 mit vier Weibchen der Kontrollinie DUKs erstellt. Durch wiederholtes Paaren der Eltern und anschließendes Paaren der F₁-Nachkommen derselben Eltern wurden große Stammbäume mit insgesamt 54 F₁-Nachkommen und 715 F₂-Nachkommen erstellt. Das Paaren wurde zunächst in einem Alter von 10 Wochen durchgeführt und nach 6 Wochen wiederholt; das Paaren wurde in allen Stammbäumen gleichzeitig durchgeführt. Die Struktur der einzelnen Stammbäume ist in Tabelle 1 zusammengefaßt. Der größte Stammbaum (Identitätsnummer 8) mit 341 F₂-Nachkommen wurde für die Untersuchung des Genoms ausgewählt. Die quantitativen Messungen, die bei der QTL-Analyse vorgenommen wurden, betrafen Körpergewicht, Abdominalfett sowie das Gewicht von Leber, Niere und Milz aller F₂-Individuen. Das gemessene Abdominalfett war in den Männchen das gonadale Fett und in Weibchen das Fett des Perimetriums. Das Verhältnis von Abdominalfett zu Körpergewicht wurde als prozentualer Abdominalfett-Anteil definiert. Die phänotypischen Daten wurden stets in einem Alter von 42 Tagen aufgenommen; dies ist der Zeitpunkt für die Selektionsentscheidung in allen Generationen. Dieses Alter entspricht dem Ende der juvenilen Phase der Ontogenese.
Marker-Analyse:
Zunächst wurde die Verteilung von Marker-Allelen zwischen den Linien für 84 Loci untersucht. Die Marker wurden so ausgewählt, daß sie über alle Chromosomen verteilt waren, wobei der Abstand zwischen den Markern durchschnittlich 16,6 cM und das größte Intervall 42 cM betrug.
Die Marker wurden hinsichtlich ihrer hohen Variabilität zwischen geeigneten Inzuchtlinien aus der Maus-Genom-Datenbank (MGD) ausgewählt. MapPair-Primer der Maus wurden von Research Genetics (Huntsville, AL, USA) erhalten. Die D11Bhm*-Primer waren ein Geschenk von Thomas Boehm (Nehls et al. 1995 YAC/P1 contigs defining the location of 56 microsatellite markers and several genes across a 3.4 cM interval on mouse Chromosome 11. Mamm. Genome &: 321–331). D9Fbn1 wurde von Rainer Fürbass in unserem Institut entwickelt. Obwohl die Auflösung der Marker-Kartierung des Mausgenoms hoch ist, war das Auffinden einer informativen Marker-Gruppe für unsere Stammbäume, die anhand von Kreuzungen von Auszuchtlinien erstellt worden waren, wegen zwischen den Eltern gleichermaßen vorliegender Allele schwierig. Über 450 Mikrosatelliten-Marker wurden in Stammbaum 8 auf informative parentale Allele getestet, bevor die Eltern, F₁ und F₂ für 94 Loci genotypisiert wurden, die sämtliche Chromosomen mit einem durchschnittlichen Abstand von 12,8 cM abdecken. Individuen der Stammbäume 3, 4 und 10 wurden auf Chromosom 11 für informative Mikrosatelliten genotypisiert, auf dem zuvor ein Einfluss auf den Fettansatz gezeigt wurde (Das, P., G. Brockmann, L. Meyer, U. Renne, G. Freyer, and M. Schwerin. 1996. The effect of a restricted region of chromosome 11 on body weight in mice under special consideration of the growth hormone gene locus. Arch. Tierz. 39: 185–194).
DNA von Gewebeproben des Maus-Schwanzes wurde unter Verwendung des QIAmp-Tissue-Kits (Qiagen, Germany) durch selektive Bindung von DNA an eine Ionenaustausch-Matrix nach Verdau mit Proteinase K extrahiert. Die DNA wurde mit Taq-Polymerase amplifiziert (Appligene, Frankreich), wobei ein modifiziertes Standard-PCR-Protokoll (Dietrich et al. 1992 A genetic map of the mouse suitable for typing intraspecific crosses. Genetics 131: 423–447) verwendet wurde: 20 ng Matrizen-DNA wurde in einem Gesamt-Reaktionsvolumen von 10 μl verwendet. Nach der Denaturierung (96°C, 3 Minuten) gefolgt von 2 Zyklen mit einer Anlagerungstemperatur von 59°C und 57°C wurde die DNA für 25 Zyklen mit 15 Sekunden bei 94°C, 1 Minute bei 55°C und 1 Minute bei 70°C amplifiziert. Die DNA wurde für die PCR mittels des Biomek 2000-Systems (Beckman) automatisch verteilt. Die Amplifikationen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einem PCR-System 9600 (Perkin Elmer) durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden getrocknet, erneut in 3 μl Formamid-Ladepuffer gelöst und auf 40 cm langen, 6%igen Polyacrylamid-Gelen unter denaturierenden Bedingungen getrennt. Die Gele wurden mit Silbernitrat gefärbt (Riesner et al. 1989 Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and proteinnucleic acid interactions. Electrophoresis 10: 377–389). Nach anfänglicher Fixierung in 10% Ethanol/0,5% Essigsäurelösung für 10 Minuten wurden die Gele für 15 Minuten in frischer 5,9 mM Lösung Silbernitrat eingetaucht und 10 Minuten in 375 mM NaOH, 2,3 mM NaBH₄, 0,125% Formaldehyd (37% w/v) entwickelt. Nach zweifachem Spülen mit Wasser wurden die Gele auf einem Filtrak-Papier (Deutschland) getrocknet.
Auf jedem Gel wurden die parentalen Marker-Allele auf getrennte Bahnen geladen und dienten als Standard für die Genotypisierung der F₁- und F₂-Nachkommen. Alle Ergebnisse der Genotypisierung wurden zweimal durch unabhängige Personen ausgewertet, und Läufe, bei denen Diskrepanzen auftraten, wurden wiederholt.
Test-Statistiken:
Quantitative Unterschiede in der Verteilung der Mikrosatelliten-Allele zwischen den Linien wurden mit Hilfe des Chi-Quadrat-Test (Rasch et al. 1978 Verfahrensbibliothek Versuchsplanung und -auswertung, Band 2. Deutscher Landwirtschaftsverlag Berlin, 884) bewertet. Die Heterozygotie-Indizes für die zwei Mauslinien und der genetische Abstand zwischen den Linien wurden gemäß Gregorius (Gregorius, A unique genetic distance, Biom. J. 1984, 26: 13–18) berechnet. Ein Heterogenitäts-Index >0,5 zwischen den Linien in einem einzelnen Locus ist mit der Signifikanzschwelle von P<10^–4 des Chi-Quadrat-Tests konsistent.
Für die Kopplungsanalyse wurden zunächst Stammbaum-spezifische Marker-Kartierungen mit dem Programm CRIMAP (Larder und Green, 1987 Construction of multilocus genetic linkage maps in humans. Proc. Nat. Acad. Sciences (USA) 84: 2363–2367) erstellt. Da diese Kartierungen inhaltlich mit den veröffentlichten Kartierungen konsistent waren, wurden die Marker-Abstände der Konsensus-Kartierung des Mausgenoms (Dietrich et al. 1996 A comprehensive genetic map of the mouse genome. Nature 380: 149–152) für die Kartierung der QTLs verwendet.
Für die Analyse der Stammbäume wurden zunächst die Einflüsse von Geschlecht, wiederholter Anpaarung und Subfamilie (d.h. F₂-Tiere vom selben F₁-Elternpaar) mittels Varianzanalyse (SAS, 1990 SAS User's guide: Statistics. SAS Inst. Inc., Cary, NC) geschätzt und für signifikant befunden und daher als fixierte Wirkungen in die Kopplungsanalyse eingebracht. Für die Analyse von Chromosom 11 wurde jeder Stammbaum separat bewertet, gefolgt von kombinierten Analysen über spezifische Stammbäume. Bei der Analyse über mehrere Stammbäume wurde zusätzlich eine fixierte Wirkung des Stammbaums in das Modell eingeschlossen.
Die Daten wurden durch multiple Regression, wie sie für die Analyse von Kreuzungen zwischen Auszuchtlinien entwickelt worden ist (Haley et al. 1994 Mapping quantitative trait loci in crosses between outbred lines using least squares. Genetics 136: 1195–207), analysiert. Zunächst wurde das Standard-Intervall-Kartierungsmodell mit einem einzelnen QTL auf die Kopplungsgruppe angewendet. Die erhaltenen Schätzungen wurden (wie von Zeng (1993 Theoretical basis for separation of multiple linked gene effects in mapping quantitative trait loci. Proc. Natl. Sci. USA 90: 10972–10976) und Jansen (1993 Interval mapping of multiple quantitative trait loci. Genetics 135:205-211) vorgeschlagen) überarbeitet, indem genetische Background-Wirkungen an die Kopplungsgruppen angepaßt wurden. Die genetischen Background-Wirkungen wurden schrittweise als Co-Faktoren eingeschlossen, wobei mit dem Locus mit der größten geschätzten Wirkung begonnen wurde, gefolgt von dem Locus mit der am zweitgrößten Wirkung, bis keine weiteren QTLs mehr auf dem vorgegebenen Signifikanzniveau nachgewiesen werden konnten. Während dieser Vorgehensweise wurde eine Background-Wirkung stets von der Analyse ausgeschlossen, wenn ihre eigene Position analysiert wurde. Das Sexchromosom wurde in einen pseudoautosomalen Bereich und einen X-spezifischen Bereich unterteilt. In zusätzlichen Analysen wurde das Körpergewicht als Co-Variante in die Analyse des Abdominalfett-Gewichtes und in die Analyse des prozentualen Abdominalfett-Anteils einbezogen, um die Abhängigkeit zwischen beiden Eigenschaften zu untersuchen. Die gemeinsame Wirkung aller signifikanten QTLs auf eine Eigenschaft (d.h. die für die F₂-Population erklärte Varianz) wurde als Reduktion der Rest-Varianz in der QTL-Analyse, bei der alle QTL-Positionen als Co-Faktoren angepaßt wurden, im Vergleich zur Analyse ohne QTLs geschätzt. Es wurden die Level für die angedeutete (α=0,1), signifikante (α=0,05) und hochsignifikante (α=0,01) Kopplung verwendet, wie sie Lander und Kruglyak 1995 vorgeschlagen haben (Larder und Kruglyak 1995 Genetic dissection of complex traits: guidelines for interpreting and reporting linkage results. Nature Genetics 11: 241–247). Chromosom-spezifische und Genom-weite empirische Schwellenwerte der Teststatistiken der Regressionsanalyse wurden mit dem von Churchill und Doerge (1994 Empirical threshold values for quantitative trait mapping. Genetics 138: 963–971) vorgeschlagenen Permutationstest ermittelt. Der angedeutete Level ist äquivalent zu dem Level, bei dem ein falsch-positives Ergebnis in einer Genomuntersuchung erwartet wird. In einem Genom von 20 unabhängigen Chromosomen-Paaren ist dies annähernd äquivalent zu der Verwendung des chromosomalen 5%igen Signifikanz-Levels, so daß im Durchschnitt eines dieser Chromosomen in einer Untersuchung des gesamten Genoms bei diesem Level signifikant ist. Die chromosomenweiten Level variieren zwischen den Chromosomen in Abhängigkeit ihrer Länge und der enthaltenen Marker. Um eine konservative Schätzung des 95%igen Konfidenzintervalls für Loci mit hochsignifikantem Niveau der genetischen Kopplung bereitzustellen, wurde der Maximalwert der Teststatistik um 2 LOD abgesenkt und dieser neue Wert der Teststatistik genutzt, um das Chromosomenintervall zu definieren, in dem mit höchster Wahrscheinlichkeit der QTL zu finden ist (van Ooijen 1992 Accuracy of mapping quantitative trait loci in autogamous species. Theor. Appl. Genet. 84: 803–811).
Sobald ein einzelnes QTL auf einem Chromosom identifiziert wurde, wurde das Vorhandensein eines zweiten QTLs durch Ausführung einer Rastersuche in 2 cM-Intervallen untersucht. Das Modell zweier QTLs wurde angenommen, sofern eine signifikante Verbesserung gegenüber dem bestmöglichen Modell mit einem QTL bei P<0,05 unter Verwendung eines Varianzraten (F)-Tests mit 3 Freiheitsgraden (für die zusätzliche additive Wirkung und die Dominanz-Wirkung und die geschätzte Position für das zweite QTL) erreicht wurde. Kartierungsstellen werden als genetischer Abstand vom Centromer in cM angegeben. wo ein QTL identifiziert wurde, wurde die Interaktion der QTL-Wirkungen mit dem Stammbaum, mit der innerhalb des Stammbaums enthaltenen Subfamilie und mit dem Geschlecht untersucht und bei P<0,05 als signifikant akzeptiert.
Beispiel 4
QTL-Analyse in der Familie DU6i × DBA/2

(Brockmann, G.A.; Kratzsch, J., Haley, C.S., Renne, U., Schwerin, M., Karle, S. (2000): "Single QTL effects, epistasis, and pleiotropy account for two thirds of the phenotypic F₂ variance of growth and obesity in DU6i × DBA/2 mice", Genome Res. 10: 1941–1957;
Brockmann, G.A.; Haley, C.S.; Wolf, E.; Karle, S.; Kratzsch, J.; Renne, U.; Schwerin, M.; Hoeflich, A. (2001): "Genome-wide search for loci controlling serum IGF-binding protein levels of mice", FASEB J. 15: 978–987).

Mauslinien:
Die Untersuchung wurde mit der Mauslinie DU6i durchgeführt, die durch Inzucht über vier Generationen aus der auf hohes Körpergewicht selektierten Linie DU6 erzeugt wurde. Als Kontrastlinie wurde die kommerziell erhältliche Inzucht-Mauslinie DBR/2 (Harlan Niederlande, Horst) verwendet. Die Auszucht-Linie DU6 wurde über 78 Generationen auf hohes Körpergewicht in einem Alter von 42 Tagen selektiert (Bünger et al. 1990, loc. cit.). Die Linie DU6 stammt von Originalkreuzungen von vier Basis-Populationen (NMRI orig., Han: NMRI CFW, CF1) und vier Inzucht-Populationen (CBA/Bln, AB/Bln, C57BL/Bln, XVII/Bln) des Forschungsinstituts für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Dummerstorf, Deutschland (Schüler 1985, loc. cit.). Die Tiere wurde ad libitum mit einer Zuchtdiät gefüttert, die 12,5 MJ/kg metabolische Energie und einen Durchschnittsgehalt von 22,5% Roh-Protein, 5% Roh-Fett, 4,5% Roh-Faser, 6,5% Roh-Asche, 13,5% Wasser, 48% N-freier Extrakt, Vitamine, Spurenelemente, Aminosäuren und Mineralien (Altromin-Diät 1314, Deutschland) umfaßte. 17 Männchen der Linie DU6i und 20 Männchen der Linie DBA/2, die nicht gefastet hatten, wurden für die Charakterisierung der zwei Mauslinien am 42. Tag untersucht.
Stammbaum-Design
Die QTL-Analyse wurde unter Verwendung eines Stammbaums des F₂-Kreuzungs-Designs durchgeführt. Diese wurden durch Kreuzung eines Weibchens der Hochwachstums-Inzuchtlinie DU6i mit einem Männchen der Kontrastlinie DBA/2 etabliert. Durch wiederholtes Paaren der Eltern und anschließendes Paaren innerhalb der Subfamilien von 12 Paaren der F₁-Nachkommen wurde ein großer Stammbaum mit insgesamt 411 F₂-Nachkommen erstellt. Das Paaren wurde zunächst in einem Alter von 10 Wochen durchgeführt und nach 6 Wochen wiederholt.
Phänotypische Messungen:
Die phänotypischen Daten wurden bei einem Alter von 42 Tagen aufgenommen; dies ist das Alter der Selektion in allen Generationen. Die quantitativen Messungen, die bei der QTL-Analyse vorgenommen wurden, betrafen das Gewicht von Körper (BW), Abdominalfett (AFW), Muskel (MW), Leber (LW), Niere (KW) und Milz (SW) sowie die Serumkonzentration von Leptin, Insulin und dem Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-I). F₂-Tiere, die nicht gefastet hatten, wurden zwischen 9 und 12 Uhr vormittags getötet. Um die größtmöglichen Volumina an Blutserum für die Analyse der physiologischen Parameter zu erhalten, wurden die Tiere dekaptiert. Das gemessene Abdominalfett war in den Männchen das testikuläre Fett und in den Weibchen das Fett des Perimetriums. Das Verhältnis von Abdominalfett zu Körpergewicht wurde als prozentualer Abdominalfett-Anteil (AFP) definiert. Das Gewicht des Quadrizeps, der den Musculus rectus femulus, den Musculus vastus intermedicus, den Musculus vastus lateralis und den Musculus vastus medialis umfaßt, wurde repräsentativ für die Muskelentwicklung (MW) festgehalten.
Leptin wurde mit dem "Quantikine Murine"-ELISA (R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland) gemessen. Die Bestimmung von Insulin in Maus-Seren wurde durch einen ultrasensitiven Ratten-Insulin- ELISA (DRG, Marburg, Deutschland) durchgeführt, der eine 100%ige Kreuzreaktivität mit Maus-Insulin zeigte. IGF-I wurde nach Säure-Ethanol-Extraktion (wie zuvor beschrieben) mittels eines ELISA im Serum bestimmt (Kratzsch et al. 1993, Measurement of insulin-like growth factor I (IGF-I) in normal adults, patients with liver cirrhosis and acromegaly: experience with a new enzyme immunoassay. Exp. Clin. Endocrinol. 101: 144–149).
Analyse von IGFBP-Spiegeln im Serum:
DU6i und DBA/2-Mäuse, die nicht gefastet hatten, und alle F₂-Hybride wurden im Alter von 42 Tagen morgens zwischen 9.00 und 12.00 Uhr durch Dekapitation getötet. Das Blut wurde gesammelt und das Serum wurde durch Zentrifugation gewonnen und bei –20°C bis zur Analyse gelagert. Serum-IGFBPs von 208 Männchen und 161 Weibchen wurde durch Western-Liganden-Blot-Analyse (Hossenlopp, P., Seurin, D., Segovia-Quinson, B., Hardouin, S., and Binoux, M. (1986) Analysis of serum insulin-like growth factor binding proteins using western blotting: use of the method for titration of the binding proteins and competitive binding studies. Anal. Biochem. 154, 138–143) analysiert. Serumproben wurden 1:5 mit Probenpuffer [50 mM Na₂HPO₄, pH 7.0; 1% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS); 50% (w/v) Glycerin], für 5 Minuten gekocht und auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel (5% Sammelgel/12% Trenngel) unter Verwendung des Mini Protean, II^TM Systems (Biorad, München, Deutschland) elektrophoretisch getrennt. Die getrennten Proteine wurden auf eine Nitrocellulose-Membran (Millipore, Eschborn, Deutschland) transferiert. Die Blots wurden mit 1% Fisch-Gelatine blockiert und mit [¹²⁵I] IGF-II (10⁶ c.p.m. pro Blot) inkubiert. Alle Inkubationen und Waschschritte wurden bei 4°C durchgeführt. Bindende Proteine wurden auf einem Phosphor-Imager Storm (Molecular Dynamics, Krefeld, Deutschland) visualisiert und unter Verwendung der ImageQuaNT Software (Molecular Dynamics) quantifiziert. Die Signalintensitäten wurden hinsichtlich des Backgrounds korrigiert und unter Verwendung identischer Standards auf verschiedenen Blots normalisiert (6).
Die Serumspiegel der IGFBPs werden als relative densitometrische werte (RDV) gegenüber dem Standard angegeben. Die Summe aller IGFBPs wurde quantifiziert und als Gesamt-IGF-Bindungskapazität definiert. Da IGFBP-2 in Mäusen, die auf hohes Körpergewicht selektiert werden, unterschiedlich reguliert wird und das Körperwachstum von transgenen Mäusen inhibiert (Hoeflich, A., Wu, M., Mohan, S., Föll, J., Wanke, R., Froehlich, T., Arnold, G. J., Lahm, H., Kolb, H. J., and Wolf, E. (1999) Overexpression of insulin-like growth factorbinding protein-2 in transgenic mice reduces postnatal body weight gain. Endocrinology 140, 5488–5496), wurde die Menge an IGFBP-2 relativ zur Gesamt-IGF-Bindungskapazität im Serum (relIGFBP-2) berechnet, wodurch die Variation in den Gesamtserum-IGFBP-Spiegeln zwischen verschiedenen Mausstämmen berücksichtigt wurde.
Quantifizierung der IGF-I Serumkonzentration:
IGF-1 wurde mittels eines ELISAs im Serum nach Säure-Ethanol-Extraktion wie zuvor beschrieben bestimmt (Kratzsch, J., Blum, W.F., Schenker, E., Keller, E., Jahreis, G., Haustein, B., Ventz, M., and Rotzsch, W. 1993. Measurement of insulin-like growth factor I(IGF-I) in normal adults, patients with liver cirrhosis and acromegaly: experience with a new enzyme immunoassay. Exp. Clin. Endocrinol. 101: 144–149).
Marker:
Die Marker wurden hinsichtlich ihrer hohen Variabilität zwischen geeigneten Inzucht-Linien aus der Maus-Genom-Datenbank (MGD, MOUSE GENOME DATABASE, Mouse Genome Informatics, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Main. World Wide Web (URL: http://www.informatics.jax.org/) June, 1998) ausgewählt. MapPair-Primer der Maus wurden von Research Genetics (Huntsville, AL, USA) erhalten. Über 630 Mikrosatelliten-Marker wurden auf informative parentale Allele getestet, bevor die Eltern und F₂ für 93 Loci genotypisiert wurden, die sämtliche Chromosome mit einem durchschnittlichen Abstand von 14,1 cM abdecken. Die Marker-Karte ist in Tabelle 10 dargestellt. Tabelle 10. Marker für die Kopplungsanalyse
Beispiel 5
Identifizierung different exprimierter Gene
Mauslinien
Die Studie wurde mit den Mauslinien DU6 und ihrem Inzuchtderivat DU6i als Linien, die auf hohes Körpergewicht selektiert worden waren, durchgeführt. Die interne Kontrollinie des Selektions-Experimentes DUKs und der kommerziell erhältliche Inzuchtstamm DBA/2 (Harlan Niederlande, Horst) wurden als Kontrastlinien für die vorliegenden Experimente verwendet. Kürzlich wurden dieselben Mauslinien für die QTL-Kartierung in gekreuzten Populationen verwendet (Brockmann et al. 1998 loc. cit., Brockmann et al. 2000 loc. cit., Brockmann et al. 2001 loc. cit.).
Die Selektionslinien DU6, DU6i und die Kontrollinie DUKs stammen von Originalkreuzungen von vier Basis-Populationen (NMRI orig., Han:NMRI, CFW, CF1) und 4 Inzucht-Populationen (CBA/Bln, AB/Bln, C57BL/Bln, XVII/Bln) des Forschungsinstituts für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Dummerstorf, Deutschland (Schüler 1985 loc. cit.). Die Auszuchtlinie DU6 war für über 100 Generationen auf hohes Körpergewicht in einem Alter von 42 Tagen selektiert worden (Bünger et al. 1990 loc. cit.). Das Alter von 42 Tagen war das Alter der Selektion in allen Generationen. Dieses Alter entspricht dem Ende der juvenilen Phase der Ontogenese. Nach 42 Tagen haben sowohl die Tiere der Selektionslinien als auch die der unselektierten Kontrastlinien den Zeitraum des schnellen Wachstums abgeschlossen und sind post-pubertär.
Die Tiere wurden ad libitum mit einer Züchtungs-Diät gefüttert, die 12,5 MJ/kg metabolische Energie und einen Durchschnittsgehalt von 22,5% Roh-Protein, 5,0% Roh-Fett, 4,5% Roh-Faser, 6,5% Roh-Asche, 13,5% Wasser, 48% N-freier Extrakt, Vitamine, Spurenelemente, Aminosäuren und Mineralien (Diät 1314; Altromin, Lage, Deutschland) umfasste.
Gewebe
Epididymale Fettgewebe wurden von Männchen, die nicht gefastet hatten, zwischen 9:00 und 12:00 Uhr vormittags gesammelt. Die Tiere waren 42 Tage alt. Nach der Dekapitation wurde das epididymale Fett umgehend gesammelt und gewogen. Gleiche Gewebemengen von 20 Tieren wurden innerhalb jeder Mauslinie in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C bis zur Präparation der RNA gelagert.
Herstellung von Hybridisierungs-Sonden
Für jede der vier Mausstämme DU6, DU6i, DUKs und DBA/2 wurden vereinigte RNA-Proben hergestellt. Vor der RNA-Isolierung wurden gleiche Mengen gefrorener Gewebeproben von 20 Individuen vereinigt und unter flüssigem Stickstoff homogenisiert. Die Vereinigung wurde angewendet, um die individuelle Variabilität zu reduzieren, die in Auszucht-Populationen hoch ist. Die Gesamt-RNA wurde aus vereinigten Gewebeproben gemäß dem Säure-Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktions-Protokoll von Chomczynski und Sacchi (Chomczynski und Sacchi 1987 Single step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochem. 162: 156–159) isoliert, das von CLONTECH modifiziert wurde (CLONTECH Laboratories GmbH, Heidelberg, Deutschland). 200 mg vereinigtes Gewebe wurde bei Raumtemperatur in einer Denaturierungslösung homogenisiert, die aus 2,7 M Guanidinthiocyanat, 1,3 M Ammoniumthiocyanat und 100 mM Natriumacetat bestand (Potter S., B. Braun Biotech International GmbH, Melsungen, Deutschland). Für die Entfernung des Fetts wurde die vollständig homogenisierte Probe in Denaturierungslösung für 10 Minuten auf Eis inkubiert, damit das Fett an die Oberfläche gelangen kann. Die Fettschicht wurde vorsichtig aus dem Reaktionsgefäß entfernt und das Homogenat wurde in ein frisches Reaktionsgefäß transferiert. Anschließend wurden Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und mit dem zweifachen Volumen gesättigtem Phenol gemischt (1008 Phenol, 15% v/v Glycerol, 100 mM Natriumacetat (pH 4,0), 18,6% v/v deionisiertes Wasser). Nach 1 Minute Vortexen und 5 minütiger Inkubation auf Eis wurde der Probe 1/5 Volumen Chloroform zugesetzt, die Probe wurde geschüttelt und für weitere 5 Minuten auf Eis gestellt. Anschließend wurde die Probe zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Die obere, wässrige Phase wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. Die Phenol-Chloroform-Extraktion wurde zweimal wiederholt. Schließlich wurde die RNA durch Zusatz eines Volumens Isopropanol zu der wässrigen Phase präzipitiert. Nach der Zentrifugation wurde das Pellet in 80% Ethanol gewaschen, getrocknet und in deionisiertem Wasser resuspendiert. Die Integrität und Reinheit der RNA wurde vor der cDNA-Synthese mittels Formaldehyd-Agarose-Gelelektrophorese und Spektrometrie kontrolliert. Die RNA hatte A260/A280-Raten von 1,8 oder höher.
GeneChip-Hybridisierung
Die Affymetrix GeneChips Mu11K A und B wurden als Oligonukleotid-Mikroarrays für die Analyse von 13.069 Sonden-Gruppen verwendet, die über 11.000 Maus-spezifische Gene und ESTs (expressed sequence tags) darstellten (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Für die Hybridisierung der gewebespezifischen RNAs mit den GeneChips wurden die Proben gemäß den Empfehlungen des Affymetrix-Benutzerhandbuchs hergestellt. Die Synthese des ersten Stranges wurde durch einen T7-(dT)24-Primer und Superscript II Reverse Transcriptase (Gibco BRL Life Technologies) unter Verwendung von 10 mg Gesamt-RNA-Probe durchgeführt. Die Synthese des zweiten Stranges wurde gemäß des Syperscript Choice Systems (Gibco BRL Life Technologies) mittels DNA-Polymerase I von E. coli, Ligase von E. coli und RNaseH durchgeführt. Das Glätten der Fragmentenden wurde unter Verwendung der T4-Polymerase durchgeführt. Eine in vitro Transkriptionsreaktion wurde verwendet, um Biotin-11-CTP und Biotin-l6-UTP in die cRNA-Sonde (BioArray HighYield RNA Transcript Labeling Kit, Enzo) einzubauen. Die fragmentierte cDNA wurde über Nacht bei 45°C hybridisiert, um die Qualität der Sonde zu gewährleisten. "Spikes" wurden in die Hybridisierungsmischung eingebracht und Test-2-Arrays (Affymetrix) wurden einen Tag zuvor hybridisiert. Das Waschen wurde unter Verwendung der GeneChip-Fluidics-Station (Affymetrix) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Das Färben wurde mittels R-Phycoerythrin-Streptavidin (Molecular Probes), gefolgt von einer Antikörper-Amplifikationsprozedur unter Verwendung eines biotinylierten Anti-Streptavidin-Antikörpers (Vector Laboratories) und Ziegen-IgG (Sigma) durchgeführt. Das Scannen wurde mit einer Auflösung von 3μm, einer Anregungswellenlänge von 488nm und einer Emissionswellenlänge von 570nm unter Verwendung des GeneArray Scanners (Hewlett Packard) durchgeführt.
Datenanalyse
Die Expressionslevel wurden mit den Programmen „GeneChip Expression Analysis Software-System Data Mining Tool (Version 1.2.)" und „Microarray Suite (Version 4.0.1.)" von Affymetrix berechnet. Zunächst wurden die Hybridisierungssignale auf jedem GeneChip unter Verwendung aller Sonden-Gruppen skaliert, um die Unterschiede in den Gesamt-Signal-Intensitäten zwischen zwei Arrays zu minimieren, was eine verläßlichere Detektion von biologisch relevanten Änderungen in der Probe erlaubt. Die „Decision-Matrix" von Affymetrix wurde verwendet, um vorhandene, kaum vorhandene und nicht vorhandene Transkriptmengen eines Gens in einer getesteten RNA zu bewerten. Anschließend erfolgten paarweise Vergleiche der normalisierten Genexpressions-Signale zwischen GeneChips, die entweder mit RNA einer selektierten Mauslinie oder mit RNA einer Kontroll-Mauslinie hybridisiert wurden. Die Hybridi-sierungen der GeneChips mit DU6- und DU6i-Sonden als selektierte Mauslinien sowie DUKs und DBA/2 als unselektierte Mauslinien wurde als eine Art Replikat verwendet. Die kreuzweise erfolgenden Vergleiche DU6 versus DUKs und DU6i versus DUKs einerseits und DU6 versus DBA/2 und DU6i versus DUKs andererseits wurden als Replikat-Vergleiche verwendet. Gene, die als positive Hybridisierungssignale auf mindestens einem der GeneChips detektiert wurden, wurden für den Genexpressions-Vergleich verwendet. Gene, die in der Selektionslinie im Vergleich zu der Kontrollmauslinie als Basislinie signifikant oder marginal erhöht oder erniedrigt waren, wurden als potentiell differentiell exprimierte Gene ausgewählt. Eine Gruppe von Konsensus-Genen wurde aus den vier paarweise erfolgten Vergleichen zwischen den zwei selektierten (DU6 und DU6i) und den zwei unselektierten Mauslinien (DUKs und DBA/2) ausgewählt, die alle Gene umfaßten, die in allen vier Vergleichen differentiell exprimiert wurden. Expressions-unterschiede zwischen den Mauslinien werden als x-fache Erhöhung (positive Werte) oder x-fache Verringerung (negative Werte) der Genexpression in der selektierten Mauslinie im Vergleich mit der Expression in den unselektierten Mauslinien angegeben.
Kartierung der Gene
Alle Gene, die den Konsensus-Pool der differentiell exprimierten Gene in epididymalem Fettgewebe zwischen großen und fetten selektierten und nichtselektierten Mauslinien umfaßten, wurden unter Verwendung der Sequenzinformation von Gen-spezifischen Oligonukleotiden auf den Affymetrix GeneChips, sowie der TIGR-, LocusLink-, Ensembl- und der Mensch-Maus-Homologie-Datenbank in silico kartiert. Die Kartierungsposition wurde akzeptiert, wenn ein spezifischer einzelner Treffer in den verschiedenen Datenbanken gefunden wurde, und die Ergebnisse der Mensch-Maus-Homologie-Datenbank mit den anderen Ergebnissen konsistent waren. In Fällen, bei denen die Kartierungsposition nicht verläßlich identifiziert werden konnte, wurde eine Radiations-Hybrid-Kartierung unter Verwendung des Mouse Hamster Radiation Hybrid (RH) Panels (Resten, Huntsville, AL, USA) durchgeführt. Gen-spezifische Primer für die RH- Kartierung wurden für die Region des Gens hergestellt, die die Oligonukleotid-Sequenz der GeneChips umfaßte.
Real-Time-Quantifizierung der Transkriptmengen
Die Ergebnisse aus der Hybridisierung der Affymetrix GeneChips mit den vereinigten Proben der selektierten bzw. nicht selektierten Mauslinien, wurden für Transkripte von selektierten differentiell exprimierten, positionellen Kandidaten-Genen in einzelnen RNA-Proben des Epididymal-Fettgewebes von 5 Männchen im Alter von 42 Tagen pro Linie kontrolliert. Diese 5 Tiere unterschieden sich von den Tieren, die für die vereinigten Proben für die Hybridisierung des GeneChips verwendet wurden. Zur Verifikation des Hybridisierungsmusters, das durch die Affymetrix GeneChips erhalten wurde, wurde eine Real-Time-Flourimetrie während der PCR unter Verwendung des FastStart DNA Master SYBR Green I Kits in einem LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Gesamt-RNA jedes Individuums wurde unter Verwendung des RNeasy Kits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) durch ein Verfahren extrahiert, das eine Gewebehomogenisierung und die selektive RNA-Adsorption an Silica-Gel-Membranen in Gegenwart eines Puffer-Systems mit hoher Salzkonzentration umfaßt. Die RNA wurde spektrophotometrisch bei 260 nm quantifiziert und zusätzlich durch Densitometrie von RNA auf Ethidiumbromid-gefärbten Agarose-Gelen quantifiziert. 1 μg Gesamt-RNA wurde für die RT-PCR in einem Gesamtvolumen von 10 μl pro Reaktion verwendet. Die RT-PCR wurde für Gesamt-RNA von Fettgewebe von allen 20 Tieren (5 Tiere pro Linie) parallel durchgeführt. Die cDNA-Synthese wurde in Gegenwart von 50 ng Oligo-dT(12-18)-Primern und 10 Units M-MLV RT (H-)Reverse Transkriptase (Promega Corp., WI, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Für die anschließende Quantifizierung von Transkriptmengen wurde ein Äquivalent von 10^–1 bis 10^–2 μg Gesamt-RNA in der PCR-Reaktion verwendet (abhängig von den Gen-spezifischen Transkriptmengen, die anhand der Hybridisierungs-Signalintensitäten auf den GeneChips erwartet wurden). Die Gen-spezifischen Primer für die Expressionsanalyse wurden anhand der Sequenzregionen erstellt, die den Sequenzpositionen der Oligonukleotide entsprachen, die das Gen auf den MU11K-GeneChips repräsentierten. Die Primersequenzen für die Gen-spezifische Transkript-Amplifikation sowie die PCR-Bedingungen werden in Tabelle 11 aufgeführt (11A: Fettgewebe; 11B: Hypothalamus). Die individuellen Expressionsdaten der getesteten Gene wurden anhand des Expressionslevels des RPS29-Gens normalisiert, bei dem man herausgefunden hatte, daß es in unserem Mausmodell nicht differentiell reguliert wird. Alle 20 Tiere (5 Tiere pro Linie) wurden gleichzeitig für ein Gen in einer PCR-Quantifizierungsrunde analysiert. Die relative Kopienzahl wurde basierend auf einer externen Standardkurve berechnet. Die x-fache Veränderung der Transkriptmengen wurde als Verhältnis der Mittelwerte aus der normalisierten Kopienzahlen aller Tiere einer selektierten Mauslinie gegenüber einer Kontrollmauslinie berechnet. Positive Werte verwiesen auf höhere Transkriptmengen in der Selektionslinie im Vergleich zu Kontrolltieren; negative Werte stellen Gene mit geringeren Transkriptmengen in der Selektionslinie im Vergleich zu der Kontrollinie dar. Der Student'sche t-Test wurde für den Vergleich von normalisierten Transkriptmengen zwischen verschiedenen Mauslinien angewendet.
Beispiel 6
Identifizierung von DNA-Varianten
Die DNA-Sequenzen der im Fettgewebe differentiell exprimierten Gene wurden unter Verwendung der in den Tabellen 12A (Fettgewebe, Promoter-Bereich) und 12C (Fettgewebe, 3'-untranslatierter Bereich) gezeigten Primer bestimmt. Die DNA-Sequenzen der im Hypothalamus differentiell exprimierten Gene wurden unter Verwendung der in den Tabellen 12B (Hypothalamus, Promoter-Bereich) gezeigten Primer bestimmt.
Folgendes Protokoll wurde dafür eingehalten:
1. Extraktion genomischer DNA-Sequenzen aus der Ensembl-Datenbank
Um die DNA-Sequenzen der Promotoren und der 3'-untranslatierten Regionen der ausgewählten Kandidatengene untersuchen zu können, wurden die genomischen Sequenzen zunächst aus der Ensembl-Datenbank extrahiert. Für die Untersuchungen des Promotorbereichs haben wir jeweils die genomischen Sequenzen von 1000 bp upstream bis 500 bp downstream des Transkriptionsstartpunktes jedes Genes von Interesse exportiert. Für die 3'-untranslatierten Regionen der ausgewählten Kandidatengene wurden 1000 bp downstream des letzten Exons aus der Ensembl-Datenbank extrahiert. In den extrahierten genomischen DNA-Sequenzen wurden spezifische Primer für die Sequenzierung des Promotors bzw. der 3'-untranslatierten Regionen abgeleitet.
2. Primerdesign
Die spezifischen Primer für die Sequenzierung des Promotors bzw. der 3'-untranslatierten Regionen, die in der Sequenzierung zum Einsatz kamen, wurden mit dem Programm Primer3 abgeleitet.
Primereigenschaften
Lage der Primer im Promotorbereich: Forward-Primer sollte ca. 1000 bp. upstream des Transkriptionsstartpunktes, Reverse-Primer sollte im 1. Exon liegen.
Lage der Primer in der 3'-untranslatierten Region: Forward-Primer sollte im letzten Exon, Reverse-Primer ca. 1000 bp. downstream des letzten Exons liegen.
Im folgenden werden die Forward-Primer und Reverse-Primer auch als F- bzw. R-Primer bezeichnet.
Länge des PCR Produkts: 1200–1300 bp.
Länge der Primer: ca. 20 nt (min. 20 nt, max. 25 nt)
Schmelztemperatur (T_m) der Primer: optimal 65°C
Unterschied in der Annealing-Temperatur zwischen Forward- und Reverse-Primer: max. 1 °C
In Abhängigkeit von der Leseweite in der Sequenzreaktion wurde ein innerhalb des ersten PCR-Fragments liegender zusätzlicher Primer für die nachfolgende Sequenzierung zur Überbrückung der Lücke abgeleitet.
3. Präparation genomischer Target-DNA einzelner Mäuse
Die Isolierung der genomischen DNA erfolgte aus dem Mausschwanz mit dem DNeasy Tissue Kit von Qiagen (Hilden, Deutschland) entsprechend des Hersteller-Protokolls. Die DNA-Konzentrations- und Qualitätsbestimmung erfolgte mit dem Photometer von Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland). Die Messung wurde bei 280 nm vorgenommen. Für nachfolgende PCR wurde die DNA-Konzentration auf 20 ng/μl mit AE-Puffer (Elutionspuffer) aus dem DNeasy tissue Kit von Qiagen eingestellt.
4. PCR-Bedingungen

Mit den für die Zielregionen abgeleiteten spezifischen Primern und der isolierten genomischen DNA aus Mausschwanz wurden PCRs durchgeführt, um die Promotorabschnitte bzw. 3'-untranslatierten Regionen von Interesse zu amplifizieren, damit ausreichend Material für die nachfolgende Sequenzierung zur Verfügung stand. PCR-Pipettierschema für Volumen von je 10 μl Reaktionsansatz:

genomische DNA	1,0 μl (20 ng/μl)
10x Reaktionspuffer	1,0 μl
dNTP-Mix	0,8 μl (l0pmol/μl)
MgCl₂	0,2 μl (25mmol/μl)
Primer F	0,5 μl (l0pmol/μl)
Primer R	0,5 μl (l0pmol/μl)
Taq-DNA-Polymerase (Promega, Mannheim, Deutschland)	0,05 μl(5U/μl)
Wasser	5,95 μl

PCR-Programm im Thermocycler (Biometra, Göttingen, Deutschland) für Amplifikation:

Denaturierung:	3 min bei 94°C
Gefolgt von 38 Zyklen
Denaturierung:	15 s bei 94°C
Annealing:	1 min bei 65°C
Extension:	1 min bei 72°C
Gefolgt von

Extension:	7 min bei 72 °C
	1 min bei 15 °C

5. Charakterisierung von Amplifikationsprodukten mittels Agarosegel-Elektrophorese
Um die Qualität und Spezifität der in der PCR gewonnenen Amplifikationsprodukte zu prüfen, wurden sie auf ein 0,8 Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch getrennt und mittels Ethidiumbromid visualisiert. Die Elektrophorese wurde bei 80 V, 90 mA über 1 Stunde durchgeführt.
6. Reinigung von PCR-Produkten
Für die Reinigung von DNA-Amplifikationsfragmenten direkt nach der PCR wurde der High Pure PCR product Purification Kit von Roche (Mannheim, Deutschland) verwendet. Die Konzentrationsbestimmung von Amplifikationsprodukten erfolgte semi-quantitativ mittels einer Konzentrationsreihe, da eine photometrische Messung bei sehr geringen DNA-Konzentrationen zu großen Ungenauigkeiten führt.
7. Sequenzierungsreaktion
Die Sequenzierung erfolgte beidseitig überlappend. Die eingesetzte Target-Menge an PCR-Produkt war abhängig von der Länge des Fragments und wurde entsprechend der Empfehlung von ABI eingestellt. Während der Sequenzierungsreaktion wurden die PCR-Fragmente noch einmal richtungsspezifisch (mit F- oder R-Primer) amplifiziert und fluoreszenzmarkiert. Hierfür wurde der ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits v2.0 von Applied Biosystems GmbH (Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die Sequenzierung erfolgte entsprechend des vom Hersteller angegebenen Protokolls.
Beispiel 7
Erzeugung von Chromosomensubstitutionslinien (CSS)
Entsprechend des Versuchsplanes (siehe 4) wurde für die Erzeugung der CSS ein Bock der Linie DU6i an mehrere Weibchen der Kontrolllinie DBA/2 angepaart. Durch wiederholte Rückkreuzungen an die Inzuchtlinie DBA/2 wurde seriell jeweils ein Chromosom der selektierten Linie auf den genetischen Background der Rezipientenlinie übertragen.
Für die Kontrolle der Weitergabe des Zielchromosoms und für die gleichzeitige Kontrolle des genetischen Hintergrundes wurde das gesamte Genom mit 148 informativen genetischen Microsatellitenmarkern abgedeckt.
Das Körpergewicht in der Inzuchtlinie DU6i war um das 3,6-Fache höher als in DBA/2-Mäusen. Entsprechend dem zunehmenden Teil des DBA/2-Genoms und der gleichzeitigen Verminderung des DU6i-Genoms reduzierte sich das Körpergewicht in den CSS mit jeder Rückkreuzung zum DBA/2-Stamm. Differenzen im Körpergewicht an Tag 42 zwischen CSSs and DBA/2 Mäusen in unterschiedlichen Rückkreuzungsgenerationen (BC) sind in 5 zum Zeitpunkt der Erstellung der generationen BC4 und BC5 gezeigt. In diesen Generationen waren zeitgleich nicht alle CSS erzeugt, deshalb werden für einige Linien keine Daten gezeigt. Nach acht Generationen Rückkreuzung, wurden signifikante Effekte der DU6i-Chromosomen im Hinblick auf das Körpergewicht im Alter von 21 Tagen für die Chromosomen 1, 3, 6, 7 und 14 beobachtet. Für die Gewichtszunahme zwischen dem 21. und 42. Tag zeigten die Chromosomen 2, 4, 8, 11, 14, 15, 16 und 17 Effekte. Die Chromosomen 2, 5, 11 und 17 waren für die Gewichtszunahme zwischen dem 42. und 63. Tag entscheidend. Der größte Effekt auf das Körpergewicht wurde auf Chromosom 5 beobachtet, wobei dieser Effekt bei jedem Lebensalter signifikant war. Die Daten bestätigen die Ergebnissen, die durch Kopplungsanalysen in Kreuzungspopulationen erhalten wurden.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes, dadurch gekennzeichnet, dass man nicht-menschlichen Säugern eine zu untersuchende Substanz verabreicht und man deren Einfluss auf die Expression der folgenden Gene bestimmt:

wobei es sich bei der Substanz um einen die Körpermasse und den Fettansatz beeinflussenden Wirkstoff handelt, wenn durch Verabreichung der Substanz die Expression eines oder mehrerer der genannten Gene verändert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Wirkstoff zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes ein Wirkstoff ist, der geeignet ist, den Fettansatz zu beschränken (vermindern), dadurch gekennzeichnet, dass man nicht-menschlichen Säugern eine zu untersuchende Substanz verabreicht und man deren Einfluss auf die Expression der genannten Gene bestimmt, wobei es sich bei der Substanz um einen die Körpermasse und den Fettansatz beschränkenden (vermindernden) Wirkstoff handelt, wenn durch Verabreichung der Substanz die Expression eines oder mehrerer der Gene

erhöht wird und/oder die Expression eines oder mehrerer der Gene

erniedrigt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Wirkstoff zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes ein Wirkstoff ist, der geeignet ist, den Fettansatz zu erhöhen, dadurch gekennzeichnet, dass man nicht-menschlichen Säugern eine zu untersuchende Substanz verabreicht und man deren Einfluss auf die Expression der folgenden Gene bestimmt, wobei es sich bei der Substanz um einen die Körpermasse und den Fettansatz erhöhenden Wirkstoff handelt, wenn durch Verabreichung der Substanz die Expression eines oder mehrerer der Gene

erhöht wird und/oder die Expression eines oder mehrere der Gene

erniedrigt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der nicht-menschliche Säuger ein Nager ist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Verfahren nach Anspruch 1 durchführt und man den identifizierten Wirkstoff zu einer zur Verabreichung geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Erniedrigung der Körpermasse und des Fettansatzes, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Verfahren nach Anspruch 2 durchführt und man den identifizierten Wirkstoff zu einer zur Verabreichung geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Erhöhung der Körpermasse und des Fettansatzes, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Verfahren nach Anspruch 3 durchführt und man den identifizierten Wirkstoff zu einer zur Verabreichung geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert.
Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der nicht-menschliche Säuger ein Nager ist.
Verwendung eines nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 identifizierten Wirkstoffs zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes.
Verwendung eines nach dem Verfahren gemäß Anspruch 2 identifizierten Wirkstoffs zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Erniedrigung der Körpermasse und des Fettansatzes.
Verwendung eines nach dem Verfahren gemäß Anspruch 3 identifizierten Wirkstoffs zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Erhöhung der Körpermasse und des Fettansatzes.
Verwendung nach den Ansprüchen 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der im Verfahren verwendete nicht-menschliche Säuger ein Nager ist.