DE1030973B

DE1030973B - Process for the production and extraction of bromotetracycline by biological means

Info

Publication number: DE1030973B
Application number: DEA24908A
Authority: DE
Inventors: Albert Peter Doerschuk; Barbara Ann Bitler; Milton Andrew Petty
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1953-10-27
Filing date: 1954-08-13
Publication date: 1958-05-29

Description

Verfahren zur Erzeugung und Gewinnung von Bromtetracyclin auf biologischem Wege Die Erfindung betrifft die fermentative Erzeugung eines neuen und therapeutisch wertvollen Antibiotikums mit breitem Wirkungsspektrum, das als Bromtetracyelin bezeichnet wird, sowie die Gewinnung und Reinigung dieser Substanz.Process for the production and recovery of bromotetracycline on biological Ways The invention relates to the fermentative production of a new and therapeutic valuable antibiotic with a broad spectrum of action called bromotracyelin as well as the extraction and purification of this substance.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von Bromtetracyclin-wird ein wäßriges Nährmedium, das wenigstens 50 Teile Bromionen auf 1 Million Teile Nährmedium enthält und einen niedrigen Chlorionengehalt aufweist, mit einem Bromtetracyclin erzeugenden Stamm von S. aureofaciens unter aeroben Bedingungen fermentiert, bis das Medium Bromtetracyclin als vorwiegendes Antibiotikum enthält.In the method according to the invention for the production of bromotetracycline-is an aqueous nutrient medium containing at least 50 parts of bromine ions per 1 million parts of nutrient medium and has a low chlorine ion content, with a bromotetracycline producing strain of S. aureofaciens fermented under aerobic conditions until the medium contains bromotetracycline as the predominant antibiotic.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde gefunden, daß unter geeignetenBedingungen einschließlich der Verwendung von Organismen der Species Streptomyces oder Mutanten davon in einem Fermentationsmedium eine antibiotische Substanz in hoher Konzentration erzeugt wird, die sich von den bisher bekannten unterscheidet, insbesondere von dem Antiboitikum Chlortetracyclin, das bisher von Organismen dieser Species erzeugt wurde.When carrying out the method according to the invention, it was found that that under appropriate conditions including the use of organisms of the Species Streptomyces or mutants thereof are antibiotic in a fermentation medium Substance in high concentration is generated, which differs from the previously known differs, in particular from the antibiotic chlortetracycline, which so far has been used by Organisms of this species was created.

Diese Substanz wurde erstmalig in guter Ausbeute und verhältnismäßig hoher Konzentration in einem an sich üblichen Fermentationsmedium erzeugt, das jedoch Bromionen enthielt und vorzugsweise praktisch chlorionenfrei war, wobei als Mikroorganismus ein im Boden gefundener Stamm von Streptomyces aureofaciens verwendet wurde.This substance was first produced in good yield and proportionate high concentration in a conventional fermentation medium, which, however Contained bromine ions and was preferably practically free of chlorine ions, the microorganism being a strain of Streptomyces aureofaciens found in the soil was used.

Diese neue antibiotische Substanz wurde Bromtetracyclin genannt, da festgestellt wurde, daß ihre Struktur ebenfalls den Molekül aufweist, der Chlortetracyclin und Oxytetracyclin gemeinsam ist (Brunings und Mitarbeiter, Journ. Amer. Chem. Soc., 74,1952, S.4976, 4977). Durch die Anwesenheit von Brom ist sie sofort von Chlortetracyclin und Oxytetracyclin zu unterscheiden.This new antibiotic substance has been called bromotetracycline since it was found that their structure also has the molecule, the chlortetracycline and oxytetracycline is common (Brunings et al., Journ. Amer. Chem. Soc., 74, 1952, pp. 4976, 4977). Because of the presence of bromine, it is instantly removed from chlortetracycline and oxytetracycline.

Bromtetracyclin besitzt die Bruttoformel C22 H23 N2 08 Br und folgende Strukturformel Bromtetracyclin als freie Base reagiert amphoter und bildet sowohl mit Säuren als auch mit Basen Salze. Es bildet beispielsweise Additionssalze mit organischen und anorganischen Säuren und kann in Form des Hydrochlorids, Hydrobromids, Sulfats, Borats, Nitrats, Phosphats, Ascorbats, Zitrats, Succinats, Acetats, Sulfamats und anderer Säureadditionssalze ähnlicher Art erhalten werden. Außerdem bildet Bromtetracyelin einbasische und zweibasische Salze mit Basen, beispielsweise mit Basen der Alkali- oder Erdalkalimetalle sowie mit Ammonium- und Aminbasen. Einzelne Beispiele hierfür sind die Salze mit Calcium, Barium, Strontium, Magnesium, Äthylendiamin, Triäthylamin, Piperidin, Kalium und Lithium. Salze oder eigentlich Komplexsalze werden von Bromtetracyclin auch mit basischen Salzen der Borsäure, beispielsweise Natriumbotat, gebildet.Bromtetracycline has the gross formula C22 H23 N2 08 Br and the following structural formula Bromtetracycline as a free base reacts amphoterically and forms salts with both acids and bases. It forms, for example, addition salts with organic and inorganic acids and can be obtained in the form of the hydrochloride, hydrobromide, sulfate, borate, nitrate, phosphate, ascorbate, citrate, succinate, acetate, sulfamate and other acid addition salts of a similar type. In addition, bromotetracyelin forms monobasic and dibasic salts with bases, for example with bases of the alkali or alkaline earth metals and with ammonium and amine bases. Individual examples are the salts with calcium, barium, strontium, magnesium, ethylenediamine, triethylamine, piperidine, potassium and lithium. Salts, or actually complex salts, are also formed by bromotetracycline with basic salts of boric acid, for example sodium botate.

Salze der im vorstehenden beschriebenen Art sind bei Isolierungs- und Reinigungsverfahren wertvoll, da sie durch Neutralisation oder doppelte Umsetzung in die freie amphotere Substanz oder aus einer Form in andere Formen übergeführt werden können. Derartige Salze besitzen außerdem antiseptische und therapeutische Eigenschaften. Die Löslichkeit des Bromtetracyclins in Wasser verändert sich mit dem p"-Wert: sie steigt an, wenn der pH-Wert von etwa 6 entweder erhöht oder erniedrigt wird. Die bei einem dazwischenliegenden pH-Wert in Wasser am wenigsten lösliche Form wird als isoelektrisch oder amphoter oder als freie Base bezeichnet. Durch Prüfungen in vitro wurde gefunden, daß die genannten Säure- und Basensalze sowie die isoelektrische Substanz oder freie Base gegenüber einer großen Zahl Bakterien, die sowohl die grampositiven als auch die gramnegativen Bakterien umfassen, wirksam sind.Salts of the type described above are in isolation and purification processes are valuable as they are neutralization or double conversion converted into the free amphoteric substance or from one form into other forms can be. Such salts also have antiseptic and therapeutic properties Properties. The solubility of the bromotetracycline in water changes with it the p "value: it increases as the pH either increases or decreases from about 6 will. The least soluble in water at an intermediate pH value Shape is called isoelectric or amphoteric or referred to as a free base. In vitro tests have shown that the acid and base salts mentioned as well as the isoelectric substance or free base against a large number of bacteria, which include both the gram positive and gram negative bacteria are.

Die Salze des Bromtetracyclins mit Säuren können leicht durch Auflösen der freien Base in Wasser oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel, das mit einer organischen oder anorganischen Säure angesäuert ist, hergestellt werden. In entsprechender Weise werden die Salze mit Basen durch Zugabe einer organischen oder anorganischen Base zu einer Lösung der freien Base gebildet.The salts of the Bromtetracyclins with acids can easily by dissolving the free base in water or another suitable solvent that is with a organic or inorganic acid is acidified. In appropriate Way are the salts with bases by adding an organic or inorganic Base formed into a solution of the free base.

Bromtetracyclin kann von bereits bekannten Antibiotika in vieler Hinsicht unterschieden werden. Eine chemische Analyse der freien Base ergibt, daß das Antibiotikum folgende Elemente enthält: Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Brom. Auf Grund des Fehlens von Schwefel oder Chlor unterscheidet es sich von vielen anderen, insbesondere vom chlorhaltigen Chlortetracyclin.Bromtetracycline can be different from already known antibiotics in many ways can be distinguished. Chemical analysis of the free base reveals that the antibiotic is Contains the following elements: carbon, hydrogen, nitrogen, and oxygen Bromine. It differs from many due to the lack of sulfur or chlorine others, especially from the chlorine-containing chlorotetracycline.

Wie für viele organische Verbindungen charakteristisch, hängen auch die Eigenschaften von kristallinem Bromtetracyclin in einigem Ausmaße vom Reinheitsgrad und der Art und Weise, in welcher die Kristalle gebildet werden, ab. Beim Fällen aus wasserhaltigen Lösungen entsteht die freie Base.As is characteristic of many organic compounds, they also depend the properties of crystalline bromotetracycline to some extent on the degree of purity and the manner in which the crystals are formed. When felling The free base is formed from aqueous solutions.

Charakteristische Infrarotabsorptionsspektra von einer Probe der in Kohlenwasserstofföl aufgeschlämmten freien Base zeigen die folgenden Merkmale: OH- und/oder NH-Absorptionsbanden nahe bei 3460 cm-' und 3320 cm-'; eine schwache Phenyl-CH-Valenzschwingung nahe bei 3050 cm-'; eine mögliche Amidcarbonyl-(C = O-Valenz)-bande nahe bei 1645 cm-'; eine mögliche C = C-Valenzschwingung nahe bei 1610 cm-'; eine mögliche NH-Knickschwingung nahe bei 1575 cm-'; eine Bande von substituiertem Phenyl mit zwei nebeneinanderliegenden CH-Gruppen im Ring nahe bei 1525 cm-'- und eine Absorption nahe bei 830 cm-', die zwei nebeneinanderliegenden CH-Gruppen, die an einem Phenylring verbleiben (p-Substitution), zugeordnet werden kann. Das Infrarotspektrum dieser Verbindung zeigt, obwohl es dem der freien Base von Chlortetracyclin in vieler Hinsicht ähnlich ist, wie beispielsweise in den Absorptionsbanden beiderseits 950 cm-', Unterschiede, die z. B. darin bestehen, daß ein Absorptions-Triplett, das dem bei Chlortetracyclin bei 800 cm -i vorhandenen entspricht, fehlt, und Unterschiede in den Verhältnissen der Absorptionsintensitäten, wie sie bei geringen Unterschieden im Molekül zu erwarten sind.Characteristic infrared absorption spectra of a sample of the in Hydrocarbon oil slurried free base show the following characteristics: OH- and / or NH absorption bands near 3460 cm- 'and 3320 cm-'; a weak phenyl CH stretching vibration close to 3050 cm- '; a possible amide carbonyl (C = O valence) band near 1645 cm-'; a possible C = C stretching vibration near 1610 cm- '; a possible NH buckling oscillation close to 1575 cm- '; a band of substituted phenyl with two adjacent CH groups in the ring near 1525 cm -'- and an absorption near 830 cm- ', the two adjacent CH groups that remain on a phenyl ring (p-substitution), can be assigned. The infrared spectrum of this compound shows, though is similar to that of the chlorotetracycline free base in many respects, such as, for example in the absorption bands on both sides 950 cm- ', differences that z. B. consist of that an absorption triplet, which is present in chlorotetracycline at 800 cm -i corresponds, absent, and differences in the ratios of the absorption intensities, as to be expected with small differences in the molecule.

Das antibiotische Wirkungsspektrum des Bromtetracyclins gleicht in vieler Hinsicht dem des Chlortetracyclins.The antibiotic spectrum of activity of the bromotetracycline is similar to in many ways that of chlorotetracycline.

Es wurde gefunden, daß es während der Fermentation wünschenswert ist, die obenerwähnten Organismen unter submersen aeroben Bedingungen unter geeigneter Belüftung und Bewegung zu züchten, beispielsweise in einem Kolben auf einer Schüttelmaschine oder in einem mit Rührer versehenen Fermentationsgefäß, das mit einer Vorrichtung zur kontinuierlichen Einführung eines feinverteilten Luftstroms ausgestattet ist. Die Temperatur scheint innerhalb des Bereichs von 25 bis 35°C nicht kritisch zu sein, obwohl der Bereich von 30 bis 33°C vorzuziehen ist. Das ursprüngliche pg des Mediums sollte nahezu neutral sein, obwohl auch in Medien mit ursprünglichen p$ Werten bis herab zu 5,0 oder bis hinauf zu 8,5 eine gewisse Menge Antibiotikum erzeugt wird.It has been found that during fermentation it is desirable the above-mentioned organisms under submerged aerobic conditions under appropriate conditions To breed ventilation and movement, for example, in a flask on a shaker or in a fermentation vessel provided with a stirrer, which is equipped with a device is equipped for the continuous introduction of a finely divided air flow. The temperature does not appear to be critical within the range of 25 to 35 ° C although the range of 30 to 33 ° C is preferable. The original pg des Medium should be almost neutral, although also in media with original p $ Values down to 5.0 or up to 8.5 will produce some amount of antibiotic will.

Ein für die Erzeugung von Bromtetracyclin geeignetes Fermentationsmedium enthält eine Kohlenstoffquelle, beispielsweise ein assimilierbares Kohlehydrat, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, anorganische Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalze usw., und Quellen für die üblichen Spurenelemente. Gewöhnlich werden auch Puffer zugegeben. Eine Bromionenquelle wird zugegeben, so daß wenigstens 50 Teile/Million Bromionen vorhanden sind, wobei die maximale Menge für eine zufriedenstellende Durchführung etwa 1500 Teile/ Million nicht übersteigt. Der Chlorionengehalt soll so niedrig wie möglich sein und 50 Teile/Million, vorzugsweise 10 Teile/Million, nicht übersteigen.A fermentation medium suitable for the production of bromotetracycline contains a source of carbon, such as an assimilable carbohydrate, a source of assimilable nitrogen, inorganic salts such as phosphates, magnesium salts etc., and sources for the usual trace elements. Usually buffers are also used admitted. A source of bromine ions is added so that it is at least 50 parts per million Bromine ions are present, the maximum amount being the maximum for satisfactory performance does not exceed about 1500 parts / million. The chlorine ion content is said to be so low be as possible and not exceed 50 parts / million, preferably 10 parts / million.

Die Kohlenstoffquelle kann entweder ein lösliches Kohlehydrat, wie Saccharose, oder ein unlösliches Kohlehydrat wie Stärke, beispielsweise Maisstärke, sein. Auch Dextrin kann verwendet werden. Obwohl Saccharose, ein löslicher Zucker, recht befriedigend ist, "sind Laktose und Glukose, zwei andere lösliche Zucker, verhältnismäßig schlecht. Die Menge der Kohlenstoffquelle kann in weiten Gr2nzen von etwa 0,5 bis 10,0 Gewichtsprozent des Gesamtgewichts des Fermentationsmediums variieren.The carbon source can either be a soluble carbohydrate, such as Sucrose, or an insoluble carbohydrate such as starch, for example corn starch, be. Dextrin can also be used. Although sucrose, a soluble sugar, is quite satisfactory, "are lactose and glucose, two other soluble sugars, relatively bad. The amount of the carbon source can be within wide limits from about 0.5 to 10.0 weight percent of the total weight of the fermentation medium vary.

Als Quelle für assimilierbaren Stickstoff eignen sich die anorganischen Ammoniumsalze. Hierunter fallen Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat usw. Es ist auch möglich, organische Stickstoffquellen zu verwenden, beispielsweise die Aminosäuren und verschiedene eiweißartige natürliche Materalien.Inorganic ones are suitable as a source of assimilable nitrogen Ammonium salts. This includes ammonium sulfate, ammonium phosphate, etc. It is too possible to use organic nitrogen sources, for example the amino acids and various proteinaceous natural materials.

Zu den als vorteilhaft befundenen anorganischenSalzen gehören auch Phosphate, die entweder als Ammoniumphosphat oder als Metallphosphat, beispielsweise als Kallumphosphat, vorliegen können, Magnesiumsulfat und eine Quelle für Kalium, wenn dieses nicht schon anwesend ist, beispielsweise als Kaliumphosphat.Inorganic salts found beneficial also include Phosphates, either as ammonium phosphate or as metal phosphate, for example as potassium phosphate, magnesium sulfate and a source of potassium, if this is not already present, for example as potassium phosphate.

Die Zugabe von geringen Mengen von Schwermetallen ist wünschenswert, wenn sie nicht bereits in anderen Ingredientien vorliegen. Zu diesen Spurenelementen, die als Verunreinigungen oder Zusätze vorhanden sind, gehören unter anderem Kupfer, Zink, Mangan, Eisen und Chrom.The addition of small amounts of heavy metals is desirable, if they are not already present in other ingredients. To these trace elements, that are present as impurities or additives include copper, Zinc, manganese, iron and chromium.

Als Puffermittel können unter anderem Calciumcarbonat und Salze organischer Säuren, beispielsweise die Citrate, Acetate und Lactate, verwendet werden, die zur Aufrechterhaltung des p,1-Wertes in dem zulässigen Bereich dienlich sind. Die organischen Säuren können außerdem bei dem Stoffwechsel des Mikroorganismus als Kohlenstoffquellen dienen. Die Verwendung eines Entschäumungsmittels ist bei den bei der technischen Durchführung verwendeten Fermentationsgefäßen wünschenswert, obwohl bei dieser Fermentation das Schäumen nicht gerade ein besonders schwieriges Problem darstellt und leicht durch Verwendung üblicher Entschäumungsmittel wie Octadecanol in Specköl oder eines anderen geeigneten handelsüblichen Entschäumers gesteuert werden kann.Calcium carbonate and organic salts can be used as buffering agents Acids, for example the citrates, acetates and lactates, are used which are used for Maintaining the p, 1 value in the permissible range are useful. The organic Acids can also be used as sources of carbon in the metabolism of the microorganism to serve. The use of a defoaming agent is in the technical It is desirable to carry out fermentation vessels used, although in this fermentation foaming is not exactly a particularly difficult problem and easy by using common defoaming agents such as octadecanol in lard oil or one other suitable commercially available defoamer can be controlled.

Mikroorganismen von Streptomyces aurefaciens können in zwei allgemeine Kategorien aufgeteilt werden, nämlich in reinigende und nichtreinigende Stämme.Streptomyces aurefaciens microorganisms can fall into two general categories Categories are divided, namely into cleaning and non-cleaning strains.

Die Reiniger besitzen die Neigung, alle in dem Medium vorhandenen Chlorionen unter Bildung von Chlortetracyclin zu verwerten. In Abwesenheit von Chlorid neigen die Organismen zurVerwendung vonBromid, wenn solches vorhanden ist, und bilden Bromtetracyclin. In jedem Fall wird etwas Tetracyclin gebildet, selbst in Gegenwart eines Chlorionenüberschusses. Welches Antibiotikum gebildet wird, hängt von den in dem Medium vorherrschenden Bedingungen ab. Ein reinigender Stamm wie S-77 wird in einem chloridhaltigen, aber bromidfreien Medium Chlortetracyclin und eine geringe :Menge Tetracyclin bilden. In einem chloridfreien bromidhaltigen Medium werdenBromtetracyclin undTetracyclin gebildet, letzteres in wesentlich größeren Mengen als in einer Chloridfermentation. Die Größenordnung der Affinität des Organismus ist derart, daß vorzugsweise Chlortetracyclin erzeugt wird, wobei Tetracyclin an zweiter und Bromtetracyclin an dritter Stelle steht.The cleaners have a tendency to remove all that is present in the medium Utilize chlorine ions with the formation of chlorotetracycline. In the absence of chloride the organisms tend to use bromide, if present, and form Brometracycline. In either case, some tetracycline is formed, even in the presence an excess of chlorine ions. Which antibiotic is made depends on the conditions prevailing in the medium. A purifying strain like S-77 becomes in a chloride-containing, but bromide-free medium, chlortetracycline and a low : Make amount of tetracycline. In a chloride-free bromide-containing medium, brometracycline and tetracycline is formed, the latter in much larger quantities than in a chloride fermentation. The order of magnitude of the affinity of the organism is such that preferably Chlortetracycline is produced, with tetracycline second and bromotetracycline is in third place.

In Gegenwart begrenzter Chloridmengen und eines Bromidüberschusses wird der Organismus zuerst das Chlorid verwerten und dann erst Bromtetracyclin zu erzeugen beginnen. Wiederum wird etwas Tetracyclin gebildet. In Gegenwart eines Überschusses an Chlorid und Bromid wird keine merkliche Menge Bromtetracyclin gebildet, das Bromid zeigt jedoch eine chloridinhibierende Wirkung und kann so das Verhältnis von Tetracycin zu Chlortetracyclin erhöhen.In the presence of limited amounts of chloride and an excess of bromide the organism will first utilize the chloride and only then will it add brometracycline begin to generate. Again some tetracycline is formed. In the presence of one If there is an excess of chloride and bromide, no noticeable amount of brometracycline is formed, however, the bromide shows a chlorine-inhibiting effect and can thus reduce the ratio increase from tetracycine to chlortetracycline.

Nichtreinigende Stämme verhalten sich abweichend. Sie bilden unter keinen Bedingungen Bromtetracyclin, ob nun Chlorid zugegen oder abwesend ist. Es werden mäßige Mengen Tetracyclin erzeugt, und bei Gegenwart von Chlorid wird außerdem etwas Chloridtetracyclin gebildet.Non-cleaning strains behave differently. They educate under no conditions of bromotetracycline, whether chloride is present or absent. It moderate amounts of tetracycline are produced and, in the presence of chloride, also some chloride tetracycline was formed.

Aus dem Vorstehenden wird deutlich, daß eine Bromtetracylinerzeugung von Bedeutung nur mittels eines chloridreinigenden Stammes und nur in Abwesenheit oder bei Begrenzung von Chlorid erreicht werden kann.From the foregoing, it is clear that bromotetracylin generation of importance only by means of a chloride-cleaning strain and only in its absence or with limitation of chloride can be achieved.

Es gibt viele Möglichkeiten, den Chlorionengehalt auf einen bestimmten Wert einzustellen. Eine Möglichkeit besteht darin, Chlorid in einem inaktiven Komplex zu binden. Gute Ergebnisse wurden durch Verwendung von destilliertem Wasser und durch Verwendung von chloridfreien Bestandteilen im Medium erzielt. Sogenannte synthetische Medien, für die weiter unten Beispiele angeführt werden, erfüllen diesen Zweck. Viele der für Fermentationsmedien oft verwendeten natürlichen Stoffe enthalten Chlorid. Ihre Verwendung ist nichtsdestoweniger möglich, wenn sie zuvor durch Behandlung mit Ionenaustauschern oder anderen geeigneten Mitteln zur Entfernung von Chlorionen deionisiert werden. Es wurde nun ein synthetisches Medium entwickelt, das im wesentlichen chloridfrei ist, überragende Ausbeuten erzeugt, leicht herzustellen, billig und gleichbeleibend in der Zusammensetzung ist. Dieses Medium enthält im allgemeinen Saccharose als Kohlehydrat, Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle, Kaliumphosphat als anorganisches Salz, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Natriumcitrat und Essigsäure als Puffermittel und Kupfersulfat, Zinksulfat und Mangansulfat in geringen Mengen als Quellen für Spurenelemente. Es werden im wesentlichen chloridfreie Sorten dieser Materialien ausgewählt, außerdem wird destilliertes Wasser verwendet, so daß dieses Medium nicht mehr als 1 Teil/Million an Chlorid enthält. Dann wird eine Quelle für Bromionen zugegeben.There are many ways of reducing the chlorine ion content to a particular one Set value. One way is to use chloride in an inactive complex to tie. Good results have been obtained by using distilled water and achieved by using chloride-free components in the medium. So-called synthetic Media, for which examples are given below, serve this purpose. Many of the natural substances often used in fermentation media contain chloride. Their use is nonetheless possible if they have been treated beforehand with ion exchangers or other suitable means for removing chlorine ions be deionized. A synthetic medium has now been developed that essentially is chloride free, produces superior yields, is easy to manufacture, cheap and is the same in composition. This medium generally contains Sucrose as a carbohydrate, ammonium sulfate as a nitrogen source, potassium phosphate as an inorganic salt, magnesium sulfate, calcium carbonate, sodium citrate and acetic acid as a buffering agent and copper sulfate, zinc sulfate and manganese sulfate in small amounts as sources of trace elements. There are essentially chloride-free varieties of these Materials selected, in addition, distilled water is used so that this Medium does not contain more than 1 part / million of chloride. Then becomes a source for Bromine ions added.

Das Impfmaterial für die Fermentation kann aus einer Züchtung, die auf mit Streptomyces aureofaciens beimpften Schrägkulturen erhalten wurden, hergestellt werden. Ein für die Schrägkultur geeignetes Medium ist Waksman-Agar mit der folgenden Zusammensetzung: Glukose....................... 10 g/1 Pepton ....................... 5 g/l K HZ P 04 . . . . . . . . .`. ***"*'*'**« 1 g/1 Mg S 04 . 7 HZ 0 . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 g/1 Agar ......................... 20 g/1 Die Schrägkultur kann in Schüttelkolben übergeführt werden, die als Laboratoriums-Fermentationsgefäße im kleinen Maßstab oder zur Erzeugung von Impfmaterial zur Beimpfung größerer Fermentationen verwendet werden.The inoculum for fermentation can be obtained from a culture that on slants inoculated with Streptomyces aureofaciens will. A medium suitable for the slant culture is Waksman agar with the following Composition: Glucose ....................... 10 g / 1 peptone ................... .... 5 g / l K HZ P 04. . . . . . . . .`. *** "* '*' **« 1 g / 1 mg S 04.7 HZ 0...... . . . . . . . . . . . 0.5 g / 1 agar ......................... 20 g / 1 the slant culture can be transferred to shake flasks that serve as laboratory fermentation vessels on a small scale or for the production of inoculum for inoculating larger fermentations be used.

Es können Luftgeschwindigkeiten, die 0,5 bis 1,5 Volumina frischer Luft je Volumen des flüssigen Mediums gleich sind, je nach Größe des Fermentationsgefäßes angewendet werden. Das Schäumen der Brühe kann durch sterile Zugabe eines Entschäumungsmittels, wie Specköl mit einem Gehalt von 2 0/a Octadecanol, gesteuert werden. Gewinnung und Reinigung Das bei der Fermentation gebildete Produkt ist eine Mischung aus Bromtetracyclin und Tetracyclin. Die Gewinnung von Bromtetracyclin und Tetracyclin aus dem Fermentationsmedium kann auf verschiedenen Wegen durchgeführt werden. Beispielsweise kann das fermentierte Material direkt zu Tierfutter zugesetzt werden, wodurch ein zur Wachstumsstimulierung und/oder zur Unterbindung von Krankheiten besonders geeignetes Produkt geschaffen wird. Wenn das Mycel und die unlöslichen Bestandteile unerwünscht sind, kann das Fermentationsmedium mit oder ohne Ansäuern abfiltriert und die klare Flüssigkeit dem Trinkwasser oder Tierfutter für die gleichen Zwecke zugesetzt werden. Gewünschtenfalls kann die das Brometracyclin und Tetracyclin enthaltende Flüssigkeit unter vermindertem Druck durch Sprühtrocknung konzentriert werden und das Antibiotikum in roher Form zur Wachstumsstimulierung oder zur Steuerung der Krankheitsbehandlung bei Menschen, Tieren oder Geflügel verwendet werden.There can be air velocities that are 0.5 to 1.5 volumes fresher Air per volume of the liquid medium are the same, depending on the size of the fermentation vessel be applied. The foaming of the broth can be achieved by sterile addition of a defoaming agent, such as lard oil with a content of 2 0 / a octadecanol, can be controlled. Extraction and purification The product formed during fermentation is a mixture of bromotetracycline and tetracycline. The recovery of bromotetracycline and tetracycline from the fermentation medium can be done in a number of ways. For example, the fermented Material can be added directly to animal feed, thereby stimulating growth and / or created a particularly suitable product for the prevention of diseases will. If the mycelium and insolubles are undesirable, that can Fermentation medium with or without acidification filtered off and the clear liquid be added to drinking water or animal feed for the same purposes. If so desired the liquid containing the brometracycline and tetracycline can be reduced Pressure can be concentrated by spray drying and the antibiotic in raw form to stimulate growth or to control disease treatment in humans, Animals or poultry.

Wenn Bromtetracyclin und Tetracyclin in einem höhergereinigten Zustand erhalten werden sollen, können sie aus dem Fermentationsmedium mittels verschiedener Verfahren isoliert werden, die eine oder mehrere der folgenden Stufen in verschiedener Reihenfolge umfassen: Adsorption, Eluieren, Lösungsmittelextraktion mit oder ohne Träger, Kristallisation, Fällung in Form von unlöslichen Salzen, beispielsweise des Calcium-m, Barium-, Strontium- oder Magnesiumsalzes bei p11-Werten oberhalb von etwa 6,5 oder als unlösliche Salze mit Sulfaten oder Sulfonsäure des Netzmittel- oder Azofarbstofftyps; oder sie können in Lösungsmitteln extrahiert werden, mit Trägern wie Sulfaten oder Sulfonaten vom Netzmittel-oder Azofarbstofftyp. Bromtetracyclin und Tetracyclin können aus der rohen Maische durch Ansäuern auf ein pH von etwa 3 oder weniger abgetrennt werden. Bromtetracyclin und Tetracyclin gehen in die wäßrige Schicht, und die unlöslichen Feststoffe können abgetrennt und entfernt werden. Bei einem p11-Wert oberhalb von etwa 6,5 können Bromtetracyclin und Tetracyclin in wäßrigen Lösungen als Erdalkaliniederschlag gefällt werden. Dieser Niederschlag kann mit angesäuertem Wasser oder mit organischen Lösungsmitteln, wie Alkoholen, Alkoxyalkaholen oder Ketonen, extrahiert werden. Die Extraktion kann unter sauren, neutralen oder basischen Bedingungen durchgeführt werden. In gleicher Weise kann die Bromtetracyclin und Tetracyclin enthaltende wäßrige Lösung mittels mit der wäßrigen Schicht nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln extrahiert werden, beispielsweise mit mit der wäßrigen Schicht nicht mischbaren niedrigermolekularen Alkoholen, Alkoxyalkanolen, Estern und Ketonen. Von bekannten Lösungsmitteln wie Butanol, Chloroform und Äthylacetat wird Butanol bei der Tetracyclin-Extraktion bevorzugt. Gewisse Alkohole wie Isopropanol, die zwar mit Wasser mischbar, aber mit einer Salzlösung nicht mischbar sind, können ebenfalls gut verwendet werden. Die Zugabe eines wasserlöslichen, in der organischenSchiehtunlöslichenSalzes, wie einAmmonium-oder Aminsalz oder Alkalihalogenide und -sulfate, ist bei der Extraktion förderlich.When bromotracycline and tetracycline are in a more highly purified state are to be obtained, they can be obtained from the fermentation medium by means of various Processes can be isolated that involve one or more of the following stages in various Order include: adsorption, elution, solvent extraction with or without Carrier, crystallization, precipitation in the form of insoluble salts, for example of the calcium-m, barium, strontium or magnesium salt at p11 values above of about 6.5 or as insoluble salts with sulfates or sulfonic acid of the wetting agent or azo dye type; or they can be extracted using solvents Carriers such as sulfates or sulfonates of the wetting agent or azo dye type. Brometracycline and tetracycline can be made from the raw mash by acidification to a pH of about 3 or less can be disconnected. Brometracycline and tetracycline go into the aqueous Layer, and the insoluble solids can be separated and removed. at a p11 value above about 6.5 can bromotetracycline and tetracycline in aqueous Solutions are precipitated as alkaline earth precipitation. This precipitation can with acidified water or with organic solvents such as alcohols, alkoxy alcohols or ketones. The extraction can be carried out under acidic, neutral or basic conditions are carried out. In the same way can the bromotetracycline and aqueous solution containing tetracycline does not use the aqueous layer miscible organic solvents are extracted, for example with the aqueous layer immiscible lower molecular weight alcohols, alkoxyalkanols, Esters and ketones. From known solvents such as butanol, chloroform and ethyl acetate butanol is preferred for tetracycline extraction. Certain alcohols such as isopropanol, which can be mixed with water, but immiscible with a saline solution can also be used well. The addition of a water-soluble salt that is insoluble in the organic layer, like an ammonium or amine salt or alkali halides and sulfates, is in the extraction conducive.

Bromtetracyclin und Tetracyclin können aus wäßrigen Lösungen durch die Zugabe von Ammoniak oder Aminen oder wasserlöslichen Alkalihalogeniden und -sulfaten ausgefällt werden. Das Aussalzen kann durch einen geringen Anteil eines organischen Lösungsmittels unterstützt werden. Wenn Chlortetracyclin in der Fermentationsmaische zugegen ist, so durchläuft es diese Verfahrensstufen zusammen mit Bromtetracyclin und Tetracyclin.Bromtetracycline and tetracycline can be obtained from aqueous solutions the addition of ammonia or amines or water-soluble alkali halides and sulfates be precipitated. The salting out can be done with a small amount of an organic Solvent are supported. When chlortetracycline is in the If fermentation mash is present, it goes through these process steps together with bromotetracycline and tetracycline.

Weiterhin wurde eine neuartige Gewinnungsmethode entwickelt, die sowohl hinsichtlich der Gewinnung eines von inaktiven Verunreinigungen freien Produktes als auch hinsichtlich der Gewinnung eines Produktes, das keine anderen antibiotischen Substanzen, die in dem Medium gleichzeitig gebildet werden, enthält, außerordentlich wirksam ist. Diese Gewinnungsmethode liefert ein kristallisiertes Produkt, das bezüglich dieser beiden Gesichtspunkte einen hohen Reinheitsgrad aufweist. Sie umfaßt als Hauptmerkmale die Verwendung von quartären Ammoniumsalzen, die Tetracyclin bei einem alkalischen p11-Wert (pH 8 bis 11) als quartäre Ammoniumsalze des Bromtetracyclins und Tetracyclins selektiv aus der Brühe ausfällen. Ein solches Salz wird dann nach dem Abfiltrieren mit einer geringen Menge Wasser und einer verhältnismäßig großen Menge Chloroform aufgeschlämmt, wodurch die quartären Ammoniumsalze von Bromtetracyclin und Tetracyclin in der Chloroformphase der Aufschlämmung gelöst werden. Die Wasser- und Chloroformphasen werden dann vorzugsweise getrennt, um jegliche in Wasser gelöste Verunreinigungen zu entfernen. Dann werden Bromtetracyclin und Tetracyclin mit einer wäßrigen sauren Lösung bei einem pH-Wert von etwa 1 bis 2,5 extrahiert unter Bildung der Säuresalze von Bromtetracyclin und Tetracyclin, die in der wäßrigen Phase in Lösung gehen. Nach der Erhöhung des p11-Wertes auf einen Bereich von 3 bis 7 werden sie aus dieser Lösung als kristallisiertes Produkt gefällt, wobei die Fällung bei dem niedrigeren pH-Wert einsetzt.Furthermore, a new extraction method was developed, which both with regard to obtaining a product free of inactive impurities as well as in terms of obtaining a product that is no other antibiotic Substances that are simultaneously formed in the medium contains extraordinary is effective. This recovery method yields a crystallized product that is related to of these two aspects has a high degree of purity. It includes as Main features the use of quaternary ammonium salts, the tetracycline in one alkaline p11 value (pH 8 to 11) as quaternary ammonium salts of bromotracycline and selectively precipitate tetracyclines from the broth. Such a salt is then used after filtering off with a small amount of water and a relatively large amount Amount of chloroform slurried, causing the quaternary ammonium salts of bromotetracycline and tetracycline are dissolved in the chloroform phase of the slurry. The water- and chloroform phases are then preferably separated to remove any dissolved in water To remove impurities. Then brometracycline and tetracycline with one aqueous acidic solution at a pH of about 1 to 2.5 extracted to form the acid salts of bromotetracycline and tetracycline, which in the aqueous phase in Solution go. After increasing the p11 value to a range from 3 to 7 they precipitated from this solution as a crystallized product, with the precipitation at the lower pH value sets in.

Die bei dieser Gewinnungsmethode besonders gut verwendbaren quartären Ammoniumsalze sind Alkyltrimethylammoniumchloride und Dialkyldimethylammoniurrichloride, worin die Alkylgruppe von 8 bis 18 (einschließlich) Kohlenstoffatome enthält.The quaternary which can be used particularly well in this extraction method Ammonium salts are alkyltrimethylammonium chlorides and dialkyldimethylammonium dichlorides, wherein the alkyl group contains from 8 to 18 carbon atoms (inclusive).

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken. Beispiel 1 Durch Behandlung von 5 g Kasein mit 0,85 ml Schwefelsäure in 100 m1 Wasser unter Rühren bei 50°C während 60 Minuten und bei 120°C während 120 Minuten in einem Autoklav wird ein Kaseinabbauprodukt gebildet. Das abgebaute Kasein wird mit wäßrigem Ammoniak bis zu einem pg von 6,0 neutralisiert, wofür etwa 2,5 ml erforderlich sind.The following examples are intended to explain the invention in more detail, without to restrict them. Example 1 By treating 5 g of casein with 0.85 ml of sulfuric acid in 100 ml of water with stirring at 50 ° C for 60 minutes and at 120 ° C during A casein degradation product is formed for 120 minutes in an autoclave. The degraded Casein is neutralized with aqueous ammonia to a pg of 6.0, for which about 2.5 ml are required.

Es wurde ein Grundmedium hergestellt, das außer dem aus 5 g Kasein hergestellten Kaseinabbauprodukt folgende Bestandteile in den angegebenen Mengen in Liter enthält Magnesiumlactat . . . . . . . . . . . . ...... 3,5 g Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,5 g NaH,P04 . H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,2 g Saccharose......................... 15,0 g Fe S 04 . 711,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40,0 mg CuSO4 - 511,0 . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . 32,0 mg Mn S O,, .4H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0 mg Zn S 04.7H2 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0 mg Cobaltacetat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 mg In dieses Medium wird Kaliumbromid in den angegebenen Mengen eingeführt, wobei die folgenden Aktivitäten erhalten wurden Kaliumbromid Antibiotische Aktivität grl Einheiten 0,1 .................... 415 0,2 ....:............... 450 0,4 ..... .............. 430 Die bei der Prüfung festgestellten Einheiten stellen die antibiotische Aktivität gegenüber Staphylococcus aureus dar, die derjenigen von 1 #tg/ml Chlortetracyclin entspricht. Die Fermentation wird 72 Stunden bei 27'C unter Bewegung und Belüftung geführt. Beispiel 2 Bei einem ähnlichen Versuch wird nach einem Wachstum von 48 Stunden eine Analyse der Materialien durchgeführt. Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten: Kaliumbromid Antibiotische Aktivität g,.1 Einheiten 0,1 .... ............... 330 0,2 .................... 305 0,4 .................... 290 Beispiel 3 Es wurde ein Medium mit einem minimalen Halogenidgehalt mit der folgenden Zusammensetzung in mg/1 bereitet Saccharose............... ........... 30 000 n,z-Alanin .......................... 450 z-Arginin ........................... 570 n,z-Methionin ....................... 200 r,-Glutaminsäure ..................... 260 z-Histidin........................... 200 v,z-ß-Asparagin ............... . ... 200 (N HJ, S 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2000 Magnesiumlactat .................... 5000 N H4 H2 P 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2000 Kaliumlactat . . . . . . . . . . . . . . . . . ...... 2000 M9H4 (P 04)2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5000 FeS04.7H20 ...................... 60 Zn S 04 7H20 .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 Mn S 04 . 11,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Cu S 04 - 5H,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Co (C H3 C 02) 2 .6H20 . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Die Lösung wird mit über Natriumhydroxyd destilliertem Wasser auf 1 1 gebracht. Alle Bestandteile außer Calciumcarbonat werden gelöst, das pl, mit 3n-Ammoniakwasser (etwa 3 m1/1) auf einen Wert zwischen 6,2 und 6,3 eingestellt und das Calciumcarbonat zugesetzt. Das Medium gibt mit Salpetersäure und Silbernitrat keinen Niederschlag, was zeigt, daß die Chlorionenkonzentration unterhalb von 0,17 mg/1 liegt.A basic medium was prepared which, in addition to the casein breakdown product prepared from 5 g of casein, contains the following components in the stated quantities in liters: magnesium lactate. . . . . . . . . . . . ...... 3.5 g calcium carbonate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5 g NaH, P04. H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 g sucrose ......................... 15.0 g Fe S 04. 711.0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40.0 mg CuSO4-511.0 . . . . . ... . . . . . . . . . ... . 32.0 mg Mn SO ,, .4H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20.0 mg Zn S 04.7H2 0. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20.0 mg cobalt acetate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.0 mg Potassium bromide is introduced into this medium in the indicated amounts, whereby the following activities are obtained Potassium bromide Antibiotic activity grl units 0.1 .................... 415 0.2 ....: ............... 450 0.4 ..... .............. 430 The units determined during the test represent the antibiotic activity against Staphylococcus aureus, which corresponds to that of 1 tg / ml chlorotetracycline. The fermentation is carried out for 72 hours at 27 ° C. with agitation and aeration. Example 2 In a similar experiment, an analysis of the materials is performed after 48 hours of growth. The following results were obtained: Potassium bromide Antibiotic activity g, .1 units 0.1 .... ............... 330 0.2 .................... 305 0.4 .................... 290 Example 3 A medium with a minimum halide content was prepared with the following composition in mg / 1 sucrose ................ .......... 30,000 n, z-alanine .......................... 450 z-arginine ... ........................ 570 n, z-methionine .................... ... 200 r, -glutamic acid ..................... 260 z-histidine ................. .......... 200 v, z-ß-asparagine ................ ... 200 (N HJ, S 04 ........................... 2000 Magnesium lactate ............. ....... 5000 N H4 H2 P 04.......................... 2000 Potassium lactate............. ...... ...... 2000 M9H4 (P 04) 2 .......................... 1000 calcium carbonate...... ................. 5000 FeS04.7H20 ...................... 60 Zn S 04 7H20 ... .................... 33 Mn S 04. 11.0........................ 19 Cu S 04-5H, 0 ........................ 5 Co (C H3 C 02) 2 .6H20........... ....... 5 The solution is brought to 1 l with water distilled over sodium hydroxide. All components except calcium carbonate are dissolved, the p 1 with 3N ammonia water (approx 6.3 and the calcium carbonate was added The medium does not precipitate with nitric acid and silver nitrate, which shows that di e chlorine ion concentration is below 0.17 mg / l.

Je 100 ml des Grundmediums werden in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gebracht, mit Wattebäuschchen verschlossen und 15 Minuten bei 120°C im Autöklav gehalten. Je 10 ml steriles destilliertes Wasser werden zu je vier Reagensgläsern mit Schrägagarsporenkulturen gegeben, die Streptomyces aureofaciens in Sporenform enthalten. Die Sporen werden mit einer sterilen Drahtöse behutsam abgekratzt und die Sporensuspensionen vereinigt. Die Kolben werden mit je 5 ml dieser Suspension beimpft und 24 Stunden bei 27°C bewegt, wodurch ein Impfstoff gebildet wird. 6,3 1 des Mediums und 35 ml Mineralöl werden in ein mit einem Rührer und einem Belüfter ausgestattetes Fermentationsgefäß gebracht und sterilisiert. Dann werden sieben 24-Stunden-Impfstoffkolben und 50m1 einer sterilen wäßrigen Lösung, die 0,97 g Kaliumbromid enthält, unter sterilen Bedingungen zu dem Fermentationsgefäß zugesetzt. Die Fermentation wird bei 27,4'C geführt. Die Geschwindigkeit des Rührers beträgt 350 Umdrehungen /Minute, der Luftstrom 71/Minute. Die Luft wird erst durch eine Waschflasche mit Salpetersäure, dann durch Silbernitrat, Wasser und schließlich einen Sterilisationsfilter geleitet. Wenn nötig, wird ein polymeres Silikon-Entschäumungsmittel zugesetzt (General Electric Silicone SS24).100 ml of the basic medium are placed in 500 ml Erlenmeyer flasks, closed with cotton balls and kept in the autoclave at 120 ° C for 15 minutes. 10 ml of sterile distilled water each become four test tubes with slant agar spore cultures which contain Streptomyces aureofaciens in spore form. The spurs will carefully scraped off with a sterile wire loop and the spore suspensions combined. The flasks are inoculated with 5 ml of this suspension each time and at 27 ° C. for 24 hours moved, creating a vaccine. 6.3 1 of the medium and 35 ml of mineral oil are poured into one equipped with a stirrer and an aerator Brought fermentation vessel and sterilized. Then there are seven 24 hour vaccine flasks and 50m1 of a sterile aqueous solution containing 0.97 g of potassium bromide sterile conditions added to the fermentation vessel. The fermentation will led at 27.4'C. The speed of the stirrer is 350 revolutions / minute, the air flow 71 / minute. The air is first through a wash bottle with nitric acid, then passed through silver nitrate, water and finally a sterilization filter. If necessary, a polymeric silicone defoamer is added (General Electric Silicone SS24).

Während das Wachstum fortschreitet, fällt der pH-Wert langsam ab. Die Fermentation wird fortgesetzt, bis der pH-Wert zu fallen aufhört und wieder zu steigen beginnt. Dies dauert etwa 51 Stunden. Die dann vorliegende Lösung besitzt einen p11-Wert von 5,9. Die so erhaltene Maische ergibt 412 Einheiten antibiotischer Aktivität.As the growth progresses, the pH will slowly drop. The fermentation continues until the pH stops falling and again begins to rise. This takes about 51 hours. The then present solution has a p11 value of 5.9. The mash so obtained gives 412 units of antibiotic Activity.

Die Fermentationsmaische enthält sowohl Bromtetracyclin als auch Tetracyclin. Zur Abtrennung des Bromtetracyclins wird die Fermentationsmaische unter Rühren mit konzentrierter Salzsäure auf p$ 1,5 angesäuert. Die Maische wird dann mit 95 g Filterhilfe gerührt und die Mischung abfiltriert.The fermentation mash contains both bromotetracycline and tetracycline. To separate off the bromotetracycline, the fermentation mash is mixed with it while stirring concentrated hydrochloric acid acidified to p $ 1.5. The mash is then covered with 95 g of filter aid stirred and the mixture filtered off.

Der Filterkuchen wird bei 50'C mit 1400 ml destilliertem Wasser aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wird abfiltriert, und die Filtrate werden vereinigt. 94,4"/, der in der Maische enthaltenen Aktivität wird in dem Filtrat gewonnen. Der pH-Wert des Filtrats wird mit 32 ml 50o/oigem Natriumhydroxyd auf 2,5 eingestellt und die Mischung im Vakuum bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 30'C auf ein Endvolumen von 2070 eingeengt. Es hinterbleiben 83,6 % der Aktivität der Maische. Das p$ wird mit konzentrierter Salzsäure auf 1,5 eingestellt und mit 331g Natriumchlorid versetzt. Die Lösung wird zweimal mit je 311 ml n-Butanol und dreimal mit je 207 ml n-Butanol extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und der pH-Wert mit 50o/oigem Natriumhydroxyd auf 2,5 eingestellt. Dann wird die Mischung im Vakuum unter Stickstoff destilliert, wobei Wasser zugegeben wird, bis das gesamte n-Butanol azeotrop abdestilliert ist. Der pH-Wert wird mit konzentrierter Salzsäure auf 1,5 eingestellt, 5 g Filterhilfe werden zugesetzt, und die Mischung wird durch einen Glassintertrichter abfiltriert. Es wird schließlich ein wäßriges Filtrat mit einem Volumen von 1100m1 erhalten, das 70,50/, der Maischenaktivität enthält.The filter cake is slurried at 50 ° C. with 1400 ml of distilled water. The slurry is filtered off and the filtrates are combined. 94.4 "/, of the activity contained in the mash is obtained in the filtrate. The pH of the filtrate is adjusted to 2.5 with 32 ml of 50% sodium hydroxide and the mixture in vacuo at a temperature in the range from 25 to 30 ° C. to a final volume of 2070. 83.6% of the activity of the mash remains. The p $ is adjusted to 1.5 with concentrated hydrochloric acid and mixed with 331 g of sodium chloride. The solution is mixed twice with 311 ml of n-butanol each time and extracted three times with 207 ml of n-butanol each time. The extracts are combined and the pH value is adjusted to 2.5 with 50% sodium hydroxide. The mixture is then distilled in vacuo under nitrogen, with water being added until all of the n The pH is adjusted to 1.5 with concentrated hydrochloric acid, 5 g of filter aid are added, and the mixture is filtered off through a sintered glass funnel 00m1 which contains 70.50 /, the mash activity.

Dieses Filtrat wird mit 41,5 g Bariumchlorid-Dihydrat, die in 119 ml destilliertem Wasser gelöst sind, versetzt. Die Mischung wird eine halbe Stunde gerührt, das pH mit Natriumhydroxyd auf &,5 eingestellt und die Mischung zentrifugiert. Der entstehende Kuchen wird mit 40 ml destilliertem Wasser gewaschen. Der gewaschene Kuchen wird mit 249 ml destilliertem Wasser aufgeschlämmt, das PH mit 50o/oiger Schwefelsäure auf 2,5 gebracht und die Mischung 1 Stunde kräftig gerührt. Dann wird das p$ mit 50o/oiger Schwefelsäure auf 1,5 eingestellt, wieder eine halbe Stunde gerührt und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren zweimal mit 15 ml n/10-Schwefelsäure gewaschen, das erste Mal unter Vermahlen. Die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten, die 260 ml ausmachen, enthalten 62,5 % der Maischeaktivität.This filtrate is mixed with 41.5 g of barium chloride dihydrate, which in 119 ml of distilled water are dissolved. The mixture is half an hour stirred, the pH adjusted to 0.5 with sodium hydroxide and the mixture centrifuged. The resulting cake is washed with 40 ml of distilled water. The washed one Cake is slurried with 249 ml of distilled water, the pH with 50% Bred sulfuric acid to 2.5 and the mixture was stirred vigorously for 1 hour. Then it will be the p $ adjusted to 1.5 with 50% sulfuric acid, again for half an hour stirred and then centrifuged. The precipitate is removed by centrifugation twice washed with 15 ml n / 10 sulfuric acid, the first time with grinding. The United Supernatants, which make up 260 ml, contain 62.5% of the mash activity.

Das oben beschriebene Verfahren wird wiederholt und die beiden überstehenden Flüssigkeitsmengen vereinigt. Das pl, der Mischung wird mit l0o/oigem Natriumhydroxyd auf 3,5 eingestellt, die Mischung 10 Minuten gerührt und zentrifugiert. Der Niederschlag wird mit 10 ml Wasser gewaschen und das Waschwasser der überstehenden Flüssigkeit zugesetzt. Der pH-Wert der vereinigten Lösungen wird mit 10%igem Natriumhydroxyd auf 4,95 eingestellt, dann wird der Niederschlag gesammelt und gewaschen. Der Niederschlag wird gefroren,und das noch verbleibende Wasser durch Sublimation entfernt. Es wurden 2,65 g eines Produktes erhalten, dessen Analyse 490 Aktivitätseinheiten ergab und das 5,43 % Brom enthielt.The procedure described above is repeated and the two remaining ones Amounts of liquid combined. The pl, of the mixture is made with 10% sodium hydroxide adjusted to 3.5, the mixture stirred for 10 minutes and centrifuged. The precipitation is washed with 10 ml of water and the wash water of the supernatant liquid added. The pH of the combined solutions is adjusted with 10% sodium hydroxide adjusted to 4.95, then the precipitate is collected and washed. The precipitation is frozen and the remaining water is removed by sublimation. There were 2.65 g of a product were obtained, the analysis of which showed 490 units of activity and which contained 5.43% bromine.

Eine Gegenstromverteilungsvorrichtung nach Craig mit 30 Rohren wird mit einem Lösungsmittelsystem beschickt, das aus gleichen Volumina destilliertem Wasser und n-Butanol besteht, wobei jeder der beiden Lösungsmittel mit dem anderen gesättigt ist und das mit konzentrierter Salzsäure auf p$ 2,5 eingestellt wird. 1,55 g des gefrorenen und getrockneten Produktes werden mit 160 ml der wäßrigen Phase aufgeschlämmt und der pH-Wert erneut auf 2,5 eingestellt. Nach Zugabe von 160 ml der n-Butanol-Phase wurde das pH unter Rühren wieder auf 2,5 gebracht. Die Mischung wird abfiltriert. Es wird bis zur Trennung der Phasen gewartet und dann 50 ml von jeder Phase in jedes der drei ersten Rohre der Gegenstromverteilungsvorrichtung gebracht. Die übrigen Rohre werden mit 50 ml der mit n-Butanol gesättigten wäßrigen Phase beschickt und die Verteilung durchgeführt, bis sich die obere Phase, anfänglich in Rohr 2, in Rohr 29 im Gleichgewicht befindet. Die Verteilung wird fortgesetzt, bis die obere Phase 18mal aus Rohr 29 abgezogen wurde. Auf diese Weise wird die Aktivität in Rohr 29 angesammelt.A Craig countercurrent distributor with 30 tubes will be used charged with a solvent system that distilled from equal volumes It is composed of water and n-butanol, each of the two solvents with the other is saturated and that is adjusted to p $ 2.5 with concentrated hydrochloric acid. 1.55 g of the frozen and dried product are mixed with 160 ml of the aqueous Phase slurried and the pH again adjusted to 2.5. After adding 160 ml of the n-butanol phase was brought back to pH 2.5 with stirring. the The mixture is filtered off. It is waited until the phases separate and then 50 ml of each phase into each of the first three tubes of the countercurrent distributor brought. The remaining tubes are filled with 50 ml of the aqueous solution saturated with n-butanol Phase charged and the distribution carried out until the upper phase, initially in pipe 2, in pipe 29 is in equilibrium. The distribution continues, until the upper phase has been withdrawn from tube 29 18 times. In this way, the Activity accumulated in tube 29.

Eine spektrophotometrische Prüfung zeigt zweiMaxima; der Mittelpunkt der ersten liegt bei Rohr 12 mit einem optischen Maximum bei 355 bis 365 m#t und der des zweiten bei Rohr 21 mit einem optischen Maximum bei 370 bis 375 m#t. Die Lösungen aus den Rohren 18 bis 29 enthalten den Hauptanteil des Materials mit dem zweiten Spitzenwert. Sie werden vereinigt und im Vakuum unter Stickstoff destilliert, wobei Wasser bei einem pff von 2,5 zugegeben wird, bis 50 ml einer wäßrigen Lösung, die frei von n-Butanol ist, erhalten wird. Der pH-Wert wird mit Salzsäure auf 1,5 eingestellt, Filterhilfe zugefügt und die Mischung abfiltriert. Der pH-Wert der Lösungen wird dann langsam unter Rühren mit 10°/oigem Natriumhydroxyd auf 5,0 gebracht, die :Mischung mit Glasperlen geschüttelt und über Nacht bei 4'C stehengelassen. Die Lösung wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gefroren und getrocknet, wobei 200 mg eines trockenen Produktes erhalten werden. 152 mg dieses Produktes werden in 1,4 ml trockenem 2-Äthoxyäthanol gelöst und abfiltriert. Nach Zugabe von 0,14 ml Wasser wird die Mischung in einen Schüttler gebracht. Das Material kristallisiert aus, und die Kristalle werden abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Die erste Ausbeute beträgt 49 mg Bromtetracyclin.A spectrophotometric test shows two peaks; the middle-point the first is at tube 12 with an optical maximum at 355 to 365 m # t and that of the second at pipe 21 with an optical maximum at 370 to 375 m # t. the Solutions from the tubes 18 to 29 contain the majority of the material with the second peak. They are combined and distilled in vacuo under nitrogen, where water is added at a pff of 2.5, up to 50 ml of an aqueous solution, which is free of n-butanol is obtained. The pH is adjusted to 1.5 with hydrochloric acid set, added filter aid and filtered off the mixture. The pH of the Solutions are then slowly brought to 5.0 with 10% sodium hydroxide while stirring, the: Mixture shaken with glass beads and left to stand at 4'C overnight. The solution is centrifuged and the supernatant liquid is frozen and dried, whereby 200 mg of a dry product are obtained. 152 mg of this product are dissolved in 1.4 ml of dry 2-ethoxyethanol and filtered off. After adding 0.14 ml of water is placed in the mixture on a shaker. The material crystallizes off, and the crystals are filtered off, washed and dried. The first yield is 49 mg of bromotetracycline.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. A process for the production and recovery of brometracycline by biological means, characterized in that an aqueous nutrient medium which contains at least 50 parts of bromine ions per 1 million parts of nutrient medium and has a low chlorine ion content with a bromotetracycline-producing strain of Streptomyces aureofaciens under aerobic conditions Conditions is fermented until the fermented medium contains bromotetracycline as the predominant antibiotic.

2. The method according to claim 1, characterized in that the content of bromine ions 50 to 1500 parts / million.

3. The method according to claims 1 or 2, characterized marked. that the chlorine ions less than 50 parts / million and preferably less than 10 parts / million.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that the fermentation medium, if necessary, a das Bromotetracycline solubilizing agent and then precipitating brometracycline as a salt quaternary ammonium compound is added.

5. The method according to claim 4, characterized characterized in that the quaternary ammonium compound is an alkyltrimethylammonium chloride or a dialkyldimethylammonium chloride is used, each alkyl group being 8 contains up to 18 carbon atoms.

6. The method according to claim 4 or 5, characterized in that that the precipitated quaternary ammonium salts purified by solvent extraction will.

7. The method according to claim 6, characterized in that the solvent extraction is carried out with chloroform in the presence of water. B.

Method according to claim 1 to 3, characterized in that the fermentation medium, if necessary, to bromotetracycline to bring into solution, acidified to a p11 value below 3 and filtered and that Bromtetracycline is obtained from the aqueous solution obtained.

9. Procedure according to Claim 8, characterized in that the pH of the aqueous solution is in the presence of calcium, barium, strontium or magnesium ions to a value between 6 and 10 and the precipitated bromotetracycline is separated.