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Die vorliegende Erfindung betrifft
einen Träger
für die
Diagnostik und/oder Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion sowie
ein Diagnostikverfahren unter Einsatz des genannten Trägers. Treponemainfektionen
können
damit detektiert, bestätigt
und im Krankheitsverlauf kontrolliert werden.
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Die Klinik der Syphilis kann grundsätzlich in unterschiedlichen
Stadien verlaufen, die als Primärsyphilis,
Sekundärsyphilis
und Tertiärsyphilis
bezeichnet werden.
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Ein direkter Erregernachweis ist
lediglich im Primärstadium
eine gute Diagnosemöglichkeit.
Der Nachweis erfolgt hierbei direkt aus der Gewebeprobe und kann
durch Dunkelfeldmikroskopie, direkte Immunfluoreszenz oder eine
Treponema pallidum spezifische PCR durchgeführt werden.
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Serologische Verfahren zum Antikörpernachweis
sind in allen Krankheitsstadien gut möglich. Sie geben Aufschluß über charakteristische
Antikörperkonstellationen,
die Informationen über
die Behandlungsbedürftigkeit
geben.
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Im wesentlichen spielen dabei anti-Treponema
pallidum-spezifische Antikörper
und Antikörper gegen
Cardiolipin eine Rolle.
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Anti-Cardiolipin-Antikörper vom
IgG- oder IgM-Typ können
bei Patienten mit Treponema Infektionen vorkommen und können mit
dem CMT – Test (Cardiolipin – Mikroflockungs – Test,
englisch VDRL Test: Veneral Disease Research Laboratories Test) oder
dem RPR – Test
(Rapid Plasma Reagin-Test) oder dem Cardiolipin Komplement-bindungsreaktions-Test
nachgewiesen werden. Bei diesen Analyseverfahren werden positive
Signale beim Vorhandensein von anti-lipoidalen Antikörpern in
der Probe beobachtet. Der VDRL Test kann bei entsprechenden Probenverdünnungen
quantitativ durchgeführt werden,
so dass ein Titer, bei dem eine deutliche Flockung gerade noch auftritt,
als positiv gewertet wird. Der Test eignet sich gut zur Verlaufskontrolle
und Therapiekontrolle, kann aber auch unspezifisch reagieren. Kreuzreaktionen
treten unter anderem bei Au toimmunerkrankungen auf, wie zum Beispiel
beim Anti-Phospholipid-Syndrom oder beim Systemischen Lupus Erythematodes.
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Anti-Treponema-pallidum-spezifische
Antikörper
können
gegen Proteine aus Treponema pallidum gebildet werden. Der Nachweis
dieser Antikörper
kann als Suchtest, als TPHA (Treponema Pallidum Hämagglutionations
Test), TPPA (Treponema Pallidum Partikel Agglutionations Test) oder
TPLA (Treponema Pallidum Latex Agglutinations Test) durchgeführt werden.
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Die diagnostisch relevanten Proteine
aus Treponema pallidum umfassen unter anderem die Proteine mit Molekulargewichten
von 47 kD, 44,5 kD, 37 kD, 17kD und 15 kD (Labor und Diagnose, Herausgeber:
Lothar Thomas, Seiten 1234 ff., TH-Books Verlagsgesellschaft mbH,
Frankfurt/Main, 2000;
DE19536166 ;
WO8802403; Sambri et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001 May; 8(3):534-9).
In unterschiedlichen marktgängigen
Testen (Innolia Syphilis, Innogenetics, Belgien; Treponema Marblot,
MarDx, USA; Treponema Recomblot, Mikrogen, Deutschland) werden Kombinationen
aus diesen Proteinen auf festphasigen Trägermaterialien immobilisiert. Während der
Inkubation der Probe mit dem beschichteten Trägermaterial können Treponema
pallidum spezifische Antikörper
an die Antigene binden und nachfolgend durch eine immunochemische
Reaktion nachgewiesen werden. Der Nachweis dieser Treponema pallidum
spezifischen Antikörper
kann im Format eines ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) zum
Beispiel als Suchtest für
Syphilis eingesetzt werden oder im Format von Immunoblots als Bestäigungstest
für Syphilis.
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Immunoblots werden daher bei unklaren
Befunden aus den Suchreaktionen, als Bestätigungstests und zur Verlaufskontrolle
eingesetzt.
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Zur Bewertung der Behandlungsbedürftigkeit sind
vor allem Testverfahren zur Bestimmung von anti-Treponema-pallidum-spezifischen
IgM-Antikörpern von
Bedeutung. Typischerweise ist dieser Nachweis mit einem Tp-IgM-FTA
Test (Fluoreszenz Treponema Antikörper-Absorptions-Test) oder
einem Tp-IgM-Elisa oder einem Treponema pallidum IgM Immunoblot möglich.
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Zur serologischen Verlaufskontrolle
und Therapiekontrolle sind vornehmlich Verfahren indiziert, die
eine zumindest semiquantitative Bestimmung von anti Cardiolipin
Antikörpern
beinhalten.
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Die aus dem Stand der Technik bekannten zur
serologischen Bestätigung
geeigneten Nachweisverfahren erlauben keine quantitave Bestimmung
der Antikörper
in der Patientenprobe. Ferner haben sie den Nachteil, dass sie es
praktisch nicht ermöglichen,
zu bestimmen, ob eine Treponemainfektion noch akut oder bereits
abgeklungen ist. Dies beruht unter anderem darauf, dass Antikörper gegen Treponemaantigen
noch sehr lange nachweisbar sind, selbst wenn die eigentliche Infektion – das heißt das Vorliegen
von Erregern – bereits
abgeklungen ist. Ferner sind die Tests aus dem Stand der Technik
teilweise umständlich
von der Verfahrensführung
und somit für
den Routinebereich und Hochdurchsatztechnologien ungeeignet.
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Der vorliegenden Erfindung lag das
technische Problem zugrunde, Mittel und Verfahren anzugeben, die
einerseits möglichst
einfach zu handhaben sind und ferner eine serologische Verlaufskontrolle
des tatsächlichen
Infektionsgrads ermöglichen.
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Das vorliegende Problem wird gelöst durch einen
Träger
für die
Diagnostik und/oder Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion,
der mindestens ein immobilisiertes Cardiolipin und mindestens ein immobilisiertes
Treponema-spezifisches Antigen enthält.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird das Cardiolipin zusammen mit Lecithin und Cholesterin eingesetzt.
Diese Kombination aus Cardiolipin, Lecithin und Cholesterin wird
im Folgenden auch als VDRL-Antigen bezeichnet.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
umfaßt
das VDRL-Antigen die genannten Bestandteile in folgenden Massenverhältnissen
Cardiolipin : Lecithin : Cholesterin in den Verhältnissen 0,1 bis 4,0: 1 bis
5,0: 1 bis 10,0. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
sind die Massenverhältnisse
1 bis 3,0 für
Cardiolipin : 1 bis 3 für
Lecithin : 5 bis 10 für
Cholesterin.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
enthält
der Träger
mehrere Positionen mit Cardiolipin, mindestens zwei, vorzugsweise
mindestens drei, besonders bevorzugt mindestens vier Positionen,
an denen das Cardiolipin in verschiedenen Konzentrationen vorliegt.
Diese Konzentrationen sind für
die einzelnen Positionen vorzugsweise wie folgt: 0,10 bis 1,00 mg/ml
(Position 1), 0,05–0,50 mg/ml
(Position 2), 0,02 bis 0,2 mg/ml (Position 3), 0,01 bis 0,1 mg/ml
(Position 4).
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
enthält
der Träger
mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, besonders bevorzugt mindestens
vier verschiedene Treponema-spezifische Antigene, wobei jedes Antigen
in einer unterschiedlichen Position auf dem Träger immobilisiert ist.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
werden die Treponema-spezifischen Antigene ausgewählt aus
Antigenen von Treponema pallidum, vorzugsweise handelt es sich hierbei
um die 15 kD, 17 kD, 44,5 kD und 47 kD Antigene.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
enthält
der Träger
weitere Kontrollen, die geeignet sind, die sachgemäße Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens
anzuzeigen. Zu diesen Kontrollen zählt bspw. eine Serumkontrolle.
Diese Kontrolle zeigt an, dass der Teststreifen in der Tat beim
Durchführen
des Verfahren mit Serum in Kontakt gebracht worden ist.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
stellt die Kontrolle eine sog. Cut-Off-Kontrolle dar, welche bspw. eine Verdünnung von
gereinigtem humanen Immunglobulin enthält. Diese Kontrolle dient der
Auswertung, indem ein schwächeres Signal
als die Cutoff-Kontrolle einem negativen Testergebnis entspricht,
während
ein stärkeres
Signal einem positiven Testergebnis entspricht. Als Trägermaterialien
kommen Nitrocellulose,, PVDF (Polyvinylidendifluorid), Nylon, Celluloseacetat,
Polystyrol in Betracht, wobei Nitrocellulose besonders bevorzugt ist.
Es hat sich gezeigt, dass beim Einsatz von Nitrocellulose ein besonders
gutes Signal- Hintergrundverhältnis,
insbesondere für
das VDRL-Signal erhalten wird.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist der Träger
als Teststreifen ausgestaltet, insbesondere in einem Format, das
den Einsatz in herkömmlichen
Verfahren der Immundiagnostik erlaubt.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist der Träger
als Westernblot ausgestaltet. Dabei enthält der Träger die diversen Reagenzien
in immobilisierter Form.
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Das oben genannte technische Problem
wird ebenfalls gelöst
durch ein Verfahren zur Diagnostik und/oder Verlaufskontrolle einer
Treponemainfektion, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein oben genannter
Träger
mit einer Patientenprobe in Kontakt gebracht wird und so das Vorliegen
von Antikörpern gegen
ein Treponema-Antigen und/oder Cardiolipin in der Patientenprobe
bestimmt wird.
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Vorzugsweise handelt es sich bei
der Patientenprobe um eine Blut-, Serum-, Plasma-, Liquor- oder
Synovialflüssigkeitsprobe
des zu untersuchenden Patienten. Der Verfahrensablauf entspricht
den üblichen
Verfahren auf dem Gebiet der Immundiagnostik und ist dem Fachmann
geläufig.
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Das oben genannte technische Problem
wird ferner gelöst
durch einen Testkit zur Diagnose einer Treponemainfektion und/oder
der Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion, wobei der Testkit
einen eingangs genannten Träger
enthält
sowie die weiteren Reagenzien zur Durchführung des diagnostischen Verfahrens
sowie eine Gebrauchsanleitung zur Durchführung des Assays.
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Mit dem neuen Testverfahren bzw.
Träger können in
einem Ansatz sowohl Treponema pallidum spezifische Antikörper jeweils
gegen das 47 kD -, das 44,5 kD -, das 17 kD und das 15 kD Protein
als auch Antikörper
gegen das VDRL Antigen (Cardiolipin : Lecithin Cholesterin), insbesondere
Cardiolipin, nachgewiesen werden.
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Durch die Kombination von Treponema
pallidum spezifischen Antigenen (47 kD -, 44,5kD-, 17 kD-, 15 kD-
Proteine) mit nicht-Treponema pallidum Antigenen (z.B. Cardiolipin)
in einem Testformat kann gewährleistet
werden, dass eine sicherere, besser automatisierbare und aussagekräftigere
Syphilis-Diagnostik efolgen kann.
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Im Rahmen der Stufendiagnostik zur
Diagnose der Syphilis ist es somit möglich, nach einem Screening
Test (TPPA, TPHA, TPLA, Tp Elisa) anschließend mit dem erfindungsgemäßen Träger bzw. Verfahren
sowohl die serologische Bestätigungsreaktion,
als auch die Analyse zur Feststellung der Behandlungsbedürftigkeit,
als auch die serologische Verlaufskontrolle durchführen zu
können.
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Insbesondere die Verlaufskontrolle
einer Treponemainfektion wird mittels des erfindungsgemäßen Trägers zuverlässig und
einfach möglich.
Das mit VDRL-Antigen erhaltene Meßsignal ist eine zuverlässige Größe für den Grad
der Treponemainfektion. Während
die in der Patientenprobe vorliegende Reaktivität mit den Treponema-Antigenen
relativ unabhängig
ist von dem Grad der Infektion (d.h. der Schwere der Infektion)
gibt des VDRL-Signal hierzu aussagekräftigere Werte. Dabei war es
insbesondere überraschend,
dass es gelungen ist, die körpereigenen
Lipide (Cardiolipin, Lecithin und Cholesterin) derart auf einen
festen Träger
zu immobilisieren, dass deren Reaktivität mit den Antikörpern des
Patientenmaterials erhalten bleibt. Dies war keineswegs zu erwarten,
da es sich bei den Lipidstrukturen, insbesondere beim Cardiolipin,
um relativ labile dreidimensionale Strukturen handelt, so dass das
Aufbringen auf einen festen Träger
ein hohes Risiko der Zerstörung der
relevanten Epitope darstellte. Überraschenderweise
bleiben die diagnostisch relevanten Epitope jedoch auch nach Fixierung
auf dem festen Träger
erhalten und erlauben somit einen raschen, einfachen und dennoch
sicheren Nachweis der gegen Cardiolipin gerichteten Antikörper.
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1 zeigt
einen erfindungsgemäßen Träger mit
VDRL-Antigenen verschiedener Konzentration sowie vier verschiedenen
Treponema pallidum Antigenen
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Die folgenden Beispiele erläutern die
Erfindung.
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Herstellung des Treponema
Testsstreifens
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Herstellung des VDRL Antigens
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VDRL Antigen wurde aus einer Mischung aus
den Einzelkomponenten Cardiolipin, Lecithin und Cholesterin in Ethanol
hergestellt. Cardiolipin wurde aus Rinderherz gereinigt (Avanti
Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA), Lecithin aus Hühnerei (Avanti Polar
Lipids Inc., Alabaster, AL, USA) und Cholesterin aus Wollfett (Avanti
Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA). Die Einzelkomponenten wurden
in Reinheitsstufen von mindestens 98 % eingesetzt. Die Einzelkomponenten
lagen jeweils als Trockensubstanz vor und wurden in Ethanol (100%)
aufgenommen. Die Konzentration von Cardiolipin betrug 4 g/l in Ethanol
(100%), die Konzentration von Lecithin betrug 100 g/l in Ethanol
(100%) und die Konzentration von Cholesterin betrug 25 g/l in Ethanol
(100 %). In der Reihenfolge Cardiolipin, Lecithin und Cholesterin wurden
die Einzelkomponenten entsprechend dem gewünschten Mischungsverhältnis gemischt.
Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 12–24 Stunden im Dunkeln vor
einer weiteren Verarbeitung aufbewahrt. In der VDRL Mischung lagen
die Massenverhältnisse
von Cardiolipin:Lecithin:Cholesterin im Bereich von (0,1–4,0) :
(0,1–5,0)
: (0,1–10,0).
Gute Ergebnisse wurden mit einer Mischung aus Cardiolipin Lecithin
: Cholesterin mit einem Massenverhältniss von 2,0:1,4:9,0 erzielt.
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Herstellung von VDRL – Verdünnungen
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VDRL Antigen wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH7,2
stufenweise in 1,4- bis
1000 – fachen
Verdünnungen
hergestellt.
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Herstellung von Treponema
spezifischen Antigenlösungen
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47 kD Protein aus Treponema pallidum
(Capricorn, USA), 44,5 kD Protein aus Treponema pallidum (Lee Laboratories,
USA), 17 kD Protein aus Treponema pallidum (Lee Laboratories, USA)
und 15 kD Protein aus Treponema pallidum (Lee Laboratories, USA)
wurden zur Herstellung der Treponema spezifischen Antigenlösungen verwendet.
Die Verdünnungen
der Antigene erfolgte in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH7,2.
Es wurden Konzentrationen zwischen 1 μg/ml und 200 μg/ml pro
Antigen verwendet. Gut geeignet haben sich beim 47 kD Protein Lösungen mit
einer Konzentration von 60 μg/ml,
beim 44,5 kD Protein Lösungen
mit einer Konzentration von 5 μg/ml,
beim 17 kD Protein Lösungen
mit einer Konzentration von 10 μg/ml
und beim 15 kD Protein Lösungen
mit einer Konzentration von 20 μg/ml.
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Immobilisierung der Antigene
auf festphasigem Trägermaterial
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Als festphasiges Trägermaterial
wurde Nitrocelluose (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland) eingesetzt.
Die entsprechend verdünnten
Antigene (Konzentrationen: VDRL: 1,40 – fache, 28,6 – fache,
55,6 – fache
und 111,1 – fache
Verdünnung der
VDRL Antigenlösung;
47 kD – Protein:
60 μg/ml; 44,5
kD – Protein:
5 μg/ml;
17 kD – Protein:
10 μg/ml; 15
kD – Protein:
20 μg/ml)
konnten durch passive Adsorption auf Nitrocellulose als festphasigem
Trägermaterial
gebunden werden. Die Antigen-Lösungen wurden
mit einem Dispensierautomaten mit Tropfengrößen von 10,67 nl bis 85 nl
und Flussraten von 0,5 μl/cm
bis 5,0 μl/cm
aufgetragen.
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Blockierung freier Bindestellen
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Mit Antigen beschichtete Nitrocellulose
wurde mit einem Puffer aus Trishydroxymethylaminomethan (3,25 g/l),
Natriumchlorid (7,51 g/l), Tween 20 (3,83 ml/l), Thimerosal (0,02
g/l), Milchpulver (40 g/l), pH 7,5, bei 37 °C 30 min inkubiert, anschließend in
einem Puffer aus Trishydroxymethylaminomethan (3,25 g/l), Natriumchlorid
(7,51 g/l), Tween 20 (3,83 ml/l), Thimerosal (0,02 g/l), Milchpulver
(5 g/l), pH 7,5, bei 37 °C
30 min inkubiert und getrocknet.
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Zur weiteren Verwendung wurde die
blockierte Nitrocellulose in Streifen geschnitten (Teststreifen).
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Entwicklung der Nitrocellulosestreifen
mit Probenmaterial
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Als Probenflüssigkeit eignen sich Serum, Plasma,
CSF (zerebrospinale Flüssigkeit)
oder Synovialflüssigkeit.
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Der mit Antigen beschichtete Nitrocellulosestreifen
(=Teststreifen, zum Beispiel Darstellung 1) wird in 1,5 ml Waschpuffer
bestehend aus Trishydroxymethylaminomethan (3,25 g/l), Natriumchlorid (7,51
g/l), Tween 20 (3,83 ml/l), Thimerosal (0,02 g/l), Milchpulver
(5 g/l), pH 7,5, bei Raumtemperatur 5 min auf einem Wippschüttler in
einer Wanne inkubiert. Anschließend
wird der Puffer dekantiert. 20 μl
Probenflüssigkeit
werden zusammen mit 1,5 ml Waschpuffer auf den Teststreifen gegeben.
Der Teststreifen wird 30 min auf dem Wippschüttler inkubiert. Nach der Inkubation
mit Probenflüssikeit
wird der Test streifen dreimal mit jeweils 1,5 ml Waschpuffer gewaschen
und anschließend
mit antihuman-IgG oder anti-human-IgM oder anti-human-IgA – alkalische Phosphatase-Konjugat inkubiert.
Anschließend
wird mit jeweils 1,5 ml Waschpuffer dreimal jeweils 5 min gewaschen.
In einem weiteren Waschschritt wird mit destilliertem Wasser für 1 min
nachgewaschen und anschließend
mit Chromogen/Substrat Lösung (BCIP/NBT)
entwikkelt. Die Entwicklung wird entsprechend der Färbung einer
Cut-Off Kontrolle durch Dekantieren der Entwicklungslösung und
dreimaliges Waschen mit jeweils 1,5 ml destilliertem Wasser gestoppt.
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Interpretation der Färbungen
auf den Teststreifen
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Auf den Teststreifen werden Färbeintensitäten der
Antigenlinien mit der Färbeintensität der Cut-Off
Kontrolle verglichen. Eine Färbeintensität kann durch
Scannen (handelsübliche
Farbscanner; Programm Virascan, Viramed, Planegg, Deutschland) der
entwickelten Teststreifen quantifiziert werden. Aus den Messwerten
der Färbeintensitäten werden
Verhältnisse
zur Cut-Off Kontrolle berechnet (Ratio). Ist das Ratio größer oder
gleich eins, so wird eine entsprechend gefärbte Antigenlinie als positiv gewertet.
Ist das Ratio kleiner als eins aber größer oder gleich 0,5 so wird
die entsprechende Antigenlinie grenzwertig gewertet. Ist das Ratio
kleiner als 0,5 so wird die entsprechende Antigenlinie negativ gewertet.
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Eine oder mehrere positive Antigenlinien
der Proteine 47 kD, 44,5 kD, 17 kD oder 15 kD weisen auf das Vorhandensein
entsprechender Antikörper
in der jeweiligen untersuchten Probe hin.
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Eine oder mehrere positive Antigenlinien
der aufgetragenen VDRL Verdünnungsstufen
weisen auf das Vorhandensein von anti Cardiolipin Antikörpern eines
entsprechenden Titers hin. Es besteht eine Korrelation zwischen
dem VDRL-Titer, ermittelt nach dem herkömmlichen VDRL Testverfahren
und der quantifizierbaren Färbeintensität der VDRL
Antigenlinien auf dem Teststreifen. Somit ist das Trägergebundene
VDRL ein geeignetes Mittel zum quantitativen, zumindest semi-quantitativen,
Nachweis von Anti-Cardiolipin-Antikörpern und
kann somit zur Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion herangezogen
werden.