DE10232483A1

DE10232483A1 - Transgene Expressionskonstrukte und Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen

Info

Publication number: DE10232483A1
Application number: DE2002132483
Authority: DE
Inventors: Ralf Dr. Badur; Michael Dr. Geiger; Karin Dr. Herbers; Susanne Dr. Tropf; Rainer Dr. Lemke; Klaus-Dieter Dr. Salchert; Ruediger Prof. Schulz-Friedrich
Original assignee: SunGene GmbH
Current assignee: SunGene GmbH
Priority date: 2002-07-17
Filing date: 2002-07-17
Publication date: 2004-02-05
Also published as: WO2004007733A1; AU2003249996A1

Abstract

Die Erfindung betrifft transgene Expressionskonstrukte und Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen, bevorzugt in Algen, durch transgene Expression von ORF slr1263 aus Synechocystis sp. PCC6803. Die Erfindung betrifft ferner transgene Expressionskonstrukte zur Expression von ORF slr1263 in pflanzlichen Organismen, bevorzugt in Algen, transgene pflanzliche Organismen exprimierend slr1263, sowie die Verwendung von besagten transgenen pflanzlichen Organismen zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere zur Herstellung von Vitamin E.

Description

Die Erfindung betrifft transgene Expressionskonstrukte und Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen, bevorzugt in Algen, durch transgene Expression von ORF slr1263 aus Synechocystis sp. PCC6803. Die Erfindung betrifft ferner transgene Expressionskonstrukte zur Expression von ORF slr1263 in pflanzlichen Organismen, bevorzugt in Algen, transgene pflanzlichen Organismen exprimierend slr1263, sowie die Verwendung von besagten transgenen pflanzlichen Organismen zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere zur Herstellung von Vitamin E.
Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E-Aktivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4., 478–488, Vitamin E). Die Gruppe der Tocopherole (1a–d) weist eine gesättigte Seitenkette auf, die Gruppe der Tocotrienole (2a–d) eine ungesättigte Seitenkette:
1a, α-Tocopherol: R¹ = R² = R³ = CH₃
1b, (β-Tocopherol [148-03-8] : R¹ = R³ = CH₃ , R² = H
1c , γ-Tocopherol [54-28-4] : R¹ = H, R² = R³ = CH₃
1d, δ-Tocopherol [119-13-1]: R¹ = R² = H, R³ = CH₃
2a, α-Tocotrienol [1721-51-3] : R¹ = R² = R³ = CH₃
2b, (β-Tocotrienol [490-23-3] : R¹ = R³ = CH₃, R² = H
2c , γ-Tocotrienol [14101-61-2] : R¹ = H, R² = R³ = CH₃
2d, δ-Tocotrienol [25612-59-3]: R¹ = R² = H, R³ = CH₃
In der vorliegenden Erfindung werden unter Vitamin E alle acht vorstehend erwähnten Tocopherole und Tocotrienole mit Vitamin-E-Aktivität verstanden.
Vitamin E-Verbindungen haben einen hohen wirtschaftlichen Wert als Zusatzstoffe im Food- und Feed-Bereich, in pharmazeutischen Formulierungen und in kosmetischen Anwendungen.
Es gibt Versuche zur Erhöhung des Stoffwechselflusses zur Steigerung des Tocopherol- bzw. Tocotrienolgehaltes in transgenen Pflanzen durch Überexpression einzelner Tocopherol-Biosynthesegene (WO 97/27285; W0 99/04622; WO 99/23231; WO 00/10380; Shintani und Dellapenna, Science 282 (5396):2098-2100, 1998; Tsegaye et al. Jahrestreffen der American Society of Plant Physiologists (24.-28.07.1999, Baltimore, USA) Abstract No. 413).
Synechocystis sp. PCC 6803 ist ein einzelliges, nicht Stickstoff fixierendes Cyanobakterium, das genetisch gut untersucht ist (Churin et al. (1995) J Bacteriol 177: 3337-3343), leicht transformiert werden kann (Williams (1988) Methods Enzymol 167:766-778) und ein sehr aktives homologes Rekombinationsvermögen aufweist. Der Stamm PCC 6803 wurde 1968 von R. Kunisawa als Aphanocapsa N-1 in Kalifornien, USA, aus Süßwasser isoliert und ist heute über die "Pasteur Culture Collection of Axenic Cyanobacterial Strains" (PCC), Unité de Physiologie Microbienne, Paris, Frankreich, erhältlich. Die genomische Gesamtsequenz von Synechocystis sp. PCC 6803 wurde ab 1995 veröffentlicht (Kaneko et al. (1995) DNA Research 2:153-166; Kaneko et al. (1995)DNA Research 2:191-198; Kaneko et al. (1996) DNA Research 3:109-136; Kaneko et al. (1996) DNA Research 3:185-209; Kaneko und Tabata (1997) Plant Cell Physiol 38:1171-1176; Kotani und Tabata (1998) Annu Rev Plant Physiol 49:151-171) und ist über das Internet (http://www.kazusa.or.jp/cyano/cyano.html) unter dem Namen "CyanoBase" veröffentlicht. Effektive Expressionssysteme für Synechocystis 6803 sind in der Literatur beschrieben (Mermet-Bouvier et al. (1993) Curr Microbiol 27:323-327; Mermet-Bouvier und Chauvat (1993) Curr Microbiol 28:145-148; Murphy und Stevens (1992) Appl Environ Microbiol 58:1650-1655; Takeshima et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:9685-9689; Xiaoqiang et al. (1997) Appl Environ Microbiol 63:4971-4975; Ren et al. (1998) FEMS Microbiol Lett 158:127-132).
Trotz einiger Erfolge besteht weiterhin Bedarf an einer Optimierung der Vitamin E Biosynthese. Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, weitere Verfahren zur Verfügung zu stellen, die die Vitamin E-Biosynthese steigern und damit zu vorteilhaften transgenen pflanzlichen Organismen führen.
Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst. Im Rahmen der Erfindung wurde das Protein kodiert durch ORF slr1263 aus Synechocystis sp. PCC 6803 (GenBank Acc.-No.: NP_441177; gi:16330449; SEQ ID NO: 2) überraschenderweise als Schlüsselfaktor der Vitamin E-Biosynthese identifiziert (infolge Tocen-2 für "Tocopherol synthesis enhancing protein"-2). Tocen-2 ist in der GenBank als unbekanntes Protein ohne jegliche Funktionsannotation klassifiziert. Das Protein weist keine signifikanten Homologien zu anderen Proteinen bekannter Funktion auf. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die transgene Expression dieses Proteins, den Vitamin E Gehalt in pflanzlichen Organismen erhöhen kann.
Ein erster Gegenstand der Erfindung umfasst Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen, durch

a) transgene Expression des Tocen-2 Proteins kodiert durch SEQ ID NO: 2 oder eines funktionellen Äquivalentes desselben oder eines funktionell äquivalenten Teils der vorgenannten in dem besagten pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus, und
b) Auswahl von pflanzlichen Organismen, bei denen – im Unterschied oder Vergleich zum Ausgangsorganismus – der Vitamin E-Gehalt in dem besagten pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus erhöht ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann im Prinzip auf alle pflanzlichen Organismen angewendet werden, bevorzugt auf solche die natürlicherweise Vitamin E produzieren, ganz besonders bevorzugt auf solche die für industrielle Produktion von natürlichem Vitamin E eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionskonstrukte zur Expression einer Nukleinsäuresequenz kodierend für das Tocen-2 Proteins kodiert durch SEQ ID NO: 2 oder eines funktionellen Äquivalentes desselben (z.B. gemäß SEQ ID NO: 23, 25 oder 27) oder eines funktionell äquivalenten Teils der vorgenannten. Besonders bevorzugt ist die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 22, 24 oder 26 und die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenzen sowie funktionell äquivalente Teile der vorgenannten.
"Pflanzlicher Organismus oder von diesem abgeleitete Zellen" meint allgemein jede Zelle, Gewebe, Teile oder Vermehrungsgut (wie Samen oder Früchte) eines Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzugt.
"Pflanze" im Rahmen der Erfindung meint alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut (zum Beispiel Knollen, Samen oder Früchte), Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zell- oder Kalluskulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
"Pflanze" umfasst alle einjährigen und mehrjährige, monokotyledonen und dikotyledonen Pflanzen und schließt beispielhaft jedoch nicht einschränkend solche der Gattungen Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Picea und Populus ein.
Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender Pflanzenfamilien: Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.
Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gramineae wie Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern.
Die Erfindung wird ganz besonders bevorzugt aus dikotyledone pflanzliche Organismen angewendet. Bevorzugte dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel

– Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula und andere mehr,
– Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr,
– Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea (z.B. Kohl, Blumenkohl oder Broccoli und weitere Kohlarten); und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Canola und andere mehr,
– Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini und andere mehr,
– Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) Soja sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere mehr
– Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispielsweise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffeestrauch) und andere mehr,
– Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Paprika), sowie Tabak und andere mehr,
– Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr,
– Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und andere mehr,
– Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karotte)) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Sellerie)) und andere mehr;

Umfasst sind ferner Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäume, Blumen, Schnittblumen, Sträucher oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose); Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen, die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen, Cyanobakterien sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Insbesondere bevorzugt ist Synechocystis.
Insbesondere bevorzugt sind pflanzliche Organismen ausgewählt aus der Gruppe der Ölpflanzen bestehend aus Borago officinalis, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica rapa, Cannabis sativa, Carthamus tinctorius, Cocos nucifera, Crambe abyssinica, Cuphea Arten, Elaeis guineensis, Ekeis oleiferu, Glycine max, Gossypium hirsitum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Helianthus annus, Linum usitatissimum, Oenothera biennis, Ozea europea, Oryza sativa, Ricinus communis, Sesamum indicum, Triticum Arten, Zea maize, Walnuss und Mandel.
Am meisten bevorzugt sind pflanzliche Organismen, die zur Vitamin E-Produktion geeignet sind, wie beispielsweise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja, Mais, Weizen oder verschiedene Nussarten wie beispielsweise Walnuss oder Mandel.
"Vitamin E-Gehalt" meint die Summe der Tocopherole und Tocotrienole in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben. Dabei umfassen Tocopherole und Tocotrienole bevorzugt die oben beschriebenen 8 Verbindungen α-Tocophero1,β-Tocopherol, γ-Tocopherol,δ-Tocopherol, α-Tocotrienol, ß-Tocotrieno, ?-Tocotrienol und ?-Tocotrienol. Besonders bevorzugt ist der Vitamin E-Gehalt im Samen eines pflanzlichen Organismus erhöht.
"Erhöhung" des Vitamin E-Gehaltes meint die Steigerung des Gehaltes an Vitamin E in einem pflanzlichen Organismus oder einem Teil, Gewebe oder Organ derselben, bevorzugt in den Samenorganen desselben. Dabei ist der Vitamin E-Gehalt im Vergleich zu einer nicht dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfenen, aber ansonsten unveränderten Ausgangspflanze unter ansonsten gleichen Rahmenbedingungen um mindestens 5%, bevorzugt mindestens 10%, besonders bevorzugt mindestens 15%, ganz besonders bevorzugt mindestens 20%, am meisten bevorzugt mindestens 25% erhöht. Rahmenbedingungen meint dabei alle für die Keimung, Kultivierung oder Wachstum der Pflanze relevanten Bedingungen wir Boden-, Klima- oder Lichtverhältnisse, Düngung, Bewässerung, Pflanzenschutzmaßnahmen usw.
Funktionelle Äquivalente meint insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen des Tocen-2 Proteins gemäß SEQ ID NO: 2 sowie homologe Polypeptide aus anderen Organismen, bevorzugt aus pflanzlichen Organismen, die die gleichen wesentlichen Eigenschaften aufweisen.
"Wesentliche Eigenschaften" des Tocen-2 Proteins beschrieben durch SEQ ID NO: 2 meint insbesondere die Eigenschaft, bei transgener Expression in einem pflanzlichen Organismus den Vitamin E Gehalt im Vergleich zu einem identischen aber nicht transgenen pflanzlichen Organismus entsprechend oben gegebener Definition zu erhöhen. In einer bevorzugten Ausführungsform gelten als wesentliche Eigenschaften ferner mindestens eine Eigenschaft ausgewählt aus nachfolgender Gruppe:

a) ein Molekulargewicht in einem Bereich von ungefähr 10 bis ungefähr 100 kDa, bevorzugt ungefähr 30 bis ungefähr 70 kDa, besonders bevorzugt ungefähr 52 kDa
b) einen theoretischen isoelektrischen Punkt in einem Bereich von ungefähr 8 bis ungefähr 10, bevorzugt ungefähr 8,5 bis ungefähr 9,5, besonders bevorzugt ungefähr pH 9,2
c) einen sauren Charakter bevorzugt mit einer Gesamtnettoladung bei neutralem pH in einem Bereich von ungefähr 3 bis ungefähr 5, bevorzugt ungefähr 3,5 bis ungefähr 4,5, besonders bevorzugt ungefähr 4,2,
d) eine Peptidsequenz umfassend mindestens ein Sequenzmotiv ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzmotiven bestehend aus

Funktionelle Äquivalente aus anderen Organismen, beispielsweise aus pflanzlichen Organismen deren genomische Sequenz ganz oder teilweise bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum oder Solanum tuberosum sowie insbesondere aus anderen Cyanobacterien wie Nostoc punctiforme ATCC 29133, Anabaena sp. PCC7120, Synechococcus sp. WH8102 – können z.B. durch Datenbanksuche in Sequenzdatenbanken wie GenBank oder Durchmustern von Genoder cDNA-Banken – z.B. unter Verwendung der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder eines Teils der vorgenannten wie beispielsweise insbesondere eines der oben genannten Sequenzmotive i) bis ix) als Suchsequenz bzw. Sonde – aufgefunden werden. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Aminosäurereste.
Bevorzugt haben besagte funktionelle Äquivalente eine Homologie von mindestens 40%, besonders bevorzugt mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 80%, am meisten bevorzugt mindestens 90% zu dem Protein mit der SEQ ID NO: 2. Dabei erstreckt sich die Homologie über mindestens 30 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 60 Aminosäuren besonders bevorzugt mindestens 90 Aminosäuren, am meisten bevorzugt über die gesamt Länge des Tocen-2 Polypeptides gemäß SEQ ID NO: 2.
Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die jeweilige Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 8 Length Weight: 2
Average Match: 2,912 Average Mismatch:-2,003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80% auf Proteinbasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80% aufweist.
Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche Proteine, die durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die eine Homologie von mindestens 40%, besonders bevorzugt mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 80%, am meisten bevorzugt mindestens 90% zu der Nukleinsäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 haben. Dabei erstreckt sich die Homologie über mindestens 100 Basen, bevorzugt mindestens 200 Basen besonders bevorzugt mindestens 300 Basen, am meisten bevorzugt über die gesamt Länge der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen wird die Identität der beiden Nukleinsäuresequezen über die jeweilige Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389ff) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10 Average Mismatch:0
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80% auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80% aufweist.
Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche Proteine, die durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die unter Standardbedingungen mit einer der durch SEQ ID NO: 1 beschriebenen Nukleinsäuresequenz, der zu dieser komplementären Nukleinsäuresequenz oder Teilen der vorgenannten hybridisieren und die wesentlichen Eigenschaften des Proteins beschrieben durch SEQ ID NO: 2 aufweisen.
"Standardhybridisierungsbedingungen" ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0,2X SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20X SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7,0). Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:

(1) Hybridisierungbedingungen zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein: a) 4X SSC bei 65°C, b) 6X SSC bei 45°C, c) 6X SSC, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierte Fischsperma-DNA bei 68°C, f) 50 % Formamid, 4X SSC bei 42°C, h) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung), i) 30 bis 40% Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung).
(2) Waschschritte können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein: a) 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% SDS bei 50°C. b) 0,1X SSC bei 65°C. c) 0,1X SSC, 0,5% SDS bei 68°C. d) 0,1X SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C. e) 0,2X SSC, 0,1% SDS bei 42°C. f) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung).

Funktionelle Äquivalente meint insbesondere die Polypeptide beschrieben durch SEQ ID NO: 23, 25 oder 27.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionskonstrukte, die eine transgene Expression des Proteins kodiert durch SEQ ID NO: 2 oder eines funktionellen Äquivalentes desselben (z.B. gemäß SEQ ID NO: 23, 25 oder 27) oder eines funktionell äquivalenten Teils der vorgenannten in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus gewährleisten können.
In besagten transgenen Expressionskonstrukten steht ein Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Protein beschrieben durch SEQ ID NO: 2 oder eines funktionellen Äquivalentes desselben (z.B. gemäß SEQ ID NO: 23, 25 oder 27) oder eines funktionell äquivalenten Teils der vorgenannten bevorzugt in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einem genetischen Kontrollelement (beispielsweise einem Promotor), das eine transgene Expression in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben gewährleistet.
Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz (zum Beispiel der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 22, 24 oder 26) und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promoter fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung als auch die Herstellung eines transgenen Expressionskonstruktes kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience und bei Gelvin et al. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen. Bevorzugt kann das transgene Expressionskonstrukt, bestehend aus einer Verknüpfung von Promoter und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insegtiert werden.
Unter einem transgenen Expressionskonstrukt sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen die Nukleinsäuresequenz kodierend für das Proteins kodiert durch SEQ ID NO: 2 oder ein funktionelles Äquivalent desselben (z.B. gemäß SEQ ID NO: 23, 25 oder 27) oder ein funktionell äquivalentes Teil der vorgenannten – zum Beispiel durch eine homologe Rekombination – so hinter einen endogenen pflanzlichen Promotor platziert wird, dass dieser die transgene Expression der besagten Nukleinsäuresequenz gewährleistet.
Pflanzenspezifische Promotoren meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, -kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein.
Bevorzugt sind:
a) Konstitutive Promotoren
"Konstitutive" Promotoren meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten (Benfey et al.(1989) EMBO J 8:2195-2202). Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21:285-294; Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6:221-228) oder der 19S CaMV Promotor ( US 5,352,605 ; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8:2195-2202). Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der "Rubisco Small subunit (SSU)"-Promotor ( US 4,962,028 ), der LeguminB-Promotor (GenBank Acc.-Nr. X03677), der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf 5 et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-649), der Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9692-9696), der Smas Promotor, der Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor ( US 5,683,439 ), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991), sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist.
b) Gewebespezifische Promotoren
Bevorzugt sind ferner Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen.
Samenspezifische Promotoren wie zum Beispiel der Promotor des Phaseolins ( US 5,504,200 ; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1(9):839-53), des 2S Albumingens (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262:12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2):326-331), des USP (unknown seed Protein; Baumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3):459-67), des Napins ( US 5,608,152 ; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199:515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4; Baumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225:121-128; Baumlein H et al. (1992) Plant J 2(2):233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechno-logy (NY) 13(10):1090f), der Oleosin-Promoter aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Bce4-Promoter aus Brassica (WO 91/13980). Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG), Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP Glucose Pyrophosphatase (AGPase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promoter des lpt2 oder lptl-Gen (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die Promotoren beschrieben in WO 99/16890 (Promotoren des Hordein-Gens, des Glutelin-Gens, des Oryzin-Gens, des Prolamin-Gens, des Gliadin-Gens, des Glutelin-Gens, des Zein-Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens). Weitere samenspezifische Promotoren sind beschrieben in WO 89/03887.
Knollen-, Speicherwurzel- oder Wurzel-spezifische Promotoren umfassen beispielsweise den Patatin Promotor Klasse I (B33) oder den Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel.
Blattspezifische Promotoren umfassen beispielsweise den Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), den SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase) oder den ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8:2445-2451).
Blütenspezifische Promotoren umfassen beispielsweise den Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder den Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).
Antheren-spezifische Promotoren umfassen beispielsweise den 5126-Promotor ( US 5,689,049 , US 5,689,051), den glob-1 Promotor und den γ-Zein Promotor.
c) Chemisch induzierbare Promotoren
Die transgenen Expressionskonstrukte können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108), durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z.B. der PRP1 Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), ein durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor ( EP 0 388 186 ), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2:397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor ( EP 0 335 528 ) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanoninduzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden.
d) Stress- oder Pathogen-induzierbare Promotoren
Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder abiotischen Stress induziert werden wie beispielsweise der pathogen-induzierbare Promotor des PRP1-Gens (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), der hitzeinduzierbare hsp70- oder hsp80-Promoter aus Tomate ( US 5,187,267 ), der kälteinduzierare alpha-Amylase Promoter aus der Kartoffel (WO 96/12814), der licht-induzierbare PPDK Promotor oder der verwundungsinduzierte pinII-Promoter (EP-A 375 091).
Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die Promotoren von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls induziert werden, wie beispielsweise Gene von PR-Proteinen, SAR-Proteinen, ß-1,3-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Uknes, et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4:111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-342; Somssich et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:2427-2430; Somssich et al. (1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chen et al. (1996) Plant J 10:955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:2507-2511; Warner, et al. (1993) Plant J 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968).
Umfasst sind auch verwundungs-induzierbare Promotoren wie der des pinII Gens (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14:494-498), des wun1- und wun2-Gens ( US 5,428,148 ), des win1- und win2-Gens (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215:200-208), des Systemin Gens (McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573), des WIP1-Gens (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76), des MPI-Gens (Corderok et al. (1994) Plant J 6(2):141-150) und dergleichen.
e) Entwicklungsabhängige Promotoren
Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise fruchtreifung-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794, EP-A 409 625). Entwicklungsabhängige Promotoren schließen zum Teil die gewebespezifische Promotoren mit ein, da die Ausbildung einzelner Gewebe naturgemäß entwicklungsabhängig erfolgt.
Besonders bevorzugt sind konstitutive, samenspezifische sowie blattspezifische Promotoren.
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine transgene Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E.coli Bakterien ermöglichen. Als Pflanzen Promotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage.
Die in den erfindungsgemäßen transgenen Expressionskonstrukten oder transgenen Expressionsvektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem Promoter funktionell verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion eines erfindungsgemäßen transgenen Expressionskonstruktes haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen transgenen Expressionskonstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen pflanzenspezifischen Promoter und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionssteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26):17131-17135) und Hitzestress (Schoffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217(2-3):246-53) beschrieben.
Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3'-Region von Genen wie beipielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adh1-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15:435-440).
Das transgene Expressionskonstrukt kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promoter enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Terminator.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel die kodierende Sequenz eines bestimmten endogenen Gens gegen die für eine dSRNA kodierende Sequenz gezielt ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung des transgenen Expressionskonstruktes aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B (1998) Methods 14(4):381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.
Ein transgenes Expressionskonstrukt und/oder die von ihm abgeleiteten transgenen Expressionsvektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen transgenen Expressionskonstrukte, der transgenen Expressionsvektoren oder der transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:

a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen Biozide wie Metabolismusinhibitoren (z.B. 2-Desoxyglucose-6-phosphat; WO 98/45456), Antibiotika (z.B. Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin) oder – bevorzugt – Herbizide (z.B. Phosphinotricin) verleihen. Als Selektionsmarker seien beispielhaft genannt: Phosphinothricinacetyltransferasen (bar und pat Gen), welche Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren, 5-Enol-pyruvylshikimat-3-phosphatsynthasen (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat^® (N-(phosphonomethyl)glycin) verleihen, Glyphosat^® degradierende Enzyme (gox-Genprodukt; Glyphosatoxidoreduktase), Dehalogenasen, welche z.B. Dalapon inaktivieren (deh Genprodukt), Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie Nitrilasen, welche z.B. Bromoxynil degradieren (bxn Genprodukt), das aasa-Genprodukt, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Apectinomycin verleih, Streptomycinphosphotransferasen (SPT), die eine Resistenz gegen Streptomycin gewähren, Neomycinphosphotransferasen (NPTII), die eine Resistenz gegen Kanamycin oder Geneticidin verleihen, das Hygromycinphosphotransferasen (HPT), die eine Resistenz gegen Hygromycin vermitteln, das Acetolactatsynthasen (ALS), die eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide verleihen (z.B. mutierte ALS-Varianten mit z.B. der S4 und/oder Hra Mutation).
b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(11:29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Sheen et al.(1995) Plant Journal 8(5):777-784), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Ow et al. (1986) Science 234:856-859), das Aequorin-Gen (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259-1268), die β-Galactosidase, ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907).
c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen transgenen Expressionskonstrukte oder transgenen Expressionsvektoren in zum Beispiel E.coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 on oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2^nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.

Zusätzlich können besagte transgene Expressionskonstrukte oder transgenen Expressionsvektoren Nukleinsäuresequenzen enthalten, die nicht für das Proteins kodiert durch SEQ ID NO: 2, ein funktionelles Äquivalent desselben oder ein funktionell äquivalentes Teil der vorgenannten kodieren, und deren transgene Expression zu einer zusätzlichen Steigerung der Vitamin E-Biosynthese führt (infolge pro-VitE). Diese zusätzlich transgen exprimierte pro-VitE Nukleinsäuresequenz kann – beispielhaft aber nicht einschränkend – ausgewählt sein aus Nukleinsäuren kodierend für Homogentisatphytyltransferase, 2-Methyl-6-plastochinonmethyltransferase, Tocopherolcyclase, ?-Tocopherolmethyltransferase, Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase, Tyrosinaminotransferase, tyrA, Geranylgeranylpyrophosphatreduktase. Bei den vorgenannten wird der erwünschte Effekt durch eine Überexpression gewährleistet. Jedoch kann ein entsprechender Effekt auch durch Expression einer einer pro-VitE Nukleinsäuresequenz erreicht werden, die z.B. als antisense RNA oder doppelsträngige RNA die Suppression der Expression bestimmter Gene bewirkt. Geeignete Zielgene wären hier – beispielhaft jedoch nicht einschränkend – die Homogentisatdioxygenase. Entsprechende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt und aus Datenbanken oder entsprechenden cDNA-Banken der jeweiligen Pflanzen leicht zugänglich. Dem Fachmann ist bewusst, dass auch mehrere unterschiedliche der oben genannten zusätzlichen Expressionen von pro-VitE Nukleinsäuresequenzen im Rahmen der Erfindung kombiniert werden können.
Die Einführung eines erfindungsgemäßen transgenen Expressionskonstruktes in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder Samen), kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die transgenen Expressionskonstrukte enthalten sind. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacterien sein. Das transgene Expressionskonstrukt kann in den Vektor (bevorzugt ein Plasmidvektor) über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Der entstandene transgene Expressionsvektor wird. zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt transformierte E.coli werden selektioniert, gezüchtet und der kombinante Vektor mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu prüfen. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration des transgenen Expressionskonstruktes in das Wirtsgenom ermöglichen.
Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die entsprechende DNA (z.B. der Expressionsvektor), RNA oder Protein in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al. (1991) Gene 100:247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein et al. (1987) Nature 327:70-73 ; Howell et al. (1980) Science 208:1265; Horsch et al.(1985) Science 227:1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte "particle bombardment" Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone Pflanzenzellen geeignet. Die Verfahren sind beispielsweise beschrieben bei Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229f).
Werden Agrobacterien verwendet, so ist das transgene Expressionskonstrukt in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wird ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit dem einzuführenden transgenen Expressionskonstrukt verbunden.
Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen (z.B. nptII) und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187). Außerhalb der T-DNA enthält der Vektor in der Regel noch ein weiteres Selektionsmarkergen , das eine Selektion transformierter Agrobakteria (und/oder E.coli) ermöglicht (z.B. nptIII). Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben ( EP 120 516 ; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4:277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
Direkte Transformationstechniken eignen sich für jeden Organismus und Zelltyp. Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA bzw. RNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
Stabil transformierte Zellen d.h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen ein Biozid z.B. ein Antibiotikum oder Herbizid (wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc.) zu verleihen vermag (s.o.). Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicherweise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Die oben genannten Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Jenes B et al.(1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press, S.128-143 sowie in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225). Vorzugsweise wird das zu transgene Expressionskonstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12:8711f).
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zell massen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, um aus Pflanzenzellen, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu regenerieren. Beispielsweise werden hierzu Verfahren beschrieben von Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89:525-533 verwendet.
"Transgen" meint – zum Beispiel bezüglich einer Nukleinsäuresequenz, einem Expressionskonstrukt oder einem Expressionsvektor enthaltend besagte Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit besagter Nukleinsäuresequenz, Expressionskonstrukt oder Expressionsvektor – alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommene Konstruktionen, in denen sich entweder

a) die Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Tocen-2 Protein gemäß SEQ ID NO: 2, ein funktionelles Äquivalent desselben (z.B. gemäß SEQ ID NO: 23, 25 oder 27) oder ein funktionell äquivalentes Teil der vorgenannten, oder
b) eine mit besagter Nukleinsäuresequenz unter a) funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder
c) (a) und (b)

US 5,565,350

"Transgen" meint in Bezug auf eine Expression ("transgene Expression") bevorzugt all solche unter Einsatz eines transgenen Expressionskonstruktes, transgenen Expressionsvektor oder transgenen Organismus – entsprechend dem oben gegebenen Definitionen – realisierten Expressionen.
Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangsorganismen sind vor allem pflanzliche Organismen gemäß der oben genannten Definition. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches, insbesondere Pflanzen, die für die Gewinnung von Ölen verwendet werden wie beispielsweise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja, Mais, Weizen und Nussarten. Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
Die Herstellung der transgenen Organismen kann mit den oben beschriebenen Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Organismen realisiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile – wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.-, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere von Vitamin E oder Vitamin E-Derivaten wie beispielsweise Vitamin E Acetat.
Sequenzen
Abbildungen
1: Konstruktkarte von pGEM-Teasy/slr1263 "A" repräsentiert das für Tocen-2 kodierende DNA-Fragment (1413 Basenpaare)
2: Konstruktkarte von pGEM-Teasy/slr1263::tn903
Fragment A' (715 Basenpaare): 5'-Bereich von Tocen-2,
Fragment B (1286 Basenpaare): Transposon 903
Fragment 'A (703 Basenpaare): 3'-Bereich von Tocen-2.
Die Kanamycin-Kassette des tn903 Transposons inserierte in pGEM-Teasy/slr1263 derart, dass die Transkription des Kanamycinresistenzgens des Tn903 in entgegengesetzter Richtung zur Transkription des offenen Leserasters von Tocen-2 verläuft.
3: Tocopherolproduktion in Synechocystis/slr1263::tn903
Acht unabhängige Tocen-2 Knockout Mutanten zeigten im Durchschnitt im Vergleich zu den Synechocystis spec. PCC 6803 Wildtypzellen (WT) eine signifikante Verminderung in der Tocopherol- und Tocotrienolproduktion. Eine Mutante, deren Mutation in einem anderen Gen des gleichen Operons liegt (slr1262), zeigt keinen Effekt auf die Tocopherolkonzentration, so dass der slr1263-vermittelte Effekt als genspezifisch gelten kann.
4: Konstrukkarte von pSUN2/NitP/slr1263/ocs (SEQ ID No: 14)
Fragment "A" (1894 bp): Nitrilase-1 Promotor
Fragment "B" (1413 Bp): offenes Leseraster von Tocen-2
Fragment "C" (219 Bp): Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens.
5: Konstruktkarte von pSUN2/NitP/rbcS/slr1263/ocs
Fragment "A" (1894 bp): Nitrilase-1 Promoter
Fragment "B" (167 bp): Fragment kodierend für das rbcS Transitpeptid
Fragment "C" (1413 bp): offenes Leseraster von Tocen-2
Fragment "D" (219 bp): Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens.
6: Konstruktkarte von pSUN2/USP/slr1263/3`cat
Fragment "A" (674 bp): Promotor des USP Gens aus Vicia faba
Fragment "B" (1413 bp): offenes Leseraster von Tocen-2
Fragment "C" (229 Bp): Terminationssignal des Cathepsin D Inhibitor Gens.
7: Konstrukkarte von pSUN2/USP/rbcS/slr1263/ocs
Fragment "A" (674 bp): Promotor des USP Gens aus Vicia faba
Fragment "B" (174 Bp): Fragment kodierend für das rbcS Transitpeptid
Fragment C (1413 bp): offenes Leseraster von Tocen-2
Fragment D (219 Bp): Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens.
Beispiele
Alle Chemikalien, wenn nicht anders erwähnt, stammen von den Firmen Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen). Restriktionsenzyme, DNAmodifizierende Enzyme und Molekularbiologie-Kits wurden von den Firmen Amersham-Pharmacia (Freiburg), Biometra (Göttingen), Roche (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Qiagen (Hilden), Stratagen (Amsterdam, Niederlande), Invitrogen (Karlsruhe) und Ambion (Cambridgeshire, United Kingdom). Die verwendeten Reagenzien wurden entsprechend der Angaben des Herstellers eingesetzt.
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467).
Beispiel 1: Allgemeine Verfahren
Die Pflanze Arabidopsis thaliana repräsentiert ein Mitglied der höheren Pflanzen (Samenpflanzen). Diese Pflanze ist eng verwandt mit anderen Pflanzenarten aus der Familie der Cruciferen wie z.B. Brassica napus, aber auch mit anderen Pflanzenfamilien der Dikotyledonen. Aufgrund des hohen Grades an Homologie ihrer DNA-Sequenzen bzw. Polypeptidsequenzen kann Arabidopsis thaliana als Modellpflanze für andere Pflanzenarten eingesetzt werden.
a) Anzucht von Arabidopsis Pflanzen
Die Pflanzen werden entweder auf Murashige-Skoog Medium mit 0,5% Saccharose (Ogas et al. (1997) Science 277:91-94) oder auf Erde gezogen (Focks & Benning (1998) Plant Physiol 118:91-101). Um einheitliche Keimungs- und Blühzeiten zu erreichen, werden die Samen nach Ausplattieren bzw. Ausstreuen auf Erde zwei Tage bei 4°C stratifiziert. Nach der Blüte werden die Schoten markiert. Entsprechend der Markierungen werden dann Schoten mit einem Alter von 6 bis 20 Tagen nach der Blüte geerntet.
b) Anzucht von Synechocystis
Die Zellen von Synechocystis sp. PCC 6803 werden in BG11-Medium normalerweise autotroph kultiviert. Sie haben einen Durchmesser von 2,3 bis 2,5 ∝m. Bei den hier geschilderten Untersuchungen wurde der Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 Stamm aus der Sammlung von Prof. Dr. Peter Wolk und Prof. Dr. Lee McIntosh (Plant Research Laboratory, Michigan State University, East Lansing, Michigan, USA) eingesetzt. Dieser ist Glukose-tolerant, d.h. er kann auch heterotroph im Dunkeln, mit nur wenigen Minuten schwacher Blaulicht-Beleuchtung pro Tag, wachsen. Diese Kulturbedingungen wurden von Anderson und McIntosh (Anderson und McIntosh (1991) J Bacteriol 173:2761-2767) entwickelt und "Light-activated heterotrophic growth" (LANG) genannt. Damit ist es möglich, diese Cyanobakterien ohne laufende Photosynthese und damit ohne Produktion von Sauerstoff zu kultivieren.
BG 11 Kulturmedium für Synechocystis
Stammlösung 100 x BG11:
Die abgewogenen Substanzen werden in 900 ml H₂O gelöst und mit 100 ml des Trace metal mix stock 1000x auf 1000 ml aufgefüllt. Diese gewonnene Lösung dient als Stammlösung.
Trace metal mix stock 1000x:
Für 1 Liter BG11 Kulturlösung werden folgende Lösungen benötigt:

1. 10 ml der Stammlösung 100 x BG 11
2. 1 ml Na₂CO₃ (189 mM)
3. 5 ml TES (1 M, pH 8 )
4. 1 ml K2P04 (175 mM)

Während Lösung 2. und 3. steril filtriert werden sollten, muss Lösung 4 autoklaviert werden. Die gesamte BG11 Kulturlösung muß vor Gebrauch autoklaviert und anschließend mit 1 ml Eisen-Ammonium-Citrat (6 mg/ml), das zuvor steril filtriert wurde, versetzt werden. Das Eisen-Ammonium-Citrat sollte auf keinen Fall autoklaviert werden. Für Agarplatten werden 1,5% (w/v) Bactoagar pro Liter BG11 Medium zugesetzt.
Beispiel 2: Amplifikation und Klonierung von Tocen-2 aus Synechocystis spec. PCC 6803
Die DNA kodierend für Tocen-2 wurde mittels "Polymerase Chain Reaction" (PCR) aus Synechocystis spec. PCC 6803 gemäß der Methode nach Crispin A. Howitt (Howitt CA (1996) BioTechniques 21:32-34) unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (slr1263-5'; SEQ ID NO: 3) und eines antisense spezifischen Primers (slr1263-3'; SEQ ID NO: 4) amplifiziert.
Die PCR erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz in dem enthalten war:
5 μl einer Synechocystis spec. PCC 6803 Zellsuspension
0,2 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP
1,5 mM Mg(OAc)₂
5 μg Rinderserum-Albumin
40 pmol Oligonukleotidprimer slr1263-5'
40 pmol Oligonukleotidprimer slr1263-3'
15 μl 3,3X rTth DNA Polymerase XL Puffer (PE Applied Biosystems)
5U rTth DNA Polymerase XL (PE Applied Biosystems)
Die PCR wurde unter folgenden Zyklus-Bedingungen durchgeführt:
Schritt 1: 5 Minuten 94°C (Denaturierung)
Schritt 2: 3 Sekunden 94°C
Schritt 3: 1 Minute 52°C (Annealing)
Schritt 4: 1 Minute 30 Sekunden 72°C (Elongation) 35 Wiederholungen der Schritte 2 bis 4
Schritt 5: 10 Minuten 72°C (Post-Elongation)
Schritt 6: 4°C (Warteschleife)
Das Amplifikat (1425 Basenpaare) wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR Klonierungsvektor pGEM-Teasy (Promega) kloniert. Das Konstrukt hat die Bezeichnung pGEM-Teasy/ slr1263. Die Identität des erzeugten Amplikons wurde durch Sequenzierung unter Verwendung des T3- und des T7-Primers bestätigt (vgl. SEQ ID NO: 1). 1 stellt pGEM-Teasy/slr1263 dar, wobei "A" das für Tocen-2 kodierende DNA-Fragment (1413 Basenpaare) representiert.
Beispiel 3: Erzeugung einer Tocen-2 Knock out Mutante
Ein DNA Konstrukt zur Erzeugung einer Deletionsmutante von Tocen-2 in Synechocystis spec. PCC 6803 wurde unter Anwendung von Standardklonierungstechniken erzeugt. Der Vektor pGEM-Teasy/ slr1263 wurde unter Verwendung des Restriktionsenzyms MscI verdaut. In diese mit stumpfen Enden vorliegende MscI-Schnittstelle des offenen Leseratsers von Tocen-2 wurde die Aminoglycosid-3'Phosphotransferase des Transposons Tn903 kloniert. Dazu wurde das Tn903 als EcoRI Fragment aus dem Vektor pUC4K (Vieira J und Messing J (1982) Gene 19:259-268) isoliert, die überstehenden Enden des Restriktionsverdaus nach Standardmethoden in glatte Enden überführt und in den MscI geschnittenen Vektor pGEM-Teasy/ slr1263 ligiert. Der Ligationsansatz wurde zur Transformation von E.coli x11 Blue Zellen verwendet. Transformanden wurden durch Verwendung von Kanamycin und Ampicillin selektioniert. Ein rekombinantes Plasmid (pGEM-Teasy/slr1263::tn903; siehe 2) wurde isoliert und zur Transformation von Synechocystis spec. PCC 6803 gemäß der Methode nach Williams (Williams (1987) Methods Enzymol 167:776-778) eingesetzt.
Die Kanamycin-Kasette des tn903 inserierte in pGEM-Teasy/slr1263 derart, dass die Transkription des Kanamycinresistenzgens des Tn903 in entgegengesetzter Richtung zur Transkription des offenen Leseratsers von Tocen-2 verläuft.
In 2 beinhaltet Fragment A' (715 Basenpaare) den 5'-Bereich von Tocen-2, Fragment B das Transposon 903 (1286 Basenpaare) und Fragment 'A (703 Basenpaare) den 3'-Bereich von Tocen-2.
Synechocystis spec. PCC 6803 Transformanden wurden auf Kanamycin haltigem (km) BG-11 Festmedium (Castenholz (1988) Methods in Enzymology Seite 68-93) bei 28_C und 30 ∝mol Photonen*(m²*s)^–1 selektioniert. Zwei unabhängige Knockout Mutanten konnten nach fünf Selektionsrunden (Passagen von Einzelkolonien auf frisches BG-11km Medium) erzeugt werden. Der vollständige Verlust des Tocen-2 Endogens bzw. der Austausch gegen die rekombinante Tocen-2::tn903 DNA wurde durch PCR Analysen bestätigt.
Beispiel 4: Tocopherolproduktion in Synechocystis spec. PCC 6803 Wildtypzellen und den Tocen-2 Knockout Mutanten
Die auf den BG-11km Agarmedium kultivierten Zellen von jeweils acht unabhängigen Synechocystis spec. PCC 6803 Tocen-2 Knockout Mutanten sowie untransformierte Wildtypzellen (auf BG11 Agarmedium ohne Kanamycin) wurden zum Animpfen von Flüssigkulturen verwendet. Dazu wurden Zellen der Mutante bzw. des Wildtyps Synechocystis spec. PCC 6803 von Platte in jeweils 10 ml Flüssigkultur überführt. Diese Kulturen wurden bei 28°C und 30 μmol Photonen*(m²*s)^–1 (30 μE) für ca. 3 Tage kultiviert. Nach Bestimmung der OD₇₃₀ der einzelnen Kulturen, wurde die OD₇₃₀ aller Kulturen durch entsprechende Verdünnungen mit BG-11 (Wildtypen) bzw. BG-11km (Mutanten) synchronisiert. Diese auf Zelldichte synchronisierten Kulturen wurden zum Animpfen von drei Kulturen der Mutante bzw. der Wildtypkontrolle verwendet. Die biochemischen Analysen konnten somit unter Verwendung von jeweils drei unabhängig gewachsenen Kulturen einer Mutante und der entsprechenden Wildtypen durchgeführt werden. Die Kulturen wurden bis zu einer optischen Dichte von OD₇₃₀=0,3 angezogen.
Das Medium der Zellkultur wurde durch zweimalige Zentrifugation bei 14000 rpm in einer Eppendorf Tischzentrifuge entfernt. Der daran anschließende Aufschluss der Zellen und Extraktion der Tocopherole und Tocotrienole erfolgte durch zweimalige Inkubation im Eppendorfschüttler bei 30°C, 1000rpm in 100 Methanol für 15 Minuten, wobei die jeweils erhaltenen Überstände vereinigt wurden. Weitere Inkubationsschritte ergaben keine weitere Freisetzung von Tocopherolen oder Tocotrienolen.
Um Oxidation zu vermeiden, wurden die erhaltenen Extrakte direkt nach der Extraktion mit Hilfe einer Waters Allience 2690 HPLC-Anlage analysiert. Tocopherole und Tocotrienole wurden über eine Reverse Phase Säule (ProntoSil 200-3-C30, Bischoff) mit einer mobilen Phase von 100 % Methanol getrennt und anhand von Standard (Merck) identifiziert. Als Detektionssystem diente die Fluoreszenz der Substanzen (Anregung 295 nm, Emmision 320 nm), die mit Hilfe eines Jasco Fluoreszensdetektors FP 920 nachgewiesen wurde.
Die Tocen-2 Knockout Mutanten zeigten überraschenderweise im Vergleich zu den Synechocystis spec. PCC 6803 Wildtypzellen eine Reduktion der Tocopherol- und Tocotrienolproduktion (3).
Beispiel 5: Manipulation der Tocopherol-Biosynthese in Nicotiana tabacum Samsun NN, Arabidopsis thaliana und Brassica napus durch transgene Expression von Tocen-2
Es werden transgene Pflanzen erzeugt, die Tocen-2 zum einen unter Kontrolle des konstitutiven Promoters des Nitrilase-1 (nit1) Gens aus A. thaliana (GenBank Acc.-No.: Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hillebrand et al. (1996) Gene 170:197-200) und zum anderen unter Kontrolle des samenspezifischen Promotors des USP (unknown seed protein) Gens aus Vicia faba (Bäumlein et. al. (1991) Mol Gen Genet 225: 459-467) exprimieren. Darüber hinaus wird Tocen-2 als Fusionsprotein mit dem Transitpeptid des rbcS-Proteins (Guerineau et al. (1988) Nucl Acid Res 16: 11380) sowohl konstitutiv als auch samenspezifisch exprimiert. Als Expressionsvektor dienen Derivate des pSUN-Vektors (WO 02/00900).
Für die konstitutive Expression wurde der Vektor pSUN2 unter Anwendung von Standardmethoden so verändert, dass der ocs-Terminator (Gielen et al. (1984) EMBO J 3:835-846) als SalI-PacIocs-HindIII Fragment (Sequenz ID No: 5) eingebracht wird. Durch Einführung eines Linkers wird zusätzlich eine SwaI Schnittstelle in den Polylinker eingeführt (SEQ ID No: 6 and SEQ ID No: 7). Das resultierende Plasmid wird mit pSUN2-1 bezeichnet (Sequenz ID NO: 8).
Für die Expression als Fusionsprotein mit dem rbcS-Transitpeptid wird das DNA-Fragment kodierend für das rbcS-Transitpeptid als SacI-SwaI-Fragment amplifiziert (Sequenz ID No: 9) und in den pSUN2-1 eingeführt. Der Vektor wird als pSUN2-2 bezeichnet (Sequenz ID NO: 10).
Zur Expression von Tocen-2 unter konstitutiver Kontrolle wird der ORF als SwaI-SmaI-Fragment unter Verwendung von Standardmethoden mit Hilfe der Primer 1263ex1-5' und 1263ex1-3'(SEQ ID No. 11 und SEQ ID No. 12) amplifiziert. Das entstehende 462 bp-Fragment wird in den pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) nach Angaben des Herstellers kloniert und mit Hilfe des T3- und T7-Primers sequenziert.
Ein korrekter Klon wird mit SwaI und SmaI geschnitten und unter Anwendung von Standardmethoden in einen SwaI geschnittenenen pSUN2-1 ligiert. In das resultierende Konstrukt, in das slr1263 in der richtigen Orientierung inserierte und das mit Ec1136II geschnitten wird, wird der Nitrilase-Promoter als Xhol-Fragment (SEQ ID No: 13), dessen überhängende Enden mit Klenow-Polymerase nach Standardmethoden aufgefüllt werden, kloniert. Dieses Plasmid wird mit pSUN2/NitP/slr1263/ocs bezeichnet (SEQ ID No: 14) und zur Erzeugung transgener Pflanzen verwendet (vgl. 4).
Zur Konstruktion eines Plasmides, das Tocen-2 als Fusionsprotein mit dem Transitpeptid des rbcS-Proteins unter Kontrolle des konstitutiven Promoters NitP exprimiert, wird pSUN2-2 mit SwaI geschnitten. Der so geschnittene Vektor wird mit dem Tocen-2 Fragment ligiert, das nach Verdau mit SwaI und SmaI aus pCR4Blunt-TOPO/slr1263 isoliert wird. In das resultierende Plasmid, das den ORF slr1263 in der richtigen Orientierung enthält und das mit Ec1136II geschnitten wird, wird der Nitrilase-Promoter (SEQ ID NO: 13) als XhoI-Fragment, dessen überhängende Enden mit Klenow-Polymerase nach Standardmethoden aufgefüllt werden, ligiert. Diese Klonierung erlaubt die Expression eines Fusionsproteins, das das Transitpeptid des rbcS-Proteins und Tocen-2 enthält (vgl. 5, SEQ ID No. 15).
Zur Erzeugung eines Plasmides, welches die samenspezifische Expression von Tocen-2 in Pflanzen ermöglicht, wird der samenspezifiche Promotor des USP Gens aus Vici faba verwendet, der als EcoRI-NcoI-Fragment in einem pUC-Derivat vorliegt (SEQ ID NO: 16).
Für die Klonierung unter Kontrolle des USP-Promoters wird das offene Leseraster von Tocen-2 unter Verwendung von Standard-PCR-Methoden so amplifiziert, dass am 5'-Ende eine BbsI-Schnittstelle und am 3'-Ende eine EcoRV-Schnittstelle generiert werden. Dazu werden nachfolgende Oligonukleotidprimer verwendet:
slr1263ex2-5': (SEQ ID NO: 17) und
Slr1263ex2-3': (SEQ ID No: 18)
Das Amplifikat wird in pCR4Blunt-TOPO kloniert und sequenziert.
Das PCR-Produkt wird als BbsI-EcoRV-Fragment in den mit NcoI (überhängende Enden kompatibel mit 5'-Überhang des PCR-Produktes) und EcoRV geschnittenen Vektor ligiert. Das Expressionskonstrukt wird als PmeI-HindIII-Fragment in den mit EcoRV und HindIII geschnittenen pSUN2 ligiert. Das resultierende Plasmid heißt pSun2-USP-slr1263-catT (vgl. 6, SEQ ID NO: 19).
Für die Konstruktion eines Plasmides, das die samenspezifische Expression als Fusionsprotein mit dem rbcS Transitpeptid erlaubt, wird das rbcS-Fragment zusammen mit dem ocs-Terminator als NcoI-HindIII-Fragment (SEQ ID No: 20) aus pSUN2-2 amplifiziert und in das pUC-Derivat kloniert, der den USP Promoter enthält. Promoter, rbcS und ocs werden als EcoRI-HindIII-Fragment in den mit EcoRI und HindIII geschnittenen pSUN2 kloniert. In diesen Expressionsvektor wird Tocen-2 als SwaI-SmaI-Fragment kloniert. Das resultierende Plasmid heißt pSUN2/USP/rbcS/slr1263/ocs (7, SEQ ID No: 21).
Beispiel 6: Herstellung transgener A.thaliana Pflanzen
Wildtyp A.thaliana Pflanzen (Columbia) werden mit dem Agrabacterium tumefaciens Stamm (EHA105) auf Grundlage einer modifizierten Methode (Steve Clough und Andrew Bent (1998) Plant J 16(6):735-743) der Vacuum Infiltrationsmethode nach Bechtold et al. (Bechtold N et al. (1993) CRAcad Sci Paris 1144(2):204-212) transformiert.
Die verwendeten A.tumefaciens Zellen werden im Vorfeld mit den Plasmiden pSUN2/NitP/slr1263/ocs (SEQ ID NO: 14), pSUN2/NitP/ rbcS/slr1263/ocs (SEQ ID NO: 15), pSUN2/USP/slr1263/catT (SEQ ID NO: 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/slr1263/ocs (SEQ ID NO: 21) transformiert.
Samen der Agrobacterium-transformierten Primärtransformanden werden auf Grundlage der Antibiotikaresistenz selektioniert. Antibiotika resistente Keimlinge werden in Erde gepflanzt und als vollentwickelte Pflanzen zur biochemischen Analyse verwendet.
Beispiel 7: Herstellung transgener Brassica napus Pflanzen
Die Herstellung transgener Raps Pflanzen orientiert sich an einem Protokoll von Bade JB und Damm B (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Puffer angegeben ist.
Die Transformationen erfolgen mit den Agrobacterium tumefaciens Stämmen EHA105 bzw. GV3101. Zur Transformation werden die Plasmide pSUN2/NitP/slr1263/ocs (SEQ ID NO: 14), pSUN2/NitP/ rbcS/slr1263/ocs (SEQ ID NO: 15), pSUN2/USP/slr1263/catT (SEQ ID NO: 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/slr1263/ocs (SEQ ID NO: 21) verwendet.
Samen von Brassica napus var. Westar werden mit 70% Ethanol (v/v) oberflächensteril gemacht, 10 Minuten bei 55?C in Wasser gewaschen, in 1%iger Hypochlorit-Lösung (25 % v/v Teepol, 0,1 % v/v Tween 20) für 20 Minuten inkubiert und sechsmal mit sterilem Wasser für jeweils 20 Minuten gewaschen. Die Samen werden drei Tage auf Filterpapier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glaskolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm groß) werden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explantate werden 30 Minuten mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einem 300 ml Kolben überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallusinduktionsmedium wurden die Kulturen für 24 Stunden bei 100 U/min inkubiert.
Vom den einzelnen mit den Plasmiden pSUN2/NitP/slr1263/ocs (SEQ ID NO: 14), pSUN2/NitP/rbcS/slr1263/ocs (SEQ ID NO: 15), pSUN2/USP/slr1263/catT (SEQ ID NO: 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/ slr1263/ocs (SEQ ID NO: 21) transformierten Agrobacterien Stämmen wird jeweils eine Übernachtkultur bei 29°C in Luria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/l) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 Stunden bei 29°C bis zu einer 0D600 von 0,4 bis 0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wird das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wird durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD₆₀₀ von 0,3 eingestellt.
Aus den Raps-Explanten wird das Kallus-Induktionsmedium mit sterilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobacterium-Lösung hinzugefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agrobacterien-Suspension wird entfernt, die Raps-Explante für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus-Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wird für 24 h auf einem Rotiationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co-Kultivierung wird durch Wegnahme des Kallus-Induktionsmediums gestoppt und die Explante zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explanten wird in 15 cm Petrischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten entfernt.
Zur Regeneration werden jeweils 20 bis 30 Explante in 90 mm Petrischalen überführt, welche 25 ml Spross-Induktionsmedium mit Kanamycin enthalten. Die Petrischalen werden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage werden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Spross-Induktionsmedium überführt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen werden wie von Bade JB und Damm B (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, 2. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrieben durchgeführt.
Beispiel 8: Herstellung transgener Nicotiana tabacum Pflanzen
10 ml YEB-Medium mit Antibiotikum (5 g/l Rinder-Extrakt, 1 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l Pepton, 5 g/l Saccharose und 2 mM MgSO₄,) werden mit einer Kolonie der einzelnen mit den Plasmiden pSUN2/NitP/slr1263/ocs (SEQ ID NO: 14), pSUN2/NitP/rbcS/slr1263/ ocs (SEQ ID NO: 15), pSUN2/USP/slr1263/catT (SEQ ID NO: 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/slr1263/ocs (SEQ ID NO: 21) transformierten Agrobacterium tumefaciens Stämme beimpft und über Nacht bei 28°C kultiviert. Die Zellen werden 20 min bei 4°C, 3500 U/min in einer Tischzentrifuge pelletiert und danach in frischem YEB-Medium ohne Antibiotika unter sterilen Bedingungen resuspendiert. Die Zellsuspension wird für die Transformation eingesetzt.
Die Wildtyp-Pflanzen aus Sterilkultur werden durch vegetative Replikation erhalten. Dazu wird nur die Spitze der Pflanze abgeschnitten und auf frisches 2MS-Medium in ein steriles Einweckglas überführt. Vom Rest der Pflanze werden die Haare auf der Blattoberseite und die Mittelrippen der Blätter entfernt. Die Blätter werden mit einer Rasierklinge in etwa 1 cm² große Stücke geschnitten. Die Agrobakterienkultur wird in eine kleine Petrischale überführt (Durchmesser 2 cm). Die Blattstücke werden kurz durch diese Lösung gezogen und mit der Blattunterseite auf 2MS-Medium in Petrischalen (Durchmesser 9 cm) gelegt, so dass sie das Medium berührten. Nach zwei Tagen im Dunkeln bei 25°C werden die Explantate auf Platten mit Kallusinduktionsmedium überführt und in der Klimakammer auf 28°C temperiert. Das Medium muß alle 7 bis 10 Tage gewechselt werden. Sobald sich Kalli bildeten, werden die Explantate in sterile Einweckgläser auf Sprossinduktionsmedium mit Claforan (0,6% BiTec-Agar (g/v), 2,0 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Gibberelinsäure, 0,25 g/ml Claforan, 1,6% Glukose (g/v) und 50 mg/l Kanamycin) überführt. Nach etwa einem Monat tritt Organogenese ein und die gebildeten Sprosse können abgeschnitten werden. Die Kultivierung der Sprosse wird auf 2MS-Medium mit Claforan und Selektionsmarker durchgeführt. Sobald sich ein kräftiger Wurzelballen gebildet hat, können die Pflanzen in Pikiererde getopft werden.
Beispiel 8: Charakterisierung der transgenen Pflanzen
Um zu bestätigen, dass durch die Expression von Tocen-2 die Vitamin E Biosynthese in den transgenen Pflanzen beeinflusst wird, werden die Tocopherol- und Tocotrienol-Gehalte in Blätter und Samen der mit den beschriebenen Konstrukten transformierten Pflanzen (Arabidopsis.thaliana, Brassica napus und Nicotiana tabacum) analysiert. Dazu werden die transgenen Pflanzen im Gewächshaus kultiviert und Pflanzen die das Gen kodierend für Tocen-2 exprimieren auf Northern-Ebene identifiziert. In Blättern und Samen dieser Pflanzen wird der Tocopherolgehalt und der Tocotrienolgehalt ermittelt. In allen Fällen ist die Tocopherol- bzw. Tocotrienol-Konzentration im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen erhöht.

Claims

Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsgut desselben, umfassend a) transgene Expression eines Proteins mit der SEQ ID NO: 2 oder eines funktionellen Äquivalentes desselben mit einer Identität von mindestens 40 % zu der Sequenz mit der SEQ ID NO: 2, und b) Auswahl von pflanzlichen Organismen, bei denen – im Unterschied oder Vergleich zur Ausgangsorganismus – der Vitamin E-Gehalt in dem besagten pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsgut desselben erhöht ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das funktionelle Äquivalent durch eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 23, 25 oder 27 beschrieben ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Pflanze eine Ölpflanze ist.
Transgenes Expressionskonstrukt umfassend unter Kontrolle eines in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben funktionellen Promotors eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Protein mit der SEQ ID NO: 2 oder ein funktionelles Äquivalent desselben mit einer Identität von mindestens 40 % zu der Sequenz mit der SEQ ID NO: 2.
Transgenes Expressionskonstrukt nach Anspruch 4, wobei das funktionelle Äquivalent durch eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 23, 25 oder 27 beschrieben ist.
Transgenes Expressionskonstrukt nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Nukleinsäuresequenz beschrieben ist durch a) eine Sequenz mit der SEQ ID NO: 1, 22, 24 oder 26 oder b) eine Sequenz, die sich entsprechend dem degenerierten genetischen Code von einer Sequenz mit der SEQ ID NO: 1, 22, 24 oder 26 ableitet, oder c) eine Sequenz, die eine Identität von mindestens 40 % zu der Sequenz mit der SEQ ID NO: 1, 22, 24 oder 26 aufweist.
Transgenes Expressionskonstrukt nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei der Promotor ein konstitutiver oder ein samenspezifischer Promotor ist.
Transgener Expressionsvektor enthaltend ein transgenes Expressionskonstrukt nach einem der Ansprüche 4 bis 7.
Transgener pflanzlicher Organismus oder Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsgut desselben, enthaltend ein transgenes Expressionskonstrukt nach einem der Ansprüche 4 bis 7 oder einen transgenen Expressionsvektor nach Anspruch 8.
Transgener pflanzlicher Organismus nach Anspruch 9, wobei der pflanzliche Organismus ausgewählt ist aus der Gruppe der Ölpflanzen bestehend aus Borago officinalis, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica rapa, Cannabis sativa, Carthamus tinctorius, Cocos nucifera, Crambe abyssinica, Cuphea Arten, Elaeis guineensis, Ekeis oleiferu, Glycine max, Gossypium hirsitum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Helianthus annus, Linum usitatissimum, Oenothera biennis, Ozea europea, Oryza sativa, Ricinus communis, Sesamum indicum, Triticum Arten, Zea maize, Walnuss und Mandel.
Verwendung eines transgenen pflanzlichen Organismus oder Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsgut desselben nach einem der Ansprüche 9 oder 10 zur Herstellung von Vitamin E, Ölen, Fetten, freien Fettsäuren oder Derivaten der vorgenannten.